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基于VEFG,HER-2,PSA蛋白质异构体的用于诊断和治疗疾病的特效试剂

阅读:1015发布:2020-08-21

专利汇可以提供基于VEFG,HER-2,PSA蛋白质异构体的用于诊断和治疗疾病的特效试剂专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供制备和筛选 抗体 的方法。可以包括将许多 抗原 和编码抗原的核酸注射入宿主的方法。也可以包括对载体 蛋白质 使用抗原的融合蛋白质在制备和/或筛选抗体制剂的方法。可以是用于同时制备和/或筛选大量的不同的抗体的方法。本发明还提供用于 治疗 、防止或诊断与蛋白质的异构体相关的 疾病 或发展为疾病的可能的治疗和诊断的方法。,下面是基于VEFG,HER-2,PSA蛋白质异构体的用于诊断和治疗疾病的特效试剂专利的具体信息内容。

1.一种治疗性的组合物,其包括表位抑制子和药物可接受的载 体,该表位包含一个经测定是一种疾病相关的表位的外显子 结合点。
2.根据权利要求1中的治疗性的组合物,其中抑制子是特定绑 定表位的抗体,该表位在SEQ ID NO:2,4,6,8,10,1 1,13或15-25之一列出。
3.根据权利要求2中的治疗性的组合物,其中抗体是单克隆抗 体。
4.一种治疗性的组合物,其包括核酸和药物可接受的载体,该 核酸包括编码与疾病相关的外显子结合点表位。
5.根据权利要求4中的治疗性的组合物,其中核酸序列编码与 疾病相关的外显子结合点表位,该表位包含在SEQ ID NO: 2,4,6,8,10,11,13或15-25之一中。
6.一种表达载体,其包括编码与疾病相关的表位的核酸序列, 该表位包含在SEQ ID NO:2,4,6,8,10,11,13或15 -25之一中。
7.根据权利要求6中的表达载体,所述表达载体进一步包含编 码载体蛋白的核酸序列。
8.一种治疗性的组合物,其包括多肽和药物可接受的载体,所 述多肽包括编码与疾病相关的外显子结合点表位多肽。
9.根据权利要求8中的治疗性的组合物,其中的多肽包含编码 与疾病相关的表位,该表位包含在SEQ ID NO:2,4,6, 8,10,11,13或15-25之一中。
10.一种siRNA绑定编码表位的核酸序列,该表位是从SEQ ID NO:2,4,6,8,10,11,13或15-25组中选择的基酸 序列。
11.一种核酸序列,其编码权利要求10中的siRNA。
12.一种载体,其包含权利要求11中的核酸。
13.一种细胞,其包含权利要求11中的siRNA。
14.一种治疗性的组合物,其包含权利要求10中的siRNA或编 码这种siRNA的核酸和药物可接受载体。
15.一种治疗性的试剂盒,其包括表位抑制子和第二种药剂或用 于治疗性方式的必须装置,该表位被测定是与疾病相关的表 位的外显子结合点。
16.根据权利要求15的试剂盒,所述试剂盒进一步包含使用说 明书或注射抑制子的设备。
17.一种诊断试剂盒,其包含表位抑制子和第二种药剂或用于治 疗性方式的必须装置,该表位被测定是与疾病相关的表位的 外显子结合点。
18.一种测定主体是否有可能在主体中形成与的疾病相关的异 构体VEGF的方法,包括:
(i)来源于主体的样本与特定绑定表位的抗体相互作 用,该表位在SEQ ID NO:2或4列出;
(ii)测定与样本绑定的抗体,若抗体绑定样本表明主 体有与疾病相关的异构体VEGF。
19.一种测定主体是否有或可能产生与疾病相关的异构体HER- 2的方法,包括:
(i)来源于主体的样本与特定绑定表位的抗体相互作用, 该表位在SEQ ID NO:6或8列出;
(ii)测定与样本绑定的抗体,若抗体绑定样本表明主体 有与疾病相关的异构体HER-2。
20.一种测定主体是否有或可能产生与疾病相关的异构体PSA 的方法,包括:
(i)来源于主体的样本与特定绑定表位的抗体相互作用, 该表位在SEQ ID NO:10、11或13列出;
(ii)测定与样本绑定的抗体,若抗体绑定样本表明主体 有与疾病相关的异构体PSA。
21.一种测定主体是否有或可能产生与疾病相关的蛋白质异构 体的方法,包括:
(i)来源于主体的样本与,根据声明29的方法鉴定的, 特定绑定与疾病相关的表位的蛋白质异构体的抗体相互作 用;
(ii)测定与样本绑定的抗体,若抗体绑定样本表明主体 有与疾病相关的蛋白质异构体。
22.已经被鉴定与疾病相关的外显子结合点表位的抑制子在制 备治疗该疾病的药物中的应用。
23.根据权利要求22的应用,制备癌症药物。
24.根据权利要求23的应用,进一步包含给患者注射另一种化 学治疗的药剂。
25.特定绑定在SEQ ID NO:2或4,SEQ ID NO:6或8,SEQ I D NO:10、11或13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:20-21,SEQ ID NO:22-24,或SEQ ID NO:25所列表 位的抗体在制备治疗VEGF,HER-2,PSA,PDGFR β;PSMA;CD 86;泌乳刺激素或胰岛素受体的异构体相关的疾病的药物中 的应用。
26.与根据权利要求29的方法鉴定的疾病相关的蛋白质异构体 的外显子结合点表位特定结合的抗体在制备用于治疗蛋白 质异构体相关的疾病的药物中的应用。
27.一种从众多抗体中,鉴定目标蛋白的抗体的方法,包括:
i.提供互不相同的众多抗体,其中至少有一种抗体特定 绑定的融合蛋白至少包含连接载体蛋白的目标蛋白的一部 分;
ii.众多抗体与固相表面相连,用以得到覆盖抗体的固相 表面,即不同抗体位于不同的固相表面;
iii.覆盖抗体的固相表面与融合蛋白连接;
iv.分析测定载体蛋白的存在性研究,若存在载体蛋白表 明有目标蛋白的抗体存在。
28.根据权利要求27的方法,目标蛋白包括蛋白质异构体或足 以引发抗体对它的反应的其中一部分。
29.根据权利要求28的方法,蛋白质异构体是与疾病相关的蛋 白质异构体。
30.根据权利要求27的方法,融合蛋白由哺乳动物的表达系统 产生。
31.根据权利要求29的方法,目标蛋白包括滤过性毒菌引起的 蛋白。
32.根据权利要求29的方法,载体蛋白包括分泌的磷酸酶 或足以保证酶活性的其中一部分。
33.根据权利要求29的方法,载体蛋白包括辣根过化物酶或 足以保证酶活性的其中一部分。
34.根据权利要求29的方法,载体蛋白包括β-半乳糖苷酶或足 以保证酶活性的其中一部分。
35.根据权利要求29的方法,载体蛋白包括荧光素酶或足以保 证酶活性的其中一部分。
36.根据权利要求29的方法,载体蛋白包括IgG-Fc(γ链)。
37.根据权利要求29的方法,抗体连接的固相表面包含蛋白质A 琼脂糖。
38.根据权利要求29的方法,抗体连接的固相表面包含蛋白质G 琼脂糖。
39.根据权利要求29的方法,用于测定载体蛋白存在的分析属 化学发光分析。
40.根据权利要求29的方法,用于测定载体蛋白存在的分析属 荧光分析。
41.根据权利要求29的方法,用于测定载体蛋白存在的分析属 比色分析。
42.根据权利要求29的方法,在(iii)和(iv)之间进一步包括 洗脱步骤,用于移去未绑定的融合蛋白。
43.一种从众多抗体中鉴定绑定蛋白异构体的抗体的方法,包 括:
i.提供互不相同的众多抗体,其中至少有一种抗体特定 绑定的融合蛋白至少包含连接载体蛋白的蛋白异构体的一 部分;
ii.众多抗体与固相表面相连,用以得到覆盖抗体的固相 表面,即不同抗体位于不同的固相表面;
iii.覆盖抗体的固相表面与融合蛋白连接;
iv.分析测定载体蛋白的存在性研究,若存在载体蛋白表 明有绑定蛋白异构体的抗体存在。
44.一种产生众多绑定目标蛋白的单克隆抗体的方法,包括:
