一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒及其使
用方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种
生物纳米材料及其制备方法，尤其涉及一种检测EGFR的Fe3O4纳米探针及其试剂盒制作方法。
背景技术
[0002] 免疫组织化学检测，简称免疫组化检测，是一种利用带有
显色剂标记的特异性
抗体在组织细胞原位通过
抗原抗体反应和标记物显示反应，对组织的相应抗原进行
定位、定性、定量测定的生物检测技术。免疫组化是一种用于
肿瘤诊断和
鉴别的病理诊断方法，广泛用于临床。其应用方向包括：(1)对
恶性肿瘤的诊断和鉴别；(2)对某类肿瘤进行病理分型；(3)确定转移性恶性肿瘤原发部位；(4)诊断软组织肿瘤；(5)鉴别和发现微小转移灶，为临床
治疗方案的制定提供参考。免疫组化根据标记物的种类可分为免疫
荧光法、免疫酶法、免疫金法和免疫荧光法等。其中免疫酶法因灵敏度高、操作简单、对设备依赖少等特点被普遍使用，具有较强的实用性，是临床使用最为广泛的免疫组化方法。在免疫酶法检测中，辣根过
氧化物酶是最为常用的一种标记物。
[0003] 近年来，多种无机纳米材料被提出具有类似天然酶的活性，可以作为天然酶的模拟物应用于生物催化和检测。这些纳米模拟酶具有造价低、活
力稳定、易于贮存和运输等优势，然而，其催化活性与天然酶相比仍有一定差距。如何提高纳米酶的活性是纳米模拟酶领域的重要研究方向。Fe3O4纳米颗粒在模拟酶领域受到了广泛的关注，被认为是一种高性能的人工模拟酶。由于Fe3O4纳米颗粒
比表面积大，表面具有大量高活性的Fe2+和Fe3+，从而可以通过Fenton反应表现出较高的类辣根过氧化物酶的活性，且其催化活性易于维持稳定，具有代替辣根过氧化物酶作为免疫组化标记物的潜力。
[0004] 要实现Fe3O4纳米颗粒的标记作用，首先需要将Fe3O4纳米颗粒与抗体等生物分子进行偶联。纳米颗粒与生物分子偶联制备纳米探针一直是纳米颗粒在生物检测领域中的研究热点。偶联技术的关键在于在保持复合物的
稳定性和特异性的同时获得较高的偶联效率。根据当前研究结果，纳米颗粒和生物分子偶联的方法有四类：(1)通过纳米颗粒和生物分子表面的相异电荷进行静电
吸附；(2)通过纳米颗粒表面的官能团与生物分子的官能团进行化学反应；(3)将生物素与链酶亲和素分别修饰到纳米颗粒和生物分子上，再通过生物素与链酶亲和素进行特异性结合；(4)利用
碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)等双功能
偶联剂将纳米颗粒表面修饰的官能团与靶向分子所含的官能团进行共价偶联。第四种方法最为常用，以EDC/NHS法最为常见，它可以将纳米颗粒表面和生物分子所携带的
氨基和羧基进行偶联。但是EDC/NHS法对官能团没有选择性，即抗体上的所有羧基和氨基都可以参加偶联反应。这容易造成多个纳米颗粒与同一个抗体偶联，出现交叉偶联的情况，从而对探针的稳定性产生负面影响。另外，也可能导致抗体的抗原结合
片段Fab片段的官能团被占用，由于空间效应导致抗体结构发生变化从而改变其活性，影响生物分子的生物效能。因此，开发出能够解决这四类偶联方法弊端的新偶联方法，对于纳米材料在检测领域的应用尤为重要。
[0005] 由于生物检测等领域的需求，需要大量生产抗原特异的单克隆抗体。传统的人、鼠、兔源的单克隆抗体生产昂贵且制备复杂。而单域抗体制备简单，生产便宜，保存容易，给单克隆抗体的制备带来了突破。20世纪90年代，研究发现在骆驼和软骨鱼体内存在着只由重链组成的抗体，这些抗体的抗原结合部位是包含了所有抗原结合的信息的一个通过
铰链区与Fc区连接的单结构域。与传统的抗体相比，单域抗体具有稳定、尺寸小、溶解性好、结构易变、容易结合到较小、较隐藏的抗原位点、抑制酶作用、高产率、低免疫原性、短血清
半衰期等优势。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于针对
现有技术中纳米酶制备中存在的不足，提供一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒。
[0007] 本发明的另一目的还在于针对现有纳米材料与生物分子偶联方法的
缺陷，提供本发明所述试剂盒中的核心组件用于检测EGFR的Fe3O4纳米探针。所述Fe3O4纳米探针通过免疫组化标准操作，可用于肿瘤EGFR表达的检测，为相关肿瘤的发生发展提供依据，并指导临床抗EGFR的靶向药物的使用。
