NGS系统对照和涉及所述NGS系统对照的方法
阅读：836发布：2020-05-11
专利汇可以提供NGS系统对照和涉及所述NGS系统对照的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于NGS方法的对照。本发明 申请 公开了涉及根据本发明的对照的质粒、 试剂 盒 、它们的用途和方法。，下面是NGS系统对照和涉及所述NGS系统对照的方法专利的具体信息内容。
1.核酸对照在制备用于基于下一代测序的诊断方法的试剂盒中的用途，所述方法包括从样品和至少一种对照样品提取核酸材料，其中在提取之前制备所述对照样品，其还包括将所提取的核酸材料进行下一代测序方法，其中所述对照样品包含添加有所述核酸对照的样品材料，其中所述核酸对照包含不同于靶标核酸序列的至少一种核酸对照序列，以及其中所述核酸对照包含至少一种野生型核酸序列和所述野生型核酸序列的至少一种突变体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸对照序列选自非人来源的核酸或选自病毒核酸。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述核酸对照序列选自来源于烟草花叶病毒的核酸。
4.根据权利要求1所述的用途，其以预先确定的比例包含至少两种如根据权利要求1所定义的核酸对照。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法适合于检测来源于感染剂或来自致癌基因的序列的存在与否。
6.根据权利要求5所述的用途，其中来源于感染剂或来自致癌基因的靶标序列的存在或不存在以及测序反应之后至少一种核酸对照序列的存在指示了从所述样品完成了核酸提取。
7.根据权利要求1所述的用途，还包含污染对照。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述污染对照包含如权利要求1所定义的至少一种核酸对照，其中所述污染对照不包含样品材料。
9.根据权利要求8所述的用途，其包括对所述污染对照进行靶标核酸-特异性测序反应。
10.根据权利要求9所述的用途，其包括对所述污染对照进行靶标核酸特异性测序反应，其中所述污染对照中靶标核酸特异性序列检测的不存在和对照核酸特异性序列的存在的检测指示不存在污染。
11.根据权利要求1所述的用途，其中在从所述样品提取核酸之后，所述对照核酸以
0.1-10fg的量存在。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品是来源于人受试者的临床样品，并且其中所述对照核酸是包含非人病毒的野生型和/或突变序列的质粒，所述病毒选自不感染人的动物病毒、植物病毒，或者其中已人工设计对照核酸并且所述对照核酸在自然界没有等价物。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述植物病毒为烟草花叶病毒。
NGS系统对照和涉及所述NGS系统对照的方法
技术领域
背景技术
[0002] 核酸测序的使用已成为现代医学的很多诊断领域中的必需工具。具体地，基于下一代测序(NGS)的基因测试很快在临床诊断学中获得认可。该领域的实例为肿瘤学，其中使用核酸序列以鉴定(例如)致癌突变是否存在于基因中或者引起和/或指示癌症的移位是否存在于基因组中。此外，使用核酸测序来检测病原微生物(如(例如)细菌或病毒)是否存在于临床样品，例如，来自人患者的组织样品或血液样品中，在后一种方法中，检测不存在于人受试者中，而仅存在于微生物中的核酸序列。
[0003] 通常，在实际测序步骤之前是扩增反应，以扩增待测序的核酸。这种扩增反应通常通过PCR反应进行；因此，在PCR反应中使用特异性引物，其杂交至待扩增序列的上游和下游的序列(即引物与待扩增序列侧接)。
[0004] 由于近年来的发展，诊断方法过程中的很多步骤，包括NGS工艺流程已自动化。例如，从临床样品提取核酸，扩增反应以及实际测序反应已自动进行。
[0005] NGS方法可以导致靶标序列的鉴定和序列确定，其可以表明致癌突变的存在或不存在或者病原体-来源的核酸的存在或不存在。
[0006] 然而，在如上所述的测定中不能排除不正确地进行了所述测定的某些步骤。而依赖于PCR的常规测定(例如，qPCR)通常涉及阳性和阴性对照的使用以确保结果的质量，基于NGS的测定通常不包含这些对照。这可以在测序结果的正确解释中产生问题。
[0007] 不正确地进行的测定的典型实例是由于未正确进行提取步骤而未检测到靶标序列。因此，致癌基因或感染性微生物可能的确存在于样品中，尽管结果(即测序反应的结果)将是测序反应失败或者测序反应后的分析将该事件归类为“无效”结果。当样品被DNA污染时，测序反应分析的结果会是结果是假阳性或假阴性结果。本文所提供的对照(包括阴性对照)允许高通量测序方法(也称为下一代测序)的使用者识别可能的假阳性和假阴性结果。本文所提供的系统对照(SC)将帮助排除测序失败的故障。尽管测序失败对患者无风险，但是由于NGS过程涉及的高成本，它仍是重要的。此外，包括如本文所提供的适当的系统对照的NGS中获得的测序数据的分析更可靠、更快速并且更准确。
[0008] 为了排除不正确的提取步骤，可以使用提取对照。提取对照可以包括加入包含对照核酸序列的完整的所谓的参比细胞，其通常不同于待检测的序列。通常，在开始自动提取步骤之前将这些细胞添加(“加标”)到样品中(通常，通过在提取期间将细胞以特定浓度加入到所使用的裂解缓冲液中)。测定完成后，提取对照序列的检测表明提取步骤确实已正确进行。
