包含无痕迹接头的持续释放递送系统
阅读：982发布：2020-05-17
专利汇可以提供包含无痕迹接头的持续释放递送系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了用于递送包含伯胺或仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮 原子 的 生物 活性剂的药物递送系统，其药学上可接受的盐；与之相关的药物递送 试剂 ；包含该药物递送系统的药物组合物；以及该药物递送系统作为持续释放 治疗 的用途。，下面是包含无痕迹接头的持续释放递送系统专利的具体信息内容。
1.一种由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
R1是氢或C1-C4烷基；
R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团和与其附接的一个或多个碳原子组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
a是0、1、2、3或4；
R3是氢或C1-C4烷基；
3a 3 3a
R 是氢、C1-C4烷基，或CRR 组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
R12是氢或C1-C4烷基；
R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
13
R 是C1-C4烷基；或
R12和R13与C(R12a)和O组合形成5、6或7元环醚；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
b是从1至10的整数；
Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
L是任选地取代的二价接头；
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
2.如权利要求1所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中D包含蛋白质、肽、多肽、核酸、寡核苷酸或多核苷酸、碳水化合物、寡糖或多糖、或小分子，其各自包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子，并且该小分子具有在100g/mol和约2000g/mol之间的分子量。
3.如权利要求1或2所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中D包含蛋白质、肽、核酸、Fab、scFv、单克隆抗体或小分子。
4.如权利要求1至3中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中D包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:5)、D3(SEQ ID NO:6)、D4(SEQ ID NO:7)、阿昔单抗、阿达木单抗、阿柏西普、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、达雷妥木单抗、迪诺舒单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、艾匹利木单抗、兰帕利珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培普拉尼、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗、或维多利珠单抗或其组合。
5.如权利要求1至3中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中D包含一种或多种生物活性肽，该一种或多种生物活性肽包括但不限于C型利尿钠肽(CNP)、心房利钠肽(ANP)、艾塞那肽-4、胰岛素、促肾上腺皮质激素、肾上腺髓质素、阿卓品、ω-漏斗网蛛毒素、刺鼠色蛋白相关蛋白、一种或多种血管紧张素、爱佩琳12、爱佩琳13、爱佩琳36、或其衍生物、缓激肽、降血钙素、可卡因和苯丙胺调节的转录物(CART)、促皮质素释放因子(CRF)、α-防御素、β-防御素、δ-睡眠诱导肽(DSIP)、弹性蛋白酶特异性抑制剂(Elafin)、内激肽、内吗啡肽、内腓呔、内皮素、艾塞那肽、纤连蛋白活性片段、甘丙肽、甘丙肽样肽、大胃泌素、胃泌素I、胃泌素相关肽、胃抑制性多肽、胃泌素释放肽、胃饥饿素、脱酰基胃饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、智利捕鸟蛛GsMTx-4、广西毒素-1E、鸟苷蛋白、肝杀菌肽1、肝杀菌肽/LEAP-1、组胺素5、人生长激素、人体肽、虎纹捕鸟蛛毒素、伊比利亚蝎毒素、帝王蝎毒素A、胰岛素样生长因子、垂体中叶素、IRL 1620、连接肽、短肤蝎毒素、基丝肽素、库特毒素、促脂解素、促脂解素、肝细胞生长因子、肝表达的抗微生物肽2、黄体生成素释放激素、胞溶素、LL-37、玛格毒素、肥大脱粒肽、肥大细胞脱粒肽、黑色素浓缩激素、促黑素细胞激素、MSH释放抑制因子、中期因子、软体动物心脏兴奋性神经肽、吗啡耐受性肽、胃动素、毒蕈碱毒素、神经内分泌调节肽-2、神经激肽A、神经激肽B、神经介肽、神经抑素-13、神经肽、神经降压素、神经毒素NSTX-3、痛稳素、痛敏肽、肥胖抑制素、阿片样肽(脑啡肽、内腓呔、BAM-12P、酪啡肽、强啡呔、内吗啡肽、新内腓呔、痛敏肽)、阿立新-A/-B、孤啡肽、骨钙素、催产素、胰抑制素、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关蛋白、肽234、肽组氨酸-甲硫氨酸、肽T、肽YY、泡蛙肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血小板因子-4、菌丝霉素、多效营养因子、前肾上腺髓质素、催乳素释放肽、狼蛛毒素1、普若毒素-1、焦谷氨酰化RF酰胺肽、肾素、RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-3、萨鲁辛-α/β、角蝰毒素、精神分裂症相关肽、青蟹毒素、促胰液素、塞松弛素、血清胸腺因子、钠钾ATP酶抑制剂-1、生长抑素、地毯海葵毒素、物质K、顶压素、顶压素相关肽、物质P、速激肽、塔兰托毒蛛SNX-482、塔兰托毒蛛ProTx-I、塔兰托毒蛛ProTx-II、托肽品、钕蝎毒素Ka、促甲状腺激素释放激素、吞噬刺激素、尿鸟苷素、尿鸟苷素异构体A或B、尿皮素、尿皮素II、尾加压素II、尾加压素II相关肽、血管活性肠肽、加压素、催产加压素、病毒复制抑制性肽、类爪蟾肽，或其组合。
6.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中D是具有分子量在约100g/mol至约
2000g/mol之间或更小的小分子，其通过伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子与R连接。
7.如权利要求6所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中该小分子包含5-(5,6,
7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
8.如权利要求1至7中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R1是氢或甲基，R1a是氢或甲基，或CR1R1a组合形成环丙-1,1-二基基团。
9.如权利要求1至8中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中变量a是
0。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R3和R3a各自是氢。
11.如权利要求1至10中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中Y是C
4 4
(O)R，并且R是C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C2烷氧基C1-C2烷基。
12.如权利要求11所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。
13.如权利要求1至10中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中Y是SiR5R6R7；
R5和R6各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且
R7是C1-C4烷基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、2-乙氧基乙氧基、2-异丙氧基-乙氧基、四氢吡喃基氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中b是2、3或4。
14.如权利要求1至13中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基或寡肽；
h是在1和20之间的整数；
g是在约2和约50之间的加权平均数；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
15.如权利要求1至13中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中Z是CHR8或NR9；
R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)-(CH2)n-Q-A、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
q在每次出现时独立地是1、2或3；
g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
m是1或0；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
10 11
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R 或R ，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
9
16.如权利要求15所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中Z是NR；
R9是C(O)-(CH2)n-Q-A或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A；
n是1至8的整数；并且
A是R10或R11。
17.如权利要求1至16中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R10是叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、取代的或未取代的C7-C12环烯基、降莰基、取代的或未取代的乙烯基羧基、取代的或未取代的乙烯基磺酰基、取代的或未取代的C2-C8烯基、氨基、硫醇、取代的或未取代的C1-C8羧基、取代的或未取代的C1-C8羰基、-O-NH2、酰肼基、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基。
18.如权利要求1至17中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R10包含适合于将具有式(I)的药物递送系统或药学上可接受的盐与载体偶联的反应性官能团。
19.如权利要求1至16中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11是可生物降解的。
20.如权利要求1至16或19中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11包含聚合物或交联的聚合物。
21.如权利要求19或20所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11包含水凝胶，该水凝胶包含一种或多种交联的聚合物。
22.如权利要求1至16和19至21中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11包含聚合物、交联的聚合物、或水凝胶，该聚合物、交联的聚合物、或水凝胶包含以下中的一种或多种：透明质酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚谷氨酸酯、聚赖氨酸、聚唾液酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚亚氨基碳酸酯、聚氨基酸、亲水性聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、右旋糖酐、琼脂糖、木聚糖、甘露聚糖、角叉菜胶、海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、白蛋白、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、壳聚糖、核酸、其衍生物、其共聚物或其组合。
23.如权利要求1至16和19至22中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11包含透明质酸、聚乙二醇、透明质酸的交联的水凝胶、聚乙二醇的交联的水凝胶或其组合。
24.如权利要求1至16和19至23中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11包含透明质酸或聚乙二醇。
25.如权利要求1至16和19至23中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中R11包含水凝胶，该水凝胶包含交联的透明质酸或交联的聚乙二醇。
26.如权利要求24或25所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中该透明质酸或聚乙二醇被至少一个官能团官能化，该官能团包含叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、C7-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、-O-NH2、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精、金刚烷基或其组合。
27.如权利要求1至16和19至26中任一项所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其
11
中R 包含含有交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含选自-NH(W1)(O(W1))d-V的至少一个侧链，其中W1是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
d是平均为0至500的数均值；并且
V是包含叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、C7-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、-O-NH2、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基的适合的官能团。
28.如权利要求27所述的药物递送系统或药学上可接受的盐，其中V是叠氮化物。
29.一种用于制备交联的载体配制品的方法，该方法包括：
(a)使载体分子R11官能化；
(b)制备反应性交联剂；以及
(c)通过在约4℃至约60℃的温度下孵育约0.5小时至约48小时，将该官能化的载体分子与该反应性交联剂反应以形成交联的载体。
30.如权利要求29所述的方法，其中该载体分子包含透明质酸或聚乙二醇。
31.如权利要求30所述的方法，其中该载体分子被叠氮化物、巯基、胺、氨氧基(O-NH2)或醛部分官能化，以提供用于交联的反应性官能团。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中该反应性交联剂的制备包括将聚乙二醇与1-((叔丁氧基羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸、3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸、1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-甲酸、2-(1-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)环丙基)乙酸、2-甲基-3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸或7-((叔丁氧基羰基)氨基)庚酸反应，并使官能化的聚乙二醇酯脱保护。
33.如权利要求32所述的方法，其中该反应性交联剂的制备进一步包括在该官能化的聚乙二醇酯的脱保护后，引入至少两个二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基基团。
34.一种交联的水凝胶，其可使用如权利要求29至33中任一项所述的方法获得。
35.如权利要求34所述的交联的水凝胶，其中该载体分子被叠氮化物官能化。
36.一种用于制备药物加合物的方法，该药物加合物包含与生物活性剂D偶联的无痕迹接头R，该方法包括：
(a)提供生物活性剂D，其包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
(b)使该生物活性剂与具有活化的羰基官能团的无痕迹接头R反应；以及
(c)从试剂中纯化该药物加合物。
37.一种药物加合物，其可使用如权利要求36所述的方法获得。
38.一种用于制备药物递送系统的方法，该方法包括：
(a)制备载体分子R11，其中R11是交联的水凝胶；任选地，步骤(a)可以进一步包括纯化该交联的水凝胶载体分子R11；
(b)单独地将无痕迹接头R与包含伯胺、仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D缀合，从而形成无痕迹接头-D加合物；步骤(b)可以任选地进一步包括纯化该无痕迹接头-D加合物，
(c)将该载体分子R11与该无痕迹接头-D加合物缀合；以及
(d)从试剂中纯化该药物递送系统。
39.一种使用如权利要求38所述的方法制备的药物递送系统。
40.一种用于治疗黄斑变性的方法，该方法包括对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，该生物活性部分包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、阿柏西普、培普拉尼、兰尼单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合；
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
R1是氢或C1-C4烷基；
R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
a是0、1、2、3或4；
R3是氢或C1-C4烷基；
R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
R12是氢或C1-C4烷基；
12a 12 12a
R 是氢或C1-C4烷基，或CR R 组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R13是C1-C4烷基；或
CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、C1-C4烷氧基或单-和二-C1-C4烷基氨基取代；
R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
b是从1至10的整数；
Z是CHR8或NR9；
R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
q在每次出现时独立地是1、2或3；
g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
m是1或0；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
41.一种用于治疗肌肉骨骼障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，该生物活性部分包含D2(SEQ ID NO:4)、D3(SEQ ID NO:5)、其他胰岛素样生长因子或其组合；
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
R1是氢或C1-C4烷基；
R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
a是0、1、2、3或4；
R3是氢或C1-C4烷基；
R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
R12是氢或C1-C4烷基；
12a 12 12a
R 是氢或C1-C4烷基，或CR R 组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R13是C1-C4烷基；或
CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、C1-C4烷氧基或单-和二-C1-C4烷基氨基取代；
R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
b是从1至10的整数；
Z是CHR8或NR9；
R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
q在每次出现时独立地是1、2或3；
g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
m是1或0；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
42.一种用于治疗心脏障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，该生物活性部分包含塞松弛素或SEQ ID NO:7；
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
R1是氢或C1-C4烷基；
R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
2 2
R在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R 基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
a是0、1、2、3或4；
R3是氢或C1-C4烷基；
3a 3 3a
R 是氢、C1-C4烷基，或CRR 组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
R12是氢或C1-C4烷基；
R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
13
R 是C1-C4烷基；或
CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、C1-C4烷氧基或单-和二-C1-C4烷基氨基取代；
R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
b是从1至10的整数；
Z是CHR8或NR9；
R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
q在每次出现时独立地是1、2或3；
g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
m是1或0；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
10
R 是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
43.一种用于治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
1
R是氢或C1-C4烷基；
R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
a是0、1、2、3或4；
R3是氢或C1-C4烷基；
R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
R12是氢或C1-C4烷基；
R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R13是C1-C4烷基；或
CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、C1-C4烷氧基或单-和二-C1-C4烷基氨基取代；
R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
b是从1至10的整数；
Z是CHR8或NR9；
R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
q在每次出现时独立地是1、2或3；
g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
m是1或0；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
10 11
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R 或R ，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
44.一种用于延长生物活性部分D的半衰期的方法，该生物活性部分D包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子，该方法包括将D附接至R，由式(I)表示，其中R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
R1是氢或C1-C4烷基；
R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
a是0、1、2、3或4；
R3是氢或C1-C4烷基；
R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
R12是氢或C1-C4烷基；
R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
R13是C1-C4烷基；或
CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、C1-C4烷氧基或单-和二-C1-C4烷基氨基取代；
R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
b是从1至10的整数；
Z是CHR8或NR9；
R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
q在每次出现时独立地是1、2或3；
g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
m是1或0；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
R11是载体。
45.一种包含式(III)的药物递送系统：
其中布洛赛珠单抗包含SEQ ID NO:4；R4是CH3-、CH3-O-CH2-、CH3CH2-或(CH3)2CH-；并且载体包含透明质酸、聚乙二醇、其水凝胶、其交联的水凝胶，或其组合。
46.一种包含式(IV)的药物递送系统：
其中D2包含SEQ ID NO:5，D3包含SEQ ID NO:6；R4是CH3-、CH3-O-CH2-、CH3CH2-或(CH3)
2CH-；并且载体包含透明质酸、聚乙二醇、其水凝胶、其交联的水凝胶，或其组合。
47.一种包含D-R-R11的药物递送系统，其中R包含与生物活性剂D偶联的无痕迹接头；D包含生物活性部分，该生物活性部分包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子；并且R11包含多个透明质酸聚合物，其各自包含随机系列的未官能化的D-葡糖醛酸单体、一个或多个被交联剂官能化的D-葡糖醛酸单体、或一个或多个被药物加合物D-R官能化的D-葡糖醛酸单体。
48.如权利要求44所述的方法，其中D包含布洛赛珠单抗D1(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:5)、D3(SEQ ID NO:6)、D4(SEQ ID NO:7)、塞松弛素、阿柏西普、培普拉尼、兰尼单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
49.一种由式(XXIV)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
50.一种由式(XXV)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
51.一种由式(XXVI)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
52.一种由式(XXVII)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
53.一种由式(XXVIII)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
54.一种由式(XXIX)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
55.一种由式(XXX)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
56.一种由式(XXXI)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
Y是C(O)R4；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
Z是N-L-A；
L是C(O)CH2CH2NH；
A是R11；
R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[3-(((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]。
57.一种由式(XXXII)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
58.一种由式XXXIII表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
Y是C(O)R4；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
Z是N-L-A；
L是C(O)CH2CH2NH；
A是R11；
R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[1-((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)氨基-环丙烷-1-甲酸酯]。
59.一种由式(XXXIV)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
60.一种由式XXXV表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
Y是C(O)R4；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
Z是N-L-A；
L是C(O)CH2CH2NH；
A是R11；
R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[1-((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)哌啶-4-甲酸酯]。
61.一种由式(XXXVI)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
62.一种由式XXXVII表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
Y是C(O)R4；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
Z是N-L-A；
L是C(O)CH2CH2NH；
A是R11；
R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[7-(((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)氨基)庚酸酯]。
63.一种由式(XXXVIII)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
64.一种由式(XXXIX)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且
R是适合于释放生物活性部分D的接头：
其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
4
Y是C(O)R；
R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
Z是N-L-A；
L是C(O)CH2CH2NH；
A是R11；
R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[2-甲基-3-(((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]。
65.如权利要求55至64中任一项所述的药物递送系统，其中D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。
66.如权利要求55至64中任一项所述的药物递送系统，其中D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
67.一种载体组合物或其药学上可接受的盐，由下式表示：
其中
L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基或寡肽；
h是在1和20之间的整数；
g是在约2和约50之间的加权平均数；
W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；并且
4
R是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代。
68.如权利要求67所述的载体组合物，其具有下式中的一种：
包含无痕迹接头的持续释放递送系统
技术领域
[0001] 本文描述了用于递送包含伯胺或仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的药物递送系统，其药学上可接受的盐；与之相关的药物递送试剂；包含该药物递送系统的药物组合物；以及该药物递送系统作为持续释放治疗的用途。
背景技术
[0002] 药物在体内的物理化学或药代动力学特性的调节可能会受到药物与载体缀合的影响。特别地，药物与载体的缀合经常被用作增加作用的治疗持续时间，降低施用后药物的最大浓度，或将药物局部递送至所希望的组织或区室，或这些目的的组合。通常，药物递送系统中的载体是(a)以非共价方式使用，其中将药物物理化学配制成溶剂-载体混合物，或(b)通过将载体试剂与药物中存在的官能团共价附接而连接。
[0003] 非共价方法需要高效的药物包封以防止药物的不受控制的突释，该突释可能发生在载体-药物系统的初次施用时发生或在向受试者施用后载体降解期间发生。抑制未结合的水溶性药物分子的扩散需要强烈的范德华接触，通常通过以下来介导：疏水部分、氢键合、或通过带电部分介导的静电结合。许多构象敏感的药物，例如蛋白质、肽或抗体，在包封过程中和/或在包封的药物的后续存储过程中会变得功能失调。
[0004] 可替代地，可以经由稳定的接头或经由可逆的接头部分(从其释放药物)将药物与载体共价缀合。如果药物与载体稳定地连接，则这种缀合物需要表现出足够的残余活性以具有药物作用，并且缀合物始终处于活性形式。
[0005] 如果药物通过可切割的接头与载体缀合，此类缀合物通常被称为载体连接的药物。可以将该方法应用于来自低分子量有机分子、天然产物、抗体及其类似物、蛋白质、肽等的各种类型和大小的生物活性分子。对载体连接的药物的重要考虑因素是用于从载体释放药物的机制。释放机理可以是酶促的、pH依赖性的或通过自主水解。通常，药物释放是容易控制的并且难以长时间维持。
[0007] 本文描述了包含生物活性分子、载体和无痕迹接头(其提供了用于将生物活性分子与载体连接的手段)的药物递送系统，包含药物递送系统的药物组合物，以及将药物递送系统作为持续释放治疗的用途。
[0008] 本文所述的一个实施例是由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0009]
[0010] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0011] R1是氢或C1-C4烷基；
[0012] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0014] a是0、1、2、3或4；
[0015] R3是氢或C1-C4烷基；
[0016] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0017] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0018] R12是氢或C1-C4烷基；
[0019] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0020] R13是C1-C4烷基；或
[0021] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0022] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0023] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0024] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0025] b是从1至10的整数；
[0026] Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0027] L是任选地取代的二价接头；
[0028] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0029] R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
[0030] R11是载体。
[0031] 在一方面，D包含蛋白质、肽、多肽、核酸、寡核苷酸或多核苷酸、碳水化合物、寡糖或多糖、或小分子，其各自包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子，并且该小分子具有在100g/mol和约2000g/mol之间的分子量。
[0032] 在另一个方面，D包含蛋白质、肽、核酸、Fab、scFv、单克隆抗体或小分子。在另一个方面，D包含布洛赛珠单抗(brolucizumab)(D1)(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:5)、D3(SEQ ID NO:6)、D4(SEQ ID NO:7)、阿昔单抗、阿达木单抗、阿柏西普、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、达雷妥木单抗、迪诺舒单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、艾匹利木单抗、兰帕利珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培普拉尼(pegpleranib)、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗、或维多利珠单抗或其组合。在另一个方面，D包含一种或多种生物活性肽，包括但不限于C型利尿钠肽(CNP)、心房利钠肽(ANP)、艾塞那肽-4、胰岛素、促肾上腺皮质激素、肾上腺髓质素、阿卓品(adropin)、ω-漏斗网蛛毒素、刺鼠色蛋白相关蛋白、一种或多种血管紧张素、爱佩琳(apelin)12、爱佩琳13、爱佩琳36、或其衍生物、缓激肽、降血钙素、可卡因和苯丙胺调节的转录物(CART)、促皮质素释放因子(CRF)、α-防御素、β-防御素、δ-睡眠诱导肽(DSIP)、弹性蛋白酶特异性抑制剂(Elafin)、内激肽(endokinin)、内吗啡肽、内腓呔、内皮素、艾塞那肽、纤连蛋白活性片段、甘丙肽、甘丙肽样肽、大胃泌素、胃泌素I、胃泌素相关肽、胃抑制性多肽、胃泌素释放肽、胃饥饿素、脱酰基胃饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、智利捕鸟蛛
(Grammostola spatulata)GsMTx-4、广西毒素(guangxitoxin)-1E、鸟苷蛋白、肝杀菌肽1、肝杀菌肽/LEAP-1、组胺素5、人生长激素、人体肽(humanin)、虎纹捕鸟蛛毒素、伊比利亚蝎毒素(iberiotoxin)、帝王蝎毒素(imperatoxin)A、胰岛素样生长因子、垂体中叶素、IRL
1620、连接肽、短肤蝎毒素、基丝肽素(kisspeptin)、库特毒素(kurtoxin)、促脂解素、促脂解素、肝细胞生长因子、肝表达的抗微生物肽2、黄体生成素释放激素、胞溶素(lysenin)、LL-37、玛格毒素、肥大脱粒肽、肥大细胞脱粒肽、黑色素浓缩激素、促黑素细胞激素、MSH释放抑制因子、中期因子、软体动物心脏兴奋性神经肽、吗啡耐受性肽、胃动素、毒蕈碱毒素、神经内分泌调节肽-2、神经激肽A、神经激肽B、神经介肽、神经抑素-13(neuronostatin-
13)、神经肽、神经降压素、神经毒素NSTX-3、痛稳素、痛敏肽、肥胖抑制素、阿片样肽(脑啡肽、内腓呔、BAM-12P、酪啡肽、强啡呔、内吗啡肽、新内腓呔、痛敏肽)、阿立新-A/-B、孤啡肽、骨钙素(osteocalci)、催产素、胰抑制素、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关蛋白、肽234、肽组氨酸-甲硫氨酸、肽T、肽YY、泡蛙肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血小板因子-4、菌丝霉素(plectasin)、多效营养因子(pleiotrophin)、前肾上腺髓质素、催乳素释放肽、狼蛛毒素(psalmotoxin)1、普若毒素(purotoxin)-1、焦谷氨酰化RF酰胺肽、肾素、RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-3、萨鲁辛(salusin)-α/β、角蝰毒素(sarafotoxin)、精神分裂症相关肽、青蟹毒素(scyllatoxin)、促胰液素、塞松弛素、血清胸腺因子、钠钾ATP酶抑制剂-1、生长抑素、地毯海葵毒素、物质K、顶压素、顶压素相关肽、物质P、速激肽、塔兰托毒蛛SNX-482、塔兰托毒蛛ProTx-I、塔兰托毒蛛ProTx-II、托肽品(tertiapin)、钕蝎毒素(tityustoxin)Ka、促甲状腺激素释放激素、吞噬刺激素、尿鸟苷素、尿鸟苷素异构体A或B、尿皮素、尿皮素II、尾加压素II、尾加压素II相关肽、血管活性肠肽、加压素、催产加压素、病毒复制抑制性肽、类爪蟾肽(xenin)，或其组合。
(Grammostola spatulata)GsMTx-4、广西毒素(guangxitoxin)-1E、鸟苷蛋白、肝杀菌肽1、肝杀菌肽/LEAP-1、组胺素5、人生长激素、人体肽(humanin)、虎纹捕鸟蛛毒素、伊比利亚蝎毒素(iberiotoxin)、帝王蝎毒素(imperatoxin)A、胰岛素样生长因子、垂体中叶素、IRL
1620、连接肽、短肤蝎毒素、基丝肽素(kisspeptin)、库特毒素(kurtoxin)、促脂解素、促脂解素、肝细胞生长因子、肝表达的抗微生物肽2、黄体生成素释放激素、胞溶素(lysenin)、LL-37、玛格毒素、肥大脱粒肽、肥大细胞脱粒肽、黑色素浓缩激素、促黑素细胞激素、MSH释放抑制因子、中期因子、软体动物心脏兴奋性神经肽、吗啡耐受性肽、胃动素、毒蕈碱毒素、神经内分泌调节肽-2、神经激肽A、神经激肽B、神经介肽、神经抑素-13(neuronostatin-
13)、神经肽、神经降压素、神经毒素NSTX-3、痛稳素、痛敏肽、肥胖抑制素、阿片样肽(脑啡肽、内腓呔、BAM-12P、酪啡肽、强啡呔、内吗啡肽、新内腓呔、痛敏肽)、阿立新-A/-B、孤啡肽、骨钙素(osteocalci)、催产素、胰抑制素、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关蛋白、肽234、肽组氨酸-甲硫氨酸、肽T、肽YY、泡蛙肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血小板因子-4、菌丝霉素(plectasin)、多效营养因子(pleiotrophin)、前肾上腺髓质素、催乳素释放肽、狼蛛毒素(psalmotoxin)1、普若毒素(purotoxin)-1、焦谷氨酰化RF酰胺肽、肾素、RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-3、萨鲁辛(salusin)-α/β、角蝰毒素(sarafotoxin)、精神分裂症相关肽、青蟹毒素(scyllatoxin)、促胰液素、塞松弛素、血清胸腺因子、钠钾ATP酶抑制剂-1、生长抑素、地毯海葵毒素、物质K、顶压素、顶压素相关肽、物质P、速激肽、塔兰托毒蛛SNX-482、塔兰托毒蛛ProTx-I、塔兰托毒蛛ProTx-II、托肽品(tertiapin)、钕蝎毒素(tityustoxin)Ka、促甲状腺激素释放激素、吞噬刺激素、尿鸟苷素、尿鸟苷素异构体A或B、尿皮素、尿皮素II、尾加压素II、尾加压素II相关肽、血管活性肠肽、加压素、催产加压素、病毒复制抑制性肽、类爪蟾肽(xenin)，或其组合。
[0033] 在另一个方面，D是具有分子量在约100g/mol至约2000g/mol之间或更小的小分子，其通过伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子与R连接。
[0034] 在另一个方面，该小分子包含5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
[0035] 在另一个方面，R1是氢或甲基，R1a是氢或甲基，或CR1R1a，组合形成环丙-1,1-二基基团。在另一个方面，R3和R3a各自是氢。在另一个方面，X是O。在另一个方面，Y是C(O)R4，并4 4
且R是C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C2烷氧基C1-C2烷基。在另一个方面，R是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。在另一个方面，Y是SiR5R6R7；R5和R6各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且R7是C1-C4烷基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、2-乙氧基乙氧基、2-异丙氧基-乙氧基、四氢吡喃基氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中b是2、3或4。
且R是C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C2烷氧基C1-C2烷基。在另一个方面，R是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。在另一个方面，Y是SiR5R6R7；R5和R6各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且R7是C1-C4烷基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、2-乙氧基乙氧基、2-异丙氧基-乙氧基、四氢吡喃基氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中b是2、3或4。
[0036] 在另一个方面，Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0037] L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
[0038] Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
[0039] Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基、寡肽；
[0040] h是在1和20之间的整数；
[0041] g是在约2和约50之间的加权平均数；
[0042] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0043] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0044] R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
[0045] R11是载体。
[0046] 在另一个方面，Z是NR9；R9是C(O)-(CH2)n-Q-A或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A；n是1至8的整数；并且A是R10或R11。在另一个方面，R10是叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、取代的或未取代的C7-C12环烯基、降莰基、取代的或未取代的乙烯基羧基、取代的或未取代的乙烯基磺酰基、取代的或未取代的C2-C8烯基、氨基、硫醇、取代的或未取代的C1-C8羧基、取代的或未取代的C1-C8羰基、-O-NH2、酰肼基、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基。在另一个方面，R10包含适合于将式(I)与载体偶联的反应性官
11 11
能团。在另一个方面，R 是可生物降解的。在另一个方面，R 包含聚合物或交联的聚合物。
在另一个方面，R11包含水凝胶，该水凝胶含有一种或多种交联的聚合物。在另一个方面，R11包含聚合物、交联的聚合物、或水凝胶，其包含透明质酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚谷氨酸酯、聚赖氨酸、聚唾液酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚亚氨基碳酸酯、聚氨基酸、亲水性聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、右旋糖酐、琼脂糖、木聚糖、甘露聚糖、角叉菜胶、海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、白蛋白、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、壳聚糖、核酸、其衍生物、其共聚物中的一种或多种或其组合。在另一个方面，R11包含透明质酸、聚乙二醇、透明质酸的交联的水凝胶、聚乙二醇的交联的水凝胶或其组合。在另一个方面，R11包含透明质酸或聚乙二醇。在另一个方面，R11包含水凝胶，该水凝胶含有交联的透明质酸或交联的聚乙二醇。在另一个方面，透明质酸或聚乙二醇被至少一个官能团官能化，该官能团包含叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、C7-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、-O-NH2、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪
