一种苯并异呋喃类化合物及其制备方法与应用
阅读：1032发布：2020-06-15
专利汇可以提供一种苯并异呋喃类化合物及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种苯并异呋喃类化合物及其制备方法与应用。所述的苯并异呋喃类化合物是从柄腺山扁豆中分离得到，命名为9-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-6(8H)- 酮 ，英文名为：9-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromen-6(8H)-one，其分子式为C15H16O4，为黄色胶状物，具有下述结构式： 。制备方法包括浸膏提取、 硅 胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤。应用为所述的苯并异呋喃类化合物在制备 抑菌剂 中的应用或所述的苯并异呋喃类化合物在制备抗 烟草 黑胫病 生物 农药 中的应用。，下面是一种苯并异呋喃类化合物及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种苯并异呋喃类化合物，其特征在于所述的苯并异呋喃类化合物是从柄腺山扁豆中分离得到，命名为9-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-6(8H)-酮，英文名为：9-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromen-6(8H)-one，其分子式为C15H16O4，为黄色胶状物，具有下述结构式：
。
2.一种权利要求1所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于是以柄腺山扁豆为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤，具体包括：
A、浸膏提取：将柄腺山扁豆粉碎过筛，用柄腺山扁豆重量3 10倍的有机溶剂超声提取3~
5次，每次30 60min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
~ ~
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2 8倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层~ ~
析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得
31.6min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物苯并异呋喃类化合物。
3.根据权利要求2所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过30 50目筛。
~
4.根据权利要求2所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度60 90%的丙酮、80 100%的乙醇或80 100%的甲醇。
~ ~ ~
5.根据权利要求2所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于浸膏a在经硅胶柱层析前，用浸膏a重量比1.5 3倍的有机溶剂溶解，然后用浸膏d重量0.8 1.5倍的80 100~ ~ ~
目硅胶拌样。
6.根据权利要求5所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。
7.根据权利要求2所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于C步骤中的反相C18中压液相色谱分离纯化是以21.2 mm × 250 mm、5 μm的C18色谱柱为固定相，以68%的甲醇为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为282nm，每次进样500μL，收集31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
8.根据权利要求2所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，其特征在于高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
9.一种权利要求1所述的苯并异呋喃类化合物的应用，其特征在于所述的苯并异呋喃类化合物在制备疫霉菌抑菌剂中的应用。
10.一种权利要求1所述的苯并异呋喃类化合物的应用，其特征在于所述的苯并异呋喃类化合物在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。
一种苯并异呋喃类化合物及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 柄腺山扁豆 (拉丁名：Cassia pumila Lam.) 是豆科决明属多年生亚灌木状披散草本植物，生于山地及空旷地的灌木丛或草丛中。在我国主要分布于广东、云南、广西等省的亚热带地区。在印度、中南半岛、马来西亚、澳大利亚等也有分布。决明属植物为我国民间传统药用植物，在民间有非常广泛的用途和悠久的药用历史。文献报道决明属植物的化学成分以黄酮类、蒽醌类为主，另外还有萜类、甾体、生物碱、色酮等。目前国内外对决明属植物柄腺山扁豆的化学成分的文献报到非常少，而决明属多种植物中都发现过大量结构新颖且生物活性较好的化合物。
[0003] 烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”。中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍。目前黑茎病的防治主要通过轮作栽培、品种基因改良、生物农药等方法实现防治。其中用生物农药防治是最常用且最容易实现的方法。
[0004] 基于以上考虑，我们对产自云南的柄腺山扁豆干燥全株的化学成分进行了研究，并从中分离到一个新的苯并异呋喃类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草黑茎病活性。
发明内容
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种苯并异呋喃类化合物；第二目的在于提供所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的苯并异呋喃类化合物的应用。
[0006] 本发明的第一目的是这样实现的，所述的苯并异呋喃类化合物是从柄腺山扁豆中分离得到，命名为9-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-6(8H)-酮，英文名为：9-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromen- 6(8H)-one，其分子式为C15H16O4，为黄色胶状物，具有下述结构式：