[0010] 此外，必需小心排除污染核酸导致的假阳性或假阴性结果。如上所述，在NGS数据分析中，污染核酸的存在可能提供了某些靶标序列(或目的核酸序列)存在于来自患者的样品中的印象。另一方面，当NGS测序反应旨在确定野生型靶标序列和变体序列(例如，在致癌基因中)是否存在时，污染可能导致整体测序结果转变到野生型或变体过度或未充分表示的一侧。这还可以改变基于NGS的诊断的整体结果，例如，当固定预定期望水平时。
[0011] 综上所述，涉及NGS的诊断测试需要本文所公开的对照(其还可以称为“系统对照”(SC))，具体地，当测定必需满足各个法规机构(如FDA)的某些监管要求时。同时，这些对照应易于获得，即无需使用复杂的分子生物技术可获得，它们应以低成本可生产，不会对环境或处理它们的人员构成危害。此外，对照的存在不应不利地影响诊断测定的灵敏度。本发明满足了这些及其它目标。
[0012] 本发明的发明人在提供用于下一代测序(NGS)反应的系统对照中获得了特别的成功，所述系统对照可以在NGS反应中用作阳性和阴性以及提取对照。
[0013] 在更详细地描述本发明的一些实施方式之前，引入以下定义。
[0014] 定义
[0016] 需要理解术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由…组成”应认为是术语“包括”的优选实施方式。如果在下文中将组定义为包括至少某些实施方式，则这还意味着涵盖了优选地仅由这些实施方式组成的组。当核酸对照或靶标核酸序列包含核酸(序列)时，这意味着在包含其它序列的序列中存在额外的残基是可能的，例如，在包含对照核酸序列的质粒中。
[0017] “靶标核酸序列特异性基于NGS的诊断方法”或“基于NGS的靶标核酸检测方法”的表述是指这些方法包括下一代测序，但是额外的步骤也是可能的，例如，从给定样品提取和/或纯化核酸，NGS-方案的任何修饰(只要根据该领域已知的方法进行测序反应)，以及测序后步骤，例如，测序和分析期间获得的数据的分析、表示或在分析结束时提供的结果分析和表示。
[0018] 当对照序列和靶标核酸序列不同时，这表示核酸至少在一个核酸残基中是不同的。经常地，这些序列来自于不同的基因，极经常地，它们来源于不同的基因和生物。优选地，对照核酸来源于来源或者已通过这样的方式修饰，所述方式使得所述对照对环境不呈现任何风险，特别是对实验室中处理它们的人员。
[0019] 如本文所使用的术语“检测存在”应理解为“检测存在或不存在”。
[0022] 如本文所使用的术语“序列”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中碱基的顺序出现，其中脱氧核糖核苷酸聚合物中存在的碱基选自A、T、G和C，核糖核苷酸聚合物中存在的碱基选自A、U、G和C。因此，脱氧核糖核苷酸聚合物中碱基序列可以是(例如)GGAAGCAAGCCT，而核糖核苷酸聚合物中碱基序列可以是(例如)GGAAUCGAU。
[0023] 如本文所使用的，术语“样品”是指来自任何人或兽医受试者的可以测试包含靶标序列的核酸的存在的任何生物样品。所述样品可以包括得自任何器官的组织，如(例如)肺组织；和得自任何器官的液体，如(例如)血液、血浆、血清、淋巴液、关节液、脑脊髓液、羊膜水、羊膜脐血、泪、唾液和鼻咽清洗液。如上所列，样品还可以来源于身体的特定区域，例如，呼吸道；来自呼吸道的样品包括喉拭子、喉清洗液、鼻拭子和来自下呼吸道的样品。
[0024] 所述样品可以来源于人或兽医受试者。因此，“患者”可以是人或兽医受试者。如果提及“临床样品”，则这表示该样品来自于怀疑带有包含靶标序列的核酸的患者。
[0025] 通过将对照核酸加入到样品中来制备根据本发明的对照样品，例如，当样品为来自人器官的FFPE材料时，所述对照样品包含来自相同来源的FFPE材料，但是另外它还包含加入样品的对照核酸。根据应作对照的步骤，例如，提取和/或测序等，可以在提取之前或之后将对照核酸加入对照样品中。
[0026] 如本文所使用的，术语“扩增”是指酶介导的程序，其能够产生数十亿的核酸靶标的拷贝。本领域中已知的酶介导的靶标扩增程序的实例包括PCR。
[0027] “提取核酸”是指从任何细胞背景中分离存在于小瓶中的任何核酸，具体地，从完整细胞或组织分离。优选地，在所述方法过程中清洗核酸并任选地浓缩。提取后，除去与核酸无关的所有细胞或组织碎片。典型的提取方法可以包括低渗裂解缓冲液、热和/或去污剂的使用，并且所述提取方法是技术人员已知的。
[0028] 在本文中以分子生物学中的常规含义使用术语“测序”。因此，确定了核酸序列中准确的碱基顺序出现。
[0030] 在本文中分别以分子生物学和肿瘤学中的常规含义使用术语“致癌基因”。因此，存在(例如)在基因中已知的突变，其使得“正常或野生型”基因具有致癌性，即引起癌症；这方面的实例为使激酶具有组成型活性从而持续发出特定信号(例如，诱导生长信号)并起始相应过程的突变。如本文所使用的“致癌基因”还可以涉及也会导致引起癌症情况的染色体内或染色体间易位。
[0031] 如本文所提及的“靶标序列”是核酸中的序列，在根据本发明所述的方法中检测其存在；“靶标序列”特征在于检测其存在的特定核酸。
