烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法
专利汇可以提供烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 烟草 普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，属于 生物 技术领域，包括下列步骤：（1）构建普通烟草来源的Pubi.u4启动子驱动TMV-N基因表达且被Tubi.u4终止表达的烟草种内基因表达载体pSH-P-N-T；（2）将种内基因表达载体pSH-P-N-T和仅含标记基因的表达载体pSH737通过农杆菌介导法，对烟草外植体进行共转化，筛选获得T0代转化烟株；（3）通过T1代遗传分离和筛选验证，获得无标记基因的烟草普通花叶病毒（TMV）抗性的种内基因改良植株。本发明对普通烟草既实现了无标记转化，也消除了非烟草源基因序列的影响，从而更大程度上实现了转基因安全。，下面是烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法专利的具体信息内容。
1.一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，包括以下步骤：
（1）克隆烟草Ubi.u4 基因的组成型表达启动子Pubi.u4：
烟草组成型表达启动子Pubi.u4是根据基因银行登记号(Genbank Accession)：
X77456中提供的Pubi.u4启动子序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位点，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位点，用PCR方法克隆烟草Ubi.u4 基因的长度为796bp的 Pubi.u4启动子；
Pubi.u4启动子的扩增引物为：
Ubi -1：5’- CCC AAG CTT GGA GGC TAA CTA CGT TAG AGC-3’；
Ubi- 2：5’-TGC TCT AGA TCT GTA TAT ACA GAA AAG GTT-3’；
（2）人工合成终止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列:
烟草终止子Tubi.u4序列为基因银行登记号：X77456中提供的终止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位点HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI序列和基因银行登记号: HM036220登录的左右边界序列组成；
常规方法合成两端添加BamHI和EcoRI酶切位点的Tubi.u4序列，以及合成两端添加BglII酶切位点的LB-MCS-RB序列备用;
（3）克隆烟草功能基因TMV-N ：
根据基因银行登记号: EF091690登录的烟草TMV-N基因的完整序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物N-1引入KpnI 酶切位点，下游引物N-2引入SmaI酶切位点，用反转录PCR方法从普通烟草RNA中克隆3426 bp的烟草普通花叶病毒抗性基因TMV-N ；
TMV-N 基因的扩增引物为：
N-1：5’-CGG GGT ACC ATG GCA TCT TCT TCT TCT TC-3’；
N-2：5’-TCC CCC GGG TCA CCC ATT GAT GAG CTC AT-3’；
（4）构建烟草种内基因表达载体：
将克隆的Pubi.u4启动子、TMV-N 基因序列和人工合成的Tubi.u4终止子、LB-MCS-RB序列分别连接到常规载体pGEM-T easy上，构建出pGEM-P、pGEM-N、pGEM-T和pGEM-LB-RB，并转化大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序，以获得正确的Pubi.u4启动子、TMV-N基因、Tubi.u4终止子和LB-MCS-RB序列；
用BglII单酶切pSH737和pGEM-LB-RB，把回收的LB-MCS-RB小片段构建到pSH737大片段上形成pSH-LB-RB；然后用HindIII和XbaI双酶切pSH-LB-RB和pGEM-P，把回收的Pubi.u4 小片段构建到pSH-LB-RB上形成pSH-P；用BamHI和EcoRI双酶切pSH-P和pGEM-T，把回收的Tubi.u4小片段构建到pSH-P，从而获得烟草种内基因表达母载体pSH-P-T；
用KpnI 和SmaI双酶切pSH-P-T和pGEM-N，把回收的TMV-N 小片段构建到pSH-P-T形成pSH-P-N-T，从而得到由烟草组成型启动子Pubi.u4驱动烟草TMV抗性基因TMV-N 表达，由烟草终止子Tubi.u4终止基因表达的烟草TMV-N 种内基因表达载体pSH-P-N-T；
（5）共转化烟草外植体
将种内基因表达载体pSH-P-N-T与含β-葡萄糖苷酸酶基因和新霉素磷酸转移酶基因的表达载体pSH737分别用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404，分别挑取含有表达载体-1 -1
pSH-P-N-T或表达载体pSH737的农杆菌单菌落，在含100mg·L 卡那霉素和20 mg·L 利福平的常规YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液；挑选鲜嫩的烟草外植体于混合的重悬菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天-1
后转入含头孢霉素 300mg·L 的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d；每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中；
（6）子代分离筛选
移栽成活的T0代抗性转化苗切取叶片组织对β-葡萄糖苷酸酶进行染色检测，对染色呈蓝色的阳性烟株提取DNA，对嵌合序列Pubi.u4-TMV-N 的497 bp进行PCR扩增检测和测序验证，对PCR检测阳性的转基因烟株套袋留种，然后种植T1代，并对T1代继续进行GUS染色和PCR检测，最后从子代中筛选出GUS染色为阴性，但嵌合序列PCR阳性的烟株，从而获得无标记基因的烟草TMV抗性种内基因改良植株；