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[0007] 本发明的第二目的是这样实现的，是以柄腺山扁豆为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤，具体包括：A、浸膏提取：将柄腺山扁豆粉碎过筛，用柄腺山扁豆重量3 10倍的有机溶剂超声提取3~
5次，每次30 60min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
~ ~
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2 8倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层~ ~
析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得
31.6min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物苯并异呋喃类化合物。
5次，每次30 60min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
~ ~
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2 8倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层~ ~
析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得
31.6min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物苯并异呋喃类化合物。
[0008] 以上述方法制备的苯并异呋喃类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：+
本发明化合物为黄色胶状物；HRESI-MS 显示其准分子离子峰为283.0952 [M+Na] (计算值283.0946)，结合 1H NMR和 DEPT 谱确定其分子式为C15H16O4，不饱和度为8。红外光谱中显示了羟基 (3415 cm-1)、羰基 (1682 cm-1) 和芳环 (1614, 1556和1442 cm-1) 的共振吸收峰。而紫外光谱在 312、272和210 nm 有最大吸收也说明了化合物中存在芳环结构。化
1 13
合物的H、C 和DEPT核磁共振谱（表-1）显示其含有15个碳和16个氢，1,2,3,4,5-五取代的苯环 (C-4~C-7、C-4a和C-7a，H-7)，一个羟乙基 (-CH2CH2OH，C-6'和C-7'，H2-6' 和H2-7')，一个谐二甲基色烯环 (-CH=CH-C(CH3)2-O-，C-1'~C-5'，H-1'，H-2'和H6-4',5')，一个酯羰基 (C-1)，一个氧化的亚甲基 (C-3，H2-3)。根据化合物中的结构片段，除去苯环的不饱合度4，谐二甲基色烯环的不饱合度2, 酯羰基的不饱合度1，化合物中还应有一个环，以满足化合物的不饱合度为8。根据化合物中存在H2-3和 C-1, C-4, C-4a, C-7a，以及H-7和C-1, C-4a, C-7a (图2) 的HMBC相关，可证实化合物在C-1和C-3之间通过酯键形成了5元环，为异苯并呋喃内酯类化合物。
本发明化合物为黄色胶状物；HRESI-MS 显示其准分子离子峰为283.0952 [M+Na] (计算值283.0946)，结合 1H NMR和 DEPT 谱确定其分子式为C15H16O4，不饱和度为8。红外光谱中显示了羟基 (3415 cm-1)、羰基 (1682 cm-1) 和芳环 (1614, 1556和1442 cm-1) 的共振吸收峰。而紫外光谱在 312、272和210 nm 有最大吸收也说明了化合物中存在芳环结构。化
1 13
合物的H、C 和DEPT核磁共振谱（表-1）显示其含有15个碳和16个氢，1,2,3,4,5-五取代的苯环 (C-4~C-7、C-4a和C-7a，H-7)，一个羟乙基 (-CH2CH2OH，C-6'和C-7'，H2-6' 和H2-7')，一个谐二甲基色烯环 (-CH=CH-C(CH3)2-O-，C-1'~C-5'，H-1'，H-2'和H6-4',5')，一个酯羰基 (C-1)，一个氧化的亚甲基 (C-3，H2-3)。根据化合物中的结构片段，除去苯环的不饱合度4，谐二甲基色烯环的不饱合度2, 酯羰基的不饱合度1，化合物中还应有一个环，以满足化合物的不饱合度为8。根据化合物中存在H2-3和 C-1, C-4, C-4a, C-7a，以及H-7和C-1, C-4a, C-7a (图2) 的HMBC相关，可证实化合物在C-1和C-3之间通过酯键形成了5元环，为异苯并呋喃内酯类化合物。
[0009] 化合物中基本骨架和基团确定后，可进一步根据化合物的HMBC相关确定其取代基位置。根据H2-6'和C-4、C-5、C-4a，以及H-7'和C-4的HMBC相关，可确定羟乙基取代在C-4位；根据H-1'和 C-5、C-6、C-7；H-2'和C-6，以及H-7和C-1'的HMBC相关，可推测偕二甲基色烯环取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳连接在苯环的C-6位。至此，化合物的结构得到确定，并命名化合物为：9-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-6(8H)-酮。
[0010] 化合物的红外、紫外和质谱数据：UV (甲醇)，λmax (log ε) 312 (3.26)、272 (3.64)、210 (3.93) nm；IR (溴化钾压片)：νmax 3415、3057、2948、1682、1614、1556、1442、1368、1149、1032、932、853 cm-1；1H 和 13C NMR 数据 (500 和125 MHz, CDCl3)，见表-1；正离子模式 ESIMS m/z 283 [M+Na]+；正离子模式HRESIMS m/z 283.0952 [M+Na]+ (计算值C15H16O4，283.0946)。
[0011] 本发明的第三目的是这样实现的，所述的苯并异呋喃类化合物在制备抑菌剂中的应用。
[0012] 所述的苯并异呋喃类化合物在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。
[0013] 烟草黑茎病是由烟草疫霉菌浸染而导致的，本发明中先测定化合物的抑制疫霉菌活性。包括以下步骤：(1)燕麦片琼脂培养基的制备：燕麦片加水1000 mL, 在沸水浴上加热1 小时，纱布过滤后加水补足1000 mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉) 过滤于三角瓶中，121 ℃、15 磅灭菌20min (分钟), 取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5 mg/100 mL) , 混匀后倾倒于平皿中, 28℃培养48 小时，经检查无菌后待用。