[0032] 如本文所使用的，将正在测序的核酸称为靶标核酸(或“靶标”)。靶标核酸包括但不限于DNA，如(但不限于)基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等，和RNA，如(但不限于)mRNA、miRNA等。靶标核酸可以来源于任何来源，包括天然存在的来源或合成来源。所述核酸可以是PCR产物、粘粒、质粒、天然存在或合成的文库成员或物质等。本发明不意欲限制于该方面。所述核酸可以来自动物或病原体来源，包括但不限于哺乳动物如人，和微生物如细菌、病毒、真菌、寄生虫和分枝杆菌。在一些实施方式中，所述核酸不是病毒核酸。靶标核酸可以得自任何体液或组织，其包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液(“CSF”)、皮肤、毛发、尿液、大便和粘液。靶标核酸还可以来源于但不限于环境样品(如水样)、食品样品、森林样品，所述样品可以是新鲜样品(例如，直接进行核酸提取的活组织检查材料)，或已处理以允许储存的样品，例如，福尔马林-固定和/或石蜡包埋的样品(FFPE样品)。根据本发明所述的方法特别适合于临床样品，例如，FFPE样品。
[0033] 一般地，将靶标核酸在5'和3'端之一或两者处连接到序列。这些衔接头序列包括在本发明所述的测序方法中使用的测序引物位点(即，测序引物将杂交的位点)。
[0034] 在一些实施方式中，如以下所讨论的，将进行扩增的靶标具有相同或类似长度(例如，靶标间5-10％的变化)。在一些实施方式中，可以保持尽可能小的这种变化，以确保均匀使用所有模板。
[0035] 可以通过多种方式将扩增产物固定在支持物表面(例如，玻璃表面)上。例如，可以在溶液中进行扩增过程，然后将最终产物连接到支持物表面。可以将扩增产物在其5'端或其3'端连接到固体支持物。连接可以通过与固定在支持物表面上的核酸的杂交或者它可以通过扩增产物末端上的部分与支持物表面上的部分之间的相互作用。实例包括使用生物素或双重生物素标记的DNA(Margulies等人,Nature 437:376(2005))与链霉亲和素/亲和素/中性亲和素包被的支持物表面、DIG(洋地黄毒苷)和抗DIG抗体或抗体片段、荧光素和抗荧光素抗体或抗体片段(Gore等人,Nature 442,836-9(2006))，或通过使用杂官能化的交联剂，如生物素化的琥珀酰亚胺基丙酸酯-PEG，其可以偶联(例如)至胺-官能化的玻璃并通过链霉亲和素夹心(即核酸生物素-链霉亲和素/亲和素/中性亲和素-生物素固体支持物相互作用)用于固定生物素-标记的DNA。
[0036] 模板可以是指随机固定至表面上。这表示基于序列，模板未放置到固体支持物表面上。然而，以在聚合酶-介导的掺入反应期间和/或在模板延伸期间确保每个模板被未被另一模板占据的区域(并因此，体积)所围绕的方式将它们置于固体支持物上。也就是说，在一些情况下，将模板以彼此之间足够的距离布置在表面上以防止模板之间的任何相互作用。
[0037] 固体支持物是指模板所结合或固定的部件，其可以由任何材料构成，所述材料包括但不限于玻璃或其它二氧化硅基材料、塑料或其它聚合物基材料，然而只要所述材料对测序反应和清洗中使用的模板、引物、聚合酶、dNTP和其它成分是相对惰性的。固体载体可以或可以不是刚性的。它可以是多孔的。它可以或可以不是连续的。在一些实施方式中，固体支持物是玻璃载玻片。在一些实施方式中，所述支持物是本身固定在固体支持物上的多个珠或颗粒(如微粒)。这些珠可以是多孔的。所述支持物可以是筛网，在一些实施方式中，所述固体支持物本身是检测器或传感器，如接触成像仪。
[0038] 应理解可以将多个模板(无论是否相同)连接至固体支持物，只要所述多个模板的每个部件与其它部件之间的间隔足够远，从而在模板之间不会发生重叠。
[0039] 通常，模板必需连接到其游离端上的可观察(或可检测)部分。该部分旨在表示模板的游离端，并因此其位置和在作用力方向上的移动表明了模板的长度。所述可观察部分可以是任何数目的部分，并且本发明不受限于其性质。可观察部分的性质将决定适于观察(或检测或监测)模板长度变化的传感器或检测器的类型。在一些重要的实施方式中，所述可观察部分为珠，如微珠，并且更具体地，如磁珠。
[0040] 所述部分可以通过多种方法并且使用多种相互作用连接到模板，其包括但不限于非共价相互作用，如生物素/链霉亲和素、DIG/抗-DIG和荧光物质/抗荧光物质结合对，以及共价相互作用，如本文中所讨论的关于模板(或引物)与支持物表面共价固定化的那些。
[0041] 所述固体支持物是流通池的一部分或邻近于流通池。如本文所使用的，流通池是具有至少入口和出口的室，其中液体通过入口和出口移动。根据用于观察模板的检测系统的位置，模板所连接的固体支持物可以在流通池的下方、上方或旁边。所述固体支持物可以是流通池的壁，包括下壁、侧壁或上壁。
[0042] 如将理解的，模板准确且快速的测序取决于未掺入的核苷酸从系统移除的程度和速率。因此，未掺入的核苷酸的快速且完全(或接近完全)的移除是重要的。还必须设计微流体系统以使清洗最大化，从而可能导致较小的清洗体积和清洗时间。
[0043] 还可以通过腺苷三磷酸双磷酸酶的使用部分或完全促进未掺入的核苷酸的清除，所述腺苷三磷酸双磷酸酶将未掺入的dNTP降解并使他们不适于进一步掺入。一旦任何给定核苷酸三磷酸盐类型的掺入停止(如通过模板末端可检测部分的任何上述背景移动的停止所指示的)，则腺苷三磷酸双磷酸酶可以自由流动，加入到清洗缓冲液中并引入到流通池中。可选地或者另外，腺苷三磷酸双磷酸酶可以固定或固定化到流通池内，如(例如)，固体支持物表面(模板也固定或固定化的表面)。这可以通过接头的使用进行，以使所述酶更可接近并移除与表面密切邻近有关的任何空间阻碍。腺苷三磷酸双磷酸酶可以连接到长度不同的多个接头上。以这种方式，腺苷三磷酸双磷酸酶可以存在于流通池内的多种气流中，包括与壁更接近的那些和与中央气流更接近或位于中央气流的那些。如以上所讨论的，接近壁的气流以低速移动，并且这些气流中存在的未掺入的dNTP不易清除。这些气流中具有的腺苷三磷酸双磷酸酶应改善这些dNTP的去除。这将提高以下可能性：模板长度的变化是新引入到流通池的dNTP的掺入的结果，而不是清洗后流通池中保留的残余和未掺入的dNTP的结果。