嵌合序列Pubi.u4-TMV-N 的PCR检测引物：
Test-1：5’-TTGATTTTGTTGTACCTGGTTGA-3’；
Test -2：5’-TCTGAGAAAACGACGATGGA-3’；
其中植物组织培养各个阶段的培养条件为：诱导、转化为暗培养；脱菌、分化、生根为-1
光培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d；重悬培养基中含有100 mg·L 乙酰丁香酮及20 -1 -1 -1 -1
g·L 蔗糖；共培养基中含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、100 mg·L 乙酰丁香酮及-1 -1 -1 -1
20g·L 蔗糖；脱菌培养基中含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、300mg·L 头孢霉素-1 -1 -1 -1
及30 g·L 蔗糖；分化培养基含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、300mg·L 头孢霉素、-1 -1 -1 -1
100mg·L 卡那霉素及30g·L 蔗糖；生根培养基中含有0.1 mg·L IAA、300 mg·L 头-1 -1
孢霉素、70mg·L 卡那霉素及20 g·L 蔗糖；除生根培养基以1/2浓度的MS（MURASHIGE & SKOOG）培养基为基础培养基外，其余培养基均以常规MS培养基为基础培养基；
1L MS培养基中包含：硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，氯化钙440mg，硫酸镁370mg，磷酸二氢钾170mg，硫酸锰22.3mg，硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，碘化钾0.83mg，钼酸钠0.25mg，乙二胺四乙酸二钠37.25mg，硫酸亚铁27.8mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg，甘氨酸2mg，PH值5.80；
1L YEP培养基中包含：蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠2.5g，PH值7.20。
烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法
技术领域
背景技术
发明内容
素和20 mg·L 利福平的常规YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液；挑选鲜嫩的烟草外植体于混合的重悬菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培-1
养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L 的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，
12~14h/d；每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中；
培养基中含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、100 mg·L 乙酰丁香酮及20g·L 蔗糖；
-1 -1 -1 -1
脱菌培养基中含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、300mg·L 头孢霉素及30 g·L 蔗-1 -1 -1 -1
糖；分化培养基含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、300mg·L 头孢霉素、100mg·L 卡-1 -1 -1 -1
那霉素及30g·L 蔗糖；生根培养基中含有0.1 mg·L IAA、300 mg·L 头孢霉素、70mg·L -1
卡那霉素及20 g·L 蔗糖。除生根培养基以1/2浓度的MS（MURASHIGE & SKOOG）培养基为基础培养基外，其余培养基均以常规MS培养基为基础培养基。
具体实施方式
0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液。
用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L 的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全。将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d。每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中。 [0057] 植物组织培养各个阶段的培养条件为：诱导、转化为暗培养；脱菌、分化、生根为-1
光培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d。重悬培养基中含有100 mg·L 乙酰丁香酮及20 -1 -1 -1 -1
g·L 蔗糖；共培养基中含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、100 mg·L 乙酰丁香酮-1 -1 -1 -1
及20g·L 蔗糖；脱菌培养基中含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、300mg·L 头孢-1 -1 -1 -1
霉素及30 g·L 蔗糖；分化培养基含有2.0mg·L 6-BA、0.2 mg·L IAA、300mg·L 头-1 -1 -1
孢霉素、100mg·L 卡那霉素及30g·L 蔗糖；生根培养基中含有0.1 mg·L IAA、300 -1 -1 -1
mg·L 头孢霉素、70mg·L 卡那霉素及20 g·L 蔗糖。除生根培养基以1/2浓度的常规MS（MURASHIGE & SKOOG）培养基为基础培养基外，其余培养基均以MS培养基为基础培养基。
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