延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用
阅读：331发布：2020-05-08
专利汇可以提供延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 分子 生物 学领域，具体涉及一个延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其应用。EjFRI基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码 蛋白质 的 氨 基酸序列，如SEQ ID No.2所示。本发明的EjFRI基因在 烟草 叶片 中瞬时表达， 定位 于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的转录因子。该基因在枇杷叶芽中的表达量最高，而在花芽中的表达量较低。通过花序浸染法将EjFRI基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达。结果显示，野生型拟南芥中过量表达EjFRI基因，能显著延迟拟南芥开花时间。利用EjFRI基因过表达载体获得的转基因植物材料，能使显著延迟植物的开花时间，进而延迟植物的结果时间，可用于植物晚花晚熟品种的定向选育，具有良好的应用前景。，下面是延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用专利的具体信息内容。
1.枇杷EjFRI蛋白，其为：
1)由SEQ EjFRI ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的枇杷EjFRI基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
7.权利要求2或3所述基因在调控被子植物开花时间的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述EjFRI基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，能延迟植物的开花结果。
9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。
10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其花芽分化和开花时间显著延迟。
延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用
技术领域
背景技术
[0002] 枇杷是亚热带和热带地区重要的常绿果树，在我国的经济生产中扮演着重要角色。在枇杷生产中，其果实货架期较短，成为制约枇杷产业发展的重要制约因素。目前，在四川攀枝花地区十一月份，枇杷果实就可上市，在广州地区三月份左右可上市，而在重庆地区四五月份可上市。目前的调查表明，不同枇杷的花期多变，且花期较长，进而为枇杷不同成熟时期的果实品种选育提供了基础。因此，开展枇杷花期调控研究，进而指导枇杷晚熟品种的生产实践，对实现枇杷周年生产具有重要意义。
[0003] 在模式植物拟南芥中，FRI基因编码抑制开花的转录因子，在调控开花网络中扮演重要角色。目前，FRI基因的功能研究仅限于拟南芥等模式植物，具有抑制开花时间的作用。但是，其他被子植物仅对FRI同源基因进行了预测，并未对这些基因序列的准确性进行验证，也尚未对功能进行研究和报道。因此，开展其他被子植物，特别是果树中的FRI同源基因序列、表达和功能进行分析，对拓展人们对FRI基因的认知具有重要作用。因此，本发明对延迟枇杷花期调控基因EjFRI的分子调控机制进行研究，有助于综合了解蔷薇科植物的开花过程，并为枇杷晚熟品种的选育提供基础。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供枇杷EjFRI蛋白及其编码基因与应用。
[0005] 首先，本发明提供枇杷EjFRI蛋白，其为：
[0007] 2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
[0008] 本发明还提供编码所述的枇杷EjFRI蛋白的基因。
[0009] 所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
[0010] 本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
[0011] 本发明还提供所述基因在调控被子植物开花时间中的用途。
[0012] 本发明从枇杷花芽中分离了1个枇杷花发育调控密切相关的EjFRI基因，发现其定位于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的转录因子。通过实时荧光定量PCR证实了EjFRI基因在枇杷不同器官中的表达量具有显著差异，其中在叶芽中表达量最高，而在花芽中的表达量较低，表明EjFRI基因的表达量具有延迟枇杷花芽分化时间的作用。利用基因工程手段构建了EjFRI基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能延迟拟南芥开花时间，进而延迟结果时间。本发明为被子植物花期的改造提供了很好的应用前景。附图说明
[0013] 图1是实施例1枇杷EjFRI基因的3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，A是3'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，3R1为3'RACE第1步PCR产物，3R2为3'RACE第2步PCR产物(箭头所示)；B是5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，5R1为5'RACE第1步PCR产物，5R2为5'RACE第2步PCR产物(箭头所示)；C为EjFRI基因ORF验证的PCR电泳照片，M为DL2000 DNA marker，1为EjFRI基因ORF的PCR产物；箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。
[0014] 图2是枇杷花期调控相关EjFRI基因编码区的cDNA核苷酸序列图。
[0015] 图3是枇杷EjFRI编码蛋白质的氨基酸序列与预测的月季、草莓、苦瓜、水稻和玉米的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性。
[0016] 图4是枇杷EjFRI基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF的合并后的图像。
[0017] 图5是枇杷EjFRI基因在枇杷不同器官的表达显示出显著差异。S代表茎；L代表叶片；LB代表叶芽；FB代表花芽；F代表花。