11
基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精、金刚烷基或其组合。在另一个方面，R 包含含有交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含选自-NH(W1)(O(W1))d-V的至少一个侧链，其中W1是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；d是平均为0至
500的数均值；并且V是包含叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、C7-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、-O-NH2、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基的适合的官能团。在一方面，V是叠氮化物。
11 11
能团。在另一个方面，R 是可生物降解的。在另一个方面，R 包含聚合物或交联的聚合物。
在另一个方面，R11包含水凝胶，该水凝胶含有一种或多种交联的聚合物。在另一个方面，R11包含聚合物、交联的聚合物、或水凝胶，其包含透明质酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚谷氨酸酯、聚赖氨酸、聚唾液酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚亚氨基碳酸酯、聚氨基酸、亲水性聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、右旋糖酐、琼脂糖、木聚糖、甘露聚糖、角叉菜胶、海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、白蛋白、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、壳聚糖、核酸、其衍生物、其共聚物中的一种或多种或其组合。在另一个方面，R11包含透明质酸、聚乙二醇、透明质酸的交联的水凝胶、聚乙二醇的交联的水凝胶或其组合。在另一个方面，R11包含透明质酸或聚乙二醇。在另一个方面，R11包含水凝胶，该水凝胶含有交联的透明质酸或交联的聚乙二醇。在另一个方面，透明质酸或聚乙二醇被至少一个官能团官能化，该官能团包含叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、C7-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、-O-NH2、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪
11
基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精、金刚烷基或其组合。在另一个方面，R 包含含有交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含选自-NH(W1)(O(W1))d-V的至少一个侧链，其中W1是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；d是平均为0至
500的数均值；并且V是包含叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、C7-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、-O-NH2、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基的适合的官能团。在一方面，V是叠氮化物。
[0047] 本文所述的另一个实施例是用于制备交联的载体配制品的方法，该方法包括：(a)使载体分子R11官能化；(b)制备反应性交联剂；和(c)通过在约4℃至约60℃的温度下孵育约0.5小时至约48小时，将官能化的载体分子与反应性交联剂反应以形成交联的载体。在一方面，载体分子R11包含聚合物或交联的聚合物。在另一个方面，R11包含水凝胶，该水凝胶含有一种或多种交联的聚合物。在一方面，载体分子包含透明质酸或聚乙二醇。在另一个方面，载体分子被叠氮化物、巯基、胺、氨氧基(O-NH2)或醛部分官能化，以提供用于交联的反应性官能团。在另一个方面，反应性交联剂的制备包括将聚乙二醇与1-((叔丁氧基羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸、3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸、1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-甲酸、2-(1-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)环丙基)乙酸、2-甲基-3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸或7-
((叔丁氧基羰基)氨基)庚酸反应，并使官能化的聚乙二醇酯脱保护。在另一个方面，反应性交联剂的制备进一步包括在官能化的聚乙二醇酯的脱保护后，引入至少两个二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基基团。在另一个方面，反应性交联剂的制备进一步包括将脱保护的官能化的聚乙二醇酯与适合的一种或多种试剂反应，以引入末端反应性基团(例如，炔基、环炔基、杂环炔基、羧酸或活化的羧酸、醛或酮、氨基或氨氧基部分)，以提供用于与载体分子交联的反应性官能团。
((叔丁氧基羰基)氨基)庚酸反应，并使官能化的聚乙二醇酯脱保护。在另一个方面，反应性交联剂的制备进一步包括在官能化的聚乙二醇酯的脱保护后，引入至少两个二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基基团。在另一个方面，反应性交联剂的制备进一步包括将脱保护的官能化的聚乙二醇酯与适合的一种或多种试剂反应，以引入末端反应性基团(例如，炔基、环炔基、杂环炔基、羧酸或活化的羧酸、醛或酮、氨基或氨氧基部分)，以提供用于与载体分子交联的反应性官能团。
[0048] 本文所述的另一个实施例是使用本文所述的方法可获得的交联的水凝胶。在一方面，载体分子被叠氮化物官能化。
[0049] 本文所述的另一个实施例是用于制备药物加合物的方法，该药物加合物包括与生物活性剂D偶联的无痕迹接头R，该方法包括：(a)提供生物活性剂D，其包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；(b)使生物活性剂与具有活化的羰基官能团的无痕迹接头R反应；和(c)从试剂中纯化药物加合物。在一方面，R在如上式(I)中所定义。
[0050] 本文所述的另一个实施例是使用本文所述的方法可获得的药物加合物。
[0051] 本文所述的另一个实施例是用于制备药物递送系统的方法，该方法包括：(a)制备载体分子R11，其中R11是交联的水凝胶，然后该步骤包括用于制备该水凝胶的方法；该载体分子可以在此阶段任选地被纯化；(b)单独地将无痕迹接头R与包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D缀合，从而形成无痕迹接头-D加合物；该无痕迹接头-D加合物可以在此阶段任选地被纯化，(c)将载体分子R11与无痕迹接头-D加合物缀合；和(d)从试剂中纯化该药物递送系统。
[0052] 本文所述的另一个实施例是使用本文所述的方法可获得的药物递送系统。
[0053] 本文所述的另一个实施例是用于治疗眼障碍，例如黄斑变性(即，湿性年龄相关性黄斑变性)的方法，包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，该生物活性部分包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、阿柏西普、培普拉尼、兰尼单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-
(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-
3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合；R是适合于释放生物活性部分D的接头：
(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-
3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合；R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0054]
[0055] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0056] R1是氢或C1-C4烷基；
[0057] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0058] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0059] a是0、1、2、3或4；
[0060] R3是氢或C1-C4烷基；
[0061] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0062] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0063] R12是氢或C1-C4烷基；
[0064] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0065] R13是C1-C4烷基；或
[0066] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0067] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0068] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0069] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0070] b是从1至10的整数；
[0071] Z是CHR8或NR9；
[0072] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0073] q是1、2或3；
[0074] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0075] m是1或0；
[0076] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0077] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0078] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0079] R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
[0080] R11是载体。
[0081] 本文所述的另一个实施例是用于治疗肌肉骨骼障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，该生物活性部分包含D2(SEQ ID NO:4)、D3(SEQ ID NO:5)、其他胰岛素样生长因子或其组合；R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0082]
[0083] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0084] R1是氢或C1-C4烷基；
[0085] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0086] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0087] a是0、1、2、3或4；
[0088] R3是氢或C1-C4烷基；
[0089] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0090] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0091] R12是氢或C1-C4烷基；
[0092] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0093] R13是C1-C4烷基；或
[0094] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0095] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0096] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0097] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0098] b是从1至10的整数；
[0099] Z是CHR8或NR9；
[0100] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0101] q是1、2或3；
[0102] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0103] m是1或0；
[0104] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0105] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0106] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0107] R10是适合于将式(I)与载体偶联的反应性官能团；并且
[0108] R11是载体。
[0109] 本文所述的另一个实施例是用于治疗心脏障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，该生物活性部分包含塞松弛素或SEQ ID NO:7；R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0110]
[0111] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0112] R1是氢或C1-C4烷基；
[0113] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0114] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0115] a是0、1、2、3或4；
[0116] R3是氢或C1-C4烷基；
[0117] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0118] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0119] R12是氢或C1-C4烷基；
[0120] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0121] R13是C1-C4烷基；或
[0122] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0123] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0124] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0125] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0126] b是从1至10的整数；
[0127] Z是CHR8或NR9；
[0128] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0129] q是1、2或3；
[0130] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0131] m是1或0；
[0132] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0133] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0134] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0135] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0136] R11是载体。
[0137] 本文所述的另一个实施例是用于治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用由式(I)表示的包含缀合物D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0138]
[0139] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0140] R1是氢或C1-C4烷基；
[0141] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0142] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0143] a是0、1、2、3或4；
[0144] R3是氢或C1-C4烷基；
[0145] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0146] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0147] R12是氢或C1-C4烷基；
[0148] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0149] R13是C1-C4烷基；或
[0150] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0151] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0152] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0153] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-3
(OCHRCH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
(OCHRCH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0154] b是从1至10的整数；
[0155] Z是CHR8或NR9；
[0156] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0157] q是1、2或3；
[0158] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0159] m是1或0；
[0160] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0161] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0162] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0163] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0164] R11是载体。
[0165] 本文所述的另一个实施例是用于延长生物活性部分D的半衰期的方法，该生物活性部分D包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子，该方法包括将D附接至R，由式(I)表示，其中R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0166]
[0167] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0168] R1是氢或C1-C4烷基；
[0169] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0170] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0171] a是0、1、2、3或4；
[0172] R3是氢或C1-C4烷基；
[0173] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0174] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0175] R12是氢或C1-C4烷基；
[0176] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0177] R13是C1-C4烷基；或
[0178] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0179] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0180] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0181] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0182] b是从1至10的整数；
[0183] Z是CHR8或NR9；
[0184] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0185] q是1、2或3；
[0186] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0187] m是1或0；
[0188] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0189] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0190] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0191] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0192] R11是载体。
[0193] 本文所述的另一个实施例是包含式(III)的药物递送系统：
[0194]
[0195] 其中布洛赛珠单抗包含D1，SEQ ID NO:4；R4是CH3-、CH3-O-CH2-、CH3CH2-或(CH3)2CH-；并且载体包含透明质酸、聚乙二醇、其水凝胶、其交联的水凝胶，或其组合。
[0196] 本文所述的另一个实施例是包含式(IV)的药物递送系统：
[0197]
[0198] 其中D2包含SEQ ID NO:5，D3包含SEQ ID NO:6；R4是CH3-、CH3-O-CH2-、CH3CH2-或(CH3)2CH-；并且载体包含透明质酸、聚乙二醇、其水凝胶、其交联的水凝胶，或其组合。
[0199] 本文所述的另一个实施例是包含D-R-R11的药物递送系统，其中R包含与生物活性剂D偶联的无痕迹接头；D包含生物活性部分，该生物活性部分包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子；并且R11包含多个透明质酸单体，其各自包含随机系列的未官能化的透明质酸单体，被一个或多个交联的透明质酸单体和一个或多个药物加合物D-R官能化的透明质酸单体。在一方面，D包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:5)、D3(SEQ ID NO:6)、D4(SEQ ID NO:7)、塞松弛素、阿柏西普、培普拉尼、兰尼单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲
基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。在一方面，无痕迹接头R是如本文所述的。
基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。在一方面，无痕迹接头R是如本文所述的。
[0200] 本文所述的另一个实施例是由式(XXIV)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0201]
[0202] 本文所述的另一个实施例是由式(XXV)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0203]
[0204] 本文所述的另一个实施例是由式(XXVI)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0205]
[0206] 本文所述的另一个实施例是由式(XXVII)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0207]
[0208] 本文所述的另一个实施例是由式(XXVIII)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0209]
[0210] 本文所述的另一个实施例是由式(XXIX)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0211]
[0212] 本文所述的另一个实施例是由式(XXX)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
[0213]
[0214] 本文所述的另一个实施例是由式(XXXI)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；以及
[0215] R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0216]
[0217] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0218] Y是C(O)R4；
[0219] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0220] Z是N-L-A；
[0221] L是C(O)CH2CH2NH；
[0222] A是R11；
[0223] R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[3-(((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]。
在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0224] 本文所述的另一个实施例是由式(XXXII)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；
并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
[0225]
[0226] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0227] 本文所述的另一个实施例是由式XXXIII表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；以及
[0228] R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0229]
[0230] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0231] Y是C(O)R4；
[0232] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0233] Z是N-L-A；
[0234] L是C(O)CH2CH2NH；
[0235] A是R11；
[0236] R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[1-((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)氨基-环丙烷-1-甲酸酯]。
[0237] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0238] 本文所述的另一个实施例是由式(XXXIV)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；
并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
[0239]
[0240] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0241] 本文所述的另一个实施例是由式XXXV表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；以及
[0242] R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0243]
[0244] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0245] Y是C(O)R4；
[0246] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0247] Z是N-L-A；
[0248] L是C(O)CH2CH2NH；
[0249] A是R11；
[0250] R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[1-((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)哌啶-4-甲酸酯]。
[0251] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0252] 本文所述的另一个实施例是由式(XXXVI)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；
并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
[0253]
[0254] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0255] 本文所述的另一个实施例是由式XXXVII表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；以及
[0256] R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0257]
[0258] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0259] Y是C(O)R4；
[0260] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0261] Z是N-L-A；
[0262] L是C(O)CH2CH2NH；
[0263] A是R11；
[0264] R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[7-(((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)氨基)庚酸酯]。
[0265] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0266] 本文所述的另一个实施例是由式(XXXVIII)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：
[0267]
[0268] 在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0269] 本文所述的另一个实施例是由式(XXXIX)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；以及
[0270] R是适合于释放生物活性部分D的接头：
[0271]
[0272] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0273] Y是C(O)R4；
[0274] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0275] Z是N-L-A；
[0276] L是C(O)CH2CH2NH；
[0277] A是R11；
[0278] R11是衍生自交联的透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含N(H)(CH2CH2O)3CH2CH2N3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联-接头包含PEG(2000)-双-[2-甲基-3-(((((1’R,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基)羰基)
4
氨基)丙酸酯]。在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R 是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
4
氨基)丙酸酯]。在一方面，D是布洛赛珠单抗，并且R 是CH2CH3。在另一个方面，D是布洛赛珠单抗，并且R4是CH(CH3)CH3。
[0279] 本文所述的另一个实施例是载体系统或其药学上可接受的盐，由下式表示：
[0280]
[0281] 其中
[0282] L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
[0283] Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
[0284] Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基或寡肽；
[0285] h是在1和20之间的整数；
[0286] g是在约2和约50之间的加权平均数；
[0287] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；以及
[0289] 图1显示了药物递送系统的示意图，该药物递送系统包含通过无痕迹接头与载体缀合的药物，和释放后的药物。触发物的反应产生亲核官能团，该亲核官能团裂解将药物与药物递送系统连接的酰胺键。在该非限制性实例中，药物通过伯胺基团连接。
[0290] 图2显示了水凝胶-药物缀合物的部分化学表示，其中该水凝胶由与PEG交联的透明质酸构成，并且该药物通过具有触发物Y的无痕迹接头与水凝胶缀合。在图2中以及整个说明书中，聚合物分子(例如，透明质酸)被表示为[P]n，其中P代表单体重复单元，并且n代表单体的重复单元的平均数。对于任何给定的聚合物群，重复单元的数目是随机分布的。另外，本文所述的水凝胶或药物递送系统的独立分子的相对连接性在群内是随机的。水凝胶或药物递送系统的结构描述在二维上表示单个潜在的结构单元，而这些复合物是三维的，其中具有许多结构亚基。
[0291] 图3A显示无痕迹接头与叠氮化物-官能化的透明质酸聚合物的示例性反应。
[0292] 图3B显示无痕迹接头与叠氮化物-官能化的水凝胶的示例性反应。
[0293] 图4A(说明性实例8.1)显示布洛赛珠单抗从水凝胶缀合物的体外释放的实例。
[0294] 图4B显示了布洛赛珠单抗从水凝胶缀合物C1a、C2a、C3a和C4a的体外比较性释放。
[0295] 图5A(说明性实例8.2)显示D2从水凝胶缀合物的体外释放，比较了从无痕迹接头L1、L2和L5到PBS缓冲液中的释放。
[0296] 图5B显示了D2从水凝胶缀合物的体外释放，比较了从无痕迹接头L1、L2和L5到牛滑液(BSF)中的释放。
[0297] 图6(说明性实例8.3)显示了D4从无痕迹接头的体外释放，说明了母体的丧失，中间体的出现和随后的消失以及D4的释放。
[0298] 图7(说明性实例9.1)显示了来自在两种不同剂量水平处的布洛赛珠单抗-水凝胶的体内测试的数据。图7A显示来自兔VEGF激发模型的荧光素渗漏数据。图7B显示在来自图
7A中相同兔的液体玻璃体液中测量的布洛赛珠单抗D1的水平。
7A中相同兔的液体玻璃体液中测量的布洛赛珠单抗D1的水平。
[0299] 图8(说明性实例9.3)显示D4从水凝胶缀合物的体内释放。
[0300] 图9(说明性实例8.2)显示从水凝胶体外释放到牛滑液(每日取样)中的D2的活性。
具体实施方式
[0301] 本文描述了用于递送包含伯胺或仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的药物递送系统，其药学上可接受的盐；与之相关的药物递送试剂；包含该药物递送系统的药物组合物；以及该药物递送系统作为持续释放治疗的用途。
[0302] 如本文使用的，术语“烷基”是指直链、支链或环状碳链。除非另有说明，否则烷基碳的一个或多个氢原子可以被取代基置换。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。当分子的两个部分通过烷基基团连接时，其也称为亚烷基。如本文使用的，“低级烷基”是烷基的子集，在一些实施例中是优选的，并且是指含有从1至4个碳原子的直链或支链烃基团。低级烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。除非另有说明，否则术语“烷基”或“低级烷基”旨在包括取代的和未取代的烷基或低级烷基，并且这些基团可以被另外的有机和/或无机基团取代，包括但不限于选自以下的基团：卤素(例如，以形成卤代烷基)、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂环、杂环烷基、羟基、烷氧基(从而产生聚烷氧基，例如聚乙二醇)、烯基氧基、炔基氧基、卤代烷氧基、环烷氧基、环烷基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基氧基、杂环氧基、杂环烷基氧基、巯基、氨基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、卤代烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、杂环氨基、杂环烷基氨基、二取代的氨基、酰基氨基、酰氧基、酯、酰胺、磺酰胺、尿素、烷氧基酰基氨基、氨基酰氧基、硝基、氰基烷基-S(O)m、卤代烷基-S(O)m、烯基-S(O)n、炔基-S(O)m、环烷基-S(O)m、环烷基烷基-S(O)m、芳基-S(O)m、芳基烷基-S(O)m、杂环-S(O)m、或杂环烷基-S(O)m，其中m＝0、1、2或3。
[0303] 如本文使用的，术语“烯基”单独地或作为另一个基团的一部分，是指含有从1至10、20或30个或更多个碳原子(或在低级烯基中1至4个碳原子)的直链或支链烃，该烃在正链中包含1至4、5、或6或更多个双键。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯、2-丁烯基、4-戊烯基、3-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、2,4-庚二烯等。除非另有说明，否则术语“烯基”或“低级烯基”旨在包括取代的和未取代的烯基或低级烯基，并且这些基团可以被如上文关于烷基和低级烷基所描述的基团取代。
[0304] 如本文使用的，术语“炔基”单独地或作为另一个基团的一部分，是指含有1至10、20、30、或40个或更多个碳原子(或在低级炔基中1至4个碳原子)的直链或支链烃，该烃在正链中包含1、2、或3个或更多个三键。炔基的代表性实例包括但不限于2-丙炔基、3-丁炔基、
2-丁炔基、4-戊炔基、3-戊炔基等。除非另有说明，否则术语“炔基”或“低级炔基”旨在包括取代的和未取代的炔基或低级炔基，并且这些基团可以被与上述烷基和低级烷基相关的相同基团取代。
2-丁炔基、4-戊炔基、3-戊炔基等。除非另有说明，否则术语“炔基”或“低级炔基”旨在包括取代的和未取代的炔基或低级炔基，并且这些基团可以被与上述烷基和低级烷基相关的相同基团取代。
[0305] 如本文使用的，术语“环炔基”是指具有在6和16之间个碳原子和1、2或3个稠合或桥接的环的状烃环系统，所述环在环结构中包含至少1个或多个三键。
[0306] 如本文使用的，术语“杂环炔基”是指以下环烃环系统，该系统具有：在6和16个之间的碳原子；独立地选自氧、氮和硫的1、2、3或4个杂原子；和稠合或桥接的1、2或3个环，所述环在环结构中包含至少1个或多个三键。
[0307] 如本文使用的，术语“环烷基”单独或作为另一个基团的一部分，是指含有3、4、5、6、7或8个碳(其中的碳可以在下文所述的杂环基团中被置换)的饱和或部分不饱和的环烃基。环烷基的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。这些环可以任选地被如本文所述的另外的取代基(例如，卤素或低级烷基)取代。除非另有说明，术语“环烷基”是通用的并且旨在包括如下所述的杂环基团。
[0308] 如本文使用的，术语“杂环”或“杂环基”单独地或作为另一个基团的一部分，是指脂肪族(例如，完全或部分饱和的杂环)或芳香族(例如，杂芳基)单环或双环系统。单环系统的例子由含有独立地选自氧，氮和硫的1、2、3或4个杂原子的任何3至8元环进行示例。5元环具有从0至2个双键，并且6元环具有从0至3个双键。单环环系统的代表性实例包括但不限于氮杂环丁烷、氮杂卓、氮杂环丙烷、二氮杂卓、1,3-二氧戊环、二噁烷、二噻烷、呋喃、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、异噻唑、异噻唑啉、异噻唑烷、异噁唑、异噁唑啉、异噁唑烷、吗啉、噁二唑、噁二唑啉、噁二唑烷、噁唑、噁唑啉、噁唑烷、哌嗪、哌啶、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四嗪、四唑、噻二唑、噻二唑啉、噻二唑烷、噻唑、噻唑啉、噻唑烷、噻吩、硫代吗啉、硫代吗啉砜、噻喃、三嗪、三唑、三噻烷等。二环环系统由与如本文所述的芳基基团、如本文所述的环烷基基团、或如本文所述的另一个单环环系统稠合的任何上述单环环系统示例。二环环系统的代表性实例包括但不限于例如，苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噻二唑、苯并噻吩、苯并噁二唑、苯并噁唑、苯并呋喃、苯并吡喃、苯并噻喃、苯并二噁烷、1,3-苯并间二氧杂环戊烯、噌啉、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、萘啶、异苯并呋喃、异苯并噻吩、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡喃吡啶、喹啉、喹嗪、喹喔啉、喹唑啉、四氢异喹啉、四氢喹啉、硫代吡喃吡啶等。这些环包括其季铵化的衍生物并且可以任选地被另外的有机和/或无机基团取代，包括但不限于选自以下的基团：卤素、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂环、杂环烷基、羟基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、卤代烷氧基、环烷氧基、环烷基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基氧基、杂环氧基、杂环烷基氧基、巯基、氨基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、卤代烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、杂环氨基、杂环烷基氨基、二取代的氨基、酰基氨基、酰氧基、酯、酰胺、磺酰胺、尿素、烷氧基酰基氨基、氨基酰氧基、硝基、氰基、烷基-S(O)m卤代烷基-S(O)m、烯基-S(O)m、炔基-S(O)m、环烷基-S(O)m、环烷基烷基-S(O)m、芳基-S(O)m、芳基烷基-S(O)m、杂环-S(O)m、杂环烷基-S(O)m，其中m＝0、1、2或3。
[0309] 如本文使用的，术语“杂芳基”如关于以上杂环所描述。
[0310] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“环烷基烷基”、“环烷基烯基”和“环烷基炔基”是指分别通过如本文所述的烷基、烯基或炔基基团附加在母体分子部分的如本文所述的环烷基基团。
[0311] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“烷氧基”是指通过氧基基团-O-附加在母体分子部分上的如本文所述的烷基或低级烷基基团(并因此包括取代的形式，例如聚烷氧基)。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。在一些方面，当是更复杂的分子的一部分时，烷氧基基团包含经由醚键附接至烷基或低级烷基的烷氧基取代基。
[0312] 如本文使用的，术语“卤素(“halo”或“halogen”)”是指任何适合的卤素，包括-F、-Cl、-Br或-I。
[0313] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“酰基”是指-C(O)R’基团，其中R’是任何适合的取代基(例如，芳基、烷基、烯基、炔基、环烷基)或如本文所述的其他适合的取代基。
[0314] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“烷硫基”是指通过如本文所述的硫醇部分附加在母体分子部分上的如本文所述的烷基基团。烷硫基的代表性实例包括但不限于，甲硫基、乙硫基、叔丁硫基、己硫基等。
[0315] 如本文使用的，如本文使用的单独地或作为另一个基团一部分的术语“酰胺”、“酰胺基(amido)”或“酰胺基(amidyl)”是指-C(O)NRaRb基团，其中Ra和Rb独立地是任何适合的取代基(例如，烷基、氢、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0316] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“酯”是指-C(O)OR’基团，其中R’是任何适合的取代基(例如，烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0317] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“醚”是指-COR’基团，其中R’是任何适合的取代基(例如烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0318] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“砜”是指-S(O)(O)R’基团，其中R’是任何适合的取代基(例如，烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0319] 如本文使用的，单独地或作为另一个基团一部分的术语“磺胺”是指-S(O)2NRaRb基团，其中Ra和Rb独立地是任何适合的取代基(例如，H、烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0320] 如本文使用的，术语“羧基”是指基团-C(O)OH。
[0321] 如本文使用的，术语“羟基”是指基团-OH。
[0322] 如本文使用的，术语“氨基”是指基团-NH2。
[0323] 如本文使用的，乙烯基是指基团-CH2CH2。
[0324] 如本文使用的，术语“磺酸酯”是指基团-S(O)(O)OR’，其中R’是任何适合的取代基(例如，烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0325] 如本文使用的，术语“磺酰基”是指基团-S(O)(O)R’，其中R’是任何适合的取代基(例如，烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基)。
[0326] 如本文使用的，硫醇是指基团-SH。
[0327] 如本文使用的，氧基胺或氨氧基是指基团-ONH2。
[0328] 如本文使用的，“酰肼”或“酰肼基”是指基团-C(O)-NH-NH2。
[0329] 如本文使用的，“马来酰亚胺或马来酰亚胺基”是指具有分子式C2H2(C(O))2NH的环状化合物或具有至少一个C-C双键的基团-N(C(O))2C2H2。
[0330] 如本文使用的，呋喃是指具有四个碳原子和一个氧的五元芳香族环。
[0331] 如本文使用的，“四嗪”或“四嗪基”是指含有四个氮原子的具有分子式C2H2N4的六元芳香族环或基团-C2HN4。
[0332] 如本文使用的，术语“叠氮化物”、“叠氮基(“azidyl”或“azido”)”是指-N3基团。
[0333] 如本文使用的，术语“BCN”是指二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基基团，其中环外亚甲基相对于二环可以具有外式或内式取向，如图所示：
[0334]
[0335] 如本文使用的，整个说明书，为方便起见，大多数结构未描绘立体化学，并因此代表所有可能的立体异构体。
[0336] 特别是关于在BCN和叠氮基化合物之间的反应的三唑产物的结构，如本文使用的，在整个说明书中，为方便起见，在单个区域化学位置上示出了三唑环上的N-连接的取代基。本领域普通技术人员将认识到，BCN炔烃与叠氮基化合物的反应将导致在三唑的1位和3位具有N-连接的取代基的产物的立体异构混合物，如下所示：
[0337]
[0338] 如本文使用的，“反应性官能团”是指适合用于正交偶联反应的官能团。适合的反应性官能团是易于进行正交反应的那些。示例性和非限制性正交化学反应包括表1中所示的官能团。
[0339] 如本文使用的，“触发物”是指存在于药物无痕迹接头加合物D-R中的官能团，该官能团能够进行化学反应而产生新的官能团。新官能团的存在显著降低了药物和无痕迹接头相对物之间的键的稳定性，并导致药物释放的可能性增加。
[0340] 术语“数均分子量”或“Mn”是指样品中所有分子的统计平均分子量，以g/mol为单位表示。可以通过本领域已知的技术确定数均分子量，例如凝胶渗透色谱(其中可以基于以下已知的标准来计算Mn，这些标准基于在线检测系统，如折射率、紫外线或其他检测器)、粘度测定法、质谱、或依数法(例如，蒸气压渗透法、端基测定或质子NMR)。数均分子量由以下方程式定义，
[0341]
[0342] 其中Mi是分子的分子量，并且Ni是该分子量的分子数。
[0343] 术语“重均分子量”或“Mw”是指所有分子(在确定其对分子量平均值的贡献时考虑到每个分子的重量)的统计平均分子量，以g/mol为单位表示。给定分子的分子量越高，该分子对Mw值的贡献就越大。重均分子量可以通过本领域已知的对分子大小敏感的技术来计算，例如静态光散射、小角度中子散射、X射线散射和沉降速度。重均分子量由以下方程式定义，
[0344]
[0345] 其中‘Mi’是分子的分子量，并且‘Ni’是该分子量的分子数。