[0014] (2)抑菌实验：取直径5 mm 的圆形滤纸, 放入培养皿中, 置于15 磅高压灭菌30 min, 烘干后分别浸入20 µM的化合物、75%乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2 mL 烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀, 将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上, 置28℃培养观察实验结果, 测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。
[0015] 测试结果表明：本发明的苯并异呋喃类化合物抑菌圈直径为16.5±1.2 mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.0 mm。说明本发明化合物的抑抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑茎病活性。
[0016] 化合物的烟草黑茎病防治效果：烟苗移栽到直径10 cm，高10 cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1) ，每盆1 株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10 g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30 ℃，黑夜28 ℃，光照∶ 黑暗 ( 12 h :12 h) ，相对湿度95%。，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20 µM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10 mL；共浇2次。，每个处理10 株，重复3 次， 14 d 后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(77.2±3.4)%，具有显著的烟草黑茎病防治效果。
[0018] (2)而且本发明化合物制备工艺简单，工业化生产容易实现，具备大规模推广应用的条件。而且化合物结构简单，采用人工合成工艺也容易实现。
[0019] (3)本发明化合物展现出良好的抗烟草黑茎病活性，本发明中苯并异呋喃类化合物抑菌圈直径为16.5±1.2 mm，化合物的抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素。实际防治效果也表明，本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(77.2±3.4)%，具有显著的烟草黑茎病防治效果。烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，本发明化合物的应用，将给烟草黑茎病防治提供高效、安全的新型生物农药分子结构。附图说明
[0020] 图1为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振碳谱；图2为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振氢谱；
图3为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振HSQC谱；
图4为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振HMBC谱；
图5为本发明苯并异呋喃类化合物的主要HMBC相关。
图3为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振HSQC谱；
图4为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振HMBC谱；
图5为本发明苯并异呋喃类化合物的主要HMBC相关。
具体实施方式
[0021] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0022] 本发明所述的苯并异呋喃类化合物是从柄腺山扁豆中分离得到，命名为9-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-6(8H)-酮，英文名为：9-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromen-6(8H)-one，其分子式为C15H16O4，为黄色胶状物，具有下述结构式：。
[0023] 本发明所述的苯并异呋喃类化合物的制备方法，是以柄腺山扁豆为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤，具体包括：A、浸膏提取：将柄腺山扁豆粉碎过筛，用柄腺山扁豆重量3 10倍的有机溶剂超声提取3~
5次，每次30 60min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
~ ~
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2 8倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层~ ~
析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得
31.6min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物苯并异呋喃类化合物。
5次，每次30 60min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
~ ~
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2 8倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层~ ~
析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，合并相同的部分；
C、高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的9:1部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得
31.6min的色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化得到目标物苯并异呋喃类化合物。
[0024] A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过30 50目筛。~
[0025] A步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度60 90%的丙酮、80 100%的乙醇或80~ ~ ~100%的甲醇。
[0026] 浸膏a在经硅胶柱层析前，用浸膏a重量比1.5 3倍的有机溶剂溶解，然后用浸膏d~重量0.8 1.5倍的80 100目硅胶拌样。
~ ~
~ ~
[0027] 所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。