[0008] 本发明的另一目的还在于提供一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒的使用方法。
[0009] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：
[0011] (1)
柠檬酸修复液，所述柠檬酸修复液为10mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸一柠檬酸钠去离子
水溶液；
[0012] (2)即用型内源性过氧化物酶阻断剂，所述阻断剂为浓度为3wt％的H2O2；
[0013] (3)非特异性结合位点阻断剂，所述非特异性结合位点阻断剂为
牛血清
白蛋白(BSA)粉剂；
[0014] (4)3，3’-二氨基联苯胺四
盐酸盐(DAB)干粉；
[0015] (5)3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色底物，所述显色底物为双氧水；
[0016] (6)3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)稀释液，所述稀释液为水或者7.4缓冲液；
[0017] (7)Fe3O4纳米探针；
[0018] (8)TBS粉剂，所述TBS粉剂为用于配制pH值为7.4的吐温
磷酸盐缓冲液所用粉剂；
[0020] 所述试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备方法包括以下步骤：
[0021] (1)将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O按照
质量比为1-1.5∶0.75-1.5溶于纯水中，在氮气保护下，在50℃～80℃之间的某一
温度下恒温水浴中搅拌，并加入
氨水反应；然后滴加8～10mL油酸，在50℃～80℃之间的某一温度下恒温水浴反应1～5h；
[0022] (2)将步骤(1)得到的反应液温度升至85℃～100℃，使氨水全部挥发，冷却之后，转移至容器中，磁分离、洗涤，然后溶解在正己烷中保存，得到Fe3O4@OA正己烷溶液；
[0023] (3)取步骤(2)中制备的Fe3O4@OA正己烷溶液与浓度为2mg/mL的二巯丁二酸的丙
酮溶液按质量比1∶1～4混合，然后在60℃下冷凝回流3-10h，磁分离、洗涤，得到
磁性颗粒；
[0024] (4)将步骤(3)中得到磁性颗粒使用纯水定容，用氢氧化钠调节pH至9-11，超声分散后，用盐酸调节pH至6-8，装入
透析袋，透析，得到Fe3O4纳米颗粒；
[0025] (5)取步骤(4)中制备的Fe3O4纳米颗粒与NiSO4·6H2O、Co(NO3)2·6H2O、MgSO4·7H2O或CaCl2·6H2O水溶液混合、孵育，在10000r/min的速度下离心，取沉淀重悬于超纯水中，得到表面携带Ni2+、Co2+、Mg2+或Ca2+的Fe3O4纳米颗粒分散液；
[0026] (6)将步骤(5)中得到的表面携带Ni2+、Co2+、Mg2+、或Ca2+的Fe3O4纳米颗粒与EGFR单域抗体进行混合、孵育，在10000r/min的速度下离心，取沉淀得到Fe3O4纳米探针。
[0027] (7)将步骤(6)中得到的Fe3O4纳米探针用含有1wt％牛血清白蛋白的pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，并放置在恒温容器中于3℃～4.5℃之间的某一温度下保存。
[0028] 优选的，所述步骤(1)中将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O溶于纯水中，在氮气保护下，在70±0.5℃之间的某一温度下恒温水浴中搅拌，所述步骤(1)中滴加8～10mL油酸后，在70±0.5℃之间的某一温度下进行恒温水浴中反应3±0.5h。
[0029] 优选的，所述步骤(2)中将步骤(1)得到的反应液温度升至90±0.5℃。
[0030] 优选的，所述步骤(4)中将步骤(3)中得到磁性颗粒使用纯水定容，用氢氧化钠调节pH至10±0.5，超声分散后，用盐酸调节pH至7±0.5，所述氢氧化钠为1mol/L浓度的氢氧化钠溶液，盐酸为1mol/L浓度的盐
酸溶液。
[0031] 优选的，所述Fe3O4纳米颗粒与NiSO4·6H2O、Co(NO3)2·6H2O、MgSO4·7H2O或CaCl2·6H2O的摩尔比为1∶1～20。