[0018] 图6是构建的EjFRI基因过表达载体的酶切验证图。其中，左边为DL15000 DNA marker，右边是EjFRI过表达载体pBI121-EjFRI的双酶切验证电泳图。
[0019] 图7是转基因拟南芥植株的PCR鉴定。其中M是为DL2000 DNA marker，1-22是EjFRI基因的转基因拟南芥株系，W是野生型拟南芥，P是pBI121-EjFRI转基因载体。
[0020] 图8是转基因前后的野生型拟南芥的开花时间照片和EjFRI基因表达分析。其中，A和B是与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFRI基因能导致转基因拟南芥开花时间延迟10天左右；C是转基因拟南芥的EjFRI基因表达量；D是转基因拟南芥内源的FRI基因表达量。
具体实施方式
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0022] 实施例1枇杷EjFRI基因cDNA序列的克隆
[0023] 枇杷花芽总RNA的提取
[0024] 采集新鲜长度约0.5cm的枇杷分化期的花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用。采用RNA提取试剂盒提取枇杷花芽中的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出收集的花芽材料，放入预先冷冻并且加有1mL RLT裂解液和100μL PLANTaid的研钵中，在室温条件下，充分研磨；将上述研磨液转移至1.5mL的eppendorf离心管中，13000rpm离心10min后，吸取500μL上清液，转移至新的1.5mL离心管；向上清液中加入250μL无水酒精，吸打混匀后，加入吸附柱中，然后将吸附柱放入收集管；向吸附柱中加入500μL去蛋白液，13000rpm离心1min后；加入500μL漂洗液，13000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液，再次重复一次加入漂洗液并13000rpm离心2min；将吸附柱重新放回空收集管中，13000rpm空离心2min，去除残留的漂洗液，将吸附柱在超净工作台中放置
2min，使残留的漂洗液挥发；将吸附柱放回至空的RNase-free离心管中，加入50μL的Rnase-free H2O2，室温放置2min，接着13000rpm离心2min；再次将第一次的洗脱液再次加入到吸附柱中，再离心一次，以提高RNA浓度。吸取2μL稀释后的RNA样品，用微量核酸浓度检测仪检测RNA浓度。
2min，使残留的漂洗液挥发；将吸附柱放回至空的RNase-free离心管中，加入50μL的Rnase-free H2O2，室温放置2min，接着13000rpm离心2min；再次将第一次的洗脱液再次加入到吸附柱中，再离心一次，以提高RNA浓度。吸取2μL稀释后的RNA样品，用微量核酸浓度检测仪检测RNA浓度。
[0025] 枇杷EjFRI基因的3'RACE实验
[0026] 采用枇杷花芽总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为接头引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA。具体操作为：吸取总RNA 1μL，3'RACE Adaptor 1μL，DEPC-ddH2O4.5μL，混合均匀后，在70℃条件下，变性10min后，冰浴2min；RNA变性反应结束后，依次加入RNase inhibitor 0.25μL，10mM dNTP 1μL，5×M-MLV buffer 2μL，M-MLV 0.25μL，混合均匀后，置于42℃条件下，反应90min；接着，在70℃条件下，反应10min；冰浴
2min，然后放置在-20℃条件下，保存待用。
2min，然后放置在-20℃条件下，保存待用。
[0027] 根据NCBI网站公布的预测的玫瑰RcFRI基因(XM_024343890.1)和草莓FvFRI基因(XM_004293767.2)FRI基因序列的保守区域，直接设计3′RACE实验的上游特异性引物3REjFRI-1和3REjFRI-2，3REjFRI-1：5′-GTGCACAATGGGAGACCACCTCTA-3′和3REjFRI-2：5′-GCTCCCATGCTTTCAACAAGTATTTC-3′。以3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjFRI-1和3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行第一链PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。接着，以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物
3REjFRI-2和3'RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，进行第二链巢式PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃
10min。第二链PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。
3REjFRI-2和3'RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，进行第二链巢式PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃
10min。第二链PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。
[0028] 枇杷EjFRI基因的5'RACE实验
[0029] 根据同源基因序列，设计5′RACE实验的特异性引物5REjFRI-1和5REjFRI-2，其中5REjFRI-1：5′-TGGAGGCTGTGGATACCATGGC-3′，5REjFRI-2：5′-CTCTTCCTCTCCATAATGTGC-3′。
根据5'RACE实验操作步骤：第一链合成，首先配制Buffer Mix，即依次加入1.0μL的dNTP Mix(10mM)，2.0μL的5×First-strand Buffer，1.0μL的DTT(20mM)，混合均匀，室温放置。
根据5'RACE实验操作步骤：第一链合成，首先配制Buffer Mix，即依次加入1.0μL的dNTP Mix(10mM)，2.0μL的5×First-strand Buffer，1.0μL的DTT(20mM)，混合均匀，室温放置。