[0044] 在本发明的一些方面中，所述测序方法被称为通过合成反应的测序。这表示确定第一核酸的序列需要使用第一核酸作为模板的第二核酸的合成。以这种方式，根据掺入的dNTP的顺序和数目确定第二核酸的序列，并且将第一核酸的序列确定为第一核酸序列的互补物。本发明所述的方法通过模板长度的变化并且不是通过直接观察dNTP向正在合成的核酸中的添加来检测dNTP的掺入。因此，dNTP可以是天然的dNTP(即，缺少任何修饰的dNTP，包括任何外源可检测标记物，如荧光团)。如根据本发明公开应清楚的，本发明的测序方法还需要模板保持完整。本发明的一些方面包括描述为在不存在荧光的情况下发生或以非荧光方式发生的测序方法。这些鉴定表示可以在不检测荧光(特别是不检测来自每个掺入的dNTP的荧光)的情况下进行所述方法。因此，这些方法的实施方式可以使用未通过添加外源荧光团修饰的天然dNTP。然而，这些鉴定不排除以下可能性：缀合至模板游离端的可观察部分本身是发荧光的。在该后一种情况下，可以通过可观察部分的荧光而不是来自单个掺入的dNTP的任何荧光来使模板长度变化可视化。
[0045] 类似地，还将理解本文所提供的测序方法能够通过检测可观察部分本身来检测核苷酸掺入(例如，如通过CMOS接触成像仪所可能的)。因此，在一些实施方式中，直接检测可观察部分，并且无需酶-介导的事件。酶促检测核苷酸掺入的实例是结合释放的无机焦磷酸的硫酸化酶和荧光素酶介导的检测的焦磷酸测序。(参见Leamon and Rothberg,Chemical Reviews,"Cramming More Sequencing Reactions onto Microreactor Chips".2006)。因此，本发明的方面被认为是非酶促法(或者作为非酶促检测核苷酸掺入)，这是因为可以在不存在酶产生的信号的情况下检测核苷酸掺入。
[0046] 在多个实施方式中，特别感兴趣的分析物是氢离子，并且具体地配置了根据本发明公开的大规模ISFET阵列来测量pH。在其它实施方式中，正在监控的化学反应可以涉及DNA合成过程，或者其它化学和/或生物过程，并且可以具体地配置chemFET阵列以测量pH或提供与目的具体化学过程有关的相关信息的一个或多个其它分析物。在多个方面，使用常规CMOS处理技术制造chemFET阵列，并且具体地配置chemFET阵列以有利于从整个阵列快速采集数据(扫描所有像素以获得相应的像素输出信号)。优选的测序系统是离子PGM系统，然而，还考虑了其它基于质子检测的测序系统。例如，焦磷酸测序系统和Illumina通过合成测序是选项。相对于分析物的检测和测量，应理解在以下更详细地讨论的多个实施方式中，通过根据本发明公开的chemFET阵列测量的一个或多个分析物可以包括提供目的化学过程(例如，多个核酸链的结合，抗体与抗原的结合等)的相关信息的任何多种化学物质。在一些方面，除了仅检测分析物的存在之外，测量一种或多种分析物的水平或浓度的能力提供了与化学过程有关的有价值的信息。在其它方面，仅检测目的分析物的存在可以提供有价值的信息。最优选的测序方法包括Ion Torrent's PGM系统的使用，即包括离子半导体测序的NGS测序方法。
[0047] 在另一个方面，本发明涉及用于测序核酸的方法，其包括将模板核酸片段化以产生多个片段化核酸，将来自多个片段化核酸的每一个的一条链单独连接至珠以产生分别具有连接其上的单链片段化核酸的多个珠，将具有连接其上的单链片段化核酸的多个珠递送到对该区域中每个传感器具有单独的反应室的chemFET阵列，并且其中仅一个珠位于每个反应室中，并且在多个室中同时进行测序反应。
[0048] 本发明考虑在相同流通池或在相同固体支持物内同时进行多个不同的测序反应。每个测序反应获得了固定在固体支持物上的一个模板的相关信息。单次试验中可以测序的模板数目将取决于模板的预期长度以及固体支持物的面积。因此，根据实施方式，可以将至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少
1000个模板固定在固体支持物上并因此同时测序。在其它实施方式中，可以同时测序100-
500、100-750、100-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000、1000-2000、
2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10000个或更多个模板。
1000个模板固定在固体支持物上并因此同时测序。在其它实施方式中，可以同时测序100-
500、100-750、100-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000、1000-2000、
2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10000个或更多个模板。
[0049] 通过将dNTP掺入到杂交至模板的新合成的核酸链来进行测序反应。新合成的链可以衍生自结合至模板的引物或衍生自可以进行聚合酶-介导的延伸的其它分子。
[0050] 在一个非限制性实例中，可以通过在允许杂交的情况下将模板与引物接触，并将模板/引物的杂交物与聚合酶接触来开始测序反应。这种接触可以在固定化至固体支持物之前、期间和/或之后发生。在一个重要的实施方式中，在固定化至固体支持物之后发生。