[0346] 术语“粘均分子量”或“Mv”是指所有分子(在确定其对分子量平均值的贡献时考虑到每个分子的重量)的统计平均分子量，以g/mol为单位表示。大分子或聚合物比更小分子具有更高的粘度。粘均分子量由以下方程式定义，
[0347]
[0348] 其中‘Mi’是分子的分子量，并且‘Ni’是该分子量的分子数，并且a是由分子、溶剂和温度确定的常数。柔性的聚合物分子具有的a值为0.5≤a≤0.8。半柔性聚合物分子具有a≥0.8。粘均分子量可以由特性粘度实验或尺寸排阻色谱确定。
[0349] 如本文使用的，“药物”包含一个或多个生物活性部分，该生物活性部分包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子。生物活性部分可以是小分子，大分子，例如蛋白质、肽、或核酸，或其组合。具体关于无痕迹接头R，药物或生物活性部分包含D-R表示中的“D”。术语或短语“药物”、“生物活性分子”、“生物活性部分”、“生物活性剂”、“活性剂”是指可以影响生物体的任何物理或生化特性的任何物质，包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人。特别地，药物或生物活性分子包括旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其他动物疾病，或以其他方式增强人或动物的身心健康的任何物质。如本文使用的，若干种药物自始至终被称为D1-D4。D1包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)。D2包含(SEQ ID NO:5)。D3包含(SEQ ID NO:6)。D4包含(SEQ ID NO:7)。
[0350] 如本文使用的，“包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分”是指在附接至无痕迹接头之前的游离生物活性部分或在从无痕迹接头加合物“D-R”切割后产生的游离生物活性部分“D-H”。在一些方面，药物加合物D-R可以具有生物活性。
[0351] 如本文使用的，药物或生物活性部分的“游离形式”是指例如在与无痕迹接头附接之前或在药物递送系统中从无痕迹接头释放之后，处于未经修饰的、药理学活性形式的药物。
[0352] 如本文使用的，“无痕迹接头”，R是由式(I)表示的适合于释放生物活性部分D的接头，该生物活性部分D包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子：
[0353]
[0354] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0355] R1是氢或C1-C4烷基；
[0356] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0357] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0358] a是0、1、2、3或4；
[0359] R3是氢或C1-C4烷基；
[0360] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0361] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0362] R12是氢或C1-C4烷基；
[0363] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0364] R13是C1-C4烷基；或
[0365] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0366] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0367] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0368] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-3
(OCHRCH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
(OCHRCH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0369] b是从1至10的整数；
[0370] Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0371] L是任选地取代的二价接头；
[0372] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0373] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0374] R11是载体。
[0375] 在另一个实施例中，R是由式(I)表示的适合于释放生物活性部分D的接头，该生物活性部分D包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子：
[0376]
[0377] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0378] R1是氢或C1-C4烷基；
[0379] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0380] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0381] a是0、1、2、3或4；
[0382] R3是氢或C1-C4烷基；
[0383] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0384] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0385] R12是氢或C1-C4烷基；
[0386] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0387] R13是C1-C4烷基；或
[0388] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0389] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0390] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0391] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0392] b是从1至10的整数；
[0393] Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0394] L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
[0395] Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
[0396] Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基、寡肽；
[0397] h是在1和20之间的整数；
[0398] g是在约2和约50之间的加权平均数；
[0399] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0400] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0401] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0402] R11是载体。
[0403] 在另一个实施例中，R是由式(I)表示的适合于释放生物活性部分D的接头，该生物活性部分D包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子：
[0404]
[0405] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0406] R1是氢或C1-C4烷基；
[0407] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0408] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0409] a是0、1、2、3或4；
[0410] R3是氢或C1-C4烷基；
[0411] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0412] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0413] R12是氢或C1-C4烷基；
[0414] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0415] R13是C1-C4烷基；或
[0416] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0417] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0418] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0419] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0420] b是从1至10的整数；
[0421] Z是CHR8或NR9；
[0422] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0423] q在每次出现时独立地是1、2或3；
[0424] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0425] m是1或0；
[0426] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0427] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0428] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0429] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0430] R11是载体。
[0431] 在一方面，该无痕迹接头是适合用于持续释放生物活性部分的接头。在一方面，“R”是D-R表示中的无痕迹接头，其中“D”是指包含生物活性部分的药物，该生物活性部分包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子。
[0432] 如本文使用的，“药物加合物”是与无痕迹接头R连接的药物D。具体关于无痕迹接头R，药物加合物包含“D-R”。
[0433] 如本文使用的，“载体”是可溶性聚合物、生物聚合物，或交联的聚合物或生物聚合物。载体包含蛋白质、核酸、碳水化合物或聚乙二醇。在一方面，载体或多个载体在分子间、分子内或其组合被交联。在一方面，该交联的载体包含水凝胶。具体关于无痕迹接头R，载体包含R11。在一方面，Z连接至载体，典型地是聚合物或水凝胶。载体直接地或经由非可切割的间隔子附接至无痕迹接头R。作为非限制性实例，载体可以包含能够形成水凝胶的聚乙二醇、透明质酸聚合物、或交联的透明质酸或聚乙二醇。
[0434] 如本文使用的，“聚合物”是指由通过化学键，以线性、环状、支化或树状方式或其组合连接的重复结构单元(单体)构成的分子，该分子可以是合成来源的、或生物来源的或两者的组合。通常，聚合物具有平均分子量为至少1kDa。共聚物是由至少两个化学上不同的单体构成的聚合物。通常，聚合物由具有分子量分布的分子构成。描述聚合物的分子量分布的一种方法是平均分子量。通常，聚合物由具有聚合度分布的分子构成。描述聚合物的聚合度分布的一种方式是平均聚合度。
[0435] 如本文所述的并且在本文的结构中所描绘的，聚合物分子(例如，聚乙二醇或透明质酸)被表示为[P]n，其中P表示单体重复单元，并且n表示聚合物中单体的平均聚合度。本领域普通技术人员将理解，如果n的差异为约10％或更小，则描绘的两个具有相同重复单元P、但n不同的聚合物分子被认为是等同的。对于在本文所述和在结构中描绘的透明质酸共聚物，聚合物中单体的分布是不确定的，并假定为随机的。另外，本文所述的水凝胶或药物递送系统的独立分子的相对连接性在群内是随机的。水凝胶或药物递送系统的结构描述在二维上表示单个潜在的结构单元，而这些复合物是三维的，其中具有许多结构亚基。
[0436] 如本文所述的，对于无痕迹接头-药物加合物R-D，酰胺键形成的确切位置尚不清楚。当D包含能够与接头R(例如，蛋白质)形成酰胺键的超过一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子时，就会出现这种情况。为方便起见，将加合物中尚不清楚的酰胺键形成的位置在本文中描绘如下：
[0437]
[0438] 如本文使用的，“水凝胶”是指能够吸收大量水的三维、亲水性或两亲性聚合物网络。该网络由均聚物或共聚物组成，并且由于共价化学或物理(离子、疏水性相互作用，缠结)交联的存在是不溶性的。交联提供了网络结构和物理完整性。水凝胶表现出与水的热力学相容性，从而使其在水性介质中溶胀。网络的链以以下方式连接：存在孔，并且所具有的尺寸小于孔的水溶性溶质能够在网络内外扩散。
[0439] 如本文使用的，“接头”或“非生物活性接头”是指不产生任何药理作用的接头。在一些实施例中，接头包含与生物系统相容的二价或多价有机接头。“二价”是指在聚合物的每个末端处具有适合于与无痕迹接头或药物D附接的反应性基团。“多价”是指在聚合物的每个末端处具有适合于与无痕迹接头或药物D附接的反应性基团，其中另外的反应性部分沿着接头分子散布。
[0440] 如本文使用的，“药物递送系统”包含与药物加合物D-R-R11连接的载体，其中该载体包含R11。如本文所述的药物递送系统是包含以下各项的分子缀合物：一个或多个药物D；一个或多个无痕迹接头R；以及一个或多个载体R11。在一些实施例中，可以存在与药物递送系统缀合的多个不同的药物种类。例如，两个不同的药物(例如D1和D2)，可以在单个药物递送系统中缀合。
[0441] 如本文使用的，短语“水不溶性”是指形成水凝胶的可溶胀的三维交联分子网络。如果将水凝胶悬浮在大量过量的水中或生理渗透压浓度的水性缓冲液中，则该水溶胶可能会吸收大量的水，例如，以重量/重量计多达10倍，并因此是可溶胀的，但在除去多余的水后仍保留凝胶的物理稳定性和形状。这样的形状可以具有任何几何形状，并且应当理解，这样的单个水凝胶物体应被认为是由多个组分构成的单个分子，其中每个组分通过化学键彼此连接。
[0442] 如本文使用的，“持续释放”或“持续释放速率”是指以下情况，其中为实现所希望的治疗效果的所需的各个药物递送系统的后续剂量之间的间隔被扩大。每日剂量给药的药物可以例如被转变成具有在两次施用之间间隔一周或甚至更长时间间隔的持续释放形式。
[0443] 如本文使用的，“官能团”是指分子内的表现出特定化学活性的一组原子。实例是酰胺、胺、醇、羰基、羧酸、硫醇。
[0444] 如本文使用的，“保护基团”是指以下部分，该部分在合成期间暂时保护分子的官能团，以在随后的化学反应中获得化学选择性。醇的保护基团是例如，苄基和三苯甲基；胺的保护基团是例如，叔丁基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基和苄基；并且硫醇的保护基团的实例是2,4,6-三甲氧基苄基、苯基硫甲基、乙酰胺基甲基、对甲氧基苄氧基羰基、叔丁基硫基、三苯基甲基、3-硝基-2-吡啶硫基、4-甲基三苯甲基。
[0445] 如本文使用的，“受保护的官能团”表示被一个或多个保护基团保护的官能团。
[0446] 如本文使用的，“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水。
[0447] 如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”是指保留生物活性剂的生物学效力和特性，并且通常在生物学上或其他方面不是所不希望的盐。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，生物活性剂能够形成酸和/或碱盐。
[0448] 可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、叶绿酸盐(chlortheophyllinate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、碱式水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
[0449] 可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
[0451] 可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。
[0453] 可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代的胺(包括天然存在的取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪或氨丁三醇。
[0454] 药学上可接受的盐可以通过传统化学方法从母体化合物、碱性或酸性部分合成。
[0455] 通常，此类盐可以通过将这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等)反应来制备，或通过将这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应来制备。此类反应典型地在水或有机溶剂中或在二者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，使用非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是所希望的。另外的合适的盐的列表可见于例如：“Remington's Pharmaceutical
Sciences[雷明顿药物科学]”，第18版,Mack Publishing Company[马克出版公司],Easton[伊斯顿],Pa.[宾夕法尼亚州],(1990)中以及Stahl和Wermuth的“Handbook of
Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐手册：特性、选择和使
用]”(Wiley-VCH[威利-VCH出版社],Weinheim[韦因海姆],德国,2002)中。
Sciences[雷明顿药物科学]”，第18版,Mack Publishing Company[马克出版公司],Easton[伊斯顿],Pa.[宾夕法尼亚州],(1990)中以及Stahl和Wermuth的“Handbook of
Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐手册：特性、选择和使
用]”(Wiley-VCH[威利-VCH出版社],Weinheim[韦因海姆],德国,2002)中。
[0456] 如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及类似物及其组合，如本领域技术人员将已知的(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿氏药物科学]，第18版，Mack出版公司(Mack Printing Company)，1990，第1289-1329页)。除了与活性成分不相容的常规载体外，其他常规载体均可以用于治疗或药物组合物中。
[0457] 术语生物活性剂的“治疗有效量”是指生物活性剂的以下量，该量将引起受试者的生物学或医学应答，例如症状的改善、病症的缓解、减缓或延迟疾病进展或预防疾病等。
[0458] 在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指生物活性剂的以下量，当施用至细胞、或组织、或非细胞生物材料或介质时，该量有效地至少部分治疗疾病或障碍。如本领域普通技术人员将理解的，有效的特定药剂的绝对量可以根据诸如所希望的生物学终点、待递送的药剂、靶组织等的此类因素而变化。本领域技术人员理解“治疗有效量”可以按单剂量施用或可以通过多剂量施用来实现。例如，在用于治疗心力衰竭的药剂的情况下，有效量可以是足以导致患者临床改善的量，例如增加运动耐量/能力、增加血压、减少体液滞留和/或改善对心脏功能定量测试的结果(例如射血分数，运动能力(衰竭时间)等)。
[0459] 如本文所用，术语“受试者”是指动物。典型地，该动物是哺乳动物。受试者也是指例如灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施例中，受试者为灵长类。在又其他的实施例中，受试者是人。
[0460] 如本文所用，术语“抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病状、症状或病症、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。
[0461] 如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”在一个实施例中，是指减轻疾病或障碍(即，减慢或停滞或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指预防或延迟该疾病或障碍的发病或发展或进展。如本文使用的，术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指由于施用疗法(例如，治疗剂)或施用疗法的组合(例如，治疗剂的组合)引起的受试者的障碍的一种或多种症状的复发、发作或发展的预防。
[0464] 如本文使用的，术语“约”是指包括整数和分数组分的任何值，其在由术语“约”修饰的值的多达±10％的变化内。
[0465] 术语“或”可以是连词或转折连词，使得“或”涵盖“和/或”。
[0466] 本文所述的一个实施例是包含药物和无痕迹接头的药物加合物D-R，其中R是由式(I)表示的适合于释放生物活性部分D的接头，该生物活性部分D包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子：
[0467]
[0468] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0469] R1是氢或C1-C4烷基；
[0470] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0471] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0472] a是0、1、2、3或4；
[0473] R3是氢或C1-C4烷基；
[0474] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0475] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0476] R12是氢或C1-C4烷基；
[0477] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0478] R13是C1-C4烷基；或
[0479] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0480] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0481] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0482] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0483] b是从1至10的整数；
[0484] Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0485] L是任选地取代的二价接头；
[0486] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0487] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0488] R11是载体。
[0489] 本文所述的另一个实施例是包含药物和无痕迹接头的药物加合物D-R，其中R是由式(I)表示的适合于释放生物活性部分D的接头，该生物活性部分D包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子：
[0490]
[0491] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0492] R1是氢或C1-C4烷基；
[0493] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0494] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0495] a是0、1、2、3或4；
[0496] R3是氢或C1-C4烷基；
[0497] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0498] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0499] R12是氢或C1-C4烷基；
[0500] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0501] R13是C1-C4烷基；或
[0502] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0503] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0504] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0505] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0506] b是从1至10的整数；
[0507] Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0508] L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
[0509] Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
[0510] Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基、寡肽；
[0511] h是在1和20之间的整数；
[0512] g是在约2和约50之间的加权平均数；
[0513] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0514] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0515] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0516] R11是载体。
[0517] 本文所述的另一个实施例是包含药物和无痕迹接头的药物加合物D-R，其中R是由式(I)表示的适合于释放生物活性部分D的接头，该生物活性部分D包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子：
[0518]
[0519] 其中虚线表示附接至该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子；
[0520] R1是氢或C1-C4烷基；
[0521] R1a是氢或C1-C4烷基，或CR1R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0522] R2在每次出现时独立地选自C1-C4烷基或氧代，或两个R2基团组合形成稠合的C3-C6环烷基或螺C3-C6环烷-1,1-二基基团；
[0523] a是0、1、2、3或4；
[0524] R3是氢或C1-C4烷基；
[0525] R3a是氢、C1-C4烷基，或CR3R3a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0526] Y是C(O)R4、C(O)OR4、C(O)NHR4、C(O)NR5R6、SiR5R6R7或CR12R12aOR13；
[0527] R12是氢或C1-C4烷基；
[0528] R12a是氢或C1-C4烷基，或CR12R12a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基；
[0529] R13是C1-C4烷基；或
[0530] CHR12OR13组合形成5、6或7元环醚；
[0531] R4是C1-C8烷基或C3-C7环烷基，其中环烷基任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被C1-C4烷氧基取代；
[0532] R5和R6各自独立地选自C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
[0533] R7是C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷氧基、杂环烷氧基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中该杂环烷氧基是具有选自N、O和S的一个环杂原子的4至7元饱和的杂环，并且任选地被0、1或2个独立选择的C1-C4烷基基团取代；
[0534] b是从1至10的整数；
[0535] Z是CHR8或NR9；
[0536] R8和R9各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基或-C(O)(CH2)q[O-W]g(NHC(O))m(CH2)q[O-W]p-Q-A，其中该烷基基团任选地被0或1个Q-A取代；
[0537] q在每次出现时独立地是1、2或3；
[0538] g和p各自独立地具有在约2和约50之间的加权平均长度；
[0539] m是1或0；
[0540] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0541] Q是键、O、N(H)或N(C1-C4烷基)；
[0542] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0543] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0544] R11是载体。
[0545] 在一些方面，式(I)的R1-R8具有以下含义。在一方面，R1是氢或甲基。在另一个方面，R1a是氢或甲基。在另一个方面，R1和R1a组合形成C3-C6环烷-1,1-二基。在另一个方面，R2是甲基。在另一个方面，两个R2基团组合形成稠合的或螺C3-C6环烷基基团。在另一个方面，3 3a 3 3a
R是氢或甲基。在另一个方面，R 是氢或甲基。在另一个方面，R 和R 组合形成C3-C6环烷-1,
1-二基。在另一个方面，Y是C(O)R4，并且R4是C1-C6烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基或C1-C6烷氧基。在另一个方面，R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。在另一个方面，Y是SiR5R6OR7；并且R5和R6各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且R7是乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、乙氧基乙基、乙氧基异丙基、四氢吡喃基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中b是2、3或4。
R是氢或甲基。在另一个方面，R 是氢或甲基。在另一个方面，R 和R 组合形成C3-C6环烷-1,
1-二基。在另一个方面，Y是C(O)R4，并且R4是C1-C6烷基、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基或C1-C6烷氧基。在另一个方面，R4是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。在另一个方面，Y是SiR5R6OR7；并且R5和R6各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且R7是乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、乙氧基乙基、乙氧基异丙基、四氢吡喃基或-(OCHR3CH2)bO-C1-C4烷基，其中b是2、3或4。
[0546] 在一些方面，式(I)的R8和R9具有以下含义。在一方面，R9是C(O)C2氨基甲酰基。在另一个方面，R9是C(O)C2酰胺基。在另一个方面，R9是C(O)C5烷基。在另一个方面，R9是C(O)C2烷基。在另一个方面，R9是C(O)C1烷基。在另一个方面，R9是C(O)CH2CH2NHC(O)CH2CH2CH2CH2。在另一个方面，R9是C(O)(CH2CH2O)bCH2CH2，其中b是1、2、3或4。在另一个方面，R9是酰胺基。
在另一个方面，R9是氨基甲酰基。在另一个方面，R9是C1烷基酰胺基。在另一个方面，R9是C2烷基酰胺基。
在另一个方面，R9是氨基甲酰基。在另一个方面，R9是C1烷基酰胺基。在另一个方面，R9是C2烷基酰胺基。
[0547] 在一些方面，Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0548] L是任选地取代的二价接头；
[0549] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0550] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0551] R11是载体。
[0552] 在一些方面，Z是CH-L-A、CH-A、N-L-A或N-A；
[0553] L是任选地取代的二价接头Q-[Sp-Q]h-Q；
[0554] Q在每次出现时独立地选自键、O、C(O)、N(H)、N(C1-C4烷基)、C(O)NH、C(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)、N(C1-C4烷基)C(O)、N(H)C(O)O、N(C1-C4烷基)C(O)O、OC(O)N(H)、OC(O)N(C1-C4烷基)、N(H)C(O)N(H)、N(C1-C4烷基)C(O)N(H)、N(H)C(O)N(C1-C4烷基)、N(C1-C4烷基)C(O)N(C1-C4烷基)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、S、S(O)2、N(H)S(O)2、N(C1-C4烷基)S(O)2、S(O)2N(H)、S(O)2N(C1-C4烷基)、C1-C2烷基-C(O)N(H)、N(H)C(O)C1-C2烷基、C1-C2烷基-C(O)O、OC(O)C1-C2烷基、1,2,3-三唑、OP(O)2、P(O)2O、C1-C4烷基-P(O)2-O或O-P(O)2-C1-4烷基；
[0555] Sp在每次出现时独立地选自任选地取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、[W-O]g、C1-C8烷基-[O-W]g、[O-W]g-O-C1-C8烷基、C1-C8C烷基-[O-W]g-O-C1-C8烷基、寡肽；
[0556] h是在1和20之间的整数；
[0557] g是在约2和约50之间的加权平均数；
[0558] W是C2-C4烷基-1,2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；
[0559] A是氢、C1-C8烷基、C(O)C1-C8烷基、C(O)OC1-C8烷基、C(O)N(H)C1-C8烷基、R10或R11，其中该烷基基团任选地被0或1个R10取代；
[0560] R10是适合于将式I与载体偶联的反应性官能团；并且
[0561] R11是载体。
[0562] 在某些方面，g和h是1至约25或从1至约10。
[0563] 在一些方面，式(I)的Z是NR9。在一方面，R9进一步被R10取代。在另一个方面，R9进一步被R11取代。
[0564] 根据式(I)，R10是适合于正交偶联反应的反应性官能团。适合的反应性官能团是易于进行正交反应的那些。示例性和非限制性正交化学反应包括表1中所示的官能团。对于表1中给定的行，官能团X(左列)适合于与官能团Y(右列)的偶联反应。偶联反应可以是共价键或分子间复合物。在大多数实施例中，偶联反应产生共价键。在其他反应中，例如金刚烷与环糊精的反应，偶联是非共价分子缔合。在一方面，官能团选自叠氮基、炔基、取代的或未取代的C6-C12环炔基、C6-C12杂环炔基、C6-C12环烯基、降莰基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、取代的或未取代的C1-C8烷氧基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、氧基胺、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精和金刚烷基。
在另一个方面，官能团是取代的C6-C12环炔基，其中该取代包括稠合的环丙基基团。在另一个方面，该官能团是二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基。在另一个方面，该官能团是叠氮基。
在另一个方面，官能团是取代的C6-C12环炔基，其中该取代包括稠合的环丙基基团。在另一个方面，该官能团是二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基。在另一个方面，该官能团是叠氮基。
[0565]
[0566]
[0567]
[0568]
[0569] 在一些实施例中，无痕迹接头R包含式(II)：
[0570]
[0572] 在一些方面，T1是-CR1R1aOY，其包含触发物部分，并且包含表2中的以下结构之一。
[0573]
[0574]
[0575] 在一些实施例中，根据式I或II的无痕迹接头R包含表3中的以下结构中的任一种。
[0576]
[0577]
[0578]
[0579] 在另一个实施例中，式(I)或式(II)的无痕迹接头R与药物或生物活性部分缀合。在一方面，缀合的药物无痕迹接头包含表4中以下结构中的任一种。
[0580]
[0581]
[0582]
[0583] 无痕迹接头R的合成
[0584] 另一个实施例是用于制造式(I)的无痕迹接头R的方法，该方法包括以下步骤中的任一个：(A)使在C2位置处含有亲核基团的哌嗪化合物的N4氮与官能化的酰基接头化合物反应，以形成N4-酰基哌嗪；(B)使N4-酰基哌嗪的哌嗪环的N1氮羧甲基化，其中羧基基团与适合的保护基团共价附接；(C)使N4-酰基哌嗪的亲核基团与本文所述的触发物化合物反应；(D)如果需要，使N4上的官能化的酰基接头复杂化，以包含适合于将无痕迹接头与载体化合物附接的官能团。在一方面，在哌嗪化合物的C2位置处的亲核基团包含羟基。在另一个方面，在哌嗪化合物的C2位置处的亲核基团是伯醇。在另一个方面，在步骤(A)或(D)的哌嗪化合物中存在的伯醇与适合的保护基团或触发物基团缀合。在另一个方面，保护基团或触发物基团包含酯、甲硅烷基醚、乙缩醛、氨基甲酸酯、碳酸酯或含有二硅氧烷的化合物。在一方面，N4羧甲基酯保护基团被脱保护以形成羧酸，其适合于形成包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的酰胺键。在另一个方面，在羧甲基化步骤中，羧甲基化试剂的羧基基团经由酰胺键与包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂共价附接。在一方面，步骤A的官能团适合于将无痕迹接头附接至载体化合物。
[0585] 另一个实施例是用于制造式(I)的无痕迹接头R的方法，该方法包括以下步骤中的任一个：(A)使在C2位置处含有亲核基团的哌嗪化合物的N1氮羧甲基化，其中羧基基团与适合的保护基团共价附接；(B)使哌嗪化合物的N4氮与官能化的烷基接头反应，以形成N4-烷基哌嗪；(C)使N4-烷基哌嗪的亲核基团与本文所述的触发物化合物反应；(D)如果需要，使N4上的官能化的烷基接头复杂化，以包含适合于将无痕迹接头与载体化合物附接的官能团。在一方面，在哌嗪化合物上的反应性基团包含羟基。在另一个方面，在哌嗪化合物的C2位置处的亲核基团是伯醇。在另一个方面，将在步骤(A)或(D)的哌嗪化合物上存在的伯醇与适合的保护基团或触发物基团缀合。在另一个方面，触发物化合物包含酯、甲硅烷基醚、乙缩醛、氨基甲酸酯、碳酸酯或含有二硅氧烷的化合物。在一方面，N4羧甲基酯保护基团被脱保护以形成羧酸，其适合于形成包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的酰胺键。在另一个方面，在羧甲基化步骤中，羧甲基化试剂的羧基基团经由酰胺键与包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂共价
附接。在一方面，步骤A的官能团适合于将无痕迹接头附接至载体化合物。
附接。在一方面，步骤A的官能团适合于将无痕迹接头附接至载体化合物。
[0586] 另一个实施例是用于制造式(I)的无痕迹接头R的方法，该方法包括以下步骤中的任一个：(A)在C2位置处含有亲核基团的吡啶化合物的C4位置处经由交叉偶联或取代反应引入官能化的接头；(B)将4-取代的吡啶化合物氢化，以形成4-取代的哌啶化合物；(C)将4-取代的哌啶化合物的N1氮羧甲基化，其中羧基基团与适合的保护基团共价附接；(D)使4-取代的哌啶化合物的亲核基团与本文所述的触发物化合物反应；(E)如果需要，使C4上的官能化的烷基接头复杂化，以包含适合于将无痕迹接头与载体化合物附接的官能团。在一方面，吡啶或哌啶化合物上的亲核基团包含羟基。在另一个方面，吡啶或哌啶化合物的C2位置处的亲核基团是伯醇。在另一个方面，触发物化合物包含酯、甲硅烷基醚、乙缩醛、氨基甲酸酯、碳酸酯或含有二硅氧烷的化合物。在一方面，N4羧甲基酯保护基团被脱保护以形成羧酸，其适合于形成包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的酰胺键。在另一个方面，在羧甲基化步骤中，羧甲基化试剂的羧基基团经由酰胺键与包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂共价附接。在一方面，步骤A的官能团适合于将无痕迹接头附接至载体化合物。
[0587] 适合的保护基团是以下部分，这些部分与反应性官能团或化学官能团可逆连接，从而使其不能与例如其他化学官能团反应。示例性和非限制性氨基保护基团包括芴基亚甲基氧基基团(FMOC)、叔丁基氧基羰基(BOC)、羧基苄基(Cbz)等。示例性和非限制性醇保护基团包括叔丁基醚、丙基醚、苄基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBDMS)等。可以在整个合成过程中根据需要添加或去除脱保护基团，以封闭和暴露特定的部分。
[0588] 在一个实施例中，用于制造无痕迹接头的方法是根据反应方案1-3。以下方案是用于制造无痕迹接头的一般和非限制性方案。如本文实例中所示，一些合成途径不特别符合这些一般方案。在另一个方面，用于制造无痕迹接头的方法根据实例1中提供的反应方案。
[0589] 方案1
[0590]
[0591] 其中以上示出的一个或多个步骤可以按不同的相继顺序进行或根据所使用的试剂而省略；
[0592] X是包含Cl、O-NHS、O(C＝O)-R2a或X-OH的活化基团，并且该反应包括标准的肽偶联试剂，例如1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)；
[0593] R2a是C1-C8烷基或芳基；
[0594] P4是适合的保护基团或H；
[0595] L是任选地取代的二价接头；
[0596] P1和P2是可以相同的保护基团；
[0597] Y是表2中提供的适合的触发物；以及
[0598] FG包含一个或多个适合的官能团，该一个或多个官能团能够与本文所述的载体缀合。
[0599] 方案2
[0600]
[0601] 其中以上示出的一个或多个步骤可以按不同的相继顺序进行或根据所使用的试剂而省略；
[0602] 其中X2是活化基团，例如Cl、Br、I或三氟甲烷磺酸盐；
[0603] Y、L、P1、P2、P4和FG是如方案1所述；
[0604] P3是可以与P1和P2相同的保护基团。
[0605] 方案3
[0606]
[0607] 其中以上示出的一个或多个步骤可以按不同的相继顺序进行或根据所使用的试剂而省略；并且
[0608] L、P1、P2、P3、Y和FG是如方案2所述。
[0609] 如本文所述的，式(I)或式(II)的加合物D-R通过将无痕迹接头R的羧酸形式与包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的氨基基团反应以
形成酰胺键来制备。该方法描述于方案4中。将适合的羧酸活化剂用于促进酰胺键形成反应。作为实例，通过二琥珀酰亚胺基碳酸酯的作用，可以将羧酸转化为氨基-反应性形式，以形成NHS酯；然后，使无痕迹接头R的NHS酯与含有氨基的药物D反应，以形成加合物D-R。
形成酰胺键来制备。该方法描述于方案4中。将适合的羧酸活化剂用于促进酰胺键形成反应。作为实例，通过二琥珀酰亚胺基碳酸酯的作用，可以将羧酸转化为氨基-反应性形式，以形成NHS酯；然后，使无痕迹接头R的NHS酯与含有氨基的药物D反应，以形成加合物D-R。
[0610] 在方案4中，L、Y和FG是如方案1-3所述；D是包含至少一个伯胺或仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂。
[0611] 方案4
[0612]
[0613] 本文所述的一个实施例是式(I)或式(II)的无痕迹接头R，该无痕迹接头通过具有一个或多个官能团的接头与载体组合物附接。在一方面，该载体组合物包含如本文所述的无痕迹接头的R11。在一方面，R11包含聚合物、生物聚合物、或通过接头与R8或R9连接的聚乙二醇。在一方面，该载体组合物是水凝胶。在一方面，水凝胶组合物包含透明质酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚谷氨酸酯、聚赖氨酸、聚唾液酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯/聚甲基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚亚氨基碳酸酯、聚氨基酸、亲水性聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、右旋糖酐、琼脂糖、木聚糖、甘露聚糖、角叉菜胶、海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、白蛋白、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、壳聚糖、核酸、其衍生物、其共聚物或其组合。在另一个方面，R11包含纳米颗粒或分子表面。在一方面，水凝胶包含聚乙二醇的透明质酸。在另一个方面，R11包含透明质酸或聚乙二醇的交联的水凝胶。在一方面，在眼睛或滑液关节中使用药物递送系统的情况下，R11包含透明质酸或交联的透明质酸。
[0614] 如本文所述的，可以将R11载体组合物交联，以将多个分子连接在一起，并促进水凝胶形成。使用本领域已知的任何方式，可以完成交联(参见，例如,Liu等人.,Chem.Commun.[化学通讯]51,(2015))。在本文所述的一个实施例中，透明质酸或聚乙二醇被表1中显示的一个或多个官能团官能化，以提供用于交联的反应性官能团。在另一个方面，透明质酸或聚乙二醇被官能团官能化，该官能团选自叠氮基、炔基、取代的或未取代的C7-C12环炔基、C7-C12环烯基、取代的或未取代的C7-C12杂环炔基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、C2-C8烯基、氨基、硫醇、C1-C8羧基、C1-C8羰基、氧基胺、碳酰肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、取代的或未取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精和金刚烷基。在另一个方面，透明质酸被叠氮基基团官能化。
[0615] 官能化的程度可以确定水凝胶的孔隙度。在一方面，约5％至约50％的载体聚合物被官能化，包括在指定范围内的所有整数。在一方面，载体聚合物被官能化约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％，或甚至更高。
[0616] 在一方面，载体是透明质酸。在另一个方面，将透明质酸与4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-鎓氯化物(CAS号3945-69-5)和2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)
乙氧基)乙氧基)乙胺(CAS号134179-38-7)反应，以形成叠氮化物官能化的透明质酸([HA-N3])。在一方面，该反应是：
乙氧基)乙氧基)乙胺(CAS号134179-38-7)反应，以形成叠氮化物官能化的透明质酸([HA-N3])。在一方面，该反应是：
[0617]
[0618]
[0619] 实验条件描述于实例3中。在一方面，约5％至约50％的透明质酸被官能化，包括在指定范围内的所有整数。在一方面，透明质酸被官能化约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％或甚至更高。
[0620] 在另一个实施例中，将聚乙二醇用各种试剂官能化，以形成用于连接如以上所讨论的官能化的透明质酸单体的交联剂。
[0621] 2kDa 2-臂PEG-BCN交联剂的合成
[0622] 在一方面，如所示，Mn约2kDa的聚乙二醇二胺盐酸盐进行反应。反应条件描述于实例4中。
[0623]
[0624] 10kDa的4-臂PEG-BCN交联剂的合成
[0625] 在另一个方面，如所示，Mn为10kDa的4-臂聚乙二醇胺盐酸盐(季戊四醇核，键凯科技公司(JenKem Technology))进行反应。反应条件描述于实例4中。
[0626]
[0627] 2kDa的2-臂β-丙氨酸PEG-BCN交联剂的合成
[0628] 在另一个方面，如所示，Mn约2kDa的聚乙二醇和3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸进行反应。反应条件描述于实例4中。
[0629]
[0630] 2kDa的2-臂氨基环丙烷羧酸PEG-BCN交联剂的合成
[0631] 在另一个方面，如所示，Mn约2kDa的聚乙二醇和1-((叔丁氧基羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸进行反应。反应条件描述于实例4中。
[0632]
[0633] 本文所述的另一个实施例是一种或多种交联剂。在一方面，该交联剂包含式V：
[0634]
[0635] 在另一个方面，该交联剂包含式VI：
[0636]
[0637] 在另一个方面，该交联剂包含式VIa：
[0638]
[0639] 在另一个方面，该交联剂包含式VIb：
[0640]
[0641] 在另一个方面，该交联剂包含式VIc：
[0642]
[0643] 在另一个方面，该交联剂包含式VII：
[0644]
[0645] 在另一个方面，该交联剂包含式VIII：
[0646]
[0647] 在另一个方面，该交联剂包含式IX：
[0648]
[0649] 在本文所述的另一个实施例中，R11包含官能化的载体，该官能化的载体已经与一种或多种交联剂反应，以形成交联的载体。在一个实施例中，该交联的载体形成水凝胶。在一方面，该交联的载体是透明质酸，该透明质酸已经被官能化并与如本文所述的一种或多种聚乙二醇交联剂交联，以形成水凝胶。
[0650] 在一个实施例中，包含透明质酸的交联的载体抗体可通过将官能化的聚合物合适地反应来制备，如下所示：
