解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及其菌剂
阅读：36发布：2020-05-08
专利汇可以提供解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及其菌剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了解 淀粉 芽胞杆菌在防治 烟草 白粉病 和烟草黑胫病中的应用，所述解淀粉芽胞杆菌的拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，菌株号为Ba33，其在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No:4127。本发明利用Ba33菌株制备的菌剂对烟草白粉病和烟草黑胫病的防效分别为84.73％和68.43％，相比现有 农药 ，防效显著，使用成本低、绿色安全。，下面是解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及其菌剂专利的具体信息内容。
1.解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用，所述解淀粉芽胞杆菌的拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，菌株号为Ba33，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No:4127。
2.一种含解淀粉芽胞杆菌的菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌的菌株号为Ba33，保藏号为CGMCC No:4127。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括所述解淀粉芽胞杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌在所述菌剂中的活菌数含量在108cfu/mL以上。
5.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌在所述菌剂中的活菌数含量在1010cfu/g以上。
6.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂还包括吐温20，所述吐温20的体积占所述菌剂总体积的0.8％-1.5％。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述吐温20的体积占所述菌剂总体积的
1％。
8.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌与大豆面、增稠剂混合后再加入填料和分散剂，按质量比，所述解淀粉芽胞杆菌与大豆面、增稠剂混合物为4-
6％，所述填料为80-90％，所述分散剂为6-15％。
9.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述填料为白炭黑。
10.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述分散剂为甲基纤维素。
解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及
其菌剂
技术领域
背景技术
[0002] 烟草是农业扶贫的重要支柱产业之一。由二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC)侵染引起的白粉病是烟草主要的叶部病害。烟草白粉病在我国云南、湖北、福建、广东、广西、贵州、重庆及陕西均有发生，在温暖潮湿的华南、西南烟区时有暴发流行。由烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)侵染引起的黑胫病是烤烟栽培中的主要土传病害。烟草黑胫病在国内各烟区常年严重发生，损失严重，已经成为制约烟草农业正常生产的重要因素。
[0003] 目前，对烟草白粉病和黑胫病的防治，仍然以化学防治为主。生物防治因其安全绿色而日益被重视。目前利用各种生防微生物控制烟草黑胫病已被广泛报道，例如防治黑胫病的枯草芽胞杆菌和木霉菌。而防治白粉病的生防微生物研究较少。在国家提出减肥减药的双减政策下，发掘新的生防资源并研发高效生物农药是防治烟草白粉病和黑胫病的重要途径之一。
[0004] 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba33菌株是一种对烟草花叶病毒有拮抗作用的生防细菌。本发明人在近期的研究中首次发现Ba33菌株的发酵产物对烟草黑胫病菌和白粉病菌具有抑制作用；而该细菌对烟草黑胫病菌和白粉病菌的生防活性尚未报道。因此，针对上述问题，有必要提出进一步地解决方案。
发明内容
[0005] 本发明旨在提供解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及其菌剂，以克服现有技术中存在的不足。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007] 解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用，所述解淀粉芽胞杆菌的拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，菌株号为Ba33，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No:4127。
[0008] 一种含解淀粉芽胞杆菌的菌剂，所述解淀粉芽胞杆菌的菌株号为Ba33，保藏号为CGMCC No:4127。
[0009] 优选地，所述菌剂包括所述解淀粉芽胞杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。
[0010] 优选地，所述解淀粉芽胞杆菌在所述菌剂中的活菌数含量在108cfu/mL以上。
[0011] 优选地，所述解淀粉芽胞杆菌在所述菌剂中的活菌数含量在1010cfu/g以上。
[0012] 优选地，所述菌剂还包括吐温20，所述吐温20的体积占所述菌剂总体积的0.8％-1.5％。
[0013] 优选地，所述吐温20的体积占所述菌剂总体积的1％。
[0015] 优选地，所述解淀粉芽胞杆菌与大豆面、增稠剂混合物为5％，所述填料为85％，所述分散剂为10％。
[0016] 优选地，所述填料为白炭黑。
[0019] 图1为Ba33发酵产物对烟草白粉病菌的控制效果图(药前)；
[0020] 图2为Ba33发酵产物对烟草白粉病菌的控制效果图(药后)；
[0021] 图3为Ba33发酵产物对烟草黑胫病菌的抑菌效果图。
具体实施方式
[0022] 参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0023] 连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
[0024] 当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0025] 单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0026] 说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