[0028] C步骤中的反相C18中压液相色谱分离纯化是以21.2 mm × 250 mm、5 的C18色谱柱为固定相，以68%的甲醇为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为282nm，每次进样500 ，收集31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
[0029] 高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
[0030] 本发明所述的苯并异呋喃类化合物的应用为所述的苯并异呋喃类化合物在制备抑菌剂中的应用。
[0031] 本发明所述的苯并异呋喃类化合物的应用为所述的苯并异呋喃类化合物在制备抗烟草黑胫病生物农药中的应用。
[0032] 下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：实施例1-化合物的制备
柄腺山扁豆样品来源于云南红河。将干燥的柄腺山扁豆取样2.5 kg粉碎以95%的甲醇提取5次，每次提取45分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏165 g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用180 g的100目粗硅胶拌样，1.2 kg 的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑
1100半制备高效液相色谱分离，以68%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2 250 mm,
5 )制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为282 nm，每次进样500，收集31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
柄腺山扁豆样品来源于云南红河。将干燥的柄腺山扁豆取样2.5 kg粉碎以95%的甲醇提取5次，每次提取45分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏165 g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用180 g的100目粗硅胶拌样，1.2 kg 的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑
1100半制备高效液相色谱分离，以68%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2 250 mm,
5 )制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为282 nm，每次进样500，收集31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
[0033] 实施例2-化合物的制备柄腺山扁豆样品来源于广西百色，将干燥的柄腺山扁豆样品粉碎到30目，取样4.2 kg，以95%的乙醇提取4次，每次提取40分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏302 g。
浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用320 g的80目粗硅胶拌样，2.2 kg 的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以68%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2
250 mm, 5 )制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为282 nm，每次进样500 ，收集31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用320 g的80目粗硅胶拌样，2.2 kg 的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以68%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2
250 mm, 5 )制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为282 nm，每次进样500 ，收集31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
[0034] 实施例3-化合物的制备柄腺山扁豆样品来源于云南元江，将柄腺山扁豆取样5.8 kg粉碎，以75%的丙酮用超声提取3次，每次提取50分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏427 g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用480 g的90目粗硅胶拌样，3.2 kg 的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以68%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2 250 mm, 5 )制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样500 ，收集
31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
31.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
[0035] 实施例4-化合物结构鉴定取实施例1-3制备的化合物，通过以下方法测定化合物结构，结果如图1-5所示：
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本发明化合物为黄色胶状物；HRESI-MS 显示其准分子离子峰为283.0952 [M+Na] (计算值283.0946)，结合 1H NMR和 DEPT 谱确定其分子式为C15H16O4，不饱和度为8。红外光谱中显示了羟基 (3415 cm-1)、羰基 (1682 cm-1) 和芳环 (1614, 1556和1442 cm-1) 的共振吸收峰。而紫外光谱在 312、272和210 nm 有最大吸收也说明了化合物中存在芳环结构。化
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合物的H、C 和DEPT核磁共振谱（表-1）显示其含有15个碳和16个氢，1,2,3,4,5-五取代的苯环 (C-4~C-7、C-4a和C-7a，H-7)，一个羟乙基 (-CH2CH2OH，C-6'和C-7'，H2-6' 和H2-7')，一个谐二甲基色烯环 (-CH=CH-C(CH3)2-O-，C-1'~C-5'，H-1'，H-2'和H6-4',5')，一个酯羰基 (C-1)，一个氧化的亚甲基 (C-3，H2-3)。根据化合物中的结构片段，除去苯环的不饱合度4，谐二甲基色烯环的不饱合度2, 酯羰基的不饱合度1，化合物中还应有一个环，以满足化合物的不饱合度为8。根据化合物中存在H2-3和 C-1, C-4, C-4a, C-7a，以及H-7和C-1, C-4a, C-7a (图2) 的HMBC相关，可证实化合物在C-1和C-3之间通过酯键形成了5元环，为异苯并呋喃内酯类化合物。