[0651]
[0652] 尽管不受任何特定实例和说明方式的限制，但在一个实施例中，如通过粘度测定法确定，透明质酸钠盐被供应商生命核生物医药公司(Lifecore Biomedical)(HA200K，查斯卡，明尼苏达州(Chaska,MN))标记为具有在151kDa-300kDa的范围内因批次而异的标称平均分子量。出于说明的目的，具有假定标称平均分子量为200kDa的透明质酸钠盐分子将由平均为约500个单体单元组成。在该结构和以下结构中，未经修饰的单体单元被定义为“m”；被叠氮基基团修饰的单体单元被定义为“n”；与交联分子缀合的叠氮基单体单元被定义为“p”；并且与无痕迹接头-药物加合物缀合的叠氮基单体单元被定义为“q”。对于包含≈500个单体单元的聚合物链，(n+m+p+q≈500)。如果透明质酸钠盐分子的修饰百分比为
25％，那么m＝75％并且(n+p+q)＝25％。
25％，那么m＝75％并且(n+p+q)＝25％。
[0653] 类似地，存在于交联剂的一个实施例中的PEG单元衍生自描述为具有标称平均分子量为2kDa的起始PEG，并且将由大约44个重复的PEG单体单元(在这些所描绘的结构中被描述为“w”)组成。
[0654] 在下式中，在一个实施例中，对于如通过粘度测定法测定的约200kDa的标称平均分子量，在随机分布中透明质酸的未经修饰的二糖重复单元(m)加上透明质酸的经修饰的二糖重复单元(n+p+q)的总和(＝m+n+p+q)可以包含约500个单位。这适用于式X至XXII。
[0655] 在一方面，该交联的载体包含式X：
[0656]
[0657] 在另一个方面，该交联的载体包含式XI：
[0658]
[0659] 在另一个方面，该交联的载体包含式XII：
[0660]
[0661] 在另一个方面，该交联的载体包含式XIIa：
[0662]
[0663] 在另一个方面，该交联的载体包含式XIIb：
[0664]
[0665] 在另一个方面，该交联的载体包含式XIIc：
[0666]
[0667] 在另一个方面，该交联的载体包含式XIII：
[0668]
[0669] 本文所述的另一个实施例是药物加合物D-R，其中D是包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且R是适合释放生物活性部分的接头。在一方面，D包含蛋白质、核酸、碳水化合物、肽、核苷酸、寡糖或小分子，其各自具有至少一个伯胺或仲胺，并且该小分子具有在约100g/mol和约2000g/mol之间的分子量。
[0670] 在本文所述的一个实施例中，D包含低分子量生物活性分子。在一方面，D包含生物活性分子，该生物活性分子含有至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子并且分子量为约100g/mol至约2000g/mol，包括在该指定范围内的所有整数。在一方面，D包含生物活性分子，该生物活性分子包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子，并且分子量为约100g/mol、约150g/mol、约200g/mol、约250g/mol、约300g/mol、约350g/mol、约400g/mol、约450g/mol、约500g/mol、约550g/mol、约600g/mol、约650g/mol、约700g/mol、约750g/mol、约800g/mol、约850g/mol、约900g/mol、约950g/mol、约1000g/mol、约1050g/mol、约1100g/mol、约1150g/mol、约1200g/mol、约1250g/mol、约1300g/mol、约1350g/mol、约1400g/mol、约1450g/mol、约1500g/mol、约1550g/mol、约1600g/mol、约1650g/mol、约1700g/mol、约1750g/mol、约1800g/mol、约1850g/mol、约1900g/mol、约1950g/mol或约
2000g/mol。
2000g/mol。
[0671] 在另一个实施例中，D包含含有至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子并且分子量为约100g/mol至约2000g/mol的生物活性分子，该生物学活性分子以治疗上有益的方式调节至少一个生物学相关的靶标。在一方面，D包含中枢神经系统-活性剂、抗感染剂、抗过敏剂、免疫调节剂、抗肥胖剂、抗凝剂、抗糖尿病药、抗肿瘤药、抗细菌剂、抗真菌药、镇痛药、避孕药、抗炎剂、抗血管生成剂、抗青光眼剂、再生剂、类固醇、血管扩张剂、血管收缩剂或心血管药物。在一方面，D包含阿卡波糖、阿拉丙酯、阿仑磷酸钠、金刚烷胺、阿米卡星、安咪奈丁、氨基格鲁米特、氨磺必利、氨氯地平、氨托沙林、阿莫沙平、阿莫西林、苯丙胺、两性霉素B、氨比西林、氨普那韦、aminone、阿尼利定、阿可乐定、阿泊拉霉素、阿替卡因、阿替洛尔、阿托西汀、阿维扎封、巴氯芬、贝那普利、苄丝肼、苯佐卡因、倍他洛尔、博来霉素、溴芬酸、溴法罗明、卡维地洛、去甲伪麻黄碱、卡西酮、氨磺丁脲、头孢氨苄、克林沙星、环丙沙星、去铁胺、地拉韦啶、去郁敏、道诺霉素、右哌甲酯、右哌甲酯、二氨基苯基砜、地佐环平、多巴胺、多巴酚丁胺、多佐胺、阿霉素、度洛西汀、依氟鸟氨酸、依那普利、肾上腺素、表柔比星、麦角灵、厄他培南、艾司洛尔、依诺沙星、乙胺丁醇、芬氟拉明、非诺多泮、非诺特罗、芬戈莫德、氟卡同胺(flecamide)、三氟戊肟胺、磷安普那韦(fosamprenavir)、夫罗曲坦、呋塞米、氟西汀(fluoexetine)、加巴喷丁、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素、格帕沙星、海克卡因、肼苯哒嗪、氢氯噻嗪、艾芬净喷、伊达比星、咪喹莫特、美加明、异丙肾上腺素、伊拉地平、卡那霉素A、氯胺酮、拉贝洛尔、拉米夫定、左布诺洛尔、左旋多巴、左甲状腺素、赖诺普利、洛美沙星、氯碳头孢、马普替林、甲氟喹、美法仑、美金刚、美罗培南、美沙拉秦、麦司卡林、甲基多巴、亚甲基二氧基甲基苯丙胺、美托洛尔、米那普仑、米托蒽醌、莫西沙星、去甲肾上腺素、诺氟沙星、去甲替林、新霉素B、制霉菌素、奥司他韦、帕米膦酸、帕罗西汀、帕珠沙星、培美曲塞、培哚普利、芬美曲秦、苯乙肼、普瑞巴林、普鲁卡因、伪麻黄碱、普罗替林、瑞波西汀、利托君、沙柔比星、沙丁胺醇、血清素、舍曲林、西格列汀、索他洛尔、奇放线菌素、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、舍曲林、奇放线菌素、磺胺林、磺胺甲基噁唑、他克林、坦洛新、特布他林、噻吗洛尔、替罗非班、妥布霉素、妥卡尼(tocamide)、托氟沙星、群多普利、凝血酸、反苯环丙胺、三甲曲沙、曲伐沙星、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、万古霉素、紫霉素、维洛沙秦、和扎西他滨。
[0672] 在另一个实施例中，D包含一种或多种生物活性肽，包括但不限于C型利尿钠肽(CNP)、心房利钠肽(ANP)、艾塞那肽-4、胰岛素、促肾上腺皮质激素、肾上腺髓质素、阿卓品、ω-漏斗网蛛毒素、刺鼠色蛋白相关蛋白、一种或多种血管紧张素、爱佩琳(apelin)12、爱佩琳13、爱佩琳36、或其衍生物、缓激肽、降血钙素、可卡因和苯丙胺调节的转录物(CART)、促皮质素释放因子(CRF)、α-防御素、β-防御素、δ-睡眠诱导肽(DSIP)、弹性蛋白酶特异性抑制剂(Elafin)、内激肽(endokinin)、内吗啡肽、内腓呔、内皮素、艾塞那肽、纤连蛋白活性片段、甘丙肽、甘丙肽样肽、大胃泌素、胃泌素I、胃泌素相关肽、胃抑制性多肽、胃泌素释放肽、胃饥饿素、脱酰基胃饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、智利捕鸟蛛(Grammostola spatulata)GsMTx-4、广西毒素(guangxitoxin)-1E、鸟苷蛋白、肝杀菌肽1、肝杀菌肽/LEAP-1、组胺素5、人生长激素、人体肽(humanin)、虎纹捕鸟蛛毒素、伊比利亚蝎毒素(iberiotoxin)、帝王蝎毒素(imperatoxin)A、胰岛素样生长因子、垂体中叶素、IRL
1620、连接肽、短肤蝎毒素、基丝肽素(kisspeptin)、库特毒素(kurtoxin)、促脂解素、促脂解素、肝细胞生长因子、肝表达的抗微生物肽2、黄体生成素释放激素、胞溶素(lysenin)、LL-37、玛格毒素、肥大脱粒肽、肥大细胞脱粒肽、黑色素浓缩激素、促黑素细胞激素、MSH释放抑制因子、中期因子、软体动物心脏兴奋性神经肽、吗啡耐受性肽、胃动素、毒蕈碱毒素、神经内分泌调节肽-2、神经激肽A、神经激肽B、神经介肽、神经抑素-13、神经肽、神经降压素、神经毒素NSTX-3、痛稳素、痛敏肽、肥胖抑制素、阿片样肽(脑啡肽、内腓呔、BAM-12P、酪啡肽、强啡呔、内吗啡肽、新内腓呔、痛敏肽)、阿立新-A/-B、孤啡肽、骨钙素、催产素、胰抑制素、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关蛋白、肽234、肽组氨酸-甲硫氨酸、肽T、肽YY、泡蛙肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血小板因子-4、菌丝霉素(plectasin)、多效营养因子
(pleiotrophin)、前肾上腺髓质素、催乳素释放肽、狼蛛毒素(psalmotoxin)1、普若毒素(purotoxin)-1、焦谷氨酰化RF酰胺肽、肾素、RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-3、萨鲁辛-α/β、角蝰毒素、精神分裂症相关肽、青蟹毒素、促胰液素、塞松弛素、血清胸腺因子、钠钾ATP酶抑制剂-1、生长抑素、地毯海葵毒素、物质K、顶压素、顶压素相关肽、物质P、速激肽、塔兰托毒蛛SNX-482、塔兰托毒蛛ProTx-I、塔兰托毒蛛ProTx-II、托肽品、钕蝎毒素Ka、促甲状腺激素释放激素、吞噬刺激素、尿鸟苷素、尿鸟苷素异构体A或B、尿皮素、尿皮素II、尾加压素II、尾加压素II相关肽、血管活性肠肽、加压素、催产加压素、病毒复制抑制性肽、类爪蟾肽，或其组合。
1620、连接肽、短肤蝎毒素、基丝肽素(kisspeptin)、库特毒素(kurtoxin)、促脂解素、促脂解素、肝细胞生长因子、肝表达的抗微生物肽2、黄体生成素释放激素、胞溶素(lysenin)、LL-37、玛格毒素、肥大脱粒肽、肥大细胞脱粒肽、黑色素浓缩激素、促黑素细胞激素、MSH释放抑制因子、中期因子、软体动物心脏兴奋性神经肽、吗啡耐受性肽、胃动素、毒蕈碱毒素、神经内分泌调节肽-2、神经激肽A、神经激肽B、神经介肽、神经抑素-13、神经肽、神经降压素、神经毒素NSTX-3、痛稳素、痛敏肽、肥胖抑制素、阿片样肽(脑啡肽、内腓呔、BAM-12P、酪啡肽、强啡呔、内吗啡肽、新内腓呔、痛敏肽)、阿立新-A/-B、孤啡肽、骨钙素、催产素、胰抑制素、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关蛋白、肽234、肽组氨酸-甲硫氨酸、肽T、肽YY、泡蛙肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血小板因子-4、菌丝霉素(plectasin)、多效营养因子
(pleiotrophin)、前肾上腺髓质素、催乳素释放肽、狼蛛毒素(psalmotoxin)1、普若毒素(purotoxin)-1、焦谷氨酰化RF酰胺肽、肾素、RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-3、萨鲁辛-α/β、角蝰毒素、精神分裂症相关肽、青蟹毒素、促胰液素、塞松弛素、血清胸腺因子、钠钾ATP酶抑制剂-1、生长抑素、地毯海葵毒素、物质K、顶压素、顶压素相关肽、物质P、速激肽、塔兰托毒蛛SNX-482、塔兰托毒蛛ProTx-I、塔兰托毒蛛ProTx-II、托肽品、钕蝎毒素Ka、促甲状腺激素释放激素、吞噬刺激素、尿鸟苷素、尿鸟苷素异构体A或B、尿皮素、尿皮素II、尾加压素II、尾加压素II相关肽、血管活性肠肽、加压素、催产加压素、病毒复制抑制性肽、类爪蟾肽，或其组合。
[0673] 在另一个方面，D包含ACTH、腺苷脱氨酶、半乳糖苷酶、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、α-1蛋白酶抑制剂(API)、阿替普酶、胰淀素(胰淀素、普兰林肽)、阿尼普酶、安克洛丝氨酸蛋白酶、抗体(单克隆或多克隆，和片段或融合物)、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶、抑肽酶、天冬酰胺酶、阿托西班、布法林(biphalin)、比伐卢定、骨形态发生蛋白、牛胰胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、钙粘素片段、降血钙素(salmon)、胶原酶、补体C1酯酶抑制剂、芋螺毒素、细胞因子受体片段、DNA酶、强啡肽A、内腓呔、恩夫韦地、脑啡肽、促红细胞生成素、艾塞那肽、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、溶纤维蛋白酵素、成纤维细胞生长因子(FGF)、生长激素释放肽2(GHRP2)、融合蛋白、促滤泡激素、短杆菌肽、胃饥饿素、去酰基-胃饥饿素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、葡糖脑苷脂酶、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人热休克蛋白(HSP)、磷脂酶-活化蛋白质(PLAP)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、血红蛋白、乙型肝炎疫苗、水蛭素、人丝氨酸蛋白酶抑制剂、透明质酸酶、艾杜糖苷酸酶、免疫球蛋白、流感疫苗、白细胞介素(1α、1β、2、3、4、6、10、11、12、13、21)、IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)、胰岛素、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白
(rhIGFBP)、干扰素(α2a、α2b、α2c、β1a、β1b、γ1a、γ1b)、细胞内黏附分子、角质细胞生长因子(KGF)、P选择蛋白的糖蛋白配体(PSGL)、转化生长因子、乳糖酶、瘦蛋白、亮丙瑞林、左甲状腺素、促黄体激素、莱姆疫苗、利尿钠肽(ANP、BNP、CNP和片段)、神经肽Y、胰脂肪酶、胰多肽、木瓜蛋白酶、甲状旁腺素、PDGF、胃蛋白酶、肽YY、血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)、催乳激素、蛋白质C、胸腺法新、奥曲肽、促胰液素、舍莫瑞林、可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)、超氧化物歧化酶(SOD)、生长素(生长激素)、生长抑素、链激酶、蔗糖酶、特利加压素、破伤风毒素片段、半乳糖苷酶、凝血酶、胸腺素、促甲状腺激素、促甲状腺素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF受体-IgG Fc、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、TSH、尿扩张素、尿酸氧化酶、尿激酶、疫苗、血管内皮生长因子(VEGF)、血管活性肠肽、加压素、齐考诺肽、凝集素、蓖麻毒素中的一种或多种，或其组合。
(rhIGFBP)、干扰素(α2a、α2b、α2c、β1a、β1b、γ1a、γ1b)、细胞内黏附分子、角质细胞生长因子(KGF)、P选择蛋白的糖蛋白配体(PSGL)、转化生长因子、乳糖酶、瘦蛋白、亮丙瑞林、左甲状腺素、促黄体激素、莱姆疫苗、利尿钠肽(ANP、BNP、CNP和片段)、神经肽Y、胰脂肪酶、胰多肽、木瓜蛋白酶、甲状旁腺素、PDGF、胃蛋白酶、肽YY、血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)、催乳激素、蛋白质C、胸腺法新、奥曲肽、促胰液素、舍莫瑞林、可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)、超氧化物歧化酶(SOD)、生长素(生长激素)、生长抑素、链激酶、蔗糖酶、特利加压素、破伤风毒素片段、半乳糖苷酶、凝血酶、胸腺素、促甲状腺激素、促甲状腺素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF受体-IgG Fc、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、TSH、尿扩张素、尿酸氧化酶、尿激酶、疫苗、血管内皮生长因子(VEGF)、血管活性肠肽、加压素、齐考诺肽、凝集素、蓖麻毒素中的一种或多种，或其组合。
[0674] 在另一个实施例中，D包含阿昔单抗、阿达木单抗、阿柏西普、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、达雷妥木单抗、迪诺舒单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、艾匹利木单抗、兰帕利珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培普拉尼、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗、或维多利珠单抗或其衍生物或组合。
[0675] 在另一个实施例中，D包含阿巴西普、白蛋白、阿法赛特、α-1蛋白酶抑制剂、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、肉毒杆菌毒素A、肉毒杆菌毒素B、达贝泊汀、地尼白介素、链道酶α、胶原酶、补体蛋白、促红细胞生成素、依那西普、因子VIII、纤维蛋白、纤维蛋白原、非格司亭、促卵泡激素、葡糖脑苷脂酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭、人生长激素、人绒毛膜促性腺素、透明质酸酶、胰岛素、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、干扰素(IF)、促黄体素、奥普瑞白介素、普兰林肽、美卡舍明、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(加硫酶)、组织纤溶酶原激活剂(TPA)、基于蛋白质的疫苗，或其组合。
[0676] 在另一个实施例中，D包含蛋白质、肽、抗体、人源化抗体、抗体片段、Fab、scFv、核酸、碳水化合物、小分子中的一种或多种，或其组合。
[0677] 在另一个实施例中，D包含核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、核酸中的一种或多种，包括但不限于DNA、RNA、PNA、siRNA、miRNA、mRNA、tRNA、rRNA，或其组合。
[0678] 在一个实施例中，D包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:5)、D3(SEQ ID NO:6)、或D4(SEQ ID NO:7)、兰尼单抗、贝伐单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-
1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
[0679] 本文所述的另一个实施例是包含载体-无痕迹接头生物活性剂缀合物的药物递送系统D-R-R11，其中D包含如本文所述的含有至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，R包含与R11附接的如本文所述的无痕迹接头，该R11包含如本文所述的载体聚合物或水凝胶。在一方面，R11包含透明质酸、交联的透明质酸、聚乙二醇、交联的聚乙二醇或如本文所述的其他适合的聚合物。在另一个方面，R包含如本文所述的无痕迹接头。在另一个方面，D包含蛋白质、肽、抗体Fab、Fc、scFv、核酸、siRNA、miRNA、mRNA、碳水化合物、肽核酸(PNA)，包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的有机小分子中的一种或多种，或其组合。在一方面，D包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:
5)、D3(SEQ ID NO:6)、或D4(SEQ ID NO:7)、兰尼单抗、贝伐单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,
7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-
基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
5)、D3(SEQ ID NO:6)、或D4(SEQ ID NO:7)、兰尼单抗、贝伐单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,
7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-
基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
[0680] 在另一个实施例中，D-R-R11包含式XIV、其中“药物”可以是以下中的一种或多种：布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、D2(SEQ ID NO:5)、D3(SEQ ID NO:6)、或D4(SEQ ID NO:7)、兰尼单抗、贝伐单抗、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲
基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-
1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-
1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。
[0681] 在一些实施例中，D-R-R11包含在式XIV-XXIII中显示的任何种类。
[0682] 在一个实施例中，药物或生物活性剂D包含多肽D2(SEQ ID NO:5)或其聚乙二醇化形式，例如像D3(SEQ ID NO:6)。D2和D3多肽以及其衍生物可以如国际专利申请公开号WO 2007/146689中所述来制备，将该申请通过引用并入本文中用于此类教导。
[0683] 在另一个实施例中，药物或生物活性剂D包含布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)。布洛赛珠单抗是单链可变片段(scFv)，包含VH区(SEQ ID NO:1)、VL区(SEQ ID NO:2)、和接头区(SEQ ID NO:3)。布洛赛珠单抗以及其衍生物可以如国际专利申请公开号WO 2009/155724中所述来制备，将该申请通过引用并入本文中用于此类教导。衍生自起始密码子的甲硫氨酸存在于布洛赛珠单抗的VL中。在一些情况下，可在被组装成如本文所述的药物递送系统之前将甲硫氨酸在翻译后切割。
[0684] 在另一个实施例中，药物或生物活性剂D包含D4(SEQ ID NO:7)。D4是13个氨基酸的肽，包含序列pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH(SEQ ID NO:7)，在C6和C12之间包含二硫键，并且其中pE表示焦谷氨酸，并且Nle表示正亮氨酸。D4以及其衍生物可以如国际专利申请公开号WO 2013/111110中所述来制备，将该申请通过引用并入本文中用于此类教导。
[0685] 在另一个实施例中，药物或生物活性剂D包含爱佩琳12、爱佩琳13、爱佩琳36，或其衍生物。爱佩琳和其衍生物披露于WO 2013/111110、WO 2014/081702、WO 2015/013168、WO 2015/013165或WO 2015/013167中，其各自通过引用并入本文中用于此类教导。
[0686] 在另一个实施例中，药物或生物活性剂D包含一种或多种抗血管内皮生长因子药物，例如贝伐单抗或兰尼单抗。贝伐单抗是重组人源单克隆IgG1抗体，其在体外和体内测定系统中结合人血管内皮生长因子(VEGF)并抑制其生物学活性。贝伐单抗含有人框架区和与VEGF结合的鼠抗体的互补决定区。抗体具有分子量约为149kDa。贝伐单抗是在营养培养基中的中国仓鼠卵巢表达系统中产生的。兰尼单抗是针对眼内使用而设计的重组人源化IgG1κ同种型单克隆抗体片段。兰尼单抗与人血管内皮生长因子A(VEGF-A)结合并抑制其生物学活性。缺少Fc区的兰尼单抗具有的分子量为约48kDa，并且是由在营养培养基中的大肠杆菌表达系统产生的。贝伐单抗和兰尼单抗分别在国际专利申请公开号WO 1994/004679和WO
1998/45331中进行了描述，将这两个申请通过引用并于本文中用于此类教导。
1998/45331中进行了描述，将这两个申请通过引用并于本文中用于此类教导。
[0687] 在另一个实施例中，药物或生物活性剂D包含5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-
1H-吲哚-1-甲酰胺；或(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-
(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺。这些分子的合成在国际专利申请公开号WO 2010/066684中进行了描述，将该申请通过引用并入本文中用于此类教导。
1H-吲哚-1-甲酰胺；或(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-
(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺。这些分子的合成在国际专利申请公开号WO 2010/066684中进行了描述，将该申请通过引用并入本文中用于此类教导。
[0688] 本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法；该方法可以包括以下顺序的步骤之一：
[0689] (a)制备载体分子R11，其中R11是交联的水凝胶，然后该步骤包括用于制备该水凝胶的方法；该载体分子可以在此阶段任选地被纯化；
[0690] (b)单独地将无痕迹接头R与包含伯胺、仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D缀合，从而形成无痕迹接头-D加合物；该无痕迹接头-D加合物在此阶段可以任选地被纯化，
[0691] (c)将载体分子R11与无痕迹接头-D加合物缀合；以及
[0692] (d)从试剂中纯化该药物递送系统。该方法显示在以下方案5A中。
[0693] 本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：
[0694] (a)制备载体分子R11，其中R11是交联的水凝胶，然后该步骤包括用于制备该水凝胶的方法；该载体分子可以在此阶段任选地被纯化；
[0695] (b)将无痕迹接头R与载体分子R11缀合，从而形成载体分子-无痕迹接头加合物，该加合物可以在此阶段任选地被纯化；
[0696] (c)将包含伯胺、仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D与载体分子-无痕迹接头加合物缀合；以及
[0697] (d)从试剂中纯化该药物递送系统。该方法显示在以下方案5B中。
[0698] 本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：
[0699] (a)制备非交联的载体分子R11，该载体分子在此阶段可以任选地被纯化；
[0700] (b)单独地将无痕迹接头R与包含伯胺、仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D缀合，从而形成无痕迹接头-D加合物；该无痕迹接头-D加合物在此阶段可以任选地被纯化；
[0701] (c)将载体分子R11与无痕迹接头-D加合物缀合，该加合物可以在此阶段任选地被纯化；
[0702] (d)通过将非交联的载体分子-无痕迹接头-生物活性剂R11-R-D与适合的交联试剂孵育以形成水凝胶来制备交联的水凝胶；以及
[0703] (e)从试剂中纯化该药物递送系统。该方法显示在以下方案5C中。
[0704] 本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：
[0705] (a)制备非交联的载体分子R11，该载体分子在此阶段可以任选地被纯化；
[0706] (b)将无痕迹接头R与载体分子R11缀合，从而形成载体分子-无痕迹接头加合物，该加合物可以在此阶段任选地被纯化；以及
[0707] (c)将包含伯胺、仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D与载体分子-无痕迹接头加合物缀合；
[0708] (d)通过将非交联的载体分子-无痕迹接头-生物活性剂R11-R-D与适合的交联试剂孵育以形成水凝胶来制备交联的水凝胶；以及
[0709] (e)从试剂中纯化该药物递送系统。该方法显示在以下方案5D中。
[0710] 本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：
[0711] (a)制备非交联的载体分子R11，该载体分子在此阶段可以任选地被纯化；
[0712] (b)将无痕迹接头R与载体分子R11缀合，从而形成载体分子-无痕迹接头加合物，该加合物可以在此阶段任选地被纯化；
[0713] (c)通过将非交联的载体分子-无痕迹接头-加合物R11-R与适合的交联试剂孵育以形成水凝胶来制备交联的水凝胶，该交联的水凝胶在此阶段可以任选地被纯化；
[0714] (d)将包含伯胺、仲胺、或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂D与交联的载体分子-无痕迹接头加合物缀合，该缀合物可以在此阶段任选地被纯化；以及
[0715] (e)从试剂中纯化该药物递送系统。该方法显示在以下方案5E中。
[0716] 方案5A-E.方案5示出了5个方法，A-E，用于组装如本文所述的药物递送系统。
[0717] 图例：
[0718] 载体分子，R11，非交联的
[0719] 交联剂
[0720] 载体分子，R11，交联的水凝胶
[0721] 无痕迹接头，R
[0722] 生物活性剂，D
[0723] 方案5A
[0724]
[0725] 方案5B
[0726]
[0727] 方案5C
[0728]
[0729] 方案5D
[0730]
[0731] 方案5E
[0732]
[0733] 在一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XIV)：
[0734]
[0735] 其中L2表示可以对特定交联剂具有特异性的间隔子基团，并且“药物”表示包含至少一个伯胺、仲胺或包含氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性分子，该生物活性分子以治疗有益的方式调节至少一个生物相关的靶标。
[0736] 在一个实施例中，间隔子L2包含在表5中示出的任何种类。
[0737]
[0738]
[0739] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XV)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0740]
[0741] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVI)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0742]
[0743] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVII)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0744]
[0745] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIII)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0746]
[0747] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIIIa)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0748]
[0749] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIIIb)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0750]
[0751] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIIIc)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0752]
[0753] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIIId)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0754]
[0755] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIIIe)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0756]
[0757] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XVIIIf)，其中该药物是布洛赛珠单抗：
[0758]
[0759] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XIX)，其中该药物是D2：
[0760]
[0761] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XX)，其中该药物是D2：
[0762]
[0763] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XXI)，其中该药物是D2：
[0764]
[0765] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XXII)，其中该药物是D2：
[0766]
[0767] 在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(XXIII)，其中该药物是D4：
[0768]
[0769] 本文所述的另一个实施例是使用本文所述的药物递送系统治疗疾病或障碍的方法。本文所述的另一个实施例涉及由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，用作药物。另一个实施例是由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐用于制造用于治疗心脏障碍、肌肉骨骼障碍、眼障碍的药物的用途，该眼障碍包括但不限于湿性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、青光眼、遗传性出血性毛细血管扩张(HHT)、增生性糖尿病性视网膜病变、葡萄膜炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、地图样萎缩、干性年龄相关性黄斑变性、新生血管形成、糖尿病性黄斑水肿或中期年龄相关性黄斑变性。在一方面，可以通过注射，将本文所述的药物递送系统的药物组合物施用对其有需要的受试者。在一方面，可以通过注射或手术植入进行施用。
[0770] 本文所述的一个实施例是用于治疗眼障碍的方法，该眼障碍包括但不限于湿性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、青光眼、遗传性出血性毛细血管扩张(HHT)、增生性糖尿病性视网膜病变、葡萄膜炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、地图样萎缩、干性年龄相关性黄斑变性、新生血管形成、糖尿病性黄斑水肿或中期年龄相关性黄斑变性，该方法包括施用如本文所述的药物递送系统D-R、其中D包含兰尼单抗、贝伐单抗、布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)、5-(5,6,7,8-四氢-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；5-(6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4d]嘧啶-4-基氧基)-吲哚-1-甲酸[5-(1-甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺；N-(1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-3-基)-5-((6-((甲基氨基)甲基)嘧啶-4-基)氧基)-1H-
吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。在一方面，该组合物是注射入眼中的溶液或悬浮液。在一方面，注射是眼内注射(例如，玻璃体内注射)。在另一个方面，该组合物是使用手术方式或通过注射植入眼中的凝胶或半固体组合物。
吲哚-1-甲酰胺；(S)-5-(6-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基氧基)-N-(5-(1-甲基环丙基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-1-甲酰胺，或其组合。在一方面，该组合物是注射入眼中的溶液或悬浮液。在一方面，注射是眼内注射(例如，玻璃体内注射)。在另一个方面，该组合物是使用手术方式或通过注射植入眼中的凝胶或半固体组合物。
[0771] 本文所述的另一个实施例是用于治疗肌肉骨骼障碍的方法，这些肌肉骨骼障碍包括但不限于软骨再生、肌腱愈合、伤口愈合或延髓脊髓性肌萎缩(bulbospinal muscular atrophy)，该方法包括施用如本文所述的药物递送系统D-R，其中D包含D2(SEQ ID NO:5)、D2的聚乙二醇化形式例如D3(SEQ ID NO:6)，或其组合。
[0772] 本文所述的另一个实施例涉及由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐(其中D包含D2(SEQ ID NO:5)、D2的聚乙二醇化形式例如D3(SEQ ID NO:6)，或其组合)，用于在治疗心脏障碍、肌肉骨骼障碍或眼障碍中使用，该眼障碍包括但不限于湿性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、青光眼、遗传性出血性毛细血管扩张(HHT)、增生性糖尿病性视网膜病变、葡萄膜炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、地图样萎缩、干性年龄相关性黄斑变性、新生血管形成、糖尿病性黄斑水肿或中期年龄相关性黄斑变性。在一方面，该组合物是注射到关节的溶液或悬浮液。在另一个方面，该组合物是使用手术方式或通过大孔径注射植入关节中的凝胶或半固体组合
物。在另一个方面，组合物处于被注射到关节中或关节附近的颗粒形式。在另一个方面，将组合物作为可生物降解的网或纱布植入关节中或关节附近，该网或纱布最终在原位被吸收或加工。在另一个方面，将组合物浸渍到缝合线，短纤维，板，网或类似的物品中，这些物品在手术期间用于在创伤或疾病之后重新连接或修复肌腱、韧带、软骨、骨头或其他关节组件。
物。在另一个方面，组合物处于被注射到关节中或关节附近的颗粒形式。在另一个方面，将组合物作为可生物降解的网或纱布植入关节中或关节附近，该网或纱布最终在原位被吸收或加工。在另一个方面，将组合物浸渍到缝合线，短纤维，板，网或类似的物品中，这些物品在手术期间用于在创伤或疾病之后重新连接或修复肌腱、韧带、软骨、骨头或其他关节组件。
[0773] 本文所述的另一个实施例是用于治疗以下心脏障碍的方法，例如心力衰竭、急性代偿性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、布鲁格达综合征、心室性心博过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水滞留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂性脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)或先兆子痫，该方法包括施用如本文所述的药物递送系统D-R，其中D包含D4(SEQ ID NO:7)。在一方面，该组合物是静脉内、动脉内、皮下、肌肉内或腹膜内递送的溶液或悬浮液。在另一个方面，该组合物是使用手术方式或大孔径注射植入的凝胶或半固体组合物。在另一个方面，该组合物是被局部或直接施用于皮肤伤口的凝胶或半固体组合物。
[0774] 在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统以特定的释放速率释放生物活性剂。在一方面，释放速率可以通过无痕迹接头R的“触发物”组分来调整或调节。不受任何理论的束缚，据信触发物在生理条件下的反应产生亲核官能团，例如以分子内方式切割将药物与药物递送系统连接的酰胺键的羟基官能团。在一个实施例中，触发物的反应是导致羟基官能团形成的水解反应。不受任何理论的束缚，据信触发物部分的空间位阻与触发的较慢反应有关，并且吸电子基团的存在和接近与触发物的较快反应有关。
[0775] 在一个实施例中，生物活性部分的释放的半衰期为约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4或多于4年。在一方面，生物活性部分释放半衰期为约2.5天、约4.5天、约7天、约10天、约11天、约12天、约14天、约15天、约21天、约28天、约30天、约31天、约32天、约40天、约58天、约60天、约65天、约70天、约80天、约125天、约165天、约380天、约940天或甚至更长。
[0776] 在一个实施例中，无痕迹接头触发物酯水解的半衰期为约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4或多于4年。在一方面，无痕迹接头触发物酯水解半衰期为约1天、约1.5天、约2天、约
2.5天、约4天、约5天、约10天、约12天、约15天、约20天、约30天、约32天、约35天、约40天、约
55天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天、约200天、约300天、约400天或甚至更长。
2.5天、约4天、约5天、约10天、约12天、约15天、约20天、约30天、约32天、约35天、约40天、约
55天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天、约200天、约300天、约400天或甚至更长。
[0777] 在另一个实施例中，药物递送系统R-R11在释放药物D(例如，D-R-R11→R-R11+D)后从向其中给予药物递送系统的组织、器官或区室清除的半衰期为约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4或多于4年。
[0778] 本文描述的其他实施例是包含如本文所述的药物递送系统D-R-R11的药物组合物。在一方面，药物组合物适合于在对其有需要的受试者中注射或植入。
[0779] 适合于通过注射或植入进行施用的药物组合物包括无菌水溶液、悬浮液、或分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末或冻干物。
[0780] 对于静脉内施用，适合的载体包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水、林格氏液或注射用水。在所有情况下，该组合物应当是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。优选的药物配制品在制造和储存条件下应该稳定并且必须抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。一般而言，相关的载体可以是包含以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、缓冲液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及其适合的混合物。可以例如通过使用涂层(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、氨基酸、山梨醇、氯化钠或其组合。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的长时间吸收。
[0781] 某些可注射组合物是水性等渗溶液或悬浮液，且栓剂是有利地制备自脂肪乳剂或悬浮液。所述组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液)。此外，它们还可含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法制备，并含有约0.1％-75％，或含有约1％-50％的活性成分。
[0782] 根据需要，无菌可注射溶液或悬浮液可以通过以下来制备：将所需量的药物递送系统与一种成分或多种成分的组合一起并入适当的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，溶液或悬浮液是通过将活性化合物掺入无菌媒介物(如无菌PBS)和任何赋形剂中来制备的。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其先前的无菌过滤溶液的任何另外的所希望成分。
[0783] 透黏膜或透皮施用方式也是可能的。用于透皮施用的适合的组合物包括有效量的生物活性剂与适合的载体。适合用于透皮递送的载体包括帮助通过接受主体皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮装置呈绷带的形式，该绷带包括背部构件、任选地具有载体的含有该化合物的储库、任选地用于将化合物以控制的和预定的速率在延长的时间段内递送至宿主的皮肤的速率控制屏障以及用于将该装置固定至皮肤的器件。
[0784] 适用于局部施用(例如，施用至皮肤、眼睛或关节)的组合物包括水溶液、悬浮液、软膏剂、霜剂、凝胶或可喷雾配制品，例如，用于借由气溶胶或类似物递送。此类局部递送系统将特别适合于皮肤应用。因此它尤其适用于局部中的用途，包括本领域中熟知的化妆品、配制品。这些可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液或防腐剂。
[0785] 如本文所用，局部施用还可涉及吸入或鼻内施用。其可在使用或不使用合适的推进剂的情况下自干燥粉末吸入器以干燥粉末的形式(单独、作为混合物，例如与乳糖的干燥掺混物，或经混合的组分颗粒，例如与磷脂质混合的组分颗粒)或自加压容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器以气溶胶喷雾形式便利地递送。
[0786] 本文还描述包含降低本文所述的作为活性成分的组合物分解速率的一种或多种药剂的药物组合物和剂型。此类药剂(本文中称为“稳定剂”)包括但不限于抗氧化剂(如抗坏血酸)、pH缓冲液、或盐缓冲液等。
[0787] 所用的有效量的药物组合物将例如取决于治疗情况和对象。本领域技术人员应理解，因此用于治疗的适当剂量水平将部分将根据以下而变化：掺入药物递送系统中的治疗剂、使用药物递送系统的适应症、施用途径以及患者的体格(体重、体表面积或器官尺寸)和/或状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医生可以滴定剂量且改变施用途径以获得最佳治疗效果。
[0788] 给药频率将取决于掺入所使用的药物递送系统中的治疗剂的药代动力学参数。典型地，临床医生将施用该组合物，直至达到获得所需效果的剂量。因此，该组合物能以单次剂量，随时间以两次或更多次剂量(可以含有或可以不含相同量的所需分子)，或经由植入装置或导管连续输注来施用。对适当剂量的进一步细化由本领域普通技术人员常规地进行，并且在他们常规执行的任务范围内。经由使用适当剂量-应答数据可以确定适当剂量。
[0789] 可以将药物递送系统制备成微颗粒的溶液或悬浮液。在一方面，使载体形成微颗粒，其可以通过标准注射器施用靶组织，例如按皮下、玻璃体内、关节内，肌腱内或肌肉内施用。这样的颗粒可以具有在1μm和5000μm之间的平均粒度分布。其他方面包含已经用如本文所述的药物递送系统浸渍的可生物降解的纱布、网或缝线。
[0790] 在一些实施例中，本文所述的药物递送系统的微颗粒可以通过乳液聚合、光刻法、旋压、模塑、喷雾干燥、研磨、挤出、机械粉粹或本领域已知的类似方法来产生。在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统、载体聚合物、或水凝胶可通过经由网或筛挤出而分成微颗粒。在一方面，挤出可以重复多次和/或连续通过较小的网孔以获得所希望的颗粒分布尺寸。
[0791] 在一个实施例中，基于激光衍射测量粒度，当悬浮于等渗水性配制品缓冲液时，该药物递送系统具有在1μm和5000μm之间的平均粒度分布。在一些方面，当悬浮于等渗缓冲液时，该药物递送系统具有在10μm和1000μm之间的平均粒度分布。在另一个方面，当悬浮于等渗水性缓冲液时，药物递送系统具有在50μm和500μm之间的平均粒度分布。在另一个方面，当悬浮于等渗水性缓冲液时，药物递送系统具有在100μm和300μm之间的平均粒度分布。在另一个方面，当悬浮于等渗水性缓冲液时，药物递送系统具有在200μm和300μm之间的平均粒度分布。在一些实施例中，该平均粒度分布包括约10μm、约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约750μm、约1000μm、约1500μm、约2000μm、约2500μm或约5000μm。
[0792] 粒度可以使用本领域普通技术人员已知的标准技术来确定。可用于测量药物递送系统颗粒的粒度分布的示例性技术可以包括激光衍射分析、光散射(例如，动态光散射)、微观颗粒图像分析、淘析或气溶胶质谱分析。可以将药物递送系统颗粒的样品测量为干样品或湿样品。遵循推荐的操作程序，根据制造商的说明，可以使用用于测量粒度的任何可商购的仪器，包括来自西莱斯公司(Cilas)；布鲁克海文仪器公司(Brookhaven Instruments Corporation)；马尔文仪器公司(Malvern Instruments)；浩瑞科学公司(Horiba Scientific)；或怀亚特公司(Wyatt)的仪器。
[0793] 使用本文描述的技术测量的粒度可以被表示为在均值、中值(例如质量中位直径)和粒径大小模式情况下具有正态分布或非正态分布的推导的直径。可以将粒度分布表示为直径数分布、表面积分布或颗粒体积分布。粒度分布的平均值可以按各自方式计算和表示，例如体积平均直径(D[4,3]或d43)、平均表面积直径(D[3,2]或d32)或平均数粒径(D[1,0]或d10)。由于粒度分布值会根据测量方法和分布的表示方式不同而有所不同，因此必须通过相同的方法来计算不同的平均粒度分布的比较，以便做出准确的比较。例如，必须将具有经测量和计算的体积平均直径的样品与具有经测量和计算的体积平均直径的第二样品进行比较，理想情况下，使用相同的测量仪器在相同条件下进行测量。因此，本文所述的特定粒度分布不旨在限于用于测量或计算粒度分布(例如，直径数分布、表面积分布或颗粒体积分布)的任何一种类型的方法，而是指示测量本文所述的粒径的每种方法的粒度值及其分布。
[0794] 在一个实施例中，可以通过注射，经由以下针头施用药物递送系统：小于0.6mm内径(例如，20号规格)的针头、优选小于0.3mm内径(例如，25号规格)的针头、更优选小于0.25mm内径(例如，27号规格)的针头、甚至更优选小于0.2mm内径(例如，28号规格)的针头、并且最优选小于0.16mm内径(例如，30号规格)的针头。在一个实施例中，当在眼内或玻璃体内施用药物递送系统时，优选小于0.16mm内径(例如，30-34号规格)的针头。例如，当注射