i.给宿主注射众多融合蛋白或编码融合蛋白的核酸,每 一融合蛋白至少包含目标蛋白和载体蛋白的一部分;
ii.从宿主细胞中获得产生众多单克隆抗体的细胞;
iii.根据声明1的方法筛选细胞,获得绑定目标蛋白的众 多单克隆抗体。
45.根据权利要求44的方法,目标蛋白包括蛋白质异构体或足 以引起抗体对其产生反应的其中一部分蛋白质异构体。
46.根据权利要求45的方法,蛋白质异构体是与疾病相关的。
47.根据权利要求44的方法,目标蛋白包括滤过性毒菌引起的 蛋白或足以引起抗体对其产生反应的其中一部分。
48.根据权利要求44的方法,载体蛋白包括分泌的碱性磷酸酶 或足以保证酶活性的其中一部分。
49.根据权利要求44的方法,载体蛋白包括辣根过氧化物酶或 足以保证酶活性的其中一部分。
50.根据权利要求44的方法,载体蛋白包括β-半乳糖苷酶或足 以保证酶活性的其中一部分。
51.根据权利要求44的方法,载体蛋白包括荧光素酶或足以保 证酶活性的其中一部分。
52.根据权利要求44的方法,载体蛋白包括IgG Fc(γ链)。
53.根据权利要求44的方法,宿主是老鼠,鸡,兔子,山羊, 绵羊,骆驼,猴子和人。
54.根据权利要求44的方法,众多指至少3种。
55.根据权利要求44的方法,众多指至少10种。
56.根据权利要求44的方法,众多指至少100种。
57.根据权利要求44的方法,众多指至少1000种。
58.根据权利要求44的方法,核酸是一表达载体。
59.一种产生众多绑的单克隆抗体的方法,其中至少一种单克隆 抗体绑定与疾病相关的蛋白异构体,包括:
i.给宿主注射众多融合蛋白或编码融合蛋白的核酸,每 一融合蛋白至少包含与疾病相关的蛋白异构体和载体蛋白 的一部分;
ii.从宿主脾细胞中获得产生众多单克隆抗体的细胞;
iii.根据声明1的方法筛选细胞,获得绑定与疾病相关的 蛋白异构体的一种单克隆抗体。
60.根据权利要求59的方法,至少有一种融合蛋白包括血管的 内皮生长因子(VEGF)异构体165多肽DRARQENPCGPC SE(SEQ ID NO:2)或VEGF121多肽DRARQEDCDKPRR(SE Q ID NO:4)。
61.根据权利要求59的方法,至少有一种融合蛋白包括HER-2 结合异构体1多肽INCTHSPLTS(SEQ ID NO:6)或HER-2结 合异构体2多肽CTHSCVASPLT(SEQ ID NO:8)。
62.根据权利要求59的方法,至少有一种融合蛋白包括SEQ I D NOs:16,16或17-19之一。
63.根据权利要求59的方法,至少有一种融合蛋白包括SEQ I D NOs:20-25之一。
64.根据权利要求59的方法,载体蛋白包括分泌的碱性磷酸酶 或足以保证酶活性的其中一部分。
65.根据权利要求59的方法,载体蛋白包括辣根过氧化物酶或 足以保证酶活性的其中一部分。
66.根据权利要求59的方法,载体蛋白包括β-半乳糖苷酶或足 以保证酶活性的其中一部分。
67.根据权利要求59的方法,载体蛋白包括荧光素酶或足以保 证酶活性的其中一部分。
68.根据权利要求59的方法,载体蛋白包括IgG Fc(γ链)。
69.根据权利要求59的方法,宿主是老鼠,鸡,兔子,山羊, 绵羊,马,骆驼,猴子和人。
70.根据权利要求59的方法,众多指至少3种。
71.根据权利要求59的方法,众多指至少10种。
72.根据权利要求59的方法,众多指至少100种。
73.根据权利要求59的方法,众多指至少1000种。
74.根据权利要求59的方法,核酸是一表达载体。
75.一种从众多抗体中,分离特异绑定与编码抗体的核酸相关的 目标蛋白的抗体的方法,包括
i.至少部分目标蛋白连接到固相表面的突起,获得覆盖 蛋白的突起;
ii.在形成抗原/抗体复合物的适当条件下,覆盖蛋白的 突起与编码抗体的核酸相关的众多抗体相连;
iii.分离与突起相连的抗体,于是分离了针对目标蛋白的 抗体。