[0032] 优选的，所述步骤(6)中表面携带Ni2+、Co2+、Mg2+、或Ca2+的Fe3O4纳米颗粒与EGFR单域抗体的质量比为1∶1～1∶5。
[0033] 优选的，所述EGFR单域抗体为C端联接6个的His-Tags的EGFR单域抗体。
[0034] 一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
[0035] (1)切片二
甲苯脱蜡，梯度酒精分化；
[0036] (2)将切片依次用阻断内源性过氧化物酶、BSA孵育；
[0037] (3)pH值为6.0柠檬酸盐缓冲液修复抗原；封闭切片中非特异性结合位点；
[0038] (4)滴加Fe3O4纳米探针；
[0039] (5)DAB显色；
[0040] (6)苏木素复染，盐酸酒精分化；
[0041] (7)脱水透明后封片，
显微镜下观察染色效果并拍照记录。
[0042] 所述使用方法更加具体的包括以下步骤：
[0043] (1)将
石蜡包埋的非小细胞
肺癌切片浸没于二甲苯中3次，每次5min；取出切片浸没于无水
乙醇中3次，每次5min；再依次浸没于浓度为90％、80％和70％乙醇中各5min；最后再浸没于纯水中5min；
[0044] (2)取出切片，放入湿盒中，3％H2O2避光孵育20min；
[0045] (3)再用1wt％的BSA溶液孵育20min；
[0046] (4)将柠檬酸修复液粉剂配成pH值为6.0柠檬酸盐缓冲液，加入高压锅中加热至80℃后，放入步骤(3)中孵育的切片，并加热至
沸腾，加压至120kPa处理10min，流水冷却；
[0047] (5)向步骤(4)制备的切片上滴加适量Fe3O4纳米探针，37℃孵育2h；再用pH值为7.4的PBS缓冲溶液洗涤后，滴加DAB工作液(即DAB显色底物、DAB浓缩液、DAB稀释液三者按照体积比1∶1∶10混合的
混合液)显色，
自来水停显；
[0048] (6)再加入苏木素复染30s，盐酸酒精分化，冷水返蓝10min；
[0049] (7)最后在梯度酒精(浓度分别为70％，80％，90％，100％，100％)中依次浸泡5min，二甲苯中浸泡3次，每次10min；中性树胶封片，显微镜下观察染色效果并拍照记录。
[0050] 本发明还给出了一种新的纳米颗粒偶联抗体的方法，巧妙地将Fe3O4纳米颗粒的高类过氧化物酶活性和EGFR单域抗体的生物特性结合起来，得到的Fe3O4纳米探针表面负载较多的EGFR单域抗体，对表达EGFR的肿瘤组织具有特异性结合作用，可以实现对EGFR的高灵敏和特异性检测。制备所得的Fe3O4纳米探针具有良好的
生物相容性，有望得到更广的生物应用范围。
[0051] 有益效果：His-Tags是一种融合标签，可与多种蛋白组合形成融合蛋白，基于组氨酸的咪唑环与
金属离子(如Ni2+、Co2+、Mg2+及Ca2+)起化学作用而生成螯合的原理，可以利用His-Tags标签纯化融合蛋白。His-Tags无免疫原性，对
蛋白质的分泌、折叠、功能等几乎没有影响。本发明利用金属离子和组氨酸咪唑基团螯合作用，开发了一种新的偶联方法，并制作了方便使用的检测人肿瘤
组织切片中EGFR表达的试剂盒。所述方法具有操作简单，无需借助偶联剂，且由于His-Tags标记在EGFR单域抗体的C端，可以使得抗体以充分暴露Fab功能区的取向偶联在Fe3O4纳米颗粒的表面，从而充分保留抗体的活性。本发明所述的一种用于检测EGFR的Fe3O4纳米探针的制备方法简单有效，制备过程中得到的Fe3O4纳米颗粒尺寸小(9nm左右)、分散性好、以棕色透明水溶液形式保存，稳定性好，该Fe3O4纳米颗粒表面带有羧基，可以吸附Ni2+、Co2+、Mg2+及Ca2+等金属离子；得到的Fe3O4纳米探针具有高的类过氧化物酶活性，可催化常用的过氧化物酶底物反应。
[0052] 本发明以上各方面中的特征可以在本发明的范围内自由组合，只要组合后的技术方案落在本发明的实质精神内，且使用方法并不受其顺序的限制。
附图说明
[0053] 图1是本发明所述Fe3O4纳米探针的功能结构示意图；
[0054] 图2是本发明所述Fe3O4纳米探针的化学结构示意图；
[0055] 图3是本发明所述Fe3O4纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片，标尺为100nm；
[0056] 图4是本发明所述Fe3O4纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片，标尺为20nm；