100μm至300μm粒度分布的药物递送系统时，20号规格的针头用于递送可能是最佳的。然而，由于颗粒形态是柔性的，因此可以成功地使用比药物递送系统粒度更窄的针头尺寸。
100μm至300μm粒度分布的药物递送系统时，20号规格的针头用于递送可能是最佳的。然而，由于颗粒形态是柔性的，因此可以成功地使用比药物递送系统粒度更窄的针头尺寸。
[0795] 短语和术语“可以通过注射施用”、“可注射的”或“注射性”是指因素的组合，例如施加到含有本文所述的药物递送系统的注射器柱塞的某种力，该药物递送系统在某种浓度(w/v)下和在某种温度下在液体中溶胀，连接到这种注射器出口的给定内径的针头；以及将一定体积的药物递送系统从注射器中通过针头挤出所需的时间。
[0796] 在一个实施例中，对于悬浮于PBS或生理盐水中的药物递送系统(至浓度为约0.1％至约20％(w/v)，包括在指定百分比范围内的所有整数)进行注射性测试。
[0797] 因此，药物递送系统显示了关于释放的药物D-H而言，控制释放速率的有益效果。优选地，获得持续释放速率。持续释放表示与不存在药物递送系统的情况下施用药物相比，本文所述的各个药物递送系统的施用间隔是延长的。例如，基于通常被每天一次或若干次施用的药物，药物递送系统提供至少三天、至少一周、至少一个月、若干个月或若干年的治疗有效水平。
[0798] 本文所述的另一个实施例是本文所述的药物递送系统的药物组合物。药物组合物可以包含一种或多种赋形剂，例如：
[0799] (i)缓冲剂：将pH维持在所希望的范围内的生理耐受缓冲液，例如磷酸钠、碳酸氢盐、琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和乙酸盐，硫酸盐、硝酸盐、氯化物、丙酮酸。还可以使用抗酸剂，例如Mg(OH)2或ZnCO3。可以调节缓冲能力以匹配对pH稳定性最敏感的条件。
[0800] (ii)等渗性改性剂：最大限度地减少由于注射储库处的渗透压差引起的细胞损伤而引起的疼痛。甘油和氯化钠是实例。可以通过渗透压测定法，使用285mOsmol/kg-315mOsmol/kg的假定的血清渗透压测定有效的浓度。
[0801] (iii)防腐剂和/或抗微生物剂：多剂量肠胃外制剂可能需要添加足够浓度的防腐剂，以使受试者在注射后被感染的风险降至最低，并且已经建立了相应的法规要求。典型的防腐剂包括间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、硝酸苯汞、硫汞撒(thimerosol)、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵。
[0802] (iv)稳定剂：通过增强蛋白质的稳定力、通过变性状态的去稳定作用，或通过赋形剂与蛋白质的直接结合来实现稳定。稳定剂可以是氨基酸，例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸；糖，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖；多元醇，例如甘油、甘露醇、山梨醇；盐，例如磷酸钾、硫酸钠；螯合剂，例如EDTA、六磷酸盐；配体，例如二价金属离子(锌、钙等)；其他盐或有机分子(例如酚的衍生物)。另外，可以使用寡聚物或聚合物，例如环糊精、右旋糖酐、树状物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、鱼精蛋白或人血清白蛋白。
[0803] (v)抗吸附剂：主要使用离子型或非离子型表面活性剂或其他蛋白质或可溶性聚合物，以竞争性方式涂覆或吸附至组合物容器的内表面，例如泊洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨醇酯20和80、右旋糖酐、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HSA以及明胶。所选择的赋形剂的浓度和类型取决于要避免的作用，但通常在界面上仅在CMC值之上形成表面活性剂的单层。
[0804] (vi)冻干或冷冻保护剂：在冷冻干燥或喷雾干燥过程中，赋形剂可能会抵消由氢键断裂和除水引起的不稳定作用。为此，可以使用糖和多元醇，但对于表面活性剂、氨基酸、非水性溶剂和其他肽也观察到了相应的正效应。海藻糖在减少水分引起的聚集方面特别有效，并且还改善了可能由于蛋白质疏水基团暴露于水而引起的热稳定性。还可以将甘露醇和蔗糖用作单独的冻干/冷冻保护剂，或在已知更高比例的甘露醇或蔗糖可以增强冻干饼的物理稳定性的情况下彼此结合使用。甘露醇也可以与海藻糖结合。海藻糖也可以与山梨醇结合，或可以将山梨醇用作唯一的保护剂。还可以使用淀粉或淀粉衍生物。
[0805] (vii)氧化保护剂：抗氧化剂，例如抗坏血酸，依克多因、甲硫氨酸、谷胱甘肽、单硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(PEI)、没食子酸丙酯、维生素E、螯合剂(如柠檬酸、EDTA、六磷酸盐、巯基乙酸)。
[0806] (viii)增粘剂或粘度增强剂：延迟颗粒在小瓶和注射器中的沉降，并用于促进颗粒的混合和重悬浮，并使悬浮液更易于注射(即，对注射器柱塞的较小作用力)。适合的增粘剂或粘度增强剂是例如，卡波姆增粘剂，如Carbopol 940、Carbopol Ultrez 10；纤维素衍生物，如羟丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素、HPMC)或二乙基氨基乙基纤维素(DEAE或DEAE-C)；胶态硅酸镁(Veegum)或硅酸钠；羟基磷灰石凝胶；磷酸三钙凝胶；黄原胶；角叉菜胶(如Satiagum UTC 30)；脂肪族聚(羟基酸)，如聚(D,L-或L-乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物(PLGA)；D,L-丙交酯、乙交酯和己内酯的三元聚合物；泊洛沙姆；亲水性聚(氧基乙烯)嵌段和疏水性聚(氧基丙烯)嵌段(以构成聚(氧基乙烯)-聚(氧基丙烯)-聚(氧基乙烯)的三嵌段(例如Pluronic.TM))；聚醚酯共聚物，例如聚乙二醇对苯二酸酯/聚丁烯对苯二酸酯共聚物；蔗糖乙酸酯异丁酸酯(SAIB)；右旋糖酐或其衍生物；右旋糖酐和PEG的组合；聚二甲基硅氧烷；胶原蛋白；壳聚糖；聚乙烯醇(PVA)和衍生物；聚烷基酰亚胺；聚(丙烯酰胺-共-二烯丙基二甲基铵(DADMA))；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；糖胺聚糖(GAG)，例如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素；透明质酸；由疏水性A嵌段(例如聚丙交酯(PLA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA))和亲水性B嵌段(例如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯基吡咯烷酮)组成的ABA三嵌段或AB嵌段共聚物；。这样的嵌段共聚物以及上述提及的泊洛沙姆可以表现出相反的热胶凝化行为(室温下的流体状态以促进施用，并且在注射后、在体温下高于溶胶-凝胶转变温度时的凝胶状态)。
[0807] (ix)扩散剂：通过胞间隙中细胞外基质的成分(例如但不限于透明质酸，在结缔组织的细胞间隙中发现的一种多糖)的水解，改变结缔组织的渗透性。分散剂(例如但不限于透明质酸酶)暂时降低细胞外基质的粘度并促进注射的药物的扩散。
[0808] (x)其他助剂：例如润湿剂、粘度调节剂、抗生素、透明质酸酶。酸和碱(例如，盐酸和氢氧化钠)是制造过程中用于调节pH所必需的助剂。
[0809] 可以将药物递送系统以液体、悬浮液或作为干组合物提供。
[0810] 在一个实施例中，该药物递送系统是干组合物。用于干燥的适合的方法是例如，喷雾干燥和冻干(冷冻干燥)。在一方面，该药物递送系统通过冻干被干燥。
[0811] 在一个实施例中，将该药物递送系统以组合物充分地给药，以在一次应用中提供治疗有效量的生物活性剂至少12小时。在一方面，药物递送系统的一次施用足以持续约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约2周、约3周、约4周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年或甚至更长。
[0812] 在一个实施例中，将药物递送系统按单一剂量提供，表示提供该药物递送系统的容器包含一个药物剂量。
[0813] 在另一个实施例中，将组合物按多剂量组合物提供，表示该组合物包含多于一个的治疗剂量。优选地，多剂量组合物包含至少2个剂量。可以将这样的多剂量药物递送系统用于对其需要的不同受试者，或旨在用于一个受试者，其中剩余的剂量在施用第一剂量之后被存储直到需要为止。
[0814] 在另一个实施例中，药物递送系统包含在一个或多个容器中。对于液体或悬浮液组合物，容器优选是单腔室注射器。对于干组合物，优选地，容器是双腔室注射器。将干组合物提供在双腔室注射器的第一腔室中，并且将重构溶液提供在双腔室注射器的第二腔室中。
[0815] 在将干药物递送系统施用于对其有需要的受试者之前，将干组合物进行重构。重构可以在提供干药物递送系统的容器(例如，小瓶、注射器、双腔室注射器、安瓿和药筒)中进行。通过向干组合物添加预定量的重构溶液来完成重构。重构溶液是无菌液体，例如磷酸盐缓冲盐水、等渗盐水、注射用水或其他缓冲液，其可以包含其他赋形剂，例如防腐剂和/或抗微生物剂，例如像苄醇和甲酚。优选地，该重构溶液是无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理盐水。可替代地，该重构溶液是用于注射的无菌水。
[0816] 另一个实施例是制备重构的组合物的方法，该重构的组合物包含治疗有效量的药物递送系统，和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂，该方法包括使组合物与一定体积的重构媒介物接触的步骤。然后可以将重构的药物递送系统通过注射或其他途径施用。
[0817] 另一个实施例是重构的组合物，该重构的组合物包含治疗有效量的药物递送系统、重构媒介物、和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
[0818] 另一个实施例是包含溶液或悬浮液的预填充的注射器，该溶液或悬浮液包含治疗有效量的药物递送系统，和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一方面，该注射器填充有在约0.01mL和约5mL之间的如本文所述的药物递送系统。在一方面，该注射器填充约0.05mL和约5mL之间、约1mL和约2mL之间、约0.1mL和约0.15mL之间、约0.1mL和约0.5mL之间、约0.15mL和约0.175mL之间或约0.5至约5mL。在一个实施例中，该注射器填充有0.165mL如本文所述的药物递送系统。在一些方面，注射器填充有约0.01mL、约0.02mL、约0.03mL、约
0.04mL、约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约1.2mL、约1.5mL、约
1.75mL、约2mL、约2.5mL、约3mL、约4mL或约5mL的如本文所述的药物递送系统。考虑到由于注射器和针头内的“死角”而造成的浪费，通常将注射器填充的剂量要多于向患者施用的所需剂量。当医生启动注射器时，还可以存在预定量的浪费，以便准备为患者注射。
0.04mL、约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约1.2mL、约1.5mL、约
1.75mL、约2mL、约2.5mL、约3mL、约4mL或约5mL的如本文所述的药物递送系统。考虑到由于注射器和针头内的“死角”而造成的浪费，通常将注射器填充的剂量要多于向患者施用的所需剂量。当医生启动注射器时，还可以存在预定量的浪费，以便准备为患者注射。
[0819] 在一个实施例中，取决于如本文所述的药物递送系统的注射途径，注射器被填充有在约0.01mL和约5mL之间(例如，在约0.01mL和约0.1mL之间、在约0.1mL和约0.5mL之间、在约0.2mL和约2mL之间、在约0.5mL和约5mL之间、或在约1mL和约5mL之间)的剂量体积(即，旨在用于递送至患者的药物体积)。在旨在用于玻璃体内注射的一个实施例中，如本文所述，注射器被填充有剂量体积为在约0.01mL和约0.1mL之间的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为1mg/mL至40mg/mL。在旨在用于关节内注射的一个实施例中，如本文所述，注射器被填充有剂量体积为在约0.05mL和约5.0mL之间的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为1mg/mL至40mg/mL。在旨在用于皮下注射的一个实施例中，如本文所述，注射器被填充有剂量体积为在约0.1mL和约5.0mL之间的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为0.1mg/mL至40mg/mL。在旨在用于通过其他途径注射的实施例中，如本文所述，注射器被填充有剂量体积为在约0.01mL和约5.0mL之间的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为0.1mg/mL至40mg/mL。在一些方面，注射器填充有约0.01mL、约0.02mL、约0.03mL、约0.04mL、约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约1.2mL、约1.5mL、约1.75mL、约2mL、约2.5mL、约3mL、约4mL或约5mL的如本文所述的药物递送系统，用于递送至对其有需要的患者。
[0820] 由于注射器包含药物溶液，因此可以将出口可逆地密封以维持该药物的无菌性。该密封可以通过本领域已知的密封装置来实现，例如鲁尔锁(luer lock)或防窃启密封。
[0821] 另一个实施例是包含一个或多个预填充的注射器的药盒，该一个或多个预填充的注射器包含如本文所述的一个或多个药物递送系统的溶液或悬浮液。在一个实施例中，这样的药盒包含预填充的注射器，该注射器包含在泡罩包装或密封套筒中的如本文所述的药物递送系统。泡罩包装或套筒的内部可以是无菌的。在一方面，如本文所述的预填充的注射器可以在进行灭菌(例如最终灭菌)之前放置在这种泡罩包装或套筒内。
[0822] 这样的药盒可进一步包括一个或多个用于施用本文所述的药物递送系统的针头。当药物递送系统有待在玻璃体内施用时，尽管可以使用31号规格或32号规格的针头，但通常使用30号规格×1/2-英寸针头。对于玻璃体内施用，33号规格或34号规格的针头可以被交替使用。此类药盒可以进一步包括使用说明书、药物标签、禁忌症、警告或其他相关信息。本文所述的一个实施例是包含一个或多个预填充的注射器的纸箱或包装，该一个或多个预填充的注射器包含在泡罩包装内的一种或多种如本文所述的药物递送系统，针头和任选的用于施用的说明书、药物标签、禁忌症、警告或其他相关信息。
[0823] 可以使用最终的灭菌工艺对注射器进行灭菌，并且这样的过程可以使用诸如环氧乙烷或过氧化氢(H2O2)灭菌工艺的已知工艺。可以通过与本文所述的药盒相同的方法对与注射器一起使用的针头进行灭菌。在一方面，将包装暴露于消毒的气体中，直到注射器的外部是无菌的。在这样的工艺后，注射器的外表面可保持无菌(当在泡罩包装中时)达6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月或更长时间。因此，在一个实施例中，如本文所述的预填充的注射器(在其泡罩包装中)可以具有长达6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月或甚至更长的保存期限。在一个实施例中，在储存18个月后，不到百万分之一的注射器在注射器的外部具有可检测到的微生物。在一方面，已经使用具有无菌保证水平为至少10-6的环氧乙烷对预填充的注射器进行了灭菌。在另一个方面，使用具有无菌保证水平为至少10-6的过氧化氢对预填充的注射器进行了灭菌。不应该使显著量的灭菌气体进入注射器的可变体积腔室。如本文使用的，术语“显著量”是指将导致在可变体积腔室内的药物递送系统溶液或悬浮液发生不可接受的改变的气体量。在一个实施例中，灭菌工艺引起药物递送系统的烷基化≤10％(优选≤5％、≤3％、≤1％)。在一个实施例中，已经使用环氧乙烷对预填充的注射器进行了灭菌，但注射器的外表面具有≤1ppm，优选≤0.2ppm的环氧乙烷残留。在一个实施例中，已经使用过氧化氢对预填充的注射器进行灭菌，但注射器的外表面具有≤1ppm，优选≤0.2ppm的过氧化氢残留。在另一个实施例中，已经使用环氧乙烷对预填充的注射器进行了灭菌，并且在注射器的外部和泡罩包装的内部发现的总环氧乙烷残留≤0.1mg。
在另一个实施例中，已经使用过氧化氢对预填充的注射器进行了灭菌，并且在注射器的外部和泡罩包装的内部发现的总的过氧化氢残留≤0.1mg。
在另一个实施例中，已经使用过氧化氢对预填充的注射器进行了灭菌，并且在注射器的外部和泡罩包装的内部发现的总的过氧化氢残留≤0.1mg。
[0824] 另一个方面是药盒套件。对于液体和悬浮液组合物，并且当给药装置仅是皮下注射器时，药盒可以包括注射器、针头和包含用于与注射器一起使用的药物递送系统组合物的容器。在干组合物的情况下，容器可以具有含有干药物递送系统组合物的一个腔室，和包含重构溶液的第二腔室。在一个实施例中，注射装置是经改适的皮下注射器，因此具有药物递送系统组合物的单独的容器可以与注射装置接合，使得在使用过程中，容器中的液体或悬浮液或重构的干组合物与注射装置的出口流体连通。给药装置的实例包括但不限于皮下注射器和笔式注射器装置。特别优选的注射装置是笔式注射器，在这种情况下，容器是药筒，优选是一次性药筒。
[0825] 另一个实施例包含药盒，该药盒包括针头和容器，该容器含有药物递送系统组合物并且任选地进一步含有重构溶液，该容器被改适以与针头一起使用。在一方面，该容器是预填充的注射器。在另一个方面，该容器是双腔室注射器。
[0826] 另一个实施例是包含如上所述的药物递送系统的组合物的药筒，该药筒与笔式注射器装置一起使用。该药筒可以包含单剂量或多剂量的药物递送系统。
[0827] 在另一个实施例中，药物递送系统溶液或悬浮液包含药物递送系统和一种或多种赋形剂，并且还包含处于其游离形式或作为药物或与其他药物递送系统(例如，聚乙二醇化药物或水凝胶连接的药物)组合的其他生物活性剂。在一方面，这种另外的一种或多种生物活性剂是游离形式的药物或第二药物递送系统。
[0828] 在另一个实施例中，将一个或多个药物递送系统同时施用，其中每个药物递送系统具有单独的或相关的生物学活性。
[0829] 在可替代的实施例中，将药物递送系统与第二生物活性化合物以以下方式组合，该方式使得首先将药物递送系统施用对其有需要的受试者，随后施用第二化合物。可替代地，在已经将另一种化合物施用受试者后，将药物递送系统组合物施用所述对其有需要的同一受试者。
[0830] 另一个实施例是由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，用作药物。
[0831] 另一个实施例是由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐，用于在肌肉骨骼障碍的治疗中使用。
[0832] 另一个实施例是由式(I)表示的包含D-R的药物递送系统或其药学上可接受的盐的用途，该用途是用于制造用于治疗肌肉骨骼障碍的药物。
[0833] 另一个实施例是用于在治疗或预防疾病或障碍的方法中使用的药物递送系统或药物组合物，该疾病或障碍可以通过从药物递送系统中释放的生物活性部分来治疗。
[0834] 另一个实施例是制造药物递送系统的溶液或悬浮液组合物的方法。在一个实施例中，通过以下来制备这样的组合物：
[0835] (i)将药物递送系统与一种或多种赋形剂混合；
[0836] (ii)将相当于单剂量或多剂量的液体或悬浮液组合物的量转移至适合的容器中；以及
[0837] (iii)将该容器密封。
[0838] 另一个实施例是制造药物递送系统的干组合物的方法。在一个实施例中，通过以下来制备这样的组合物：
[0839] (i)将药物递送系统与一种或多种赋形剂混合；
[0840] (ii)将相当于单剂量或多剂量的量转移至适合的容器中；
[0841] (iii)将该组合物在所述容器中进行干燥；以及
[0842] (iv)将该容器密封。
[0843] 适合的容器是小瓶、注射器、双腔室注射器、安瓿和药筒。
[0844] 另一个实施例是用于合成如上所述的药物递送系统或其药学上可接受的盐的方法。药物递送系统或药物递送系统的前体可以通过已知的方法，或根据如下所述的反应顺序来制备。在药物递送系统或其前体的制备(合成)中使用的起始物质是已知的或可商购
的，或可以通过已知的方法或如下所述来制备。
的，或可以通过已知的方法或如下所述来制备。
[0845] 对于相关领域的普通技术人员将显而易见的是，在不脱离任何实施例或其方面的范围的情况下，可以对本文所述的组合物、方法和施用进行适当的修改和改适。提供的组合物和方法是示例性的，并不旨在限制任何具体实施例的范围。可以将本文披露的各种实施例、方面和选择中的全部按任何和所有变型或重复进行组合。本文所述的组合物、配制品、方法、和工艺的范围包括本文所述的实施例、方面、选择、实例和偏好的所有实际或潜在的组合。
[0846] 实例
[0847] 缩写
[0848] Ac 乙酰基
[0849] ACN 乙腈
[0850] AcOH 乙酸
[0851] Ac2O 乙酸酐
[0852] aq. 水性的
[0853] atm 大气
[0854] Boc，BOC 叔丁基羧基
[0855] Boc-酸酐 二叔丁基二碳酸酯
[0856] (Boc)2O，(BOC)2O 二叔丁基二碳酸酯
[0857] br. 宽
[0858] BSA 牛血清白蛋白
[0859] BuOH 丁醇
[0860] CAD 带电气溶胶探测器
[0861] calcd. 经计算的
[0862] Cat，cat 催化性
[0863] CBZ，Cbz 苄氧羰基
[0864] Cu(OTf)2 三氟甲烷磺酸铜(II)
[0865] d 二重峰
[0866] dd 双重双重峰
[0867] DCM 二氯甲烷
[0868] DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯
[0869] DIPEA，DIEA N,N-二异丙基乙胺
[0870] DMAP 4,4-二甲基氨基吡啶
[0871] DMF N,N-二甲基甲酰胺
[0872] DMSO 二甲亚砜
[0873] DOSY-NMR 一维扩散有序NMR
[0874] ECL 电化学发光
[0875] Elem.Anal. 元素分析
[0877] EDC·HCl N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐
[0878] ESI 电喷雾离子化
[0879] EtOAc，AcOEt 乙酸乙酯
[0880] Et 乙基
[0881] EtOH 乙醇
[0882] FCC 快速柱色谱
[0883] FITC 异硫氰酸荧光素
[0884] g 克
[0885] G 规格
[0886] h 小时
[0887] HATU 2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)--1,1,3,3-四甲基脲
[0888] 鎓六氟磷酸盐甲铵
[0889] HC HPLC条件
[0890] HPLC 高效液相色谱
[0891] IPA 2-丙醇
[0892] IR 红外光谱
[0893] i或iso 异
[0894] IVT，ivt 玻璃体内的
[0895] K2CO3 碳酸钾
[0896] kD，kDa 千道尔顿
[0897] L 升
[0898] LCMS 液相色谱-质谱
[0899] M 摩尔/升
[0900] MHz 兆赫兹
[0901] m 多重峰
[0902] Me 甲基
[0903] MeCN 乙腈
[0904] MeOH 甲醇
[0905] MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸
[0906] mg 毫克
[0907] μg 微克
[0908] mM 毫摩尔/升
[0909] mm 毫米
[0910] min 分钟
[0911] mL 毫升
[0912] mmol 毫摩尔
[0913] μL 微升
[0914] μmol 微摩尔
[0915] MOPS 3-(N-吗啉代)丙磺酸
[0916] MS 质谱
[0917] MsCl 甲磺酰氯
[0918] MsOH 甲磺酸
[0919] MWCO 分子量截断
[0920] m/z 质荷比
[0921] N 正
[0922] NA 不可获得
[0923] NaBH4 硼氢化钠
[0924] NaBH3CN 氰基硼氢化钠
[0925] Na(AcO)3BH 三乙酰氧基硼氢化钠
[0926] ng 纳克
[0927] NH4Cl 氯化铵
[0928] NHS N-羟基琥珀酰亚胺
[0929] nM 纳摩尔/升
[0930] NMR 核磁共振
[0931] OMe 甲氧基
[0932] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0933] 1×PBS 磷酸盐缓冲盐水，典型地约10mM PO43-
[0934] Pd/C 钯碳
[0935] Pd(dppf)Cl2 1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)
[0936] Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2加 1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯
[0937] 合物 甲烷复合物
[0938] Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)钯(0)
[0939] Ph 苯基
[0940] ppm 百万分率
[0941] psi 磅/平方英寸
[0942] rac 外消旋
[0943] rcf 相对离心力
[0944] RP 反相
[0945] rt，RT 室温
[0946] s 单峰
[0947] sat. 饱和的
[0948] SDS-page 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0949] SEC 尺寸排阻色谱
[0950] SFC 超临界流体色谱
[0951] t 三重峰
[0952] t-Bu，tBu 叔丁基
[0953] t1/2 半衰期
[0954] tr或ret.time 保留时间
[0955] TBAF 四-正丁基氟化铵
[0956] TBSCl，TBDMSCl 叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物
[0957] TEA、Et3N、NEt3 三乙胺
[0958] tert- 叔
[0959] TFA 三氟乙酸
[0960] Tf2O 三氟甲烷甲磺酸酐
[0961] THF 四氢呋喃
[0962] TLC 薄层色谱
[0963] TMS 三甲基甲硅烷基
[0964] TMSOTf 三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐
[0965] Tris 三(羟甲基)氨基甲烷
[0966] Triton X-100 叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(CAS 9002-93-1)
[0967] Ts 对甲苯磺酰基
[0968] TsOH 对甲苯磺酸
[0969] Tween 20 聚山梨酯20、聚氧化乙烯(20)脱水山梨糖醇单
[0970] 月桂酸酯
[0971] UPLC 超高效液相色谱
[0972] UV 紫外线
[0973] VEGF 血管内皮生长因子
[0974] v/v 体积/体积
[0975] w/v 重量/体积
[0976] w/w 重量/重量
[0977] 这些实例中描述的以下药物被简称为：
[0978] D1：布洛赛珠单抗(SEQ ID NO:4)；
[0979] D2：(SEQ ID NO:5)；
[0980] D3：(SEQ ID NO:6)；以及
[0981] D4：(SEQ ID NO:7)。
[0982] 方法
[0983] 将下面
[0984]
[0985] 的一些实例中使用的((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯的合成描述于A.M.Jawalekar,等人；Molecules[分子],2013,18,
7346-7363中。
7346-7363中。
[0986] 将下面的
[0987]
[0988] 一些实例中使用的((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(4-硝基苯基)碳酸酯的合成描述于J.Dommerholt,等人；Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版]
2010,49,9422-9425中。
2010,49,9422-9425中。
[0989] 如本文未具体地作为合成而描述的所有其他的中间体和试剂是可商购的，并且如表述的那样使用。
[0990] LCMS方法
[0991] 方法1
[0992] 柱SunFire C18 3.5μm 3.0×30mm；柱温度40℃；流速2.0mL/min；终止时间2.20min；pH 2.2；洗脱液A1在水中的0.05％TFA；洗脱液B1乙腈；梯度时间(min)/％A(洗脱液A1)：％B(洗脱液B1)；0.00/95:5；1.70/5:95；2.00/5:95；2.10/95:5。
[0993] 方法2
[0994] 柱AcQuity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×30mm；柱温度50℃；流速1.0mL/min；终止时间2.00min；pH 2.6；洗脱液A1在水中的0.1％甲酸；洗脱液B1在乙腈中的0.1％甲酸；梯度时间(min)/％A(洗脱液A1)：％B(洗脱液B1)
[0995] 0.00/98:2；0.10/98:2；1.50/2:98；1.80/2:98；1.90/98:2；2.00/98:2。
[0996] 方法3
[0997] 柱：Kinetex 2.6μm C18 100A(100×4.6mm)；流动相A(在水中的0.1％甲酸)，B(乙腈)；梯度(时间(min)/％B)：0/5、1/30、3/95、4/95、4.1/5、6/5。
[0998] 方法4
[0999] 柱：AcQuity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×30mm；柱温度50℃；流速1.0mL/min；终止时间：2.00min；pH 2.6；洗脱液A1在水中的0.1％甲酸；洗脱液B1在乙腈中的0.1％甲酸；梯度时间(min)/％A(洗脱液A1)：％B(洗脱液B1)；0.00/98:2；0.10/98:2；1.50/2:98；1.80/2:98；1.90/98:2；2.00/98:2。
[1000] 方法5
[1001] 柱：SunFire C18 3.5μm 3.0×30mm；柱温度40℃；流速2.0mL/min；终止时间2.20min；pH 2.2；洗脱液A1在水中的5mM氢氧化铵；洗脱液B1乙腈；梯度时间(min)/％A(洗脱液A1)：％B(洗脱液B1)；0.00/95:5；1.70/5:95；2.00/5:95；2.10/95:5。
[1002] 方法6
[1003] 柱：Kinetex 2.6μm C18 100A，(100×4.60mm)；梯度/(时间(min)/％B)0/5、1/30、3/95、4/95、4.1/5、6/5；流动相：在水中的0.1％甲酸(A)/乙腈(B)；流速：1.4mL/min；柱温度：40℃。
[1004] 方法7
[1005] 柱：Synergi 2.5μm MAX-RP 100A Mercury(100×4.6mm)；流动相A(在水中的0.1％甲酸)，B(乙腈)；梯度(时间(min)/％B)：0/30、0.5/30、1.5/95、2.4/95、2.5/30、3.0/
30。
30。
[1006] 方法8
[1007] 柱：Kinetex 2.6μm C18 100A(100×4.6mm)；流动相A(在水中的0.1％甲酸)，B(乙腈)；梯度(时间(min)/％B)：0/50、1/70、2/100、4/100、4.1/50、6/50。在Acquity G2Xevo-QTOF-MS上记录ESI-MS数据。使用MassLynx软件包中的MaxEnt 1程序，将正离子质谱解卷积。
[1008] 方法9
[1009] 柱：Proswift Monolith(4.6x50mm)；流动相A(在水中的0.1％甲酸)，B(在乙腈中的0.1％甲酸)；梯度(时间(min)/％B)：0/2、0.7/2、2/98、2.1/98、2.3/2、3.3/2。在Acquity G2Xevo-QTOF-MS上记录ESI-MS数据。使用MassLynx软件包中的MaxEnt 1程序，将正离子质谱解卷积。记录了(M+H)+的解卷积的m/z。
[1010] 实例1
[1011] 无痕迹接头
[1012] 该实例描述了多种无痕迹接头的合成，该多种无痕迹接头能够与含有胺的药物缀合以及与载体缀合。
[1013]
[1014]
[1015]
[1016]
[1017] 无痕迹接头的合成
[1018] 常见的中间体：L-INT-1c
[1019]
[1020] L-INT-1b.1-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-3-(羟甲基)哌嗪
[1021]
[1022] 向可商购的N-Cbz-β-丙氨酸(SM-1，2.5g，11.2mmol)在四氢呋喃(30mL)中的0℃溶液里添加三乙胺(1.13g，11.2mmol)和乙基氯甲酸酯(1.21g，11.2mmol)。在0℃下，将溶液搅拌2小时，以提供N-Cbz-β-丙氨酸乙基碳酸酐(L-INT-1a)的原位形成。将该反应混合物添加至2-(羟甲基)哌嗪(SM-2，1.95g，16.8mmol)和三乙胺(1.13g，11.2mmol)在水(30mL)中的溶液里，并将所得混合物在室温下搅拌12小时。将该溶液用碳酸钠溶液(2M，1mL)调成碱性。添加盐水(2mL)，并将水相浓缩以给出粗固体。通过柱色谱(碱性氧化铝，用3％-15％甲醇:二氯甲烷洗脱)进行纯化，提供L-INT-1b。MS(ESI+)m/z 322.2(M+H)。
[1023] L-INT-1c.1-(Boc)-2-(羟甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)哌嗪
[1024]
[1025] 向L-INT-1b(1g，3.1mmol)在二氯甲烷(20mL)中的0℃溶液里添加三乙胺(0.504g，4.98mmol)和二叔丁基二碳酸酯(611mg，2.8mmol)。将该溶液在室温下搅拌2小时。将反应混合物用水处理，并用二氯甲烷萃取。将有机层干燥(硫酸钠)并蒸发。通过快速色谱(SiO2，用
2:98甲醇:二氯甲烷洗脱)进行纯化，提供L-INT-1c。MS(ESI+)m/z 422.2(M+H)。
2:98甲醇:二氯甲烷洗脱)进行纯化，提供L-INT-1c。MS(ESI+)m/z 422.2(M+H)。
[1026] 接头中间体L-INT-1.
[1027]
[1028] L-INT-1d.1-(Boc)-2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)哌嗪
[1029]
[1030] 向L-INT-1c(1g，2.37mmol)在二氯甲烷(15mL)中的0℃溶液里添加三乙胺(0.60g，5.93mmol)。然后逐滴添加甲氧基乙酰氯(307mg，2.85mmol)，并将该溶液在室温下搅拌12小时。将反应混合物用水处理，并用二氯甲烷萃取。将有机层干燥(硫酸钠)并蒸发。通过快速色谱(SiO2，用1％-2％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供L-INT-1d。MS(ESI+)m/z 494.2(M+H)。
[1031] L-INT-1e.1-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-3-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)哌嗪，三氟乙酸盐
[1032]
[1033] 向L-INT-1d(1g，2.02mmol)在二氯甲烷(26mL)中的0℃溶液里添加三氟乙酸(7mL)。将该溶液在室温下搅拌3小时。将该反应混合物浓缩，用戊烷洗涤，并在高真空下干燥，以提供三氟乙酸盐L-INT-1e。MS(ESI+)m/z 394(M+H)。
[1034] L-INT-1.2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1035]
[1036] 向L-INT-1e(1.0g，2.54mmol)和碳酸钾(1.05g，7.63mmol)在乙腈(25mL)中的0℃混合物里逐滴添加叔丁基溴乙酸酯(0.744g，3.82mmol)。将该溶液在室温下搅拌24小时。将该反应混合物用水处理，并用乙酸乙酯萃取。将有机层干燥(硫酸钠)并蒸发。通过快速色谱(SiO2，用1％-2％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供呈无色粘性固体的L-INT-1。LCMS(方法8)：保留时间＝3.43min；MS(ESI+)m/z 508.3(M+H)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.35-7.28(m,
5H),5.58-5.52(m,1H),5.08(s,2H),4.38-4.22(m,1H),4.20-4.08(m,1H),4.10-4.00(m,
3H),4.00-3.90(m,1H),3.70-3.60(m,1H),3.60-3.54(m,1H),3.50-3.49(d,J＝4,4H),3.45(s,3H),3.42-3.38(m,1H),3.33(s,1H),3.32-3.29(m,1H),3.28-3.20(m,1H),3.18-3.10
(m,1H),3.10-3.00(m,1H),2.86-2.72(m,2H),2.53-2.51(t,J＝4,2H),1.46(s,9H)。
5H),5.58-5.52(m,1H),5.08(s,2H),4.38-4.22(m,1H),4.20-4.08(m,1H),4.10-4.00(m,
3H),4.00-3.90(m,1H),3.70-3.60(m,1H),3.60-3.54(m,1H),3.50-3.49(d,J＝4,4H),3.45(s,3H),3.42-3.38(m,1H),3.33(s,1H),3.32-3.29(m,1H),3.28-3.20(m,1H),3.18-3.10
(m,1H),3.10-3.00(m,1H),2.86-2.72(m,2H),2.53-2.51(t,J＝4,2H),1.46(s,9H)。
[1037] 使用类似于用于合成L-INT-1的方法，来制备表7中所示的种类。
[1038]
[1039]
[1040] L-INT-5.2-(1’-甲基环丙基羰基氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1041]
[1042] L-INT-5a.1-(Boc)-2-(1’-甲基环丙基羰基氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)哌嗪
[1043]
[1044] 向L-INT-1c(1.0g，2.37mmol)、1-甲基环丙烷甲酸(0.475g，4.75mmol)和2-氯-1-甲基-吡啶鎓碘化物(1.21g，4.75mmol)在甲苯(20mL)中的溶液里添加三乙胺(5.0mL)，并将所得反应在110℃下搅拌24小时。将该反应混合物用水处理，并用乙酸乙酯萃取。将有机相用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。通过快速色谱(SiO2，用1％-2％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供L-INT-5a。MS(ESI+)m/z 504.2(M+H)。
[1045] L-INT-5.2-(1’-甲基环丙基羰基氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1046] 根据对L-INT-1e和L-INT-1的合成所描述的一般方法，L-INT-5以两个步骤从L-INT-5a制备。L-INT-5：LCMS(方法8)：保留时间＝3.84min；MS(ESI+)m/z 518.3 1H NMR(400MHz,CDCl3)7.35-7.30(m,5H),5.5(s 1H),5.08(s,2H),4.28-4.12(m,2H),4.06-3.88
(m,2H),3.67-3.49(m,3H),3.41-3.28(m,3H),3.26-3.17(m,1H),3.12-3.05(m,1H),3.03-
2.90(m,1H),2.78-2.74(m,2H),2.53-2.50(t,J＝8,2H),1.45(s,9H),1.29(s,3H),1.25-
1.20(m,2H),0.73-0.68(m,2H)。
(m,2H),3.67-3.49(m,3H),3.41-3.28(m,3H),3.26-3.17(m,1H),3.12-3.05(m,1H),3.03-
2.90(m,1H),2.78-2.74(m,2H),2.53-2.50(t,J＝8,2H),1.45(s,9H),1.29(s,3H),1.25-
1.20(m,2H),0.73-0.68(m,2H)。
[1047] L-INT-6和L-INT-7.2-(乙酰氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯的手性拆分
[1048]
[1049] 将L-INT-2的各个对映异构体通过L-INT-2的制备型手性HPLC纯化(菲罗门(Phenomenex)Lux Amylose-2柱，5μm，250mm×21.2mm)，用具有以下组合(等度)的20mL/min的流动相洗脱来分离：55％正己烷、45％70:30的乙醇:异丙醇(含0.1％二乙胺)。将含有产物的级分蒸发，溶解于氯仿中，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，并蒸发，以提供立体异构体L-INT-
6和L-INT-7。
6和L-INT-7。
[1050] L-INT-6：LCMS(方法8)：保留时间＝1.93min；MS(ESI+)m/z 478.3(M+H)。手性HPLC(方法如下)：保留时间＝8.018min；98.3％纯度)。
[1051] L-INT-7：LCMS(方法8)：保留时间＝1.92min；MS(ESI+)m/z 478.3(M+H)。手性HPLC(方法如下)：保留时间＝9.694min；94.4％纯度)。
[1052] 手性HPLC方法：柱：菲罗门Lux Amylose-2,5μm，250mm×4.60mm；柱温度25℃；流速1.0mL/min；流动相：A＝己烷，B＝乙醇:甲醇1:1；洗脱：等度30:70A:B。
[1053] 无痕迹接头；L1-L7
[1054]
[1055] L-2a.2-(乙酰氧基甲基)-4-(β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1056]
[1057] 将L-INT-2(185.5mg，0.39mmol)溶解于甲醇(12mL)中，并进行流氢解作用(钯碳药筒，5atm H2，35℃，1小时，以1mL/min流速)。将该溶液蒸发，以提供标题化合物L-2a。LCMS(方法1)：保留时间＝0.72min；MS(ESI+)m/z 344.1(M+H)。
[1058] L-2b:2-(乙酰氧基甲基)-4-(β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸，双三氟乙酸盐
[1059]
[1060] 将L-2a(123.2mg，0.36mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(1mL)中。将该反应在室温下搅拌过夜，然后蒸发，以提供粗标题物质(L-2b)。LCMS(方法1)：保留时间＝0.10min；MS(ESI+)m/z 288.0(M+H)。
[1061] L2.2-(乙酰氧基甲基)-4-(N-(((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸
[1062]
[1063] 将粗L-2b(163mg，0.57mmol)吸收在二氯甲烷和乙腈中，以提供微浑浊的混合物。添加三乙胺(0.40mL，2.84mmol)和((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(182mg，0.63mmol)产生溶液，将该溶液在0.5小时后进行蒸发。将粗物质溶解于6mL的3:1乙腈:水中，并通过HPLC(柱：沃特斯XBridge BEH 5μm 19×150mm；
方法：在水中的15％-30％乙腈10min梯度(10mM氢氧化铵)，30mL/min)进行纯化。将级分蒸发，快速冷冻并冻干，以提供L2。LCMS(方法1)：保留时间＝0.97min；MS(ESI+)m/z 464.1(M+H)。1H-NMR(CD3OD,ppm)(样品包含痕量残余三乙胺):4.17(m,4H)；4.00(m,1H),3.75(m,1H),
3.5-3.32(m,5H),3.06(m,1H),2.91(m,1H),2.79(m,1H),2.60(t,2H),2.19(m,6H),2.05(m,
3H),1.59(m,2H),1.38(m,1H),0.96(m,2H)。
方法：在水中的15％-30％乙腈10min梯度(10mM氢氧化铵)，30mL/min)进行纯化。将级分蒸发，快速冷冻并冻干，以提供L2。LCMS(方法1)：保留时间＝0.97min；MS(ESI+)m/z 464.1(M+H)。1H-NMR(CD3OD,ppm)(样品包含痕量残余三乙胺):4.17(m,4H)；4.00(m,1H),3.75(m,1H),
3.5-3.32(m,5H),3.06(m,1H),2.91(m,1H),2.79(m,1H),2.60(t,2H),2.19(m,6H),2.05(m,
3H),1.59(m,2H),1.38(m,1H),0.96(m,2H)。
[1064] 使用类似于用于合成L2的方法，来制备表8中所示的种类。
[1065]
[1066]
[1067]
[1068]
[1069] 无痕迹接头L8.2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6’-叠氮基己酰基)-1-哌嗪乙酸[1070]
[1071] L-8a.1-(Boc)-2-(羟甲基)-4-(6’-叠氮基己酰基)哌嗪
[1072]
[1073] 将6-叠氮基己酸(743mg，4.73mmol)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.0g，5.22mmol)称重到圆底烧瓶中，并溶解于二氯甲烷(20mL)中。5分钟后，添加固体叔丁基2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸酯(0.98g，4.53mmol)和二异丙基乙胺(1.0mL，5.73mmol)，并将该溶液储存在室温下过夜。第二天，将该反应混合物用100mL的二氯甲烷进行稀释，并用1M HCl(2×50mL)、1M NaOH(1×50mL)和盐水(1×50mL)进行洗涤。将有机相浓缩，以提供L-8a。MS(ESI+)m/z 356.3(M+H)。
[1074] L-8b.1-(Boc)-2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6”-叠氮基己酰基)哌嗪
[1075]
[1076] 在圆底烧瓶中，将L-8a(959mg，2.70mmol)溶解于二氯甲烷(12mL)。添加搅拌棒和二异丙基乙胺(1mL，5.73mmol)，随后添加2-甲氧基乙酰氯(0.32mL，3.51mmol)，并给该烧瓶加盖。将该反应在室温下搅拌。6小时后，再添加100μL的2-甲氧基乙酰氯。30分钟后，将该反应混合物用90mL乙酸乙酯稀释，并用1M HCl(2×25mL)和盐水(1×20mL)洗涤。使用旋转蒸发仪，将有机相进行浓缩。通过在二氧化硅上，用乙酸乙酯:庚烷梯度进行快速柱色谱，将产物进行纯化。将包含产物的级分合并，并浓缩，以提供L-8b。MS(ESI+)m/z＝428.3(M+H)。
[1077] L-8c.1-(6’-叠氮基己酰基)-3-(2”-甲氧基乙酰氧基甲基)哌嗪，三氟乙酸盐
[1078]
[1079] 将L-8b(846mg，1.979mmol)溶解于三氟乙酸(10mL，130mmol)和二氯甲烷(10mL)中。将该溶液在室温下搅拌。1小时后，使用旋转蒸发仪去除溶剂，并将该产物在真空下干燥以提供L-8c。MS(ESI+)m/z 328.2(M+H)。
[1080] L-8d.2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6”-叠氮基己酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1081]
[1082] 在具有搅拌棒的玻璃小瓶中，将L-8c(439mg，0.994mmol)溶解于二甲基甲酰胺(5mL)中。添加叔丁基溴乙酸酯(0.220mL，1.491mmol)和二异丙基乙胺(0.868mL，
4.97mmol)，并给该小瓶加帽。将该反应在50℃下搅拌过夜。第二天，将该反应混合物从热源去除，并储存在-20℃下直到第二天纯化。通过在二氧化硅上用庚烷:乙酸乙酯梯度进行快速柱色谱，将该反应混合物进行纯化而无需萃取后处理。将包含产物的级分合并，并浓缩以提供L-8d。MS(ESI-)m/z＝486.5(M+甲酸盐)。
4.97mmol)，并给该小瓶加帽。将该反应在50℃下搅拌过夜。第二天，将该反应混合物从热源去除，并储存在-20℃下直到第二天纯化。通过在二氧化硅上用庚烷:乙酸乙酯梯度进行快速柱色谱，将该反应混合物进行纯化而无需萃取后处理。将包含产物的级分合并，并浓缩以提供L-8d。MS(ESI-)m/z＝486.5(M+甲酸盐)。
[1083] L8.2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6”-叠氮基己酰基)-1-哌嗪乙酸
[1084]
[1085] 将L-8d(150mg，0.317mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)中，并将该反应在室温下搅拌过夜。第二天，使用旋转蒸发仪将该溶液浓缩，并将残余物重新溶解于4mL乙腈中。将该溶液过滤，并通过具有质量定向级分收集的制备型反相HPLC进行纯化(以下方法)。将包含产物的级分合并，冷冻，并冻干，以提供L8。MS(ESI+)m/z＝386.5(M+H)。制备型HPLC条件：沃特斯Sunfire C18；粒度：5μm；柱尺寸：30×50mm；洗脱液/梯度：10％CH3CN/H2O/0.7min、10％-30％CH3CN/H2O/3.5min、30％-95％CH3CN/H2O 0.5min(含有0.1％TFA的CH3CN和H2O)；流速：75mL/min；柱温度：室温；总m/z：+385。
[1086] 无痕迹接头：L9-L11
[1087]
[1088] L-9a.2-(丙酰基氧基甲基)-4-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸，三氟乙酸盐
[1089]
[1090] 在0℃下，将L-INT-3(250mg，0.51mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，然后用三氟乙酸(2.5mL)处理，并在室温、氩气下搅拌6小时。将反应进行蒸发，用戊烷洗涤，并干燥以提供呈三氟乙酸盐的粗L-9a。LCMS(方法5)：保留时间＝0.262min；MS(ESI+)m/z 436.2(M+H)。
[1091] L-9b.2-(丙酰基氧基甲基)-4-(β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸
[1092]
[1093] 将L-9a(250mg，0.57mmol)溶解于乙醇(5mL)中，向其中添加10％钯碳(25mg)。将该溶液在氢气囊下搅拌6小时，并然后通过 过滤，用乙醇洗涤。将合并的滤液进行蒸发，以提供化合物L-9b。LCMS(方法5)：保留时间＝0.774min；MS(ESI+)m/z 302.2(M+H)。
[1094] L9.