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本发明化合物为黄色胶状物；HRESI-MS 显示其准分子离子峰为283.0952 [M+Na] (计算值283.0946)，结合 1H NMR和 DEPT 谱确定其分子式为C15H16O4，不饱和度为8。红外光谱中显示了羟基 (3415 cm-1)、羰基 (1682 cm-1) 和芳环 (1614, 1556和1442 cm-1) 的共振吸收峰。而紫外光谱在 312、272和210 nm 有最大吸收也说明了化合物中存在芳环结构。化
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合物的H、C 和DEPT核磁共振谱（表-1）显示其含有15个碳和16个氢，1,2,3,4,5-五取代的苯环 (C-4~C-7、C-4a和C-7a，H-7)，一个羟乙基 (-CH2CH2OH，C-6'和C-7'，H2-6' 和H2-7')，一个谐二甲基色烯环 (-CH=CH-C(CH3)2-O-，C-1'~C-5'，H-1'，H-2'和H6-4',5')，一个酯羰基 (C-1)，一个氧化的亚甲基 (C-3，H2-3)。根据化合物中的结构片段，除去苯环的不饱合度4，谐二甲基色烯环的不饱合度2, 酯羰基的不饱合度1，化合物中还应有一个环，以满足化合物的不饱合度为8。根据化合物中存在H2-3和 C-1, C-4, C-4a, C-7a，以及H-7和C-1, C-4a, C-7a (图2) 的HMBC相关，可证实化合物在C-1和C-3之间通过酯键形成了5元环，为异苯并呋喃内酯类化合物。
[0036] 化合物中基本骨架和基团确定后，可进一步根据化合物的HMBC相关确定其取代基位置。根据H2-6'和C-4、C-5、C-4a，以及H-7'和C-4的HMBC相关，可确定羟乙基取代在C-4位；根据H-1'和 C-5、C-6、C-7；H-2'和C-6，以及H-7和C-1'的HMBC相关，可推测偕二甲基色烯环取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳连接在苯环的C-6位。至此，化合物的结构得到确定，并命名化合物为：9-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-6(8H)-酮。
[0037] 实施例5-化合物抗菌活性试验取实施例1-3制备的苯并异呋喃类化合物进行抑制疫霉菌活性测试，主要包括以下步骤：
(1)燕麦片琼脂培养基的制备：燕麦片加水1000 mL, 在沸水浴上加热1 小时，纱布过滤后加水补足1000 mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉) 过滤于三角瓶中，121 ℃、15 磅灭菌20min (分钟), 取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5 mg/100 mL) , 混匀后倾倒于平皿中, 28℃培养48 小时，经检查无菌后待用。
(1)燕麦片琼脂培养基的制备：燕麦片加水1000 mL, 在沸水浴上加热1 小时，纱布过滤后加水补足1000 mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉) 过滤于三角瓶中，121 ℃、15 磅灭菌20min (分钟), 取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5 mg/100 mL) , 混匀后倾倒于平皿中, 28℃培养48 小时，经检查无菌后待用。
[0038] (2)抑菌实验：取直径5 mm 的圆形滤纸, 放入培养皿中, 置于15 磅高压灭菌30 min, 烘干后分别浸入20 µM的化合物、75%乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2 mL 烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀, 将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上, 置28℃培养观察实验结果, 测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。
[0039] 测试结果表明：本发明的苯并异呋喃类化合物抑菌圈直径为16.5±1.2 mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.0 mm。说明本发明化合物的抑抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑茎病活性。
[0040] 实施例5-化合物的烟草黑茎病防治效果实验取实施例1-3制备的苯并异呋喃类化合物进行烟草黑茎病防治效果测试，主要包括以下步骤：
烟苗移栽到直径10 cm，高10 cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1) ，每盆1 株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10 g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30 ℃，黑夜28 ℃，光照∶ 黑暗 ( 12 h :12 h) ，相对湿度95%。，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20 µM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10 mL；共浇2次。每个处理10 株，重复3 次， 14 d 后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(77.2±3.4)%，具有显著的烟草黑茎病防治效果。
烟苗移栽到直径10 cm，高10 cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1) ，每盆1 株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10 g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30 ℃，黑夜28 ℃，光照∶ 黑暗 ( 12 h :12 h) ，相对湿度95%。，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20 µM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10 mL；共浇2次。每个处理10 株，重复3 次， 14 d 后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(77.2±3.4)%，具有显著的烟草黑茎病防治效果。
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