76.根据权利要求75的方法,与编码抗体的核酸相关的抗体是 抗菌素。
77.根据权利要求75的方法,进一步包括从突起中分离抗体的 方法。
78.根据权利要求75的方法,进一步包括在步骤(ii)和(iii) 之间的洗脱步骤。
79.根据权利要求75的方法,众多的蛋白质与众多的突起相连, 不同的蛋白质与不同的突起相连。
80.根据权利要求75的方法,固相表面至少包含10突起。
81.根据权利要求75的方法,固相表面至少包含100突起。
82.根据权利要求75的方法,固相表面至少包含1000突起。
83.根据权利要求75的方法,至少部分目标蛋白与钥孔嘁血蓝 素(KLH)相关。
84.根据权利要求75的方法,至少部分目标蛋白与分泌的碱性 磷酸酶(SEAP)相关。
85.根据权利要求75的方法,至少部分目标蛋白与IgG Fc(γ 链)相关。
86.根据权利要求75的方法,至少部分目标蛋白与谷光甘肽S 转移酶(GST)相关。
87.根据权利要求75的方法,至少部分目标蛋白与多聚组氨酸 标签相关。
88.根据权利要求75的方法,固相表面包括生物素或链霉亲和 素。
89.根据权利要求75的方法,固相表面包括镍。
90.根据权利要求75的方法,固相表面包括谷胱甘肽。
91.一种在样品中测定抗原存在的方法,包括:
(i)在形成特异抗原/抗体复合物的条件下,样品与在 其表面特定位置上包含多种抗体的固相表面相连;
(ii)在形成特异抗原/抗体复合物的条件下,进一步固 相表面与众多融合蛋白相连,每一融合蛋白包括特异绑定位 于固相表面上的抗体的多肽和载体蛋白;
(iii)在固相表面每一特定位置测定载体蛋白的存在 性,若在特定位置无载体蛋白表明在特定位置有抗原特异绑 定抗体,也就是在样本中存在抗原。
92.根据权利要求91的方法,固相表面至少包括100种抗体。
93.根据权利要求91的方法,固相表面至少包括1000种抗体。
94.根据权利要求91的方法,固相表面是一抗体组,每一抗体 位于抗体组的特定位置。
95.根据权利要求91的方法,载体蛋白是酶或足以保证酶活性 的其中一部分并且此方法进一步包括与固相表面连接的酶 的底物。
96.一种鉴定目标蛋白表位的方法,包括:
i.提供编码众多融合蛋白的众多核酸,每一融合蛋白包 括目标蛋白的6-15个氨基酸多肽和载体蛋白,这些多肽包括 不同的目标蛋白序列;
ii.给宿主动物注射众多的核酸;
iii.从宿主获得血清;
iv.根据声明1的方法测定在血清中存在的绑定目标蛋 白多肽的抗体数量。
97.根据权利要求96的方法,多肽包括目标蛋白的交错序列。
98.根据权利要求96的方法,蛋白质是细胞的表面受体并且融 合蛋白包括位于受体胞外领域的氨基酸序列。
99.根据权利要求96的方法,目标蛋白包括与疾病相关的蛋白 质异构体。
100.根据权利要求96的方法,多肽有8-12个氨基酸组成。
101.一种鉴定目标蛋白表位的方法,包括:
i.提供编码众多融合蛋白的众多核酸,每一融合蛋白包 括目标蛋白的6-15个氨基酸多肽和载体蛋白,这些多肽包括 不同的目标蛋白序列;
ii.给宿主动物注射众多的核酸;
iii.从宿主细胞制备大量产生单克隆抗体的细胞;
iv.根据声明1的方法扫描细胞,鉴定绑定目标蛋白的 抗体,若存在绑定多肽的抗体,表明此多肽对应于目标蛋白 的表位。
102.根据权利要求96的方法,目标蛋白包括与疾病相关的蛋白 质异构体。
103.根据权利要求96的方法,多肽有8-12个氨基酸组成。
104.一种制备治疗疾病的DNA疫苗的方法,包括:
i.根据声明96的方法鉴定一种或更多与疾病相关的蛋 白质表位;
ii.转染编码一种或更多表位的核酸序列进入表达载体, 以此来制备治疗疾病的DNA疫苗。
105.一种制备治疗疾病的DNA疫苗的方法,包括:
i.根据声明96的方法鉴定一种或更多与疾病相关的蛋 白质表位;
制备包括一种或更多表位的氨基酸序列的多肽,以此来 制备治疗疾病的DNA疫苗。