[1095]
[1096] 在0℃下，将在乙酸乙酯(5mL)中的L-9b(100mg，0.33mmol)和5-叠氮基戊酸(57mg，0.40mmol)用二异丙基乙胺(107mg，0.83mmol)和丙基膦酸酐(在乙酸乙酯中的50％溶液，
158mg，0.50mmol)处理。将该反应在室温、氩气下搅拌16小时，然后用水淬灭并蒸发。初始快速色谱(SiO2，10％甲醇:二氯甲烷)，然后进行制备型HPLC(柱：zorbax C-18 4.6×150mm；
流动相A＝:在水中的甲醇(1:1)0.01％TFA，流动相B＝乙腈:甲醇(1:1)；时间＝0分钟：30％B；1分钟：70％B；6分钟：100％B；1mL/min)，以提供L9。LCMS(方法5)：保留时间＝0.18min；MS(ESI+)m/z 427.1(M+H)。1H-NMR(CD3OD,ppm)(所有分配是临时的)4.23-4.17(m,2H),4.16-
3.98(m,1H),3.78-3.62(m,1H),3.54(s,2H),3.46-3.43(t,J＝4,3H),3.26-3.20(m,1H),
3.18-3.05(m,1H),3.03-2.76(m,2H),2.64-2.61(t,J＝8,2H),2.43-2.36(m,2H),2.24-
2.21(t,J＝8,2H),1.75-1.58(m,4H),1.15-1.12(t,J＝8,3H)。
158mg，0.50mmol)处理。将该反应在室温、氩气下搅拌16小时，然后用水淬灭并蒸发。初始快速色谱(SiO2，10％甲醇:二氯甲烷)，然后进行制备型HPLC(柱：zorbax C-18 4.6×150mm；
流动相A＝:在水中的甲醇(1:1)0.01％TFA，流动相B＝乙腈:甲醇(1:1)；时间＝0分钟：30％B；1分钟：70％B；6分钟：100％B；1mL/min)，以提供L9。LCMS(方法5)：保留时间＝0.18min；MS(ESI+)m/z 427.1(M+H)。1H-NMR(CD3OD,ppm)(所有分配是临时的)4.23-4.17(m,2H),4.16-
3.98(m,1H),3.78-3.62(m,1H),3.54(s,2H),3.46-3.43(t,J＝4,3H),3.26-3.20(m,1H),
3.18-3.05(m,1H),3.03-2.76(m,2H),2.64-2.61(t,J＝8,2H),2.43-2.36(m,2H),2.24-
2.21(t,J＝8,2H),1.75-1.58(m,4H),1.15-1.12(t,J＝8,3H)。
[1097] 使用类似于用于合成L-9的方法，来制备表9中所示的种类：
[1098]
[1099]
[1100]
[1101] 无痕迹接头：L12和L13
[1102]
[1103] L-12a.1-(Boc)-2-(羟甲基)-4-(N-马来酰基-β-丙氨酰基)哌嗪
[1104]
[1105] 在0℃下，将叔丁基2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸酯(200mg，0.93mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)。添加二异丙基乙胺(359mg，2.78mmol)和HATU(422mg，1.11mmol)，并将该溶液在0℃下搅拌15分钟。添加3-马来酰亚胺基丙酸(187mg，1.11mmol)，并然后将该反应在室温，氩气下搅拌12小时。将该反应用水稀释，并用二氯甲烷萃取。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(中性氧化铝，2％甲醇:乙酸乙酯)进行纯化，提供标题物质L-12a。LCMS(方法6)：保留时间＝2.87min。
[1106] L-12b.1-(Boc)-2-(乙酰氧基甲基)-4-(N-马来酰基-β-丙氨酰基)哌嗪
[1107]
[1108] 在0℃，氩气下，向在二氯甲烷(4mL)中的L-12a(300mg，0.82mmol)和三乙胺(330mg，3.27mmol)里逐滴添加乙酰氯(125mg，1.64mmol)。将该反应在室温下搅拌3小时，然后用水处理，并用二氯甲烷萃取。将有机层干燥(硫酸钠)，浓缩，并且通过快速色谱(中性氧化铝，2％甲醇:乙酸乙酯)进行纯化，以提供标题物质L-12b。LCMS(方法6)：保留时间＝
3.2min。
3.2min。
[1109] L-12c.1-(N-马来酰基-β-丙氨酰基)-3-(乙酰氧基甲基)哌嗪，三氟乙酸盐
[1110]
[1111] 在0℃下，将L-12b(200mg，0.49mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，然后用三氟乙酸(0.4mL)逐滴处理，并在室温氩气下搅拌3小时。将该反应蒸发，用戊烷洗涤，并干燥，以提供粗标题物质L-12c。LCMS(方法6)：保留时间＝1.709min；MS(ESI+)m/z 310(M+H)。
[1112] L12.2-(乙酰氧基甲基)-4-(N-马来酰基-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1113]
[1114] 在0℃下，向在乙腈(5mL)中的L-12c(140mg，0.45mmol)和碳酸钾(156mg，1.13mmol)里逐滴添加叔丁基溴乙酸酯(100mg，0.54mmol)。将该反应加热至10℃-15℃，然后在室温、氩气下允许搅拌12小时。将该反应用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层干燥(硫酸钠)，浓缩，并通过制备型HPLC(柱：zorbax eclipse XDB C18，21.2×150mm，5μm；流动相A＝水，流动相B＝乙腈；时间＝0分钟：30％B；2分钟：40％B；10分钟：60％B)进行纯化，以提供L12。LCMS(方法6)：保留时间＝3.08min；MS(ESI+)m/z 424(M+H)。1H-NMR(CDCl3,ppm)
6.69(s,2H),4.25-4.14(m,2H),4.09-3.96(m,2H),3.88-3.83(t,J＝9,2H),3.65-3.54(m,
1H),3.46-3.33(m,2H),3.31-3.17(m,2H),3.05-2.98(m,2H),2.84-2.75(m,2H),2.68-2.63(t,J＝9,2H),2.09-2.07(d,J＝6,3H),1.45(s,9H)。
6.69(s,2H),4.25-4.14(m,2H),4.09-3.96(m,2H),3.88-3.83(t,J＝9,2H),3.65-3.54(m,
1H),3.46-3.33(m,2H),3.31-3.17(m,2H),3.05-2.98(m,2H),2.84-2.75(m,2H),2.68-2.63(t,J＝9,2H),2.09-2.07(d,J＝6,3H),1.45(s,9H)。
[1115] 使用类似于用于合成L12的方法，来制备L13：
[1116] L13.2-(2’-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(N-马来酰基-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-4-(3-(马来酰亚胺基)丙酰基)哌嗪-2-基)甲基2-甲氧基乙酸酯
[1117]
[1118] L13.LCMS(方法6)：保留时间＝3.04min；MS(ESI+)m/z 454.5(M+H)。1H-NMR(CDCl3,ppm)6.70(s,2H),4.40-4.24(m,1H),4.20-4.10(m,1H),4.07-4.60(d,J＝4,2H),4.02-3.94(m,1H),3.87-3.83(t,J＝8,2H),3.70-3.60(m,1H),3.68-3.60(m,1H),3.58-3.51(m,1H),3.45(s,3H),3.41-3.39(d,J＝8,1H),3.36-3.32(s,1H),3.32-3.28(s,1H),3.18-3.10(m,
1H),3.04-2.97(m,1H),2.83-2.81(t,J＝4,1H),2.79-2.75(m,1H),2.67-2.64(t,J＝8,
2H),1.46(s,9H)。
1H),3.04-2.97(m,1H),2.83-2.81(t,J＝4,1H),2.79-2.75(m,1H),2.67-2.64(t,J＝8,
2H),1.46(s,9H)。
[1119] 无痕迹接头；L14-L16
[1120]
[1121] L14a.1-(Boc)-2-(羟甲基)-4-(3’-(2”-(2”’-(2””-((N-Cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪
[1122]
[1123] 在0℃下，向溶解于二氯甲烷(20mL)中的叔丁基2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸酯(1.0g，4.63mmol)里添加二异丙基乙胺(1.79g，13.9mmol)和HATU(2.10g，5.55mmol)。将溶液在0℃下搅拌15分钟。添加3-(2’-(2”-(2”’-((N-Cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸
(1.64g，4.63mmol)，并将该反应在室温、氩气下搅拌16小时。将该反应用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(SiO2，1％-4％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供标题物质L-14a。LCMS(方法5)：保留时间＝1.27min；MS(ESI+)m/z
554.3(M+H)。
(1.64g，4.63mmol)，并将该反应在室温、氩气下搅拌16小时。将该反应用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(SiO2，1％-4％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供标题物质L-14a。LCMS(方法5)：保留时间＝1.27min；MS(ESI+)m/z
554.3(M+H)。
[1124] L-14b.1-(Boc)-2-(乙酰氧基甲基)-4-(3’-(2”-(2”’-(2””-((N-Cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪
[1125]
[1126] 在0℃下，向溶解于二氯甲烷(20mL)中的L-14a(500mg，0.90mmol)和三乙胺(228mg，2.26mmol)里逐滴添加乙酰氯(83mg，1.08mmol)。将该反应在室温、在氩气下搅拌16小时。将该反应用水稀释，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并浓缩，然后通过快速色谱(SiO2，1％-4％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，以提供标题物质L-14b。LCMS(方法
7)：保留时间＝1.54min；MS(ESI+)m/z 595.8(M+H)。
7)：保留时间＝1.54min；MS(ESI+)m/z 595.8(M+H)。
[1127] L-14c.1-(3’-(2”-(2”’-(2””-((N-Cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-3-(乙酰氧基甲基)哌嗪，三氟乙酸盐
[1128]
[1129] 在0℃下，将L-14b(500mg，0.84mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，然后用三氟乙酸(3mL)逐滴处理，并在室温、氩气下搅拌3h。将该反应蒸发，用戊烷洗涤，并干燥，以提供粗标题物质L-14c，将其无需进一步纯化或分析即可用于下一步反应。
[1130] L14.2-(乙酰氧基甲基)-4-(3’-(2”-(2”’-(2””-((N-Cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁酯
[1131]
[1132] 在0℃下，向在乙腈(10mL)中的L-14c(500mg，1.0mmol)和碳酸钾(418mg，3.03mmol)里逐滴添加叔丁基溴乙酸酯(295mg，1.51mmol)。将该反应在室温、氩气下搅拌20小时。将该反应用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层干燥(硫酸钠)，浓缩并通过初始快速色谱(SiO2，1％-5％甲醇:二氯甲烷)，随后通过制备型HPLC(柱：zorbax eclipse XDB C18，
4.6×150mm，5μm；流动相A＝在水中的0.01％TFA，流动相B＝乙腈:甲醇(1:1)，1mL/min；时间＝0分钟：30％B；1分钟：70％B；6分钟：100％B)进行纯化，以提供L14。LCMS(方法5)：保留时间＝3.43min；MS(ESI+)m/z 610.35(M+H)。1H-NMR(CDCl3,ppm)7.36-7.31(m,5H),5.49(s,
1H),5.09(s,2H),4.26-4.16(m,1H),4.07-3.98(m,1H),3.78-3.74(t,J＝6,2H),3.60-3.53(m,11H),3.39-3.32(m,4H),2.84-2.72(m,2H),2.61-2.57(t,J＝3,2H),2.08-2.06(d,J＝
6,2H),1.45(s,9H)。
4.6×150mm，5μm；流动相A＝在水中的0.01％TFA，流动相B＝乙腈:甲醇(1:1)，1mL/min；时间＝0分钟：30％B；1分钟：70％B；6分钟：100％B)进行纯化，以提供L14。LCMS(方法5)：保留时间＝3.43min；MS(ESI+)m/z 610.35(M+H)。1H-NMR(CDCl3,ppm)7.36-7.31(m,5H),5.49(s,
1H),5.09(s,2H),4.26-4.16(m,1H),4.07-3.98(m,1H),3.78-3.74(t,J＝6,2H),3.60-3.53(m,11H),3.39-3.32(m,4H),2.84-2.72(m,2H),2.61-2.57(t,J＝3,2H),2.08-2.06(d,J＝
6,2H),1.45(s,9H)。
[1133] 使用类似于用于合成L14的方法，来制备表10中所示的种类：
[1134]
[1135]
[1136]
[1137]
[1138]
[1139]
[1140]
[1141] 实例2
[1142] 无痕迹接头与生物活性部分的加合物
[1143] 该实例描述了多种无痕迹接头-药物加合物的合成，该加合物还能够与载体缀合。
[1144]
[1145]
[1146]
[1147] 加合物的合成
[1148] 生物活性部分与无痕迹接头：
[1149] L4-NHS的酰化。2-(异丁酰基氧基甲基)-4-(N-(((1R’,8’S,9’s)-二环[6.1.0]壬-4’-炔-9’-基)甲氧基羰基)-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯
[1150]
[1151] 将L4(22mg，0.045mmol)在二氯甲烷(5mL)中的悬浮液用三乙胺(0.0062mL，0.045mmol)、二甲基氨基吡啶(0.55mg，0.0045mmol)和N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯
(10.9mg，0.043mmol)处理，并在室温下搅拌2小时，然后蒸发，并无需进一步纯化而立即使用。LCMS(方法1)：保留时间＝1.33min；MS(ESI+)m/z 589.6(M+H)。
(10.9mg，0.043mmol)处理，并在室温下搅拌2小时，然后蒸发，并无需进一步纯化而立即使用。LCMS(方法1)：保留时间＝1.33min；MS(ESI+)m/z 589.6(M+H)。
[1152] 使用类似于用于合成L4-NHS的方法，来制备表13中所示的种类。
[1153]
[1154]
[1155] L4-布洛赛珠单抗(L4D1b)
[1156]
[1157] 将缓冲液(由20mM柠檬酸三钠二水合物、125mM氯化钠、0.01mg/mL Tween 20组成，在pH 6.25下)中的布洛赛珠单抗(10mL、0.023mmol)的60mg/mL溶液用1×PBS(10mL、pH 7.4)稀释，以提供30mg/mL的溶液，然后将该溶液用38mM的L4-NHS在DMSO(0.65mL，
0.023mmol)中的溶液缓慢处理、涡旋，并在室温下保持1小时。通过超速离心(Vivaspin浓缩器、10kDa MWCO)纯化，用1×PBS(4次)洗涤去除残余的小分子杂质，产生L4D1和未经修饰的布洛赛珠单抗(D1)的混合物。MS(方法9)解卷积的m/z 26312(布洛赛珠单抗，M+H)；解卷积的m/z 26786(L4D1、M+H，预期的MW＝MW(布洛赛珠单抗)+473)。
0.023mmol)中的溶液缓慢处理、涡旋，并在室温下保持1小时。通过超速离心(Vivaspin浓缩器、10kDa MWCO)纯化，用1×PBS(4次)洗涤去除残余的小分子杂质，产生L4D1和未经修饰的布洛赛珠单抗(D1)的混合物。MS(方法9)解卷积的m/z 26312(布洛赛珠单抗，M+H)；解卷积的m/z 26786(L4D1、M+H，预期的MW＝MW(布洛赛珠单抗)+473)。
[1158] 重要的分析参数是确定(未经修饰的布洛赛珠单抗，n＝0):(单酰化的布洛赛珠单抗，n＝1):(聚酰化的布洛赛珠单抗，n>1)的比率。通过比较质谱中各种物质的相对峰高，允许估算出待产生的产物比率，但该比率可能不准确，因为各种产物在MS分析中可能不具有类似的摩尔/升应答因子。在该实例中：MS分析表明产物比率[(n＝0):(n＝1):(n＝2)]约为5:1:0(方法9)。
[1159] 用于估算反应产物比率的另外的方法是利用对衍生的反应产物进行的SEC(尺寸排阻色谱)或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析；为实现对反应产物的分离，需要衍生化。
[1160] L4D1b衍生化反应
[1161]
[1162]
[1163] 将来自30mg/mL L4D1b反应混合物(0.005mL，0.0057μmol)的反应溶液的等分试样用Mn约5kDa的甲氧基-PEG-叠氮化物(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，689475，在1×PBS中的10μL 100mg/mL溶液，0.20μmol)处理，涡旋，然后在37℃下振荡45分钟。
[1164] 对L4D1b衍生物的分析
[1165] SEC：(柱：安捷伦AdvanceBioSEC 300A 2.7μm 4.6×150mm；流动相：在水中150mM磷酸钾，含有5％异丙醇(等度)；快方法：0.2mL/min持续13min；慢方法：0.1mL/min持续25min；检测：210nm)。L4D1b衍生物确定的比率为(未经修饰的布洛赛珠单抗，n＝0，保留时间＝12.74min(慢方法)):(单酰化的布洛赛珠单抗，n＝1，保留时间＝11.26min(慢方法)):
(双酰化的布洛赛珠单抗，n＝2，保留时间＝10.36min(慢方法))＝[(n＝0):(n＝1):(n＝
2)]＝81:18:1。
(双酰化的布洛赛珠单抗，n＝2，保留时间＝10.36min(慢方法))＝[(n＝0):(n＝1):(n＝
2)]＝81:18:1。
[1166] SDS-Page：(MOPS运行缓冲液； 4-12％Bis-Tris Gels；考马斯蓝染色剂；伯乐(Bio-Rad)ChemiDoc成像仪；Image Lab 5.2.1分析软件)：L4D1b衍生物确定的比率为(未经修饰的布洛赛珠单抗，n＝0):(单酰化的布洛赛珠单抗，n＝1):(聚酰化的布洛赛珠单抗，n＝2)＝[(n＝0):(n＝1):(n＝2)]约67:33:痕量。
[1167] 使用类似于用于合成L4D1b的方法，来制备表14和表15中所示的加合物。用于制备加合物的反应条件在表14中列出；将这些加合物的特征描述于表15中。
[1168]
[1169]
[1170]
[1171]
[1172] L8D4
[1173]
[1174] 将L8(43.4mg，0.113mmol)溶解于二甲基甲酰胺(2.55mL)中，随后是EDC·HCl(21.2mg，0.111mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(18.6mg，0.114mmol)。将该溶液在室温下搅拌过夜(约16小时)。向该溶液中添加溶解于1.5mL二甲基甲酰胺和1.5mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的D4(35mg，0.02mmol)。2小时后，将该反应用4mL的乙腈稀释，过滤，并通过具有质量定向级分收集的制备型反相HPLC进行纯化(以下方法)。将包含产物的级分合并，冷冻，并冻干，以提供L8D4。MS(ESI+)m/z＝952.5(M+2H)2+。
[1175] 制备型HPLC条件：沃特斯XSelect CSH OBD；粒度：5μm；柱尺寸：19×150mm；洗脱液/梯度：24％CH3CN/H2O/1.65min，24％-34％CH3CN/H2O/8.35min(含有0.1％TFA的CH3CN和H2O)；流速：30mL/min；柱温度：室温；总m/z：+951.7.
[1176] 实例3
[1177] 透明质酸的官能化
[1178] 该实例描述了官能化的透明质酸的合成，该透明质酸本身可以是载体或还可以与交联部分反应，以形成水凝胶。
[1179] 透明质酸中间体[HA-N3]的合成：
[1180]
[1181] 透明质酸钠盐是由葡糖醛酸和N-乙酰基半乳糖胺的重复二聚体单元组成的线性聚合物，其中重复单元的分子量为401.3Da。在该实例中，报道的透明质酸的摩尔数是指重复单元的摩尔数，并且相对于透明质酸重复单元的摩尔数，报道了在与透明质酸的反应中使用的试剂的当量。聚合物的平均分子量确定了重复单元的平均数/聚合物链。如通过粘度测定法确定，被供应商生命核生物医药公司(Lifecore Biomedical)(HA200K，查斯卡，明尼苏达州(Chaska,MN))标记为具有200kDa的标称平均分子量的透明质酸钠盐可在151kDa-
300kDa的范围内因批次而异。在该实例中，具有假定标称平均分子量为200kDa的透明质酸钠盐的这种分子将具有约500个单体单元的平均长度。
300kDa的范围内因批次而异。在该实例中，具有假定标称平均分子量为200kDa的透明质酸钠盐的这种分子将具有约500个单体单元的平均长度。
[1182] [HA-N3]-23％的合成
[1183] 将透明质酸，钠盐(标称平均分子量200kD；250.1mg，0.623mmol；生命核生物医药公司(Lifecore Biomedical,LLC)；产品编号HA200K)的溶液完全溶解于25mL的MES缓冲液(50mM，pH 5.5)中。向该溶液中添加4-(4’,6’-二甲氧基-1’,3’,5’-三嗪-2’-基)-4-甲基吗啉-4-鎓氯化物(DMTMM，295mg，1.07mmol，1.71当量)，接下来在5分钟后添加11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一-1-胺(N3-PEG3-NH2，196mg，0.90mmol)。将该反应搅拌过夜，然后用25mL
0.25M的NaCl溶液稀释，并通过切向流过滤进行纯化。
0.25M的NaCl溶液稀释，并通过切向流过滤进行纯化。
[1184] 使用来自赛多利斯公司(Sartorius)的30kDa MWCO Vivaflow-50R hydrosart药筒进行切向流过滤，用400mL 0.25M的NaCl溶液，之后用400mL水进行洗脱。
[1185] 将该产物快速冷冻并冻干，以提供标题物质[HA-N3]-23％。
[1186] 1H NMR(400MHz,D2O)δ4.45(bs,2H),4.0-3.1(m,15.5H),1.95(s,3H)。
[1187] DOSY-NMR.在具有5mm DCH冷冻探针的Bruker AVANCE III400MHz(针对1H)仪器上，使用具有一个扰动梯度脉冲序列的受激回波(stegp1s1d)，收集一维扩散有序NMR谱
(DOSY)。将扩散时间和扩散梯度时间分别设定为50ms和4ms。收集了两个谱，其中梯度强度(gpz6)被设定为2％和95％。对两个谱的比较现实除了溶剂峰之外没有差异，表明聚合物中不存在小分子杂质。
(DOSY)。将扩散时间和扩散梯度时间分别设定为50ms和4ms。收集了两个谱，其中梯度强度(gpz6)被设定为2％和95％。对两个谱的比较现实除了溶剂峰之外没有差异，表明聚合物中不存在小分子杂质。
[1188] 元素分析：C：40.05％；H：5.67％；N：5.70％。
[1189] 将[HA-N3]的取代程度定义为％重复单元，其中羧酸酯部分已经经历了反应以给出所示的酰胺。将元素分析用于确定取代程度。将通过对经纯化的样品进行元素分析而确定的[％C/％N]比率输入下式，以提供取代程度。其中y＝[(％C)/(％N)])，然后：
[1190]
[1191]
[1192] 在该实例中，[HA-N3]的取代程度(DS)为23％。
[1193] 用23％的叠氮化物接头官能化的该200kDa透明质酸被标记为[HA-N3]-23％。
[1194] 在其余实例中，用X％的叠氮化物接头官能化的200kDa的透明质酸被标记为[HA-N3]-X％。
[1195] 使用类似于用于合成[HA-N3]-23％的方法，来制备和表征表16中的种类。我们发现所达到的取代程度取决于所使用的DMTMM试剂的给定原料，并且可能是异质的。通常，对于DMTMM的给定原料，取代程度随着所使用的DMTMM的当量数增加而增加，并且取代程度随着所使用的DMTMM的当量数减少而减少。通过透析代替切向流过滤，将一些[HA-N3]中间体进行纯化([HA-N3]-23％b，[HA-N3]-37％)。在这些情况下，将粗反应混合物填充到再生的纤维素透析膜(MWCO 1-25kD)中，并经0.25M-1M NaCl透析1-3天，其中更换该透析溶液若干次，随后经去离子水透析1-3天后，同样多次更换该透析溶液。完成后，将样品从透析管中取出，快速冷冻并冻干。
[1196]
[1197]
[1198] 实例4
[1199] PEG聚合物，XL-1-XL-10的制备
[1200] 该实例描述了交联剂的合成，该交联剂可以与其他官能化的聚合物反应，以形成水凝胶。
[1201] 基于PEG的交联聚合物
[1202] 一般结构1.
[1203]
[1204] 一般结构2.
[1205]
[1206]
[1207]
[1208] XL-8的结构：
[1209]
[1210] 起始PEG的MW：Mn约10,000kDa。
[1211] 基于PEG的交联聚合物的合成
[1212] 取代程度是PEG衍生的交联剂的重要参数，并且被定义为被所希望引入的官能团取代的PEG末端基团的百分比。使用1H-NMR确定取代程度，从而将对PEG末端基团特异的亚甲基基团的积分与对引入的官能团特异的质子的积分进行比较。对于XL-1-XL-6，对PEG部分特异的亚甲基基团是酯或氨基甲酸酯亚甲基[-(C＝O)-O-CH2-]，将该亚甲基基团与在二环[6.1.0]壬-4-炔部分中的质子的积分进行比较。取代程度＝((通过1H-NMR，引入的官能团摩尔数)/(通过1H-NMR，PEG末端基团的摩尔数))×100。
[1213] XL-1.PEG(2000)-双-[3-(((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]
[1214]
[1215] XL-1a.PEG(2000)-双-[3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸酯]
[1216]
[1217] 将3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(1.892g，10.00mmol)和Mn约2kDa PEG(5g，2.500mmol)溶解于50mL二氯甲烷中。添加二甲基氨基吡啶(0.153g，1.250mmol)和EDC·HCl(1.922g，10.03mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。通过在二氧化硅上，用0-15％二氯甲烷:甲醇梯度的快速柱色谱，将该粗产物进行纯化。将包含产物的级分合并，并减压至干燥，以提供XL-1a。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.23(m,4H),3.70(m,4H),3.63(br s,
167H),2.52(m,4H),1.43(br s,18H)。
167H),2.52(m,4H),1.43(br s,18H)。
[1218] XL-1b.PEG(2000)-双-[3-(氨基)丙酸酯]，双-三氟乙酸
[1219]
[1220] 将XL-1a(600mg，0.261mmol)溶解于二氯甲烷(6mL)中。添加三氟乙酸(2mL)，并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂在减压下去除。将该粗产物用Et2O研磨两次，然后在真空下干燥，以提供XL-1b。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.33(m,4H),3.73(m,4H),3.64(br s,183H),2.80(m,4H)。
[1221] XL-1-1.PEG(2000)-双-[3-(((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]
[1222]
[1223] 将XL-1b(200mg，0.086mmol)溶解于乙腈(3mL)中。添加三乙胺(0.599mL，4.30mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-
1-基)碳酸酯(200mg，0.688mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌4小时。将该反应混合物通过具有ELSD触发的级分收集的制备型反相HPLC直接纯化(以下方法)。将包含产物的级分合并，冷冻并冻干，以提供XL-1-1。出于储存目的，将XL-1-1作为乙腈、DMSO或甲醇溶液保持在冷冻器中。分析型HPLC-CAD(以下方法)：保留时间＝11.93min。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.23(m,4H),4.14(m,4H),3.63(br s,175H),2.54(m,4H),2.22(m,12H),1.60(m,4H),1.37(m,2H),0.94(m,4H)。
1-基)碳酸酯(200mg，0.688mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌4小时。将该反应混合物通过具有ELSD触发的级分收集的制备型反相HPLC直接纯化(以下方法)。将包含产物的级分合并，冷冻并冻干，以提供XL-1-1。出于储存目的，将XL-1-1作为乙腈、DMSO或甲醇溶液保持在冷冻器中。分析型HPLC-CAD(以下方法)：保留时间＝11.93min。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.23(m,4H),4.14(m,4H),3.63(br s,175H),2.54(m,4H),2.22(m,12H),1.60(m,4H),1.37(m,2H),0.94(m,4H)。
[1224] 制备型HPLC条件：沃特斯XBridge C18；粒度：5μm；柱尺寸：19×250mm；洗脱液/梯度：5％CH3CN/H2O/0.5min，5-95％CH3CN/H2O/12.5min，95％CH3CN/H2O/3min；流速：30mL/min；柱温度：室温。
[1225] 分析型HPLC-CAD条件：沃特斯XBridge BEH300C18；粒度：3.5μm；柱尺寸：4.6×100mm；洗脱液/梯度：2％CH3CN/H2O/0.5min，2％-98％CH3CN/H2O/17.5min(含有0.05％TFA的CH3CN和含有0.1％TFA的H2O)；流速：1mL/min；柱温度：50℃。
[1226] 分析型HPLC-CAD条件(方法10)：沃特斯ACQUITY BEH C18；粒度：1.7μm；孔径:柱尺寸：2.1×50mm；洗脱液/梯度：5％CH3CN/H2O/1.2min，5％-95％CH3CN/H2O/
1.8min(含有0.1％TFA的CH3CN和含有0.1％TFA的H2O)；流速：1mL/min；柱温度：45℃。
1.8min(含有0.1％TFA的CH3CN和含有0.1％TFA的H2O)；流速：1mL/min；柱温度：45℃。
[1227] 可替代地，将反应混合物通过快速色谱(SiO2，0-10％甲醇:二氯乙烷)直接纯化，以提供纯度较低的批次XL-1-2。
[1228] 使用类似于用于合成XL-1的方法(除XL-1-2之外)，来制备表18中的种类：
[1229]
[1230]
[1231]
[1232]
[1233] 在基于PEG的交联聚合物的合成中使用的中间体：
[1234]
[1235]
[1236]
[1237] XL-5.PEG(2000)-双-[3-(((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基氨基甲酰基]
[1238]
[1239] 将Mn约2kDa的PEG二胺盐酸盐(键凯科技公司(JenKem Technology)，300mg，0.148mmol)溶解于乙腈(3mL)中。添加三乙胺(0.413mL，2.96mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(345mg，1.184mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌4小时。将该反应混合物通过具有ELSD触发的级分收集的制备型反相HPLC直接纯化(以下方法)。将包含产物的级分合并，冷冻并冻干，以提供XL-5。出于储存目的，将XL-5作为乙腈、DMSO或甲醇溶液保持在冷冻器中。分析型HPLC-CAD(以下方法)：保留时间＝11.85min。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.14(m,4H),3.63(br s,186H),3.54(m,4H),2.22(m,12H),1.61(m,4H),1.38(m,2H),0.94(m,4H)。
[1240] 制备型HPLC条件：沃特斯XBridge C18；粒度：5μm；柱尺寸：19×250mm；洗脱液/梯度：5％CH3CN/H2O/0.5min，5-95％CH3CN/H2O/12.5min，95％CH3CN/H2O/3min；流速：30mL/min；柱温度：室温。
[1241] 分析型HPLC-CAD条件：沃特斯XBridge BEH300C18；粒度：3.5μm；柱尺寸：4.6×100mm；洗脱液/梯度：2％CH3CN/H2O/0.5min，2％-98％CH3CN/H2O/17.5min(含有0.05％TFA的CH3CN和含有0.1％TFA的H2O)；流速：1mL/min；柱温度：50C。
[1242] XL-6.PEG(10000)-四-[3-(((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基氨基甲酰基]
[1243]
[1244] 将Mn为10kDa的4-臂PEG胺盐酸盐(季戊四醇核，键凯科技公司(JenKem Technology)，500mg，0.05mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中。添加三乙胺(0.554mL，
4.00mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-
1-基)碳酸酯(175mg，0.600mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。使用2kDa MWCO Spectra/Por 6再生纤维素透析膜(频谱公司(Spectrum,Inc.))，通过经甲醇透析，将该反应混合物直接进行纯化。为了分析和用于进一步的反应，使用旋转蒸发仪通过浓缩分离XL-
6。出于储存目的，将该化合物在室温下以甲醇溶液保存。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.14(m,8H),3.63(br s,995H),2.22(m,24H),1.61(m,8H),1.38(m,4H),0.94(m,8H)。
4.00mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-
1-基)碳酸酯(175mg，0.600mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。使用2kDa MWCO Spectra/Por 6再生纤维素透析膜(频谱公司(Spectrum,Inc.))，通过经甲醇透析，将该反应混合物直接进行纯化。为了分析和用于进一步的反应，使用旋转蒸发仪通过浓缩分离XL-
6。出于储存目的，将该化合物在室温下以甲醇溶液保存。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.14(m,8H),3.63(br s,995H),2.22(m,24H),1.61(m,8H),1.38(m,4H),0.94(m,8H)。
[1245] XL-8.
[1246]
[1247] 将Mn约10kDa的8-臂PEG胺盐酸盐(六甘油核，键凯科技公司(JenKem Technology)，800mg，0.08mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中。添加三乙胺(0.887mL，
6.40mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-
1-基)碳酸酯(807mg，2.56mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌5小时。使用旋转蒸发仪，将该反应混合物浓缩，然后溶解于甲醇中，并使用2kDa MWCO Spectra/Por 6再生纤维素透析膜(频谱公司(Spectrum,Inc.))，通过经甲醇透析进行纯化。为了分析和在进一步的反应中使用，使用旋转蒸发仪，通过浓缩分离XL-8，然而出于储存目的，将XL-8在室温下以甲醇溶液储存。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.14(m,16H),3.63(br s,935H),2.23(m,48H),1.61(m,16H),1.38(m,8H),0.95(m,16H)。
6.40mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-
1-基)碳酸酯(807mg，2.56mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌5小时。使用旋转蒸发仪，将该反应混合物浓缩，然后溶解于甲醇中，并使用2kDa MWCO Spectra/Por 6再生纤维素透析膜(频谱公司(Spectrum,Inc.))，通过经甲醇透析进行纯化。为了分析和在进一步的反应中使用，使用旋转蒸发仪，通过浓缩分离XL-8，然而出于储存目的，将XL-8在室温下以甲醇溶液储存。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.14(m,16H),3.63(br s,935H),2.23(m,48H),1.61(m,16H),1.38(m,8H),0.95(m,16H)。
[1248] 实例5
[1249] 该实例描述了通过将适合地官能化的聚合物与交联剂反应而制备的水凝胶的合成。
[1250] 透明质酸水凝胶的合成：H1a
[1251]
[1252]
[1253] 在室温下，在5mL微量离心管中，经30min将[HA-N3]-23％b(60mg，136μmol，取代程度＝23％)溶解于3.8mL无菌1×PBS缓冲液，pH 7.4中。未取代的羧酸钠盐重复二聚体单元的分子量为401.3Da。叠氮化的重复二聚体单元的MW为579.6Da。[HA-N3]-23％b的钠盐形式的二聚体单元的平均MW为442.3Da＝((401.3×0.77)+(579.6×0.23))。使用钠盐二聚体单元的平均MW，重复二聚体单元的总摩尔为136μmol，并且叠氮化的重复二聚体单元的摩尔数为31μmol。
[1254] 向该溶液中添加XL-1-1(0.215mL，假定MW为2500Da的4.30μmol试剂，8.60μmol的反应官能性)的50mg/mL溶液。这产生了关于[HA-N3]-23％b的1.5％w/v的溶液，并且其中预测6.3％的[HA-N3]-22％b重复单元有待通过XL-1-1]((8.60μmol[XL-1-1-反应官能性]/136μmol[HA单元)×100＝6.3％)被交联。
[1255] 将该混合物短暂涡旋以混合，然后分配到两个3mL的注射器中，给该注射器加帽，并在37℃下保持过夜，以提供H1a。目视检查(反向测试)表明凝胶化成功。
[1256] 基于透明质酸的水凝胶颗粒的制备
[1257] 迫使H1a(2mL)通过100目不锈钢筛网盘进入5mL注射器中，产生粗凝胶颗粒。向该注射器中添加1mL的1×PBS，随后进行涡旋以混合。将该注射器在室温下保持6小时，以允许水凝胶溶胀。这样产生关于[HA-N3]-23％b是1.0％的混合物。迫使H1a的溶胀的粗凝胶颗粒通过200目不锈钢筛网盘20次，产出呈终产物的细凝胶颗粒。
[1258] 类似于H1a，制备表20中列出的基于透明质酸的水凝胶(和相应的水凝胶颗粒)。水凝胶由以下定义：所使用的[HA-N3]组分及其在交联反应中的浓度，以及所使用的PEG交联剂，和预期与主链聚合物形成交联的程度(％交联)。
[1259]
[1260] 实例6
[1261] 水凝胶-药物缀合物的合成
[1262] 该实例描述了水凝胶-药物缀合物的合成，其中该药物经由无痕迹接头与载体缀合。
[1264] C4b(H1a-L4D1)
[1265]
[1266]
[1267] 将H1a(2.5mL，10mg/mL，23mM总二聚体重复单元)的水凝胶颗粒悬浮液用L4D1b(在1×PBS中14.5mL的42mg/mL溶液)的溶液处理，涡旋并在37℃下保持过夜。将反应管离心
(1000rcf，5分钟)，并使用针头和注射器将上清液从管中去除。将新鲜的1×PBS(10-15mL)添加至管中，将该管振荡以重悬凝胶。将离心、去除上清液以及用新鲜的缓冲液稀释进行重复。继续洗涤直到在上清液中检测不到布洛赛珠单抗(使用Nanodrop分光光度计，用于检测在280nm处的吸光度，总共约65mL的PBS洗涤)。将剩余的水凝胶沉淀[C4b]转移至注射器中，用于储存和分配。
(1000rcf，5分钟)，并使用针头和注射器将上清液从管中去除。将新鲜的1×PBS(10-15mL)添加至管中，将该管振荡以重悬凝胶。将离心、去除上清液以及用新鲜的缓冲液稀释进行重复。继续洗涤直到在上清液中检测不到布洛赛珠单抗(使用Nanodrop分光光度计，用于检测在280nm处的吸光度，总共约65mL的PBS洗涤)。将剩余的水凝胶沉淀[C4b]转移至注射器中，用于储存和分配。
[1268] 对水凝胶-药物缀合物的关键描述是载药量/水凝胶体积(＝药物荷载)。当该药物是蛋白质时，存在确定荷载的若干种方法。
[1269] 通过以下来确定水凝胶的蛋白质荷载：从已知体积的水凝胶强制释放缀合的蛋白质，随后量化所释放的蛋白质。在该实例中，将37.3μg的[C4b]称重到反应管(在假设该水凝胶的密度为约1g/mL下，相当于37.3μL的样品)中。将该样品用1M Tris·HCl缓冲液，pH 9.5(1mL)处理，涡旋并在37℃下振荡48小时(或直到测量的浓度达到稳态)。在该实例中，将释放的药物(布洛赛珠单抗)的浓度测量(Nanodrop分光光度计)为0.48mg/mL，对应于[C4b]中水凝胶的13.35mg布洛赛珠单抗/mL((0.048mg/mL/0.0373mL)×(1.0373mL总体积)＝13.35mg/mL)。将该分析一式三份进行。在稀释之前，对于[C4b]的平均测定的蛋白质荷载是