[0030] 在200μL的eppendorf管，加入1.0μL总RNA，1.0μL的5’-CDS primer A，1.75μL的H2O，混合均匀，瞬时离心后，72℃3min，冷却至42℃2min，冷却后，14000g离心10s，加入1μL的SMARTER IIA oligo，1.0μL的SMARTscrube Reverse Transcriptese(100U)，4.0μL的Buffer Mix，0.25μL的RNase inhibitor(400U/μL)，总体积10μL，混合均匀，瞬时离心后，42℃反应90min，70℃变性10min，获得control 5’-RACE-Ready cDNA。
[0031] 5'RACE扩增体系：34.5μL的PCR-Grade water，5.0μL的10×Advantage 2PCR Buffer，1.0μL的50×Advantage 2polymerase Mix，1.0μL的dNTP Mix，2.5μL的control 5’-RACE-Ready cDNA，1.0μL的5REjFRI-1引物，5.0μL的UPM(10×)。降落PCR的程序为：95℃
30s，72℃3min，5个循环；95℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，95℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min。PCR反应结束后，以第一链5'RACE的PCR反应产物为模板，使用高保真LA-taq酶，上游外侧特异性引物5REjFRI-2和UPM Primer，进行第二链PCR反应，反应程序为95℃
5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1B)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。
30s，72℃3min，5个循环；95℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，95℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min。PCR反应结束后，以第一链5'RACE的PCR反应产物为模板，使用高保真LA-taq酶，上游外侧特异性引物5REjFRI-2和UPM Primer，进行第二链PCR反应，反应程序为95℃
5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1B)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。
[0032] 在枇杷EjFRI基因序列全长两端设计引物EjFRIF:5'-ATGGGAAAGAAGAAGAAGAGAGT-3'和EjFRIR:5'-CTAAAATGCCATTCGACCAGCAAGC-3'，反应条件为94℃5min；94℃60s，56℃
60s，72℃60s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1C)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjFRI基因的编码区序列进行验证。
60s，72℃60s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1C)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjFRI基因的编码区序列进行验证。
[0033] 使用DNAMAN软件对3'RACE、5'RACE和编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列分析和拼接，得到枇杷EjFRI基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)，其序列图片见图2。
[0034] 使用primer 5软件，对枇杷EjFRI基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjFRI基因，编码蛋白质的氨基酸序列与预测的月季、草莓、苦瓜、水稻和玉米的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性(图3)。
[0035] 实施例2枇杷EjFRI基因的亚细胞定位分析
[0036] 利用软件Oligo7对EjFRI基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，LEjFRI-BamHI：5'-GGATCCATGGGAAAGAAGAAGAAGAGAGT-3'；LEjFR-SalI：5'-GTCGACAAATGCCATTCGACCAGCAAGC-3'。以测序正确的pMD18-EjFRI质粒为模板进行扩增，得到含有BamHI和SalI酶切位点的EjFRI基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶BamHI和SalI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T4 DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjFRI和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV1301感受态细胞。
[0037] 从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图4)。
[0038] 从图4中可以看出，对照组(未含EjFRI的表达载体)的烟草表皮细胞里的绿色荧光蛋白在细胞质和细胞核中均有表达；而实验组(含EjFRI基因的表达载体)在烟草表皮细胞里的绿色荧光蛋白仅在细胞核中均有表达。
[0039] 实施例3枇杷EjFRI基因的实时荧光定量PCR分析
[0040] 分别提取枇杷茎、叶、叶芽、花芽和花的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用oligo 7.0软件设计实时荧光定量PCR引物qEjFRIF:5'-GCAGCACCAGAAAGCCAAGCA-3'和qEjFRIR:5'-GTTGACTCCCTGCCATCCTTCG-3'。以枇杷actin基因为内参基因，引物为qRTEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qRTEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：在枇杷花发育过程中，EjFRI基因在枇杷不同器官中的表达具有显著性差异，在叶芽中表达量最高，而在花芽中的表达量较低(图5)，表明EjFRI基因的表达具有延迟枇杷花芽分化的作用。
[0041] 实施例4枇杷EjFRI基因的植物转基因载体pBI121-EjFRI构建