[0051] 一旦将引物和聚合酶结合到模板，则重复循环的试剂流入并通过流通池。当试剂流含有与直接在引物3'端的下游的模板上的核苷酸互补的核苷酸时，聚合酶将掺入dNTP。如果模板上邻接的下游位置未被相同的核苷酸(本文中称为均聚物)占据，则聚合酶将掺入相同数目的互补dNTP。当流中的dNTP与模板上下一个可用的核苷酸不互补时，这种掺入将停止。流动的dNTP的量和这种流动的时间将分别超过模板上互补碱基的数目和掺入所有可能的dNTP所需的时间。
[0052] 重要地，互补dNTP的掺入在超过一种结合引物上发生。更优选地，掺入在至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或在全部结合的引物上发生。引物的百分比可以基于模板中靶标拷贝的数目。对于一些实施方式，每个单个模板中，掺入在至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少
100个或更多个引物上发生。将理解本发明考虑在给定模板上的多个杂交引物上掺入dNTP以通过提高所发生的长度变化的幅度(无论长度增加或减少)来提高信噪比。
100个或更多个引物上发生。将理解本发明考虑在给定模板上的多个杂交引物上掺入dNTP以通过提高所发生的长度变化的幅度(无论长度增加或减少)来提高信噪比。
[0053] 作为测序反应的一部分，如果其互补核苷酸存在于模板核酸的相同位置，则dNTP将连接至(或如本文所使用的“掺入到”)新合成的链的3'端(或者就第一个掺入的dNTP来说，测序引物的3'端)。引入的dNTP的掺入将模板单链区转化为双链区，并且这种转化反映在张力作用下的模板长度的变化。通过确定和监控模板游离端的可观察部分(例如，珠)的位置，检测长度变化。因此，如果在任何给定流过后，珠位置未改变，则无dNTP掺入，并且可以推断流过的dNTP与模板中下一个可用的核苷酸不互补。如果检测了所述部分位置的变化，则流过的dNTP是互补的并且掺入到新合成的链中。dNTP可以以任何顺序流动，只要所述顺序是已知的并且优选地在整个测序试验中保持恒定。
[0054] 对于本发明的一些方面，典型的测序循环可以包括用清洗缓冲液清洗流动室(和孔)，测量连接到模板核酸末端的可观察部分的位置，在存在聚合酶的情况下将第一dNTP种类(例如，dATP)引入到流动室，测量可观察部分的位置，腺苷三磷酸双磷酸酶任选地在清洗缓冲液中流过，清洗缓冲液的流过，在存在聚合酶的情况下第二dNTP种类的引入等。该过程持续直至所有4种dNTP(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)已流过所述室并使其掺入到新合成的链中。这种4-核苷酸循环可以重复任何次数，包括(但不限于)10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000次或更多次。循环次数将取决于正在测序的靶标长度和补充反应试剂(具体地，dNTP储备溶液和清洗缓冲液)的需要。因此，可以使用本发明所述的方法确定的序列长度可以为至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、多至并且包括1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸或更多个核苷酸。
[0055] 适合的聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或其亚基，只要这些亚基能够基于模板合成新的核酸链并能够从杂交引物开始。适合的聚合酶亚基的实例是缺少3'至5'外切核酸酶活性的大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶1的Klenow片段的外切形式。其它适合的聚合酶包括T4 exo-、Therminator和Bst聚合酶。聚合酶在溶液中可以是游离的(并且可以存在于清洗和/或dNTP溶液中)或者它可以固定在固体支持物、流通池的一个或多个壁、模板或引物上。
[0056] 将理解本文所提供的测序方法具有一些应用，其包括但不限于确定核酸(或者一系列核酸，如存在于基因组中的核酸，包括哺乳动物基因组并且更具体地人基因组)的部分或完全的核苷酸序列，确定样品中是否存在核酸(如在(例如)诊断和法医学方法中可以是有用的样品)，确定核酸在序列中是否包括突变或变化(如(例如)等位变化，包括单核苷酸多态性)，确定已知核酸是否经历导致新物种产生的的突变(如可能是抗生素耐受性微生物的潜在原因)，确定基因修饰的微生物或基因工程核酸的存在，确定两种样品(如(例如)正常组织和患病组织)间是否存在遗传学差异并且存在何种遗传学差异，确定对于患有如可以通过受试者的遗传构成确定的特定病况的受试者的治疗什么治疗方案将最有效，和基因分型(例如，分析一个或多个基因位点以确定(例如)载体状态)。在这些实施方式的一些中，可以将使用本发明所述的方法确定的核苷酸序列与已知或参考序列相比较以定向所获得的序列和/或鉴定两条序列间的差异。这可以帮助鉴定遗传变化和突变。所述已知或参考序列可以是先前确定的序列(例如，由物种完整的基因组测序所产生的)。
[0057] 本文所述的方法也可以用于帮助鉴定和治疗病况。例如，所述方法可以用于鉴定与特定病况有关的序列或用于鉴定用于诊断特定病况不存在的序列。所分析的样品可以来自于任何受试者，包括人。所述病况可以是癌症或感染。
[0058] 所述方法也可以用于鉴定与对试剂的阳性反应有关的序列。所述方法可以包括使用本文所提供的一种或多种测序方法对来自多位对试剂显示出阳性反应的受试者和来自多位对试剂显示出阴性反应的受试者的DNA测序，和鉴定多位显示阳性反应的受试者中的共有序列和来自显示出阴性反应的受试者中的共有序列，并且该共有序列不存在于其它多位受试者中。优选地，所述受试者是哺乳动物，并且更优选地，是人。