13.9mg布洛赛珠单抗/mL水凝胶。
13.9mg布洛赛珠单抗/mL水凝胶。
[1270] 确定蛋白质荷载的可替代的方法依赖于差异计算。在该方法中，将在水凝胶洗涤中回收的所测量的(Nanodrop分光光度计)布洛赛珠单抗从已知总添加的蛋白质(例如，布洛赛珠单抗+L4D1)中减去。该差异给出了基于总水凝胶体积的布洛赛珠单抗荷载。
[1271] 使用类似于用于合成C4b的方法，来制备表21中的水凝胶。
[1272]
[1273]
[1274] 可以将水凝胶-药物缀合物用1×PBS稀释，以获得用于给药的所希望的药物终浓度。待添加的1×PBS的量可以通过以下方程式计算：(PBS稀释液(mL))＝[(总药物(mg)/所希望的药物荷载(mg/mL)]-(缀合物的初始体积(mL))。
[1275] 通过添加1×PBS(0.8mL)，将如上所述制备的缀合物C4b(2mL水凝胶缀合物、13.9mg/mL布洛赛珠单抗、总布洛赛珠单抗＝27.8mg)进行稀释。给该注射器加帽，并剧烈振荡以均化。这产生总的样品体积为2.8mL，其中蛋白质荷载＝27.8mg布洛赛珠单抗/2.8mL＝
9.93mg/mL布洛赛珠单抗。
9.93mg/mL布洛赛珠单抗。
[1276] 通过去除柱塞并用所希望的体积的C4b回填，在具有附接的30G针头的0.5mL胰岛素注射器中，将缀合物C4b分配用于给药。
[1277] 将水凝胶-药物缀合物储存在4℃下。
[1278] 水凝胶药物缀合物的合成：C13
[1279]
[1280] 将接头-药物加合物L8D4(三三氟乙酸盐，19.9mg，8.86μmol)用XL-8(在DMSO中0.157mL的200mg/mL溶液)的溶液处理，振荡，并保持80分钟，在此期间HPLC分析显示L8D4与XL-8的完全缀合。向该溶液中添加XL-7(在DMSO中，0.154mL的200mg/mL溶液)的溶液。将该反应振荡，并在室温下保持4小时。
[1281] 迫使块状凝胶通过100目不锈钢筛网盘进入3mL注射器中，产出粗凝胶颗粒。向该注射器中添加2mL的DMSO，随后进行涡旋以混合。将注射器在室温下保持1h，以允许凝胶溶胀。迫使溶胀的粗凝胶颗粒通过200目不锈钢筛网盘20次，产出细凝胶颗粒。
[1282] 将细凝胶颗粒悬浮液(在加帽的注射器中)以2000rcf离心5分钟，以沉淀凝胶。使用针头和注射器，将上清液去除，并将沉淀物用冷的1×PBS，pH 6.5洗涤，以从该凝胶中去除未缀合的种类。将该悬浮液以2000rcf离心5分钟，以使凝胶沉淀。使用针头和注射器，从注射器中去除上清液，添加新鲜的1×PBS(pH 6.5)以填充注射器，并且将加帽的注射器振荡以使凝胶重悬浮。将离心、去除上清液以及用新鲜的缓冲液稀释再重复四次。在最终的离心和去除缓冲液后，测试上清液中的内毒素，并将经洗涤的凝胶沉淀用1×PBS(pH 6.5)稀释至最终的总体积为1.4mL。将稀释的颗粒悬浮液涡旋以混合，并将产物，C13储存在4℃下。
[1283] C13中D4的浓度(假定100％缀合)为10.3mg/mL。
[1284] 实例7
[1285] 该实例描述了一系列模型无痕迹接头-药物缀合物的制备，其中模型“药物”是含低分子量胺的化合物，最常见的是对甲氧基苄基胺。化合物M1-M27不与聚合物、水凝胶或其他载体缀合。对来自化合物M1-M27的含低分子量胺的化合物的体外释放研究允许对多种不同的释放触发物进行评估。
[1286]
[1287]
[1288]
[1289]
[1290]
[1291]
[1292] 模型化合物的合成：
[1293] M1.(4-(3’-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酰基)-1-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基丙酸酯
[1294]
[1295] M1.(4-(3’-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酰基)-1-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基丙酸酯
[1296]
[1297] 将L-INT-3(61.7mg，0.13mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液用三氟乙酸(1mL)处理，并在室温下搅拌过夜，然后蒸发。将粗中间体溶解于二氯甲烷(3mL)中，并用二异丙基乙胺(0.066mL，0.38mmol)、HATU(57.3mg，0.15mmol)和对甲氧基苄基胺(0.017mL，0.13mmol)处理，搅拌1小时，然后蒸发。通过快速色谱(SiO2，0-15％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M1。LCMS(方法1)：保留时间＝1.16min；MS(ESI+)m/z 555.2(M+H)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.25(m,5H),7.12(m,2H),6.80(m,2H),5.43(m,1H),5.01(m,2H),4.33(d,2H),4.02(tdt,2H),
3.73(s,3H),3.55-3.2(m,7H),3.09(m,1H),2.72(m,2H),2.41(dq,3H),2.18(m,2H),1.04
(dt,3H)。
3.73(s,3H),3.55-3.2(m,7H),3.09(m,1H),2.72(m,2H),2.41(dq,3H),2.18(m,2H),1.04
(dt,3H)。
[1298] M2.(4-(3’-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酰基)-1-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基乙酸酯
[1299]
[1300] 使用类似于用于合成M1的方法，从中间体(L-INT-2)制备M2。LCMS(方法1)：保留时间＝1.10min：MS(ESI+)m/z 541.1(M+H)。NMR(400MHz,CDCl3)7.35(m,5H),7.20(m,2H),6.88(m,2H),5.53(m,1H),5.09(m,2H),4.41(d,2H),4.10(tdt,2H),3.81(s,3H),3.55-3.2
(m,7H),3.17(dd,1H),2.79(m,2H),2.49(dq,3H),2.0(m,3H)。
(m,7H),3.17(dd,1H),2.79(m,2H),2.49(dq,3H),2.0(m,3H)。
[1301] M3.(4-(3’-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酰基)-1-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基甲氧基乙酸酯
[1302]
[1303] 使用类似于用于合成M1的方法，从中间体(L-INT-1)制备M3。LCMS(方法1)：保留时间＝1.11min MS(ESI+)m/z 571.2(M+H)。NMR(400MHz,CDCl3)7.37(m,5H),7.21(m,2H),6.90(m,2H),5.49(m,1H),5.10(m,2H),4.42(d,2H),4.23(tdd,2H),3.83(s,3H),3.55-3.2
(m,9H),3.20(dd,1H),2.83(d,2H),2.52(m,3H)。
(m,9H),3.20(dd,1H),2.83(d,2H),2.52(m,3H)。
[1304] M4.(4-(3’-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酰基)-1-(2”-((4”’-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基2-甲氧基乙酸酯
[1305]
[1306] 使用类似于用于合成M1的方法，除了用N-甲基-对甲氧基苄基胺取代对甲氧基苄基胺，从中间体(L-INT-1)制备M4。LCMS(方法1)：保留时间＝1.04min MS(ESI+)m/z 585.2(M+H)。NMR(400MHz,CDCl3)7.35(m,5H),7.20(m,2H),6.80(m,2H),5.43(m,1H),5.13(m,
2H),4.7-3.9(m,7H),3.82(m,3H),3.8-3.2(m,10H),2.8(m,3H),2.7(m,3H),2.6(m,2H)。
2H),4.7-3.9(m,7H),3.82(m,3H),3.8-3.2(m,10H),2.8(m,3H),2.7(m,3H),2.6(m,2H)。
[1307] M5.(4-(3’-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酰基)-1-(2”-((4”’-甲氧基苯基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基2””-甲氧基乙酸酯
[1308]
[1309] 使用类似于用于合成M1的方法，除了用4-甲氧基苯胺取代对甲氧基苄基胺，从中间体(L-INT-1)制备M5。LCMS(方法1)：保留时间＝1.14min MS(ESI+)m/z 557.1(M+H)。NMR(400MHz,CDCl3)8.7(br s,1H),7.4(d,2H),7.37(m,5H),6.8(m,2H),5.5(m,1H),5.1(m,2H),4.3(m,2H),4.0(m,2H),3.8(s,4H),3.7-3.2(m,11H),3.2(m,1H),2.8(m,2H),2.5(m,
2H),2.18(m,3H)。
2H),2.18(m,3H)。
[1310] M6.(4-乙酰基-1-(2-((4-甲氧基苄基)氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基乙酸酯
[1311]
[1312] M6a.1-N-乙酰基-3-羟甲基哌嗪
[1313]
[1314] 在0℃，氩气下，将2-(羟甲基)哌嗪(2g，17.2mmol)在水(25mL)中的溶液用三乙胺(3.5mL，25mmol)逐滴处理，搅拌10分钟，然后用乙酸酐(1.64mL，17.3mmol)在水(15mL)中的溶液逐滴处理。将该反应在室温下搅拌2小时，然后用2M碳酸钠(10mL)和饱和的氯化钠(20mL)处理。将该水溶液蒸发，并将残余物通过快速色谱(碱性氧化铝，3％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，以提供M6a。MS(ESI+)m/z159.0(M+H)。
[1315] M6b.叔丁基4-乙酰基-2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸酯
[1316]
[1317] 在0℃，氩气下，将M6a(1.4g，8.84mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙胺(1.78g，17.6mmol)逐滴处理，搅拌10分钟，然后用二叔丁基二碳酸酯(2.12g，9.73mmol)逐滴处理。将该反应在室温下搅拌12小时，然后用二氯甲烷稀释，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，3％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M6b。MS(ESI+)m/z
259.0(M+H)。
259.0(M+H)。
[1318] M6c.叔丁基2-(乙酰氧基甲基)-4-乙酰基哌嗪-1-甲酸酯
[1319]
[1320] 在0℃，氩气下，将M6b(0.20g，0.77mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用三乙胺(0.20g，1.94mmol)逐滴处理，搅拌10分钟，然后用乙酰氯(0.072g，0.93mmol)逐滴处理。将该反应在室温下搅拌4小时，然后用DCM稀释，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，3％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M6c。MS(ESI+)m/z 301.1(M+H)。
[1321] M6.(4-乙酰基-1-(2’-((4”-甲氧基苄基)氨基)-2’-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基乙酸酯
[1322]
[1323] 在0℃，氩气下，将M6c(0.15g，0.49mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用三氟乙酸(2.0mL)逐滴处理，并在室温下搅拌4小时，然后蒸发。将该物质溶解于乙腈(10mL)中，并保持在0℃，氩气下，然后用碳酸钾(0.414g，2.99mmol)和2-溴-N-(4-甲氧基苄基)乙酰胺(0.232g，0.89mmol)处理。将该反应在室温下搅拌12小时，然后蒸发。将该粗混合物用二氯甲烷萃取，将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，5％甲醇:二氯甲烷)，随后通过制备型HPLC(柱：Zorbax Eclipse XDB C18(150×21.5mm*5mm)；流动相：A＝水，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：10％B；2-8分钟：20％B；8分钟至结束：40％B；)进行纯化，提供M6。LCMS(方法8)：保留时间＝2.67min；MS(ESI+)m/z 378.2(M+H)。
[1324] M7.甲基4-乙酰基-1-(2’-((4”-甲氧基苄基)氨基)-2’-氧代乙基)哌嗪-2-甲酸酯[1325]
[1326] M7a.甲基4-乙酰基哌嗪-2-甲酸酯，三氟乙酸盐
[1327]
[1328] 在0℃，氩气下，将1-(叔丁基)2-甲基哌嗪-1,2-二甲酸酯(0.20g，0.82mmol)和三乙胺(0.33g，3.27mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液用乙酰氯(0.125mg，25mmol)逐滴处理，然后在室温下搅拌2小时。将该反应用水稀释，用二氯甲烷萃取，并将有机相经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，2％甲醇:乙酸乙酯)进行纯化，提供中间体产物：MS(ESI+)m/z 287(M+H)。在0℃下，将该物质溶解于二氯甲烷(5mL)中，并用三氟乙酸逐滴处理，然后在室温下搅拌3小时。将该反应混合物蒸发，用戊烷洗涤并干燥，以提供作为三氟乙酸盐的M7a，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 187(M+H)。
[1329] M7b.甲基4-乙酰基-1-(2’-(苄氧基)-2’-氧代乙基)哌嗪-2-甲酸酯
[1330]
[1331] 在0℃，氩气下，将M7a(0.16g，0.86mmol)和碳酸钾(0.30mg，2.15mmol)在乙腈(5mL)中的混合物用苄基溴乙酸酯(0.234mg，1.03mmol)逐滴处理，允许缓慢达到室温，然后在室温下搅拌12小时。将该反应用水稀释，用乙酸乙酯萃取，并将有机相经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(中性氧化铝，1％甲醇:乙酸乙酯)进行纯化，提供M7b。MS(ESI+)m/z 335(M+H)。
[1332] M7c.2-(4’-乙酰基-2’-(甲氧基羰基)哌嗪-1’-基)乙酸
[1333]
[1334] 向M7b(0.285g，0.85mmol)的溶液中添加10％钯碳(0.02g)，然后在氢气囊压下且在室温下搅拌12小时。将该反应通过硅藻土过滤，用甲醇洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。将M7c无需进一步纯化即可使用。MS(ESI+)m/z 245(M+H)。
[1335] M7.甲基4-乙酰基-1-(2’-((4”-甲氧基苄基)氨基)-2’-氧代乙基)哌嗪-2-甲酸酯[1336]
[1337] 在0℃在氩气下，将M7c(0.21g，0.86mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用二异丙基乙胺(0.275g，2.14mmol)和HATU(0.39g，1.03mmol)处理，然后15分钟后用4-甲氧基苄基胺(0.117g，0.86mmol)处理。将该反应在室温下搅拌12小时，然后用水处理，并用二氯甲烷萃取，将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过制备型HPLC(柱：XBridge(150×19mm)；流动相：A＝(在水中的0.01％TFA)，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：20％B；2-8分钟：20％B；
8分钟至结束：80％B)进行纯化，提供M7。LCMS(方法3)：保留时间＝2.85min；MS(ESI+)m/z
364(M+H)。
8分钟至结束：80％B)进行纯化，提供M7。LCMS(方法3)：保留时间＝2.85min；MS(ESI+)m/z
364(M+H)。
[1338] M8.(4-乙酰基-1-(2’-((4”-甲氧基苄基)氨基)-2’-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基甲基碳酸酯
[1339]
[1340] M8a(4-乙酰基-1-(叔丁氧基羧基)哌嗪-2-基)甲基甲基碳酸酯
[1341]
[1342] 在0℃氩气下，将M6b(0.30g，1.16mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液逐滴用三乙胺(0.20g，1.94mmol)处理，搅拌10分钟，然后用甲基氯甲酸酯(0.54g，5.8mmol)逐滴处理。将该反应在室温下搅拌72小时，然后用二氯甲烷稀释，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，3％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M8a。MS(ESI+)m/z 317.1(M+H)。
[1343] M8.(4-乙酰基-1-(2’-((4”-甲氧基苄基)氨基)-2’-氧代乙基)哌嗪-2-基)甲基甲基碳酸酯
[1344]
[1345] 在0℃，氩气下，将M8a(0.09g，0.28mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用三氟乙酸(2.0mL)逐滴处理，并在室温下搅拌4小时，然后蒸发。将该物质溶解于乙腈(10mL)中，并保持在0℃，氩气下，然后用碳酸钾(0.23g，1.66mmol)和2-溴-N-(4-甲氧基苄基)乙酰胺(0.128g，0.49mmol)处理。将该反应在室温下搅拌12小时，然后蒸发。将该粗混合物用二氯甲烷萃取，将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，5％甲醇:二氯甲烷)，随后通过制备型HPLC(柱：Zorbax Eclipse XDB C18(150×21.5mm*5mm)；流动相：A＝水，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：10％B；2-10分钟：20％B；10分钟至结束：50％B；)进行纯化，提供M8。LCMS(方法7)：保留时间＝0.24min；MS(ESI+)m/z 394.2(M+H)。
[1346] M9. 1-(4’-乙酰基-1’-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2’-基)甲基N-甲基氨基甲酸酯
[1347]
[1348] M9a.1-(4’-乙酰基-1’-(叔丁氧基羰基)哌嗪-2’-基)甲基N-甲基氨基甲酸酯
[1349]
[1350] 在0℃，氩气下，将M6b(0.30g，1.16mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用三乙胺(0.30mg，2.90mmol)逐滴处理，并搅拌10分钟。添加甲基氨基甲酰氯(0.11g，1.27mmol)，并将该反应在室温下搅拌72小时。将该反应用二氯甲烷稀释，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，3％甲醇:乙酸乙酯)进行纯化，提供M9a。MS(ESI+)m/z
316.1(M+H)。
316.1(M+H)。
[1351] M9. 1-(4’-乙酰基-1’-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-2’-基)甲基N-甲基氨基甲酸酯
[1352]
[1353] 在0℃，氩气下，将M9a(0.12g，0.38mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用三氟乙酸(2.0mL)逐滴处理，并在室温下搅拌4小时，然后蒸发，并无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 216.1(M+H)。将该物质溶解于乙腈(10mL)中，并保持在0℃，氩气下，然后用碳酸钾(0.385g，2.78mmol)和2-溴-N-(4-甲氧基苄基)乙酰胺(0.215g，0.83mmol)处理。将该反应在室温下搅拌12小时，然后蒸发。将该粗混合物用二氯甲烷萃取，将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，5％甲醇:二氯甲烷)，随后通过制备型HPLC(柱：Zorbax Eclipse XDB C18(150×21.5mm*5mm)；流动相：A＝水，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：10％B；2-8分钟：20％B；8分钟至结束：50％B)提供M9。LCMS(方法3)：保留时间＝2.61min；MS(ESI+)m/z 393.2(M+H)。
[1354] M10. 2-(4’-乙酰基-2’-(((四氢-2”H-吡喃-2”-基)氧基)甲基)哌嗪-1’-基)-N-(4”’-甲氧基苄基)乙酰胺
[1355]
[1356] M10a.2-(4’-乙酰基-2’-(羟甲基)哌嗪-1’-基)-N-(4”-甲氧基苄基)乙酰胺
[1357]
[1358] 将M6a(1.0g，6.32mmol)在乙腈(20mL)中的溶液保持在0℃，氩气下，然后用碳酸钾(2.62g，19.0mmol)和2-溴-N-(4’-甲氧基苄基)乙酰胺(1.4g，5.68mmol)处理。将该反应在室温下搅拌16小时，然后用水处理，用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机层经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(SiO2，1％-2％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M10a。LCMS(方法8)：保留时间＝2.61min；MS(ESI+)m/z 336.3(M+H)。
[1359] M10.2-(4’-乙酰基-2’-(((四氢-2”H-吡喃-2”-基)氧基)甲基)哌嗪-1’-基)-N-(4”’-甲氧基苄基)乙酰胺
[1360]
[1361] 在0℃，氩气下，将M10a(0.10g，0.30mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用3,4-二氢-2H-吡喃(0.05g，0.60mmol)处理，然后分批添加对甲苯磺酸(0.030g，0.89mmol)，并将该反应在室温下搅拌4小时。将该反应用饱和水性碳酸氢钠处理，并用二氯甲烷萃取，将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(SiO2，1％-2％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M10。LCMS(方法8)：保留时间＝2.78min；MS(ESI+)m/z 420.3(M+H)。
[1362] M11. 2-(4’-乙酰基-2’-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)哌嗪-1’-基)-N-(4”’-甲氧基苄基)乙酰胺
[1363]
[1364] M11. 2-(4’-乙酰基-2’-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)哌嗪-1’-基)-N-(4”’-甲氧基苄基)乙酰胺
[1365]
[1366] 在0℃、氩气下，将M10a(0.10g，0.30mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用咪唑(0.061g，0.89mmol)处理，然后逐滴添加叔丁基二甲基氯硅烷(0.054g，0.36mmol)，并将该反应在室温下搅拌2小时。将该反应用饱和的水性氯化铵处理，并用二氯甲烷萃取，将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过制备型HPLC(柱：Zorbax Eclipse XDB C18(150×21.5mm*5mm)；流动相：A＝水，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：30％B；2-8分钟：40％B；8分钟至结束：90％B；)进行纯化，提供M11。LCMS(方法8)：保留时间＝3.48min；MS(ESI+)m/z 450.3(M+H)。
[1367] M17. 1-(4’-乙酰基-1’-(2”-氧代-2”-(吡啶-2”’-基氨基)乙基)哌嗪-2’-基)甲基乙酸酯
[1368]
[1369] M17a 1-(4’-乙酰基哌嗪-2’-基)甲基乙酸酯，三氟乙酸盐
[1370]
[1371] 在0℃，氩气下，向叔丁基2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸酯(0.70g，3.23mmol)在DMF(7mL)中的溶液里添加二异丙基乙胺(1.65mL，2.76mmol)、4-二甲基氨基吡啶(0.007g)和乙酰氯(0.57mL，8.09mmol)，并在室温下搅拌16小时。将该反应用水处理，并用乙酸乙酯萃取。
将合并的有机层用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，50％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供无需进一步纯化即可使用的中间体化合物。MS(ESI+)m/z
323(M+Na)。在0℃下，将该物质溶解于二氯甲烷(2mL)，并用三氟乙酸(1mL)处理，并在室温下搅拌16小时，然后蒸发。将该残余物用戊烷洗涤，并在高真空下干燥以提供作为三氟乙酸盐的M17a，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 201(M+H)。
将合并的有机层用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，50％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供无需进一步纯化即可使用的中间体化合物。MS(ESI+)m/z
323(M+Na)。在0℃下，将该物质溶解于二氯甲烷(2mL)，并用三氟乙酸(1mL)处理，并在室温下搅拌16小时，然后蒸发。将该残余物用戊烷洗涤，并在高真空下干燥以提供作为三氟乙酸盐的M17a，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 201(M+H)。
[1372] M17b.苄基2-(2’-(乙酰氧基甲基)-4’-乙酰基哌嗪-1’-基)乙酸酯
[1373]
[1374] 在氩气下，将M17a(0.75g，3.73mmol)在乙腈(8mL)中的溶液用碳酸钾(1.54g，11.9mmol)和苄基2-溴乙酸酯(0.59mL，3.73mmol)处理，并在室温下搅拌16小时。将该反应浓缩，并通过快速色谱(碱性氧化铝，1％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，以提供M17b。MS(ESI+)m/z 349(M+H)。
[1375] M17c.2-(2’-(乙酰氧基甲基)-4’-乙酰基哌嗪-1’-基)乙酸
[1376]
[1377] 向M17b(0.30g，0.86mmol)在乙醇(6mL)中的溶液里添加5％钯碳(0.060g)，并将该反应在氢气囊压力下搅拌16小时。将该反应浓缩并通过制备型HPLC(柱：Zorbax Eclipse XDB C18(150×21.5mm*5mm)；流动相：A＝水，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：10％B；2-10分钟：20％B；10分钟至结束：40％B)进行纯化，以提供M17c。MS(ESI+)m/z 259(M+H)。
[1378] M17. 1-(4’-乙酰基-1’-(2”-氧代-2”-(吡啶-2”’-基氨基)乙基)哌嗪-2’-基)甲基乙酸酯
[1379]
[1380] 在氩气下，向M17c(0.070g，0.27mmol)在二氯甲烷(1mL)中的溶液里添加二异丙基乙胺(0.039mL，0.81mmol)、HATU(0.35g，0.90mmol)和2-氨基吡啶(0.028g，0.29mmol)，并在室温下搅拌16小时。将反应用水处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤并蒸发。通过制备型HPLC(柱：Zorbax Eclipse XDB C18(150×21.5mm*5mm)；流动相：A＝水，B＝乙腈；梯度：0-2分钟：10％B；2-6分钟：20％B；6分钟至结束：70％B)进行纯化，提供M17。LCMS(方法3)：保留时间＝2.35min；MS(ESI+)m/z 335.2(M+H)。
[1381] M18. 1-(4’-甲基-1’-(2”-氧代-2”-(吡啶-2”’-基氨基)乙基)哌嗪-2’-基)甲基乙酸酯
[1382]
[1383] M18a.3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-甲基哌嗪
[1384]
[1385] 在氩气下，向(4-甲基哌嗪-2-基)甲醇(0.60g，4.6mmol)在二氯甲烷(7mL)中的溶液里添加三乙胺(1.08mL，7.82mmol)、4-二甲基氨基吡啶(0.01g)，然后逐滴添加叔丁基二甲基氯硅烷(1g，6.91mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，并在室温下搅拌16小时。将另外的三乙胺(0.6当量)和叔丁基二甲基氯硅烷(0.6当量)添加至溶液中，将该溶液在室温下搅拌2小时。将反应用水处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(碱性氧化铝，1％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M18a。MS(ESI+)m/z 245(M+H)。
[1386] M18c.苄基2-(2’-(乙酰氧基甲基)-4’-甲基哌嗪-1’-基)乙酸酯
[1387]
[1388] 在氩气下，将M18a(1.2g，4.91mmol)在乙腈(12mL)中的溶液用碳酸钾(1.69g，12.3mmol)和苄基2-溴乙酸酯(0.7mL，4.42mmol)处理，并在室温下搅拌16小时。将该反应用水处理，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(碱性氧化铝，1％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供中间体M18b。向M18b(0.49g，1.25mmol)在脱气的(用氩气)二氯甲烷(12mL)中的溶液里添加三氟甲烷磺酸铜(II)(0.45g，
1.25mmol)。将该混合物再次脱气(10分钟)，随后添加乙酸酐(0.31g，3.0mmol)，第三次脱气(10min)，并在氩气下且在室温下搅拌48小时。将该反应用饱和水性碳酸氢钠处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(中性氧化铝，0.25％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M18c。MS(ESI+)m/z 321(M+H)
1.25mmol)。将该混合物再次脱气(10分钟)，随后添加乙酸酐(0.31g，3.0mmol)，第三次脱气(10min)，并在氩气下且在室温下搅拌48小时。将该反应用饱和水性碳酸氢钠处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(中性氧化铝，0.25％甲醇:二氯甲烷)进行纯化，提供M18c。MS(ESI+)m/z 321(M+H)
[1389] M18d.2-(2’-(乙酰氧基甲基)-4’-甲基哌嗪-1’-基)乙酸
[1390]
[1391] 向M18c(0.225g，0.70mmol)在乙醇(5mL)中的溶液里添加5％钯碳(0.045g)，并将该反应在氢气囊压力下搅拌5小时。将该反应通过硅藻土过滤，将该滤液经硫酸钠干燥并浓缩，以提供M18d，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 231.2(M+H)
[1392] M18. 1-(4’-甲基-1’-(2”-氧代-2”-(吡啶-2”’-基氨基)乙基)哌嗪-2’-基)甲基乙酸酯
[1393]
[1394] 在0℃，氩气下，向M18d(0.060g，0.26mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液里添加二异丙基乙胺(0.10g，0.78mmol)和HATU(0.146g，0.39mmol)。将该溶液搅拌10分钟，然后添加2-氨基吡啶(0.029g，0.31mmol)。将该反应在室温下搅拌16小时，然后用水处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(SiO2，10％-12％甲醇:二氯甲烷)，随后通过制备型HPLC(柱：XBridge(150×19mm)；流动相：A＝(在水中的0.1％TFA)，B＝(CAN:甲醇)；梯度：0-2分钟：10％B；2-8分钟：20％B；8分钟至结束：50％B)进行纯化，提供M18。LCMS(方法8)：保留时间＝2.12min；MS(ESI+)m/z 307.1(M+H)。
[1395] M19. 1-(4’-乙基-1’-(2”-氧代-2”-(吡啶-2”’-基氨基)乙基)哌啶-2’-基)甲基乙酸酯
[1396]
[1397]
[1398] M19b.1-(4’-乙基哌啶-2’-基)甲醇
[1399]
[1400] 向1-(4’-溴吡啶-2’-基)甲醇(2g，10.6mmol)在脱气的甲苯(20mL)中的溶液里添加三丁基乙烯基锡(4.44g，16.0mmol)和PdCl2(PPh3)2(0.746g，1.06mmol)，之后进行第二次的10分钟脱气。在50℃下，将该反应在氩气下搅拌18小时，然后用另外部分的丁基乙烯基锡(0.5当量)和PdCl2(PPh3)2(0.05当量)处理，随后在80℃下搅拌18小时。将该反应蒸发。通过快速色谱(SiO2，30％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供中间体M19a。在80psi氢气压下，将M19a(1.4g，10.4mmol)、氧化铂(0.941g，4.15mmol)和乙酸(0.622g，10.4mmol)在甲醇(54mL)和水(36mL)中的混合物放置在Parr振荡器中持续36小时。将该反应通过 过
滤，并浓缩。将残余物用水处理，并用乙酸乙酯萃取。将水层浓缩，以提供M19b，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 144(M+H)。
滤，并浓缩。将残余物用水处理，并用乙酸乙酯萃取。将水层浓缩，以提供M19b，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 144(M+H)。
[1401] M19c.2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-乙基哌啶
[1402]
[1403] 向M19b(0.4g，2.79mmol)在二氯甲烷(8mL)中的溶液里添加三乙胺(0.85g，8.4mmol)、4-二甲基氨基吡啶(0.01g)，然后逐滴添加叔丁基二甲基氯硅烷(1.26g，
8.4mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液，并在室温下搅拌16小时。将反应用水处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(中性氧化铝，10％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供M19c。MS(ESI+)m/z 258.6(M+H)。
8.4mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液，并在室温下搅拌16小时。将反应用水处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(中性氧化铝，10％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供M19c。MS(ESI+)m/z 258.6(M+H)。
[1404] M19e.苄基2-(2’-(乙酰氧基甲基)-4’-乙基哌啶-1’-基)乙酸酯
[1405]
[1406] 在0℃在氩气下，将M19c(0.50g，1.94mmol)和碳酸钾(0.67g，4.86mmol)在乙腈(10mL)中的溶液用苄基2-溴乙酸酯(0.53g，2.33mmol)逐滴处理，并在室温下搅拌6小时。将该反应用饱和水性氯化铵处理，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(SiO2，10％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供中间体M19d。向M19d(0.30g，0.74mmol)在脱气的(用氩气)二氯甲烷(12mL)中的溶液里添加三氟甲烷磺酸铜
(II)(0.267g，0.74mmol)。将该混合物再次脱气(10分钟)，随后添加乙酸酐(0.18g，
1.78mmol)，第三次脱气(10分钟)，并在室温、氩气下搅拌24小时。将该反应用饱和水性碳酸氢钠处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(SiO2，15％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供M19e。MS(ESI+)m/z 334.0(M+H)。
(II)(0.267g，0.74mmol)。将该混合物再次脱气(10分钟)，随后添加乙酸酐(0.18g，
1.78mmol)，第三次脱气(10分钟)，并在室温、氩气下搅拌24小时。将该反应用饱和水性碳酸氢钠处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱(SiO2，15％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供M19e。MS(ESI+)m/z 334.0(M+H)。
[1407] M19f.2-(2’-(乙酰氧基甲基)-4’-乙基哌啶-1’-基)乙酸
[1408]
[1409] 向M19e(0.40g，1.2mmol)在乙醇(8mL)中的溶液里添加5％钯碳(0.08g)，并将该反应在氢气囊压力下搅拌5小时。将该反应通过 过滤。将该滤液经硫酸钠干燥并浓缩，以提供M19f，将其无需进一步纯化而使用。MS(ESI+)m/z 244.1(M+H)。
[1410] M19. 1-(4’-乙基-1’-(2”-氧代-2”-(吡啶-2”’-基氨基)乙基)哌啶-2”-基)甲基乙酸酯
[1411]
[1412] 在0℃，氩气下，向M19f(0.10g，0.41mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液里添加二异丙基乙胺(0.16g，1.23mmol)和HATU(0.187g，0.39mmol)。将该溶液搅拌15分钟，然后添加2-氨基吡啶(0.046g，0.49mmol)。将该反应在室温下搅拌16小时，然后用水处理，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。通过快速色谱(SiO2，25％-30％乙酸乙酯:己烷)进行纯化，提供M19。LCMS(方法8)：保留时间＝2.58min；MS(ESI+)m/z
320.5(M+H)。
320.5(M+H)。
[1413] M20.苄基N-(3-(3’-(((二乙基(异丙氧基)甲硅烷基)氧基)甲基)-4’-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-1’-基)-3-氧代丙基)氨基甲酸酯
[1414]
[1415] M20a.苄基(3-(3-(羟甲基)-4-(2-((4-甲氧基苄基)氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)氨基甲酸酯
[1416]
[1417] 将L-INT-1b(342mg，1.065mmol)溶解于乙腈(5mL)中，并冷却至0℃。将该反应用碳酸钾(402mg，2.91mmol)和2-溴-N-(4-甲氧基苄基)乙酰胺(250mg，0.969mmol)处理，并在室温下搅拌过夜。将该反应混合物用水处理，并用乙酸乙酯萃取。将有机相用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。通过快速色谱(SiO2，用0-10％甲醇:二氯甲烷洗脱)进行纯化，提供M20a。LCMS(方法1)：保留时间＝0.91min；MS(ESI+)m/z 499.4(M+H)。
[1418] M20b.苄基N-(3-(3’-(((氯二乙基甲硅烷基)氧基)甲基)-4’-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-1’-基)-3-氧代丙基)氨基甲酸酯
[1419]
[1420] 在室温下，将M20a(40mg，0.080mmol)和咪唑(273mg，4.01mmol)溶解于四氢呋喃(2mL)中，并且在约50℃下，经若干分钟逐滴添加至二氯二乙基硅烷(0.120mL，0.802mmol)在二甲基甲酰胺(1mL)和四氢呋喃(1mL)的溶液中。将所得溶液从冷浴中移出，并在室温下搅拌1小时，以提供M20b，将其无需进一步纯化而使用。LCMS(方法5)：保留时间＝1.13min；MS(ESI+)m/z 601.3(水解的M20b的M+H)。
[1421] M20.苄基N-(3-(3’-(((二乙基(异丙氧基)甲硅烷基)氧基)甲基)-4’-(2”-((4”’-甲氧基苄基)氨基)-2”-氧代乙基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)氨基甲酸酯
[1422]