[0042] 采用PCR扩增手段，在枇杷EjFRI基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以TEjFRIF：5′-GCTCTAGAATGGGAAAGAAGAAGAAGAGAGTGG-3′(引入XbaⅠ酶切位点)和TEjFRIR：5′-CGCGGATCCCTAAAATGCCATTCGACCAGCAAG-3′(引入BamHI酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用XbaⅠ和BamHI限制性内切酶分别双酶切pMD18-EjFRI重组质粒和pBI121载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T4 DNA连接酶将双酶切后的EjFRI基因与pBI121连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体pBI121-EjFRI。将获得的pBI121-EjFRI表达载体分别使用XbaⅠ和BamHI进行双酶切验证，酶切后pBI121-EjFRI载体分别出现了pBI121载体和EjFRI基因2条带(图6)，证明EjFRI基因与pBI121载体连接成功。
[0043] 实施例5将转基因表达载体pBI121-EjFRI转入拟南芥
[0044] 取1μg的pBI121-EjFRI质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。
[0045] 将含有pBI121-EjFRI阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上，28℃，倒置培养48h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。
[0046] 将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入PBI121-EjFRI农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。
[0047] 实施例6枇杷EjFRI基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定
[0048] 收取EjFRI转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将拟南芥种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动6min；离心5000rpm，2min；倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心
5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和
0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的种子置于人工气候箱中，进行正常培养。待其长出6片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。
5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和
0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的种子置于人工气候箱中，进行正常培养。待其长出6片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。
[0049] 提取EjFRI转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。
[0050] 分别以未转基因野生型拟南芥叶片(阴性对照)和筛选后的转基因拟南芥叶片DNA为模板，同时以pBI121-EjFRI质粒作为阳性对照的模板，使用TEjFRIF和TEjFRIR作为引物，进行PCR分析，结果显示共获得22株阳性的EjFRI转基因野生型拟南芥植株(图7)。在这些转基因株系中，随机挑选了3、11和18号转基因株系进行开花时间的表型鉴定分析，对这3个代表性转基因拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照(图8A)。进一步使用实时荧光定量引物qEjFRIF和qEjFRIF，以及拟南芥FRI基因和内参基因作为对照，拟南芥actinTUB2-F：5′-ATCCGTGAAGAGTACCCAGAT-3′；TUB2-R：5′-AAGAACCATGCACTCATCAGC-3′；qRT-FRI-F1：5′-GCGTCGAAGGTGTGGTGTTAC-3′；qRT-FRI-R1：5′-ATGGCCATGCCGCCAGCGGTG-3′。以未转基因野生型拟南芥的cDNA作为对照，以3、11和18号转基因株系作为实验组进行进行EjFRI基因和内源FRI基因的表达量进行分析。
[0051] 结果显示：与野生型拟南芥相比，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFRI基因能导致转基因拟南芥开花时间延迟10天左右(图8A和B)；转基因拟南芥的EjFRI基因表达分析发现，与未转基因野生型拟南芥中相比，延迟开花的转基因拟南芥的EjFRI基因显著高表达(图8C)，而这些拟南芥自身的内源FRI基因表达量并未显著变化(图8D)。因此，结果表明：EjFRI基因表达导致拟南芥开花时间的延迟，EjFRI基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物延迟开花，进而有效延迟植物的果实成熟时间，有利于晚熟品种的选育。
[0052] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种同时检测TMV、PVY和TVBMV的速测卡及其制备、使用方法 | 2020-05-08 | 675 |
| 一种烟草中NNK和NNN的合相色谱串联质谱测定方法 | 2020-05-11 | 259 |
| 解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及其菌剂 | 2020-05-08 | 36 |
| 一种柔性备货模组、柔性模组化备货系统及工艺方法 | 2020-05-08 | 755 |
| 用于片烟的处理系统、处理方法以及制烟装置 | 2020-05-08 | 514 |
| 烟草执法证据保存箱 | 2020-05-08 | 649 |
| 一种烟草生产用进料均匀的星辊输送机 | 2020-05-08 | 271 |
| 一种用于烟草IB-F压梗机新型润湿装置 | 2020-05-08 | 272 |
| 一种基于电磁感应加热的不燃烧电子烟具 | 2020-05-08 | 701 |
| 一种昆虫诱捕器 | 2020-05-08 | 355 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
有烟烟草热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