[0057] 图5是本发明所述Fe3O4纳米颗粒的粒径分布统计图；
[0058] 图6是本发明所述Fe3O4纳米颗粒的催化TMB的类过氧化物酶活性；
[0059] 图7是本发明所述Fe3O4纳米颗粒吸附不同量的Co2+之后的zeta电位值；
[0060] 图8是本发明所述试剂盒在人非小细胞肺癌组织切片免疫组化染色结果。
具体实施方式
[0061] 下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读本发明之后，本领域的技术人员对本发明的各种等价形式的
修改均落于本
申请的
权利要求所限定的范围。
[0062] 如图1所示，是Fe3O4纳米探针的功能结构示意图。其中1为Fe3O4纳米颗粒，是Fe3O4纳米探针的标记物，具有类辣根过氧化物酶的活性，可以用于检测过程中的显色反应，其显色结果可通过
光学显微镜进行观察；2为EGFR单域抗体，对肿瘤组织的EGFR具有特异性结合的作用，可以将Fe3O4纳米探针特异性地结合到EGFR所在区域。
[0063] 如图2所示，是Fe3O4纳米探针的化学结构示意图。其中1为共沉淀法制备的Fe3O4纳米颗粒；2为Fe3O4纳米颗粒表面的羧基；3为通过羧基吸附的Ni2+(亦可为Co2+、Mg2+及Ca2+)；4为His-Tags中的咪唑环；5为通过咪唑环与Ni2+(亦可为Co2+、Mg2+及Ca2+)螯合的EGFR单域抗体。
[0064] 如图3至图4所示，为Fe3O4纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片。可以看到Fe3O4纳米颗粒为多面体形状，纳米结构分散均匀。
[0065] 如图5所示，为Fe3O4纳米颗粒的粒径分布统计图。结果显示Fe3O4纳米颗粒的尺寸分布范围较窄，平均尺寸为8.7nm左右。
[0066] 如图6所示，是Fe3O4纳米颗粒的催化TMB的类过氧化物酶活性测量结果。对照组几乎未显示
颜色变化，而Fe3O4纳米颗粒组在2min内有明显的吸光度的上升，说明Fe3O4纳米颗粒可以有效地催化H2O2氧化底物TMB显色。其中，TMB为3，3’，5，5’-四甲基联苯，为常用的过氧化物酶显色底物。
[0067] 如图7所示，是Fe3O4纳米颗粒吸附不同量的Ni2+之后的zeta电位值。取10μg Fe3O4纳米颗粒，与不同量Ni2+孵育后，当Ni2+超过1.2μmol时候，zeta电位位降至-20mV以下，此时由于电位较低，表面的静电斥力作用不足以维持纳米颗粒的稳定性，便会导致纳米颗粒的聚集。本发明选择使用的Fe3O4纳米颗粒与Ni2+的摩尔比为1∶1～1∶20。最后，将吸附了Ni2+后的Fe3O4纳米颗粒与EGFR单域抗体按不同的比例混合，孵育30min～1h。以吸附Ni2+的Fe3O4纳米颗粒为例，最多可偶联EGFR单域抗体50μg。纯化得到Fe3O4纳米探针，存放于含1％BSA的PBS溶液中，存放于温度为3℃～4.5℃之间的某一温度的恒温容器中备用。
[0068] 如图8A所示，利用所述试剂盒，对临床数据已知EGFR表达阳性的非小细胞肺癌组织切片免疫组化染色结果，可见大量肿瘤细胞的细胞膜被标记棕色。图8B为高浓度抗体封闭后，再使用所述试剂盒检测的结果，可见组织上仅有极少的棕色。图8C为利用所述试剂盒中Fe3O4纳米探针制备试剂A实验的结果，可见染色为阴性。图8D为利用所述试剂盒对临床数据已知EGFR表达阴性的组织切片的染色结果，可见染色结果为阴性。
[0070] 一种DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒的制备流程：
[0071] 取FeCl3·6H2O 28g，纯水80mL，FeSO4·7H2O 20g，通N2，搅拌使溶解完全并水浴加热升温至70℃，剧烈搅拌作用下快速加入40mL氨水。继续搅拌10min后，滴加10mL油酸。在70℃下继续反应3h。升温至90℃使氨水挥发。反应结束后，冷却，磁分离，乙醇洗2次，纯水洗
3次，乙醇洗2次，溶于正己烷保存，得到Fe3O4@OA的正己烷溶液。取Fe3O4@OA正己烷溶液(含Fe3O4@OA纳米颗粒200mg)，与等体积的DMSA丙酮溶液(含DMSA100mg)均匀混合，置于三颈瓶，60℃水浴条件下冷凝回流5h，纯水洗涤8遍。取沉淀溶于二次水，调pH至10，反复超声分散，再将pH调至7，透析袋中纯水透析72小时，得到Fe3O4纳米颗粒保存于4℃