说明书全文

背景

自身的抗体是由称之为浆细胞的特殊淋巴细胞最初生成的。 宿主动物体内产生的强烈的抗体反应,是通过介导和调整B细胞 分化为浆细胞的过程来进行控制的。这种分化包括由原初B细胞 (含有修饰的抗体作为细胞表面抗原受体,并不分泌抗体)转变 为活跃B细胞(含有细胞表面抗体并且也分泌抗体),然后转变 为浆细胞(高度特异的抗体生产者,并不含表面抗原受体)。这 种分化过程受抗原存在情况以及B细胞和T辅助细胞间通讯情况 的影响。

由于抗体具有特异地结合抗原的能,其已经被广泛地用于 研究、诊断和治疗应用中。单克隆抗体的发展扩大了抗体潜在运 用价值。与多克隆抗血清不同(其包含针对不同表位的抗体混合 物),单克隆抗体直接针对抗原上的单一的决定因子或表位,并 且具有均一性。此外,单克隆抗体可以无限量地被生产。

抗体试剂蛋白质体研究和药物应用中的使用已被极大地 扩展和多样化。这些运用包括抗体治疗,免疫测定,亲和纯化, 蛋白质表达,功能分析,组织和生物体成像。抗体微阵列技术目 前正处于其初期,但在诊断和其他广泛的临床应用上具有极大的 发展潜力。然而,在人类全基因组编码的总数大于100000种蛋 白质中,目前只有少部分拥有其抗体配对物。这主要归因于目前 抗体的生产在很小的范围基础上完成,并且其过程耗时费力。

例如,一种生产抗体的方法由Kohler和Milstein最初提出(K ohler and Milstein(1975)Nature 256:495),一种分泌抗体的免疫 细胞先从被免疫的小鼠中分离,然后与B细胞肿瘤的一种骨髓瘤 细胞进行融合。最终的杂交细胞(例如:杂交瘤细胞)能够在体 外存活。一旦建立,这些杂交瘤细胞将不断分泌特定的抗体。

另一种生产单克隆抗体的方法是噬菌体展示库的构建。这种 方法通过提取人全部外周血细胞的mRNA,随后构建cDNA文库, 包含合适的所有免疫球蛋白可变区域的序列。这些cDNAs被插 入噬菌体,将免疫球蛋白可变区表达为Fab片段。理论上,如果 噬菌体库足够大,通过用感兴趣的抗原筛选噬菌体,可以分离出 表达期望的Fab片段的特异噬菌体。然而,这种方法一般仅应用 于充分纯化的抗原,而不能用于抗原混合物,如细胞表达的数千 种表面抗原。

单克隆抗体目前应用于治疗急性和慢性人类疾病的临床试 验,包括白血病,淋巴瘤,实体瘤(例如结肠,乳房,肝),AI DS和自身免疫疾病。抗体治疗试剂作为商业应用的例子是抗-He r2(Trastuzumab或Herceptin)。抗-Her2是第一种人工抗体,用 于治疗HER2的阳性转移乳房癌,其针对并阻止HER2蛋白的过 量表达活动。虽然抗-Her2已经成功治疗乳房癌,然而这种药物 的副作用导致27%的病人产生心肌症(Horton J.(2002)Cancer C ontrol,9:499-507,Ewer et al.(2002)Proc Annu Meet Am Soc C1 in Oncol.21:489)。这种药物的其他副作用也已有报道,包括一 些超敏反应(包括过敏),浸润反应,部病变。

对于Her2的鼠同源物erbB2的更多研究,解释了在防止扩 大化的心肌症中Her2的作用(Crone et al.(2002)Nat Med 8(5): 459-465)。另一独立的临床研究报道,在20位运用抗-Her2的病 人中,7位病人出现心肌摄取放射标记的抗-Her2现象(Behe et al.(2002)N Engl J Med.345:995-996)。这些研究让研究者得出 结论:由于运用抗-Her2进行治疗的病人中,抗-Her2不能区分乳 房和心肌中的Her2,从而导致心肌炎的产生。抗-Her2治疗性抗 体的设计无法使抗体区分在疾病组织中过量表达的突变Her2和 在心肌组织中表达的正常Her2。虽然抗-Her2对于其目标蛋白H er2具有高度的特异性,但是一个重要的问题是这个抗体无法区 分疾病组织和正常、健康组织。综上所述,设计具备更好的特异 性和有效性的抗体治疗方法十分必要。