[0027] 此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
[0028] 本发明人采用细菌传统分离方法，从烤烟土壤中获得了一株解淀粉芽胞杆菌，(Bacillus amyloliquefaciens)Ba33菌株，Ba33菌株已于2010年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No:4127。
[0029] Bacillus amyloliquefaciens Ba33菌株为革兰氏阳性菌，在LB培养基上形成有粘性的、乳白色、圆形菌落；显微镜下可见两端钝圆的圆杆状细胞。利用生理生化特性和16S rDNA序列比对(细菌通用引物，F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反义引物，R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’测定菌株的16S rDNA-PCR产物的序列，在NCBI数据库中进行相似性搜索)来鉴定菌株。鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
[0030] 1.本发明中Ba33菌株的发酵培养及菌剂制备
[0031] Ba33菌株的活化及液体种子培养：将该菌株的斜面菌种划线转接到LA固体培养基平板上，28℃下培养1d活化菌株。挑取单菌落接种到含LB液体培养基的三角瓶中，28℃，150rpm条件下摇床培养2d获得液体种子。
[0033] Ba33液剂的制备：经发酵罐发酵72h的菌液于8000rpm离心15min去菌体，为发酵产物。添加0.8-1.5％体积的表面活性剂吐温20，本实施例中添加量为1％体积，制成Ba33液剂。需保证Ba33菌株在菌剂中的活菌数含量在108cfu/mL以上。
[0034] Ba33可湿性粉剂的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的大豆面、增稠剂混合增稠后为活菌体，再加入填料白炭黑、分散保护剂甲基纤维素(本实施例中配比：菌体5％，白炭黑85％，甲基纤维素10％)，搅拌混匀，在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。一般解淀粉芽胞杆菌与大豆面、增稠剂混合物为4-6％，填料为80-90％，分散剂为6-15％即可，当然填料还可采用高岭土、滑石粉、硅藻土、碳酸钙、钾长石或膨润土，分散剂还可以采用聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、K12(十二烷基硫酸钠)
10
或LAS(十二烷基苯磺酸钠)。需保证Ba33菌株在菌剂中的活菌数含量在10 cfu/g以上。
10
或LAS(十二烷基苯磺酸钠)。需保证Ba33菌株在菌剂中的活菌数含量在10 cfu/g以上。
[0035] 2.本发明的供试病原菌培养
[0036] 本发明的供试病原菌有：白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)为人工气候室和温室7-8月温暖湿润(22-26℃，相对湿度70-80％)时自然发病；黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)为中国农业科学院烟草研究所保存，按微生物常规培养方法制备。
[0037] 3.本发明Ba33发酵产物对烟草白粉病和黑胫病菌的抑菌试验
[0038] 对烟草白粉病的室内生物测定试验：采用喷雾法测定发酵产物对白粉病的室内控制效果。对发生白粉病的5-7叶期幼苗喷施发酵产物，以不喷施为对照处理。每处理6株重复，每株喷施全部发病叶片，2-3d调查控制效果。
[0039] 对烟草黑胫病菌的抑菌试验：发酵产物过0.22μm滤膜除菌后，采用对峙平板法测定对黑胫病菌的拮抗作用。无菌条件下，在燕麦平板中央接种直径为5mm病原菌菌饼，28℃培养2-3d后，取直径为3mm的无菌滤纸片，放置在距离菌饼四周1.5cm处，吸取50μL发酵上清滴于滤纸片上，以滴加同体积的无菌水为对照处理。设置4皿重复，28℃培养4-5d，测量病原菌接种点到沿平板边缘辐射生长的距离R1，沿拮抗菌方向辐射生长的距离R2，计算病原菌径向生长抑制率。
[0040]
[0041] 由图1观察到：对发生白粉病的幼苗，喷施生防菌Ba33发酵产物后48h，叶面上白粉菌菌丝显著被抑制，不喷施的对照处理其白粉病情显著上升(图1、图2)。此外，培养6-8d时，对照平板中黑胫病菌菌丝已长满平板，而生防菌Ba33发酵产物处理的平板，病原菌菌丝沿拮抗菌方向产生明显的抑菌圈，显示对黑胫病菌菌丝生长具有明显的抑制作用(图3)。
[0042] 由表1可知，叶面喷施生防菌Ba33发酵产物，对白粉病的控制效果达100％。发酵产物对黑胫病菌的菌丝生长抑制率达到56.9％，显示对黑胫病病菌具有一定的抑制效果；
[0043] 表1 Ba33对黑胫病菌抑菌活性及对白粉病的控制效果
[0044] Table 1 Antimicrobial activity of Ba33 to suppress the growth of Phytophthora parasitica var.nicotianae and Erysiphe cichoracearum.
[0045]
[0046] 4.本发明Ba33菌剂对烟草白粉病和黑胫病的防效试验
[0047] 供试药剂：Ba33液剂/粉剂，活菌数含量为108-1010cfu/g，按本发明上述方法制备；30％氟菌唑可湿性粉剂(日本曹达株式会社)5000倍液为白粉病对照药剂；1％申嗪霉素悬浮剂(贵州遵义泉通化工有限公司)500倍液为黑胫病对照药剂。
[0048] 药效试验方法：将Ba33液剂用水稀释15倍，菌量约为106-108cfu/mL，采用叶面喷雾法进行温室白粉病防治试验。在发病初期第一次施药，间隔7-10天，再喷药一次。每处理设置4次重复，每重复15株，喷雾均匀。
[0049] 将Ba33粉剂用水稀释50倍，菌量约为106-108cfu/g(现制配现用)，采用茎基部喷淋法进行黑胫病的预防试验。普通烟NC89移栽时第一次施药，间隔7-10天，再喷淋一次。每处理设置4次重复，每重复15株，每株50mL。
[0050] 于末次施药后10d调查一次病情，每处理调查全部烟株。按GB/T23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》进行病害分级，白粉病以叶片为单位调查，黑胫病以株为单位调查。
[0052]
[0053]
[0054] 试验结果：从表2能够看出，Ba33液剂对烟草白粉病的防治效果为84.73％，略低于对照药剂30％氟菌唑可湿性粉剂5000倍液的防效90.09％。Ba33粉剂对烟草黑胫病的预防效果为68.43％，略高于对照药剂1％申嗪霉素悬浮剂500倍液的防效67.70％。
[0055] 表2各处理对烟草黑胫病和白粉病的田间预防效果
[0056] Table 2 The inhibition effect on tobacco black shank and powdery mildew in fields
[0057]
[0058] 综上所述，利用Ba33菌株制备的菌剂，能有效防治烟草白粉病和黑胫病，且具有使用成本低和绿色安全的特点。
[0059] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
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