[1423] 在室温下，将2-丙醇(0.061mL，0.802mmol)逐滴添加至以上制备的粗M20b在DMF/THF中的溶液中。将该溶液在室温下搅拌2小时，然后浓缩。通过制备型HPLC(柱：沃特斯XBridge 5μm 30×50mm；方法：经3.5分钟梯度，以75mL/min，45％至70％乙腈/H2O(含有10mM NH4OH))进行纯化，产出级分，将这些级分浓缩，快速冷冻并冻干，以提供M20。LCMS(方法5)：保留时间＝1.35min；MS(ESI+)m/z 643.3(M+H)。1H-NMR(CD3OD,ppm):δ:7.25-7.39(m,
5H),7.22(d,J＝8.7Hz,2H),6.85-6.90(m,2H),5.06(d,J＝1.3Hz,2H),4.27-4.42(m,2H),
4.08-4.12(m,1H),3.70-3.84(m,5H),3.61-3.66(m,1H),3.44-3.55(m,1H),3.34-3.43(m,
4H),3.03-3.19(m,2H),2.74-2.85(m,1H),2.39-2.66(m,4H),1.15(d,J＝6.0Hz,6H),0.92-
0.98(m,6H),0.52-0.63(m,4H)。
5H),7.22(d,J＝8.7Hz,2H),6.85-6.90(m,2H),5.06(d,J＝1.3Hz,2H),4.27-4.42(m,2H),
4.08-4.12(m,1H),3.70-3.84(m,5H),3.61-3.66(m,1H),3.44-3.55(m,1H),3.34-3.43(m,
4H),3.03-3.19(m,2H),2.74-2.85(m,1H),2.39-2.66(m,4H),1.15(d,J＝6.0Hz,6H),0.92-
0.98(m,6H),0.52-0.63(m,4H)。
[1424] 使用类似于用于合成M20的方法，来制备表23中的种类：
[1425]
[1426]
[1427]
[1428]
[1429]
[1430]
[1431]
[1432] 实例8
[1433] 体外药物释放研究
[1434] 8-1.布洛赛珠单抗从水凝胶-药物缀合物中释放
[1435]
[1436] 其中Y是选自以上表2。
[1437] 如图4A所示，发生从水凝胶缀合物C1a、C2a、C3a和C4a中释放布洛赛珠单抗。在该研究中，在37℃下，将一系列水凝胶-布洛赛珠单抗-缀合物保持在1×PBS中，以评估无痕迹接头可切割反应后的药物释放。在各个时间点处对这些反应取样，并进行分析以确定在上清液中的释放的布洛赛珠单抗的浓度。
[1438] 将每种水凝胶(约50μL；通过称重测定的准确量，假定水凝胶的密度＝1g/mL)添加至 插入物(康宁公司(Corning,Inc)；聚碳酸酯膜，10μm厚度，6.5mm直径，0.4μm孔径)。用1mL 1×PBS填充板的孔，并且将含有水凝胶的插入物置于孔中。针对每个水凝胶样品，准备三个孔。将该板牢固地加帽，并在潮湿环境中保持在37℃。
[1439] 在长达180天的不同的时间点处将收集缓冲液的样品从孔中取出。在每个时间点和对于每个孔，将 插入物从孔中取出，并将收集缓冲液的整个体积转移至干
净的管中并称重，然后将时间点样品从收集缓冲液(0.10mL)中取出，并储存在4℃下直到最终分析。将该收集缓冲液用1×PBS补充，从而将收集缓冲液体积恢复至1mL，然后将该收集缓冲液返回至孔中。然后将插入物放回其孔中，并将板放回培养箱中。
净的管中并称重，然后将时间点样品从收集缓冲液(0.10mL)中取出，并储存在4℃下直到最终分析。将该收集缓冲液用1×PBS补充，从而将收集缓冲液体积恢复至1mL，然后将该收集缓冲液返回至孔中。然后将插入物放回其孔中，并将板放回培养箱中。
[1440] 在研究完成后，使用蛋白质测定药盒(DCTM蛋白质测定药盒II，伯乐公司5000112)测定时间点样品的蛋白质浓度(代表在该时间点处每个孔中的蛋白质浓度)，其中从布洛赛珠单抗产生标准曲线。将每个时间点样品一式两份进行分析，并将结果平均。在给定时间点处的给定孔中蛋白质的总量通过将该时间点处的蛋白质浓度乘以所测量的体积(假定密度为1g/mL)来计算。从给定时间点处的给定孔中取出的蛋白质的量通过将该时间点处的蛋白质浓度乘以取出的体积(0.10mL)来计算。通过将每个时间点处孔中的布洛赛珠单抗的总量与在该时间点之前从每个时间点处的孔中取出的布洛赛珠单抗的累积量相加，来计算直到该时间点时从每种水凝胶释放到每个孔中的累积的布洛赛珠单抗。直到给定的时间点时，将从缀合物C1a、C2a、C3a和C4a释放的蛋白质的累积百分比示出在图4B中。通过将在给定时间点处释放的累积布洛赛珠单抗除以在初始水凝胶样品中存在的总布洛赛珠单抗并乘以100，来计算释放的布洛赛珠单抗的累积百分比。通过将所测量的已达到平台值的释放药物的量设置为100％，来对数据进行标准化。如从图4B明显看出，布洛赛珠单抗从载体的释放持续了超过了若干个月，并且释放速率受缀合物中使用的无痕迹接头的结构的影响。
[1441] 在时间点t处，孔中蛋白质的浓度：
[1442] [P](t)
[1443] 在时间点t处，孔中的总体积：
[1444] V(t)
[1445] 在时间点t处，孔中的总蛋白质：
[1446] P孔(t)＝[P](t)×V(t)
[1447] 在时间点t处，从孔中取出的蛋白质：
[1448] R(t)＝[P](t)×0.1mL
[1449] 直到时间点t时，从水凝胶释放的累积蛋白质：
[1450]
[1451] 8-2.D2从水凝胶-药物缀合物释放
[1452] 在6.5mm 插入物(8μm孔径，康宁公司(Corning))中进行体外释放测定。将药物连接的HA水凝胶的100μL等分试样，连同100μL牛滑液(BSF，来自生物再生公司(Bioreclamation IVT)，补充有以下抗微生物剂：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(生命技术公司(Life Technologies))和1％二性霉素B(生命技术公司))或100μL PBS添加至每个Transwell插入物。在插入物中凝胶和释放介质的总初始体积为200μL。将900μL的BSF(加抗微生物剂)或PBS移液至Transwell板的孔中，将含水凝胶的插入物置于孔中，并将该板在加湿培养箱中、在37℃、5％CO2下孵育(针对每个水凝胶样品准备两个插入物)。在每个时间点处，将Transwell插入物转移至填充有1000μL新鲜的BSF(加抗微生物剂)或PBS的新孔中，并且将旧孔中的内容物取出并储存在-80℃下直到测定。
[1453] 通过夹心ELISA确定释放的D2的定量。该方案类似于在人IGF-1 DuoSet Elisa开发系统(R&D系统公司)中所述的方案，但具有以下修改：对于板的准备，将96孔型式的板(奥仕达公司(Costar))用在BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液Pack(赛默飞世尔科技公司
(Thermoscientific))中稀释的捕获抗体(诺华公司(Novartis))涂覆，并在4℃下孵育过
夜。除BSA(西格玛公司(Sigma))、洗涤缓冲液KPL(柯克加德和佩里实验室(Kirkegaard&
Perry))和封闭溶液KPL奶稀释剂/封闭剂(柯克加德和佩里实验室)外，所有其他试剂均来自R&D系统公司。将检测抗体孵育1.5小时。在与PBS或BSF孵育期间，从水凝胶C10、C11和C12释放的蛋白质的累积量显示在图5中。给定时间点处孔中释放的蛋白质的量通过将在该时间点处的释放介质(BSF或PBS)中的蛋白质浓度乘以释放介质的总体积(1.1mL)来计算。直到给定的时间点时，从每种水凝胶释放的累积蛋白质通过将在该时间点处释放的蛋白质的量(对于每种水凝胶，来自两个孔的平均值)与在该时间点之前的每个时间点处释放的蛋白质的累积量相加来计算。如从图5明显看出，D2从载体的释放持续了超过了若干周，并且释放速率受缀合物中使用的无痕迹接头的结构的影响。
(Thermoscientific))中稀释的捕获抗体(诺华公司(Novartis))涂覆，并在4℃下孵育过
夜。除BSA(西格玛公司(Sigma))、洗涤缓冲液KPL(柯克加德和佩里实验室(Kirkegaard&
Perry))和封闭溶液KPL奶稀释剂/封闭剂(柯克加德和佩里实验室)外，所有其他试剂均来自R&D系统公司。将检测抗体孵育1.5小时。在与PBS或BSF孵育期间，从水凝胶C10、C11和C12释放的蛋白质的累积量显示在图5中。给定时间点处孔中释放的蛋白质的量通过将在该时间点处的释放介质(BSF或PBS)中的蛋白质浓度乘以释放介质的总体积(1.1mL)来计算。直到给定的时间点时，从每种水凝胶释放的累积蛋白质通过将在该时间点处释放的蛋白质的量(对于每种水凝胶，来自两个孔的平均值)与在该时间点之前的每个时间点处释放的蛋白质的累积量相加来计算。如从图5明显看出，D2从载体的释放持续了超过了若干周，并且释放速率受缀合物中使用的无痕迹接头的结构的影响。
[1454] D2是引起在过表达人IGF-1受体的NIH3T3细胞中IGF1受体磷酸化的药物。当将过表达人IGF-1受体的NIH3T3细胞与来自各个时间点(如上所述收集)的含药物的释放介质孵育时，通过对引起的IGF1受体的磷酸化作用定量，来评估释放的D2的生物活性。通过裂解细胞并对裂解物进行ELISA来确定IGF-1受体磷酸化作用的水平。将细胞以6000个细胞/孔(96孔板型式)接种在DMEM高葡萄糖、10％FCS、1％丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、
100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素中，并在37℃下在含有5％CO2的加湿培养箱中孵育过夜。
然后在37℃，5％CO2下与新鲜的D2标准品或含药物的释放介质孵育1小时之前，将细胞在37℃、5％CO2下在饥饿培养基(DMEM高葡萄糖、0.1％BSA、1％丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中进行血清饥饿1.5小时。假定没有活性损失，在添加至细胞之前，将含药物的释放介质用饥饿培养基稀释，以便于实现D2浓度在标准曲线范围内。基于先前已经使用以上段落中所述的方法，通过夹心ELISA测量的释放介质中的D2浓度，确定每个样品的合适的稀释倍数。在4℃下，在水平振荡器上，将细胞在1×Tris-缓冲盐水(50mM Tris·HCl，pH 7.5，150mM NaCl)、1％Triton X-100、5mM EDTA、1×蛋白酶磷酸酶抑制剂(赛默飞世尔科技公司(Thermoscientific))中裂解30-45分钟。将样品在-80℃下储存过夜。通过ELISA，使用具有以下修改的DuoSet IC人磷光体-IGF-1R(R&D系统公司)来分析IGF-1R磷酸化作用水平：将捕获抗体(R&D MAB391)在PBS中稀释至4ug/ml；将孔用
300ul/孔的PBS-Tween(密理博公司(Millipore)，524653)洗涤；将孔用200ul/孔的在PBS中的1％BSA封闭；使用抗体HRP-抗磷酸酪氨酸(R&D，HAM1676)检测磷酸化作用；以及用化学发光底物(皮尔斯公司(Pierce)，37069)检测发光信号。从标准曲线内推在用释放的D2处理的细胞中为实现所测量的IGF-1R磷酸化作用水平所需的新鲜D2的当量浓度，并然后针对稀释进行校正。结果值(对于从缀合物C8释放到BSF释放介质中的D2，如图9所示)表示新鲜的D2的当量浓度，该当量浓度将提供细胞中IGF-1R磷酸化作用的观察水平。如从图9明显看出，生物活性D2从缀合物C8中的释放持续超过七天。
100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素中，并在37℃下在含有5％CO2的加湿培养箱中孵育过夜。
然后在37℃，5％CO2下与新鲜的D2标准品或含药物的释放介质孵育1小时之前，将细胞在37℃、5％CO2下在饥饿培养基(DMEM高葡萄糖、0.1％BSA、1％丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中进行血清饥饿1.5小时。假定没有活性损失，在添加至细胞之前，将含药物的释放介质用饥饿培养基稀释，以便于实现D2浓度在标准曲线范围内。基于先前已经使用以上段落中所述的方法，通过夹心ELISA测量的释放介质中的D2浓度，确定每个样品的合适的稀释倍数。在4℃下，在水平振荡器上，将细胞在1×Tris-缓冲盐水(50mM Tris·HCl，pH 7.5，150mM NaCl)、1％Triton X-100、5mM EDTA、1×蛋白酶磷酸酶抑制剂(赛默飞世尔科技公司(Thermoscientific))中裂解30-45分钟。将样品在-80℃下储存过夜。通过ELISA，使用具有以下修改的DuoSet IC人磷光体-IGF-1R(R&D系统公司)来分析IGF-1R磷酸化作用水平：将捕获抗体(R&D MAB391)在PBS中稀释至4ug/ml；将孔用
300ul/孔的PBS-Tween(密理博公司(Millipore)，524653)洗涤；将孔用200ul/孔的在PBS中的1％BSA封闭；使用抗体HRP-抗磷酸酪氨酸(R&D，HAM1676)检测磷酸化作用；以及用化学发光底物(皮尔斯公司(Pierce)，37069)检测发光信号。从标准曲线内推在用释放的D2处理的细胞中为实现所测量的IGF-1R磷酸化作用水平所需的新鲜D2的当量浓度，并然后针对稀释进行校正。结果值(对于从缀合物C8释放到BSF释放介质中的D2，如图9所示)表示新鲜的D2的当量浓度，该当量浓度将提供细胞中IGF-1R磷酸化作用的观察水平。如从图9明显看出，生物活性D2从缀合物C8中的释放持续超过七天。
[1455] 8-3.D4从接头-药物加合物释放：L8D4
[1456]
[1457] 在1×PBS中制备L8D4的1mg/mL溶液。测量加合物溶液的pH，并发现其为6.9。将该溶液置于40℃热混合器中，以600rpm振荡。溶解后，在以下时间点处取出等分试样用于HPLC分析：0小时、2小时、4小时、21.5小时、28.5小时、43.5小时、67.5小时、100.5小时、180.5小时和266.5小时。
[1458] 提高HPLC(以下方法)，在每个时间点处评估溶液的组成。通过MS检测指定了母体(L8D4，(M+2H)2+的m/z＝+952.2)、中间体(L8D4-INT，(M+2H)2+的m/z＝+916.4)和释放的药物(D4，M+H的m/z＝+1537.9)峰，并通过将来自使用214nm处UV吸光度产生的色谱图的峰积分来确定每个种类的相对量。在溶液中存在的每个种类的百分比通过将各自的峰面积(L8D4、L8D4-INT或D4)除以L8D4、L8D4-INT和D4的三个峰面积的总和，并将该结果乘以100来计算。将溶液中存在的每个种类的百分比相对时间绘图(图6)，并使用曲线拟合软件(假定释放和降解的第一级动力学)来估算母体L8D4(1天)的降解半衰期和D4(8天)的释放半衰期。如从图6明显看出，D4从无痕迹接头释放会持续超过11天。观察到的反应产物与图1所示的无痕迹接头切割机理一致。
[1459] 分析型HPLC-MS条件：ACQUITY UPLC BEH C18；粒度：1.7μm；柱尺寸：2.1×50mm；洗脱液/梯度：2％-98％CH3CN/H2O/4.4min(含有0.1％甲酸的CH3CN和含有0.1％甲酸的H2O)；流速：1.0mL/min；柱温度：50℃。
[1460] 8-4a.体外M1-M19模型无痕迹接头-药物缀合物的释放研究方案
[1461] 在该研究中，将一系列的模型无痕迹接头-药物缀合物(其中该药物是低分子量含胺化合物)保持在37℃下的1×PBS中。在不同时间点对这些反应取样，并分析，以确定剩余起始化合物的浓度，以及释放的含胺药物(对甲氧基苄基胺、2-氨基-吡啶、对甲氧基苯胺或N-甲基-对甲氧基苄基胺)的浓度。计算了母体降解的半衰期和含胺药物释放的半衰期。
[1462] 用于估算含胺药物从M1-M19的释放速率的方法
[1463] 将每种化合物M1-M19作为在DMF中的0.1M储备溶液制备，作为释放的含胺药物(4-甲氧基苄基胺、2-氨基吡啶、对甲氧基苯胺和N-甲基-对甲氧基苄基胺)的一组标准溶液。将每个溶液的35μL等分试样添加至3.465mL的PBS中，以获得每种缀合物或含胺药物的1mM溶液。将每个1mM溶液的150μL等分试样分配到具有聚丙烯插入物的LCMS小瓶中；在每个时间点处针对每种化合物准备2个小瓶。
[1464] 将小瓶在37℃下孵育。在每个时间点处(例如，0、1、5、7、14、21、28、35、49和56天)从培养箱中取出每种缀合物的两个小瓶，并在-20℃下冷冻以避免进一步水解。将所有样品解冻并在完成释放研究后使用下述分析型HPLC方法以一批进行分析。将每个样品分析两次。在分析之前制备含胺药品的对照溶液，并无需事先在37℃下孵育按原样进行分析。
[1465] 用于研究8.4a的分析型HPLC-MS条件
[1466] HPLC：Thermo Accela HPLC和Autosampler；Autosampler Tray温度：8℃；注射体积：20μL；柱：菲罗门Kinetex C18，2.1×50mm，2.6μm。柱温度：环境温度；流动相：A＝水中的0.1％甲酸；B＝乙腈中的0.1％甲酸；流速：200μL/min。梯度(时间/％B)：0/0、3/0、10/80、
15/80、15.1/0、18/0。
15/80、15.1/0、18/0。
[1467] UV：Thermo Accela PDA；扫描范围：200nm-400nm；波长步长：1nm；采样率：20Hz；过滤器带宽：9nm；MS：Thermo LTQ XL；电离模式：ESI；喷雾电压：在时间0-1分钟的0V，然后切换到4kV；毛细管温度：250℃；分流阀：在时间0-1分钟针对废物的LC洗脱，然后是分流的MS；质量范围：120-800Da。
[1468] 使用HPLC，在每个时间点处评估溶液的组成。通过MS检测指定母体、中间体和释放的含胺药物峰，并且通过将来自使用272nm处UV吸光度检测产生的色谱图的峰积分来确定每个种类的相对量。将第0天，每种化合物M1-M19的平均峰面积被指定标准化值为100。对于释放的含胺药物的标准品(例如，对甲氧基苄基胺)，将每种标准品的平均峰面积指定标准化值为100。将检测到的每个种类的曲线下绝对面积与这些值进行比较。对于强信号，运行与运行之间的峰面积的重现性通常在20％以内，而对于弱信号，重现性则要差得多，因此高于100的标准化信号可能对应于等于或接近100的值(在实验误差范围内可能为90-100)。溶液中存在的母体和含胺药物的百分比通过相对峰面积除以针对相同种类的被指定标准化值为100的平均面积，并将结果乘以100来计算。将溶液中存在的母体和含胺药物的百分比相对时间绘图，并使用曲线拟合软件(假定第一级动力学)来估算母体的降解半衰期和含胺药物的释放半衰期。表25中报道最近的一整天四舍五入计算的半衰期。
[1469] 8-4b.M20-M27体外释放研究
[1470] 在该研究中，将一系列模型无痕迹接头-药物缀合物M20-M27保持在37℃下的水溶液中。在各个时间点处对这些反应取样，并进行分析以确定剩余的起始化合物的浓度。对于确定含胺药物的浓度，未优化分析型方法。计算母体的降解半衰期。
[1471] 用于估算M20-M27的缀合物降解速率的方法
[1472] 将每种化合物M20-M27作为在DMF中的0.1M储备溶液制备。将每种溶液的35μL等分试样添加至3.465mL的2:1DMF:PBS(对于化合物M24：3:1DMF:PBS)中，以获得每种化合物M20-M27的1mM溶液。将这些反应小瓶保持在37℃下。在每个时间点(例如，0、1、3、8、14、21、
28、35、49、56、70、92天)处，通过从每个1mM溶液中收集150μL，并用75μL DMF稀释来制备分析样品。在每个时间点处从每个反应小瓶中收集两个分析样品，并储存在4℃下。在完成释放研究后，将所有样品以一批进行分析。使用以下描述的分析型HPLC方法，将每个样品分析两次。
28、35、49、56、70、92天)处，通过从每个1mM溶液中收集150μL，并用75μL DMF稀释来制备分析样品。在每个时间点处从每个反应小瓶中收集两个分析样品，并储存在4℃下。在完成释放研究后，将所有样品以一批进行分析。使用以下描述的分析型HPLC方法，将每个样品分析两次。
[1473] 使用HPLC，在每个时间点处评估反应溶液的组成。通过MS检测指定化合物M20-M27峰，并确定来自使用272nm处UV吸光度检测产生的色谱图的峰积分。将第0天，每种化合物M20-M27的平均峰面积被指定标准化值为100。将在每个时间点处的曲线下绝对面积与这些值进行比较。对于强信号，运行与运行之间的峰面积的重现性通常在20％以内，而对于弱信号，重现性则要差得多，因此高于100的标准化信号可能对应于等于或接近100的值(在实验误差范围内可能为90-100)。溶液中存在的化合物M20-M27的百分比通过将相对峰面积除以被指定标准化值为100的平均面积，并将结果乘以100来计算。将溶液中存在的化合物M20-M27的百分比相对时间绘图，并使用曲线拟合软件(假定第一级动力学)来估算降解半衰期。表25中报道最近的一整天四舍五入计算的半衰期。
[1474] 用于研究8.4b的分析型HPLC-MS条件。
[1475] 除了以下各项外，所有的设置均与针对研究8.4a的分析型HPLC-MS条件相同：流动相：A＝水中的5mM氢氧化铵；B＝乙腈中的5mM氢氧化铵；流速：400μL/min：梯度(时间/％B)：0/10、0.5/10、4/80、8/80、8.1/10、12/10。样品注射后0.5分钟切换分流阀。
[1476]
[1477]
[1478] 实例9
[1479] 9-1.布洛赛珠单抗从水凝胶-药物缀合物中释放
[1480] 在这些实例中，将水凝胶药物缀合物以2种不同的剂量向兔的玻璃体内给药，随后在32天后给予VEGF剂量。34天后，通过成像检查兔眼，以评估视网膜血管渗漏的封闭程度。还确定了在眼玻璃体的液体部分中布洛赛珠单抗的最终暴露。
[1481] 在给药前，将以布洛赛珠单抗的10.2mg/mL荷载制备的水凝胶-药物缀合物C2b稀释，以获得具有布洛赛珠单抗荷载为6mg/mL(C2b1)和0.6mg/mL(C2b2)的样品。待添加的1×PBS的量通过以下方程式计算：(PBS稀释液(mL))＝[(总药物(mg)/所希望的药物荷载(mg/mL)]-(缀合物的初始体积(mL)。
[1482] 为制备具有布洛赛珠单抗荷载为6mg/mL(C2b1)的缀合物：向在3mL注射器中的0.9mL C2b里添加0.63mL的1×PBS。给该注射器加帽，并剧烈振荡以均化。这产生总的样品体积为1.53mL，其中蛋白质荷载＝9.18mg布洛赛珠单抗/1.53mL＝C2b1中6.0mg/mL布洛赛珠单抗。
[1483] 通过去除柱塞并用所希望的体积的C2b1回填，在具有附接的30G针头的0.5mL胰岛素注射器中，将缀合物C2b1分配用于给药。通过轻柔地操作注射器即可去除气泡。
[1484] 为制备具有布洛赛珠单抗荷载为0.6mg/mL(C2b2)的缀合物：向在3mL注射器中的0.1mL C2b1里添加0.9mL的1×PBS。给该注射器加帽，并剧烈振荡以均化。这产生总的样品体积为1.0mL，其中蛋白质荷载＝0.60mg布洛赛珠单抗/1.0mL＝C2b2中0.6mg/mL布洛赛珠单抗。
[1485] 通过去除柱塞并用所希望的体积的C2b2回填，在具有附接的30G针头的0.5mL胰岛素注射器中，将缀合物C2b2分配用于给药。通过轻柔地操作注射器即可去除气泡。
[1486] 在雄性荷兰黑带兔(Dutch belted rabbit)(体重约1.6-2kg)的眼中在玻璃体内施用400ng/眼的人VEGF(hVEGF)，导致在处理后48小时的最大渗漏。这种血管渗漏可以通过事先IVT施用抗VEGF分子(例如兰尼单抗、贝伐单抗或布洛赛珠单抗)，来完全抑制。抗VEGF分子的施用与hVEGF激发之间的间隔决定了抗VEGF分子的作用持续时间。在该研究中，在hVEGF激发前32天(成像前34天)，将抗VEGF抗体(在溶液中或作为水凝胶-缀合物)或空白水凝胶(阴性对照)注射到玻璃体中。在相同的时间用相同的抗体/构建体对由3-5只动物(6-
10只眼)组成的每个兔群组进行注射。相对于在空白水凝胶处理组中观察到的血管渗漏，计算了每种抗VEGF构建体诱导的血管渗漏的抑制。
10只眼)组成的每个兔群组进行注射。相对于在空白水凝胶处理组中观察到的血管渗漏，计算了每种抗VEGF构建体诱导的血管渗漏的抑制。
[1487] 用局部1％环喷托酯和2.5苯肾上腺素扩张雄性荷兰黑带兔(体重约1.6-2kg)眼，并且用局部0.5％丙美卡因麻醉角膜。然后将兔通过肌肉内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物
(17.5mg/kg-35mg/kg和2.5mg/kg-5mg/kg)进行麻醉。在用手术显微镜直接观察下，将50μL处理液注入玻璃体。将30号规格的针头距角膜缘约2mm从颞上插入进入玻璃体中部。检查兔眼由注射引起的并发症(例如出血、视网膜脱离或晶状体损伤)，然后在另一只眼上重复该过程。在所有研究中，将抗生素软膏施用在两只眼上。在初始注射水凝胶-药物缀合物后32天，将400ng的重组hVEGF注射到兔眼的玻璃体中。将人VEGF(派普泰克公司(Peprotech)；
cat AF 100-20，Lot 0508AF10)稀释于无菌0.9％盐水中。在玻璃体内注射VEGF激发后48小时，如下所述对兔视网膜血管进行成像。
(17.5mg/kg-35mg/kg和2.5mg/kg-5mg/kg)进行麻醉。在用手术显微镜直接观察下，将50μL处理液注入玻璃体。将30号规格的针头距角膜缘约2mm从颞上插入进入玻璃体中部。检查兔眼由注射引起的并发症(例如出血、视网膜脱离或晶状体损伤)，然后在另一只眼上重复该过程。在所有研究中，将抗生素软膏施用在两只眼上。在初始注射水凝胶-药物缀合物后32天，将400ng的重组hVEGF注射到兔眼的玻璃体中。将人VEGF(派普泰克公司(Peprotech)；
cat AF 100-20，Lot 0508AF10)稀释于无菌0.9％盐水中。在玻璃体内注射VEGF激发后48小时，如下所述对兔视网膜血管进行成像。
[1488] 在静脉内施用荧光染料后，通过获取视网膜血管图像来量化人VEGF诱导的视网膜血管变化。将荧光素递送后获得的图像用于确定血管渗透性。定量荧光素渗漏值的产生还需要对选择用来标记血管的荧光染料(异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的右旋糖酐)进行成像。VEGF后48小时获得眼图像。图像是在与视神经相邻的鼻髓射线上用30度透镜获得的多达40张配准扫描激光检眼镜(SLO)图像的平均值。将来自6模式 (海德堡工程
(Heidelberg Engineering))的荧光素的通道用于所有的图像采集。在成像之前，使兔局部接受1-2滴的1％环喷托酯和1-2滴的2.5％苯肾上腺素用于扩张；0.5％丙美卡因还被用作局部麻醉剂。随后如先前所述将兔麻醉。图像采集之前约5分钟，用静脉内注射1mL FITC-缀合的2000kD右旋糖酐 溶液进入边缘耳静脉来标记血管。基于产生高质量图像
所需的荧光信号，根据经验为每批选择使用的FITC-右旋糖酐的浓度(35mg/mL-70mg/mL)。
随后获取标记的视网膜血管的图像。然后通过将0.3mL 10％的荧光素溶液注射到边缘耳静脉，评估视网膜血管渗透性。然后将一只眼IV注射后3分钟采集图像，随后将对侧眼IV荧光素注射后约4-6分钟采集图像。
(Heidelberg Engineering))的荧光素的通道用于所有的图像采集。在成像之前，使兔局部接受1-2滴的1％环喷托酯和1-2滴的2.5％苯肾上腺素用于扩张；0.5％丙美卡因还被用作局部麻醉剂。随后如先前所述将兔麻醉。图像采集之前约5分钟，用静脉内注射1mL FITC-缀合的2000kD右旋糖酐 溶液进入边缘耳静脉来标记血管。基于产生高质量图像
所需的荧光信号，根据经验为每批选择使用的FITC-右旋糖酐的浓度(35mg/mL-70mg/mL)。
随后获取标记的视网膜血管的图像。然后通过将0.3mL 10％的荧光素溶液注射到边缘耳静脉，评估视网膜血管渗透性。然后将一只眼IV注射后3分钟采集图像，随后将对侧眼IV荧光素注射后约4-6分钟采集图像。
[1489] 根据3-6分钟的荧光素图像评估VEGF对血管渗透性的影响。使用用出于此目的而开发的定制软件进行定量分析。在图像
质量不足的情况下(如果存在明显炎症)，或在注射有问题的情况下，则在遮掩之前进行排除。
质量不足的情况下(如果存在明显炎症)，或在注射有问题的情况下，则在遮掩之前进行排除。
[1490] 使用下述方法，通过图像处理技术定量荧光素渗漏。
[1491] 首先，使用两个图像共有的血管特征将VEGF后的FITC-右旋糖酐图像和荧光素图像彼此对齐，然后：
[1492] 1.然后从共同配准的图像以及任何图像质量不足以进行分析的局部区域中裁剪出髓射线之外的区域。
[1493] 2.在两个图像中都描绘了视网膜血管中的若干个目的区域，并增强了一个图像的强度，直到两个图像中的目的区域中的信号相等为止(标准化)。
[1494] 3.从荧光素泄漏图像中减去对齐的FITC-右旋糖酐图像，得到由渗出的荧光素构成的图像。
[1496] 相对于阴性对照组，计算每组中的荧光素渗漏的抑制。使用Dunnett的多重比较检验利用方差单向分析，进行统计分析。
[1497] 所测量的荧光信号与血管渗漏成比例。功效被定义为相对于在接受盐水或其他阴性对照(例如空白水凝胶)注射的动物中观察到的信号，所测得的荧光信号强度的降低。平均荧光信号的较低值对应于更高的泄漏抑制，因此，对应于更大的功效。
[1498] 图7A中显示的来自该研究的数据显示，与阴性对照(水凝胶H1b)相比，用水凝胶-药物缀合物C2b的两种剂量(C2b1和C2b2)情况下荧光素渗漏的强抑制。对于阳性对照(1000μg/眼的布洛赛珠单抗)，每只眼均观察到类似的强抑制作用。较低剂量的布洛赛珠单抗(300μg/眼)仅显示荧光素渗漏的部分封闭，显著低于剂量匹配的水凝胶-药物缀合物(C2b1)或低10倍的剂量的水凝胶-药物缀合物(C2b2)。
[1499] 9-2.兔玻璃体中的药物暴露
[1500] 将来自先前VEGF激发研究的已经被给予C2b1和C2b2的兔用于评价玻璃体液中最终的药物水平。
[1501] 在最终的时间点处，从兔中采集血清和眼。解剖兔眼以分离玻璃体液。在进一步处理或分析之前，将样品保存在80℃。如下，将玻璃体液进一步分离成“液体”和“凝胶”玻璃体液级分。将玻璃体液解冻，并使用塑料1000μL移液器吸头将固体状凝胶玻璃体液与样品中的液体玻璃体液物理分离。剩余的体积被认为是玻璃体液的“液体”部分，其分析示于图7B。
[1502] 将Meso Scale Discovery(MSD)384孔ELISA板(目录号L21XA-4)用针对接头(其连接布洛赛珠单抗VH和VL)的在PBS中的15μL(1μg/mL)兔单克隆抗体涂覆，并在4℃下孵育过夜。将这些板用80μL的TBST(Tris-缓冲盐水，pH 7.5，0.05％Tween 20)洗涤3次，并用40μL的封闭缓冲液(PBS中的5％BSA)封闭。BSA购自密理博公司(Millipore)(目录号820452)或罗氏公司(Roche)(目录号03 116 964 001)。用于封闭的孵育时间是在室温下2小时或在4℃下过夜。然后将这些板用80μL的TBST洗涤三次。将样品与稀释剂(在Tris-缓冲盐水中2％BSA、0.1％Tween-20、0.1％Triton X-100，pH 7.5)混合，并然后将样品的15μL等分试样在MSD ELISA板上在室温下孵育1小时，伴随轻微振荡。然后将这些板用TBST洗涤三次。将检测抗体的15μL(0.5μg/mL)等分试样，针对接头(SEQ ID NO:3)(该接头连接布洛赛珠单抗VH(SEQ ID NO:2)和VL(SEQ ID NO:1))的加硫代标签的兔单克隆抗体添加至每个孔，在室温下保持1小时，伴随轻微振荡。根据MSD标记药盒(MSD Gold硫代标签NHS-Easter缀合物包装
1目录号R31AA-1)中的方案，硫代标签与针对接头(其连接布洛赛珠单抗VH和VL)的兔单克隆抗体缀合。一小时后，将这些板用80mL的TBST洗涤三次。将MSD读取缓冲液T(MSD目录号R92TC-2)用水稀释至1×浓度，并且将37.5μL的1×MSD读取缓冲液T添加至每个孔。在Meso Scale Discovery M6000检测器上读取板。为了定量从水凝胶中的布洛赛珠单抗回收水平，将经纯化的布洛赛珠单抗用作标准品。
1目录号R31AA-1)中的方案，硫代标签与针对接头(其连接布洛赛珠单抗VH和VL)的兔单克隆抗体缀合。一小时后，将这些板用80mL的TBST洗涤三次。将MSD读取缓冲液T(MSD目录号R92TC-2)用水稀释至1×浓度，并且将37.5μL的1×MSD读取缓冲液T添加至每个孔。在Meso Scale Discovery M6000检测器上读取板。为了定量从水凝胶中的布洛赛珠单抗回收水平，将经纯化的布洛赛珠单抗用作标准品。
[1503] 如下产生使用经纯化的布洛赛珠单抗的标准曲线。通过在ELISA稀释液中稀释布洛赛珠单抗2倍(其中起始浓度为500ng/mL)，生成十二点标准曲线。使用Meso Scale
Discovery分析软件(Discovery Workbench 4.0版)用于数据分析。通过绘制x轴上布洛赛珠单抗浓度的log和y轴上原始ECL单元的log，将原始电化学发光(ECL)信号和布洛赛珠单抗浓度进行转化以产生标准曲线。最终的布洛赛珠单抗浓度通过将从标准曲线内推的布洛赛珠单抗值乘以适当的稀释因子来确定。仅使用标准曲线线性范围内的ECL信号值。
Discovery分析软件(Discovery Workbench 4.0版)用于数据分析。通过绘制x轴上布洛赛珠单抗浓度的log和y轴上原始ECL单元的log，将原始电化学发光(ECL)信号和布洛赛珠单抗浓度进行转化以产生标准曲线。最终的布洛赛珠单抗浓度通过将从标准曲线内推的布洛赛珠单抗值乘以适当的稀释因子来确定。仅使用标准曲线线性范围内的ECL信号值。
[1504] 图7B中的结果显示与阴性对照(H1b)和与两种剂量的溶液给予的布洛赛珠单抗相比，用两种剂量的水凝胶-药物缀合物C2b(C2b1和C2b2)给药的兔的液体玻璃体液中显著更高水平的布洛赛珠单抗。(请注意，出于制图目的，对检测到零药物的样品指定了0.1ng/mL的值)。
[1505] 9-3.D4从缀合物C13体内释放
[1506] 在啮齿动物模型中，评估从水凝胶药物缀合物C13中的体内肽释放。
[1507] 所有研究均根据NIBR批准的《动物护理和使用规程》(Animal Care and Use Protocols)进行。C57BL/6小鼠(雄性，1-11周龄)获得自英维格公司(Envigo)。用固定的27号规格的针头，将1×PBS，pH 6.5中的C13(D4含量＝10mg/mL)转移至胰岛素注射器。将配制品以体积为5mL/kg(50mg/kg D4)的剂量皮下注射到小鼠的背侧中点。对两组动物(各自n＝
3)给药。在用EDTA作为抗凝剂给药后的多个时间，通过尾部横切采集50μL血样。将血样以
4000×g离心20分钟，以获得20μL血浆上清液。
3)给药。在用EDTA作为抗凝剂给药后的多个时间，通过尾部横切采集50μL血样。将血样以
4000×g离心20分钟，以获得20μL血浆上清液。
[1508] 通过LC/MS方法测定血浆样品中D4的浓度。将150μL萃取溶剂(乙腈:甲醇:水:甲酸；1:1:1:0.003)添加至20μL血浆中，并在96孔深孔板中涡旋30秒。将其以4000×g离心10分钟。将上清液的150μL等分试样转移至新鲜的深孔板在。D4的标准曲线通过在EDTA血浆中从10,000ng/mL至0.5ng/mL D4连续稀释D4来制备，并与未知的样品共萃取。在安捷伦
1290HPLC上，以流速为700μL/min，将未知的样品和标准曲线样品注射(10μL，CTC PAL HTS自动进样器)到ACE C18LC柱(30×2.1，3μm)中。将柱用95％缓冲液A(水中的0.1％甲酸)，
5％缓冲液B(乙腈中的0.1％甲酸)预平衡。经1.3分钟，通过5％至98％缓冲液B的梯度洗脱D4。将洗脱液注入以ESI模式(450℃，CE＝15，DP＝50)运行的Sciex 6500 MS中。监测378.0(母体)至167.0(子代)的m/z转化用于定量。在给药后直至7天的时间点处，测定血浆中释放的D4的浓度。从图8可以明显看出，当以水凝胶-药物缀合物给药(使用本文所述的无痕迹接头L8例证)时，实现了D4的延长暴露。
1290HPLC上，以流速为700μL/min，将未知的样品和标准曲线样品注射(10μL，CTC PAL HTS自动进样器)到ACE C18LC柱(30×2.1，3μm)中。将柱用95％缓冲液A(水中的0.1％甲酸)，
5％缓冲液B(乙腈中的0.1％甲酸)预平衡。经1.3分钟，通过5％至98％缓冲液B的梯度洗脱D4。将洗脱液注入以ESI模式(450℃，CE＝15，DP＝50)运行的Sciex 6500 MS中。监测378.0(母体)至167.0(子代)的m/z转化用于定量。在给药后直至7天的时间点处，测定血浆中释放的D4的浓度。从图8可以明显看出，当以水凝胶-药物缀合物给药(使用本文所述的无痕迹接头L8例证)时，实现了D4的延长暴露。
[1509] 实例10
[1510] 水凝胶的组织耐受性比较
[1511] 该研究检验了当单一皮下注射各种水凝胶并在7天后检查时C57BL/6小鼠引发肉芽肿免疫应答的能力。测试品是H9(通过硫醇官能化的透明质酸和丙烯酸酯官能化的PEG之间的反应交联的基于透明质酸的水凝胶颗粒)；H1f(通过叠氮化物官能化的透明质酸和炔烃修饰的PEG之间的反应交联的基于透明质酸的水凝胶颗粒)；和用于治疗骨关节炎膝盖疼痛(赛诺菲公司(Sanofi))的基于Synvisc- 透明质酸的可注射溶液。
[1512] H9的制备
[1513] 将硫醇-官能化的透明质酸GLYCOSILTM(可从埃西博公司(EsiBio)，阿拉米达(Alameda)，加利福尼亚州)购得)用于制备H9。
[1514] 基于公开的参考文献(Shu,X.Z.等人.,J Biomed Mater Res A[生物医学材料研究杂志A部分],2006,79(4):902-12；Shu,X.Z.,等人.,Biomaterials[生物材料],2004,25:
TM
1339-1348)，GLYCOSIL 被理解为具有分子量为158kDa-187kDa且被含硫醇部分42％-45％官能化的硫醇-官能化的透明质酸聚合物。出于计算凝胶化反应中反应性基团的浓度的目的，假定取代程度为45％。未取代的羧酸钠盐重复二聚体单元的分子量为401.3Da。具有在出版物中描述的结构的硫醇化重复二聚体单元的分子量为481.5Da。具有假定的45％取代TM
程度的GLYCOSIL 的钠盐形式的二聚体单元的平均MW为437.5Da＝((401.3×0.55)+(481.5
×0.45))。
TM
1339-1348)，GLYCOSIL 被理解为具有分子量为158kDa-187kDa且被含硫醇部分42％-45％官能化的硫醇-官能化的透明质酸聚合物。出于计算凝胶化反应中反应性基团的浓度的目的，假定取代程度为45％。未取代的羧酸钠盐重复二聚体单元的分子量为401.3Da。具有在出版物中描述的结构的硫醇化重复二聚体单元的分子量为481.5Da。具有假定的45％取代TM
程度的GLYCOSIL 的钠盐形式的二聚体单元的平均MW为437.5Da＝((401.3×0.55)+(481.5
×0.45))。
[1515] 在室温下，经40分钟，在原始样品小瓶中，将GLYCOSILTM(10mg，22.9μmol)溶解于1mL的1XPBS，pH 7.4中。使用钠盐二聚体单元的平均分子量，重复二聚体单元的总摩尔数被计算为22.9μmol，并且硫醇化的重复二聚体单元的摩尔数被计算为10.3μmol。向该溶液中添加1X PBS(0.775mL)和聚乙二醇二丙烯酸酯(5kDa)的100mg/mL(在PBS中)溶液(0.125mL，
12.5mg，0.0025mmol的试剂，0.005mmol的反应官能性，Creative PEGworks公司)。所得溶液关于GLYCOSILTM具有的浓度为5.3mg/mL，并且其中22％的GLYCOSILTM重复单元是由聚乙二醇二丙烯酸酯(5kDa)交联的((0.005mmol[聚乙二醇二丙烯酸酯，5kDa反应官能性]/
0.0229mmol[HA单元])×100＝22％)。
12.5mg，0.0025mmol的试剂，0.005mmol的反应官能性，Creative PEGworks公司)。所得溶液关于GLYCOSILTM具有的浓度为5.3mg/mL，并且其中22％的GLYCOSILTM重复单元是由聚乙二醇二丙烯酸酯(5kDa)交联的((0.005mmol[聚乙二醇二丙烯酸酯，5kDa反应官能性]/
0.0229mmol[HA单元])×100＝22％)。
[1516] 将该混合物短暂涡旋以混合，并转移至3mL注射器中，将该注射器加帽并在室温下保持过夜，以提供H9。目视检查(反向测试)表明凝胶化成功。
[1517] 如针对H1a所述制备H9的基于透明质酸的水凝胶颗粒，除了在第一次挤出之后将等体积的PBS添加至颗粒中。这产生关于GLYCOSILTM是2.65mg/mL的水凝胶颗粒悬浮液。通过去除柱塞并用所希望的体积的H9回填，在具有附接的30G针头的0.5mL胰岛素注射器中，将H9的水凝胶颗粒分配用于给药。通过轻柔地操作注射器即可去除气泡。
[1518] H1f的制备
[1519] 如针对H1a所述制备H1f的基于透明质酸的水凝胶颗粒，其中在第一次挤出后将一半体积的PBS添加至颗粒中。这产生关于[HA-N3]-23％b是6.7mg/mL的水凝胶颗粒悬浮液。通过去除柱塞并用所希望的体积的H1f回填，在具有附接的30G针头的0.5mL胰岛素注射器中，将H1f的水凝胶颗粒分配用于给药。通过轻柔地操作注射器即可去除气泡。
[1520] Synvisc-
[1521] 购买Synvisc- 并接收即使用。
[1522] 皮下植入
[1523] 经由皮下注射(肩胛间的区域)向雄性C57BL/6小鼠(5只/测试品)施用60μL的测试品(表26)。将另外的5只初试小鼠作为对照。获得生命期观察结果：在给药日(给药前和给药后约4小时)两次，并在其后直到尸检至少每天一次。每周两次测量体重。
[1524] 表26研究设计、动物分配和测试品剂量
[1525]
[1526] 在7天后，将动物用CO2安乐死(作为安乐死的第一种形式)，并进行开胸手术(作为安乐死的第二种形式)。在记录宏观异常的同时进行尸检。从所有动物中收集方案组织的代表性样品。标本的固定和保存是在10％中性缓冲的福尔马林中。针对对照动物和所有存活的给药的动物将指定的组织加工成石蜡块然后进行苏木精和曙红染色的组织切片。
[1527] 临床观察：
[1528] 每天触诊注射部位并记录观察结果。接受H9水凝胶颗粒、Synvisc- 和H1f水凝胶颗粒的所有小鼠在注射时间在注射部位的皮下组织发展出凸块。在第4天，接受
Synvisc- 和H1f水凝胶颗粒的小鼠的凸块缩退，然而接受H9水凝胶颗粒的所有小鼠在
第8天仍保留硬凸块。在第4天开始并且直到第6天，接受H9的两只动物中，在凸块上的皮肤上观察到痂。不存在其他值得注意的临床观察。两组之间的体重没有显著差异。
Synvisc- 和H1f水凝胶颗粒的小鼠的凸块缩退，然而接受H9水凝胶颗粒的所有小鼠在
第8天仍保留硬凸块。在第4天开始并且直到第6天，接受H9的两只动物中，在凸块上的皮肤上观察到痂。不存在其他值得注意的临床观察。两组之间的体重没有显著差异。
[1529] 微观观察
[1530] 施用H9水凝胶颗粒的所有小鼠在注射部位的皮下组织中均具有明显的局灶性肉芽肿。肉芽肿的特征在于约4mm的良好限制性皮下包块，其包含与嗜酸性粒状碎片和退化的中性粒细胞混合的透明质的核，周围是大量中性粒细胞的致密边缘，继而又包含一层巨噬细胞和成纤维细胞。
[1531] 被施用Synvisc- 或H1f水凝胶颗粒的小鼠在注射部位的皮下组织中具有最小至轻微的局灶性混合细胞和/或小的薄壁囊肿(表27)。
[1532] 表27.测试品-相关的组织病理学变化的发生率和严重性
[1533]
[1534]
[1535] 结论
[1536] 对给予皮下注射基于透明质酸的水凝胶的小鼠的微观发现取决于所给予的水凝胶的组成而不同。施用Synvisc- 或H1f的小鼠在注射部位的皮下组织中没有微观发
现或局灶性混合的细胞浸润和/或小的薄壁囊肿，而H9引起明显肉芽肿免疫应答。
现或局灶性混合的细胞浸润和/或小的薄壁囊肿，而H9引起明显肉芽肿免疫应答。
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