[0059] 本文所述的方法可以自动化进行从而通过机器人进行测序反应。另外，得自检测器或传感器的测序数据可以输入到个人电脑、个人数字助理、移动电话、电视游戏系统或电视中，从而使用者可以远程监控测序反应的进行。
[0060] 本发明还考虑了包含进行扩增和/或测序反应所必需的多种试剂的试剂盒，以及根据本文所述方法的使用说明书。本文所提供的方法依赖于检测模板中每个靶标拷贝的单个核苷酸。分辨率极限依赖于所使用的检测系统的分辨率。
[0061] 尽管在本文中已描述和说明了一些发明性实施方式，但是本领域那些技术人员将容易地设想用于发挥功能和/或获得结果和/或本文所述的一种或多种优势的多种其它方式和/或结构，并且这些变化和/或改变中的每一个被认为在本文所述的本发明的实施方式的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将基于本发明教导内容所使用的特定用途。仅使用常规实验方法，本领域技术人员将认识或能够确定与本文所述的具体的本发明的实施方式等价的多种实施方式。因此，应理解仅通过举例的方式提供了上述实施方式，并且上述实施方式在所附权利要求及其等价形式的范围内；可以以其它方式实施除了如所具体描述和主张的之外的本发明的实施方式。本公开的发明实施方式涉及每个单独的本文所述的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法彼此不一致，则这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法中的两种或更多种的任意组合包含在本发明公开的发明范围内。
[0062] 应理解如本文所定义和使用的所有定义优先于词典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的常规含义。
[0063] 本发明的方面
[0064] 本发明提供了检测样品中包含靶标序列的核酸的存在的新方法，所述方法包括下一代测序，其中使用了系统对照，即阳性和/或阴性对照，其优选地不影响核酸检测方法的灵敏度。
[0065] 本发明基于对照核酸，也称为系统对照(SC)的使用，在诊断(以及在研究)测定中，可以将其加入(“加标”)到含有待分析样品材料的反应容器中。在所附权利要求中更详细地定义了对照。
[0066] 令人惊奇地认识到可以在基于NGS的诊断方法中使用本发明的对照核酸并且使得能够确定提取和后续NGS方法步骤，例如，核酸扩增、文库制备和测序是否能够满足可靠的质量标准，并且认识到NGS工艺流程是完全有功能的。同时，本发明的对照核酸允许监控是否发生DNA污染。作为满足强制性调控要求所需的质量控制，这些对照是理想适合的。还令人惊奇地注意到仅需要极低量的对照核酸来实现以上所列的目标。注意到这些较低量的对照核酸不会负面地影响来源于待研究样品的核酸的提取、扩增和测序反应(或NGS中的其它步骤)。
[0067] 阴性对照反应通常在单独的反应容器中进行，其中仅向该特定小瓶中加入缓冲液而不是样品。阴性对照中靶标序列的存在表明样品被污染。
[0068] 在第一个方面，本发明提供了用于靶标核酸序列-特异性基于下一代测序的诊断方法的核酸对照，其中所述核酸对照包括至少一种不同于所述靶标核酸序列的核酸对照序列。然而，有可能的是对照包括更多的核酸对照序列，其可以存在于单独的或相同的核酸分子。
[0069] 所述核酸对照序列可以来源于任何生物、微生物或其部分，例如，器官，只要所述对照序列不同于所述靶标序列所来源的生物、微生物或器官的靶标序列。例如，当分析人患者样品时，对照序列可以来源于非人来源以确保特异性鉴定并同时避免所使用的材料的任何交叉反应。
[0070] 在另一个方面，核酸对照可以选自病毒、细菌、真菌和病原体-来源的核酸，或来源于动物、植物的核酸，或来源于不同于分析是否存在所述靶标核酸序列的器官或身体部分的器官或身体部分的核酸。
[0071] 在本发明的一个方面，核酸对照选自病毒核酸，例如，来源于动物或植物病毒的核酸。核酸序列通常以排除了感染可能的方式使用，从而对于处理对照的人员或环境无风险。
[0072] 在另一个方面，所述核酸对照序列选自来源于烟草花叶病毒(TMV)的核酸。这些序列可以是野生型序列，即存在于自然界的那些，或者可以是修饰的序列，即所述序列可以含有核酸残基的突变、添加、缺失、倒位。有可能突变序列用作对照核酸，例如，当与野生型序列相比时，已修饰从而它们带有可示踪变化的TMV来源的核酸。有可能通过核酸残基的突变、添加、缺失或倒位使TMV突变。用作核酸对照的TMV核酸是适合的非人序列的实例。这些非人序列(例如，TMV核酸)的一个优势在于当靶标核酸序列来源于人时，这些序列可以用作阴性对照。
[0073] 本发明另外的方面中，所述核酸对照包括至少两种不同的核酸对照序列。这些序列可以在至少一个核酸残基中是不同的，但是还有可能修饰更多残基。
[0074] 在另一个方面，所述对照包含至少一种野生型核酸序列和所述野生型核酸序列的至少一种突变体，例如，野生型和突变型非人序列，如TMV序列。使用野生型和突变型核酸序列的混合物的一个优势在于这些混合物可以用作变体调用的参考材料并提供限定的突变率。这大大提高了根据本发明所述的方法的灵敏度。不使用参考材料时，突变率调用(靶标核酸中，例如，致癌基因中)将较不可靠。