冰箱中。
[0072] 实施例2-6
[0073] 一种基于Fe3O4纳米探针的检测人肿瘤组织切片中EGFR表达的试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备流程：
[0074] 取实施例1中所得Fe3O4纳米颗粒(试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备试剂A)10μg，与20μg、50μg、100μg、200μg、300μg的NiSO4·6H2O(试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备试剂B)在水溶液中孵育1h。用离心机10000r/min的速度离心20min，取沉淀。将沉淀重悬于1mL纯水中，加入50μgEGFR单域抗体(试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备试剂C)混匀后在25℃孵育
30min，用离心机10000r/min的速度离心20min，取沉淀，用含有1％BSA的pH7.4PBS缓冲液溶解，放置在4℃冰箱中保存。
[0075] 实施例7-15
[0076] 一种基于Fe3O4纳米探针的检测人肿瘤组织切片中EGFR表达的试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备流程：
[0077] 取实施例1中所得Fe3O4纳米颗粒(试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备试剂A)10μg，与300μg的NiSO4·6H2O(试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备试剂B)在水溶液中孵育1h。用离心机
10000r/min的速度离心20min，取沉淀。将沉淀重悬于1mL纯水中，加入10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg EGFR单域抗体(试剂盒中Fe3O4纳米探针的制备试剂C)混匀后在25℃条件下孵育30min，用离心机10000r/min的速度离心20min，取沉淀，用含有1％BSA的pH7.4PBS缓冲液溶解，放置在4℃冰箱中保存。
[0078] 实施例16
[0079] 一种基于Fe3O4纳米探针的检测人肿瘤组织切片中EGFR表达的试剂盒及其使用方法：
[0080] (1)将石蜡包埋的非小细胞肺癌切片(临床已知EGFR表达阳性样本)浸没于二甲苯中3次，每次5min；取出切片浸没于无水乙醇中3次，每次5min；再依次浸没于浓度为90％、80％和70％乙醇中各5min；最后再浸没于纯水中5min。
[0081] (2)取出切片，放入湿盒中，3％H2O2避光孵育20min。
[0082] (3)再用1wt％的BSA溶液孵育20min。
[0083] (4)将柠檬酸修复液粉剂配成pH值为6.0柠檬酸盐缓冲液，加入高压锅中加热至80℃后，放入步骤(3)中孵育的切片，并加热至沸腾，加压至120kPa处理10min，流水冷却。
[0084] (5)向步骤(4)制备的切片上滴加适量按照例2-15制备得到的Fe3O4纳米探针，37℃孵育2h；再用pH值为7.4的PBS缓冲溶液洗涤后，滴加DAB工作液(即DAB显色底物、DAB浓缩液、DAB稀释液三者按照体积比1∶1∶10混合后的混合溶液)显色，自来水停显；
[0085] (6)再加入苏木素复染30s，盐酸酒精分化，冷水返蓝10min；
[0086] (7)最后在梯度酒精(浓度分别为70％，80％，90％，100％，100％)中依次浸泡5min，二甲苯中浸泡3次，每次10min。中性树胶封片，显微镜下观察染色效果并拍照记录。
[0087] 需要说明的是，在上述实施例1-15中，技术人员可以根据实际需要改变某些参数，例如NiSO4·6H2O和EGFR单域抗体的质量、反应溶液的体积等。实质上只需要调节NiSO4·6H2O与Fe3O4纳米颗粒的质量比，以及吸附了Ni2+的Fe3O4纳米颗粒与EGFR单域抗体的质量比例在一定的范围即可。另外，技术人员还可以根据上述实施例对透析和离心的条件进行优化。技术人员还可以选择其他带有His-Tags的抗体进行上述实验，通过这些抗体的特异性，实现多种靶分子表达情况的检测。在实施例16中，技术人员可以根据实际需求，利用本发明所述试剂盒检测不同组织的EGFR表达情况。