[0075] 修饰的对照序列可以或可以不人工突变，即突变可以或可以不自然发生，只要可以在基于NGS的方法中通过测序追踪所述修饰。期望地，NGS测定结果使得能够决定核酸对照已加样到怀疑包含靶标核酸的样品中，或者在没有样品的情况下使用对照核酸，例如，在基于NGS的核酸分析中用作阴性内部对照。在后一种情况下，如在给定基于NGS的测序反应中确定的，对照序列的存在和靶标序列的不存在指示不存在来源于样品的材料或来源于任何其它来源的材料的污染，例如，从先前分析、环境等所携带的核酸。
[0076] 在本发明的一些方面，核酸对照具有单个核苷酸突变、大于1个核苷酸的突变、核酸残基的倒位、缺失或添加。
[0077] 在本发明的其它方面，提供了对照核酸的混合物。可以在靶标核酸序列-特异性基于下一代测序的诊断方法中使用所述混合物，并且所述混合物以预先确定的比例包括至少两种核酸对照。例如，如果基于NGS的诊断方法或测定针对以特定变体频率水平(例如，25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、1％或小于1％)检测变体，则混合不同的对照序列以反映这些变体频率水平。例如，当应检测5％的变体频率水平时，将1个对照核酸(例如，TMV野生型)与5％的另一种对照核酸(例如，具有1个修饰的TMV，例如，单个点突变、三个突变、倒位、缺失等)混合。95％的野生型对照核酸序列和5％的突变对照核酸的所得混合物可以用于验证基于NGS的方法能够正确检测变体频率水平。本领域技术人员知道如何准确确定变体核酸的量，即应与在本发明方法或本发明的混合物中用作对照的野生型核酸混合的变体(或突变/修饰)核酸的量。
[0078] 还提供了适合在序列-特异性基于下一代测序的诊断方法中用于检测靶标核酸的试剂盒。这些试剂盒包括如上定义的至少一种核酸对照或以上详细说明的核酸对照混合物。此外，任选地所述试剂盒可以包括用于基于下一代测序的诊断方法的其它试剂，例如，化学试剂、说明活页等。
[0079] 本文还提供了基于下一代测序的诊断方法，包括从样品和对照样品提取核酸材料。在提取之前，制备了对照样品。这些方法还包括将所提取的核酸材料进行下一代测序方法，例如，离子半导体测序。在一些方面，本文所提供的基于下一代测序的诊断方法包括对照样品，其含有添加有任何上述核酸对照或核酸对照混合物的样品材料。
[0080] 在本发明的其它方面，基于下一代测序的诊断方法旨在检测来源于感染剂或致癌基因的靶标序列的存在与否。当然，在一次NGS运行中，有可能分析不止一个靶标。此外，NGS方法可以使用得自一个或多个来源的样品，例如，一位人患者或多位人患者。还有可能使用来自一个来源的样品材料和靶标不同的核酸序列。对用作对照样品的来自一个来源的样品进行至少一次NGS-分析，即向样品中加标至少一种上述核酸对照或本发明的混合物。当使用来自不止一个来源的样品时或者如果相对于不同靶标分析来自一个来源的样品，则对于每个来源，可以存在对照，或者对于每个靶标，可以存在对照。
[0081] 因此，根据本发明所述的基于下一代测序的诊断方法使得能够检测和分析来源于感染剂或致癌基因的靶标序列的存在与否。测序反应后，核酸对照序列的存在指示了从样品中成功实现的核酸提取。
[0082] 如以上所指出的，本发明所述的基于下一代测序的诊断方法还可以包括污染对照，即阴性对照。出于该目的，对未加入到样品材料中的对照核酸进行NGS工艺流程。污染对照包括如上定义的至少一种核酸对照或如上定义的核酸对照混合物。基于下一代测序的诊断方法包括对污染对照进行靶标核酸特异性测序反应，其中污染对照中靶标核酸特异性序列检测的不存在和对照核酸特异性序列存在的检测指示不存在污染。
[0083] 在本发明的一些实施方式中，所述样品是临床样品，其中所述临床样品优选地来自人受试者。优选地，所述临床样品是组织样品或体液样品。所述样品可以(例如)是从呼吸道、胃肠道或移植后的移植物获得的组织样品。此外，所述样品可以具体地为体液样品，其选自血液、血浆、血清、淋巴液和唾液。
[0084] 在另一个优选的实施方式中，所述靶标核酸可以是来自微生物的核酸。优选地，所述微生物选自细菌、古细菌、原生动物、真菌和病毒。在特别优选的实施方式中，所述微生物为细菌，其选自A群链球菌，包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti)和田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)的结核分枝杆菌复合群成员，肠沙门氏菌种(Salmonella enterica spp.)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，万古霉素耐受性肠球菌(Vancomycin-resistant enterococcus)和二甲氧苯青霉素耐受性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。在另一个特别优选的实施方式中，所述微生物是病毒，其选自腺病毒、流感病毒、家禽流行性感冒A(H7N9)病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、诺瓦克病毒、BK病毒、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、HIV-1、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和基孔肯亚病毒。
[0085] 在一些实施方式中，所述靶标核酸可以是致癌基因，优选地人致癌基因，例如，选自下列的致癌基因：主要BCR-ABL、次要BCR-ABL、BCR-AML1ETO、PML-RARA、BRAF V600突变体、KRAS突变体、NRAS突变体、EGFR、KIT或PIK3CA。在本发明的实施方式中，因此本发明所述的方法可以用于检测样品中一种或多种致癌基因的存在。
[0086] 本发明的对照核酸可以在基于NGS的诊断方法中以允许特异性检测和/或预期检测水平的量使用。样品反应中对照的存在不应负面影响结果的结局。这意味着就足够质量和/或足够数量的靶标核酸而言，不应存在可以导致对结果的错误理解的对照核酸对提取、扩增和测序或任何其它NGS方法步骤的干扰。
[0087] 根据就变体频率(vf)而言的特异性靶标序列所需的灵敏度，选择本发明的对照的量。例如，当期望检测5％的变体频率(vf)时，可以使用5fg的本发明的系统对照(用5％的变体频率构建)来提供对靶标大于1000倍的覆盖度。如果所需的灵敏度改变为1％vf，则有可能使用20fg的本发明的对照(用1％变体频率构建)来提供靶标序列的10000倍的覆盖度。0.1-1000fg，优选地，0.1-100fg，更优选地，1.0-50.0fg、1.0-25fg，更优选地，1.0-10.0fg，例如，5fg的对照核酸存在于NGS反应中可以是足够的。例如，可以将约100fg至1000fg加入到样品中。然而，根据靶标材料的来源，可以调整正确的量。出于此目的，可以对来自不同来源的参考材料或已物理处理以类似于所需来源材料的材料进行对照核酸的量的滴定分析以确定每个具体测定中所需的适合的量。例如，从植物材料或动物组织提取核酸可能需要不同的预处理。根据来自不同来源的核酸的预期得率或损失，对照材料的定量输入可以是不同的。
[0089] 图1提供了根据本发明的发明性NGS方法的总览。A，在该示意图中进行的八个反应。在第一反应孔(1)中，仅加入阳性系统对照(SC)，即该反应不含任何样品材料。反应孔(2至8)含有FFPE样品材料和加标SC。还显示了在自动化工艺流程中使用的装置。在B和C中，显示了测序反应的结果。尽管根据需要检测了孔(1)和(2至8)中的阳性对照和加标对照SC序列，但是孔(1)中不存在靶标序列。另一方面，成功完成了孔(2)至(8)中的FFPE样品中存在的致癌基因的测序反应。孔(1)中使用的系统对照是包含野生型非人核酸序列的质粒和包含所述非人核酸序列中的突变的质粒的混合物。混合质粒，以便突变以5％的变体频率存在，并且其余的由包含野生型非人核酸序列的质粒组成。作为FFPE参考材料，细胞系得自Horizon Discovery Ltd.,UK。对这些细胞系进行工程设计以具有以限定的变体频率(2-33％)存在的已知突变。
[0090] 图2显示了带条码的NGS运行的结果，所述运行包含每个PCR(AmpliSeq)反应中加入10、5、1、0.5、0.25和0.1fg SC的FFPE-DNA，以及在自动化工艺流程开始时以100fg SC加标到样品中的类似的DNA样品。A，SC覆盖度相对于在AmpliSeq(Life technologies)之前(手动)加入到每个测序反应中的SC的已知量的柱状图。在工艺流程开始时，用于该测试部分的FFPE DNA不可用SC加标。所得的SC覆盖度与加入到每个AmpliSeq反应中的SC的水平成正比。B，SC覆盖度相对于SC水平的图显示了SC覆盖度和SC水平之间的线性关系。在本发明中，用样品中所有扩增子的平均覆盖度归一化SC覆盖度。通过内插法(红色虚线)，在提取步骤开始时以100fg的SC加标的FFPE样品将产生与AmpliSeq反应中加入5fg的SC的样品相当的SC覆盖度。该测试表明在自动化工艺流程之后可以回收SC，并且可以估计它在测序反应中的水平。因此，SC可以用作加标对照。(注意除SC外，用于该测序运行的所有样品具有相匹配的DNA输入)。
[0091] 图3显示了如以上图2中所述的相同加条型码的运行。本文所示的柱状图是靶标扩增子的平均覆盖度相对于加入每个样品的不同SC水平的图。本发明中，SC从0.1提高至10fg不抑制样品中的平均覆盖度，其显示在这些水平(0.1至10fg)，SC不会不利地影响靶标扩增子的扩增。
[0092] 图4显示了具有固定的SC(每个AmpliSeq反应加入5fg)和不同的DNA输入(0.1-5ng)的实验。本发明中，SC覆盖度与平均靶标覆盖度成反比。将未归一化和归一化的SC覆盖度对DNA输入作图(分别为A和B)。数据显示SC水平根据样品中DNA输入而改变，并因此作为低DNA输入的检查点可以是有用的。
[0093] 图5显示了仅含SC的阴性对照孔(孔#1)。该数据表明SC作为阳性对照和阴性对照(NTC)的有用性。A.检测了SC的序列，但是未检测人靶标序列的序列。B，在下一代测序后，回收了SC中的所有三个突变。SC的扩增子表示为EC_pUC97。
[0094] 图6包括表1，其显示了作为NGS的质量(QC)概念参与系统对照(SC)的使用的逻辑表。成功的测序运行需要每个样品中加标的SC的序列回收，以及孔(1)中SC(独立的SC)的序列回收。另外，不应对孔(1)中的人靶标进行序列谱图绘制。以这种方法，孔(1)用作运行的外部、整体阳性对照以及非模板对照(NTC)两者。加标SC用作每个样品的提取和样品中阳性对照。对于成功的样品，预期能够成功检测预期的靶标扩增子。无法回收孔(1)中的SC表明了工艺流程的严重失败，并且将认为运行是无效的。即使成功测序，靶标扩增子也可能不可靠。对于不能产生靶标扩增子但是通过了孔(1)中独立SC的标准的样品，加标SC的存在表明工艺流程运行，但是样品具有不足量的可扩增的DNA。加标的不存在表明样品中抑制剂的存在。
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