这样,需要一种用于诊断和治疗应用的高产的抗体生产方 法,以及药物发明

摘要

这里提供了一些治疗性复合物,包含例如:一种表位的抑制 物,该表位含有经证实为疾病相关表位的外显子结合点,和一个 药物可接受载体。这种抑制物可以是一个抗体,如:一种单克隆 抗体,可与SEQ ID NO序号为:2,4,6,8,10,11,13或1 5-25的任何一个表位特异结合。

另外,提供了包含核酸的治疗性复合物,此核酸包含疾病相 关外显子结合点的表位和药物接受载体编码序列。这种核酸序列 可以编码一种在SEQ ID NO序号为:2,4,6,8,10,11,1 3或15-25中与疾病相关的表位。包含编码疾病相关的包括在SE Q ID NO序号为:2,4,6,8,10,11,13或15-25中的表位 序列的核酸的表达载体也被显示。表达载体另外可以包含编码载 体蛋白序列的核酸。治疗性复合物也可包含一种多肽,该多肽包 含疾病相关外显子结合点的表位和一个药物接受载体。这个多肽 可以包含一种包括在SEQ ID NO序号为:2,4,6,8,10,1 1,13或15-25的疾病相关的表位。

此外,提供了一些siRNAs,针对编码表位的核酸序列,该表 位包含从SEQ ID NO序号为:2,4,6,8,10,11,13或15- 25中任一个挑选出来的基酸序列,还提供了编码siRNA的核 酸。另外还包括了包含有这些核酸的载体,以及包含siRNA或编 码此类的核酸的细胞。SiRNA或核酸可以以一种包含药物接受载 体的治疗性复合物形式存在。

试剂盒也被提供。例如,治疗性试剂盒包含一种表位的抑制 物,该表位包含一个外显子结合点,并被认为是一种疾病相关表 位,试剂盒也可以包括治疗方案必需的第二种试剂或材料。试剂 盒还包含使用说明书,以及施行抑制物的设备。诊断试剂盒包含 一种表位的抑制物,该表位包含一个外显子结合点,并被认为是 一种疾病相关表位,试剂盒也可以包括诊断方案必须的第二种试 剂或材料。

此外显示了一些治疗方案。测定受试者是否患有VEGF异构 体相关的疾病,包括(1)将来自受试者样本与特异结合表位(来 自SEQ ID NO:2或4)的抗体相联,(2)测定抗体与样本的结 合情况,若抗体与样本结合说明受试者患有VEGF异构体相关的 疾病。测定受试者是否患有HER-2异构体相关的疾病,包括(1) 将来自受试者样本与特异结合表位(来自SEQ ID NO:6或8) 的抗体相联,(2)测定抗体与样本的结合情况,若抗体与样本结 合说明受试者患有HER-2异构体相关的疾病。测定受试者是否 患有PSA异构体相关的疾病,包括(1)将来自受试者样本与特 异结合表位(来自SEQ ID NO:10,11或13)的抗体相联,(2) 测定抗体与样本的结合情况,若抗体与样本结合说明受试者患有 PSA异构体相关的疾病。测定受试者是否患有某蛋白异构体相关 的疾病,包括(1)将来自受试者样本与特异结合蛋白质异构体 疾病相关表位的抗体相联,该蛋白由这里所述的方法鉴定,(2) 测定抗体与样本的结合情况,若抗体与样本结合说明受试者患有 某蛋白异构体相关的疾病。

一种治疗性方法包括,例如,通过给予病人所需的治疗性有 效剂量的试剂进行治疗,例如一种特异结合疾病相关的蛋白质异 构体的抗体。这种试剂可以是之前所述的一种抗体。

一种治疗方案例子可以是这样一种方法:对于特异蛋白异构 体相关疾病的病人的治疗,包括给予病人所需的疾病相关外显子 -结合点表位的抑制物,例如:那些被认为是疾病相关外显子-结 合点表位的抑制物。这种疾病可以是癌症,这些外显子结合点表 位将在SEQ ID NO:2,4,6,8,10,11,13,或15-25中任一个中列出。 病人也可被给予化疗治疗。这里还提供了一种疾病相关外显子结 合点表位抑制物的使用方法,在疾病治疗的药剂的制备中有所运 用,而该抑制物被认为是疾病相关外显子结合点表位抑制物。该 疾病可以是癌症,该药剂可以和其他化疗药剂联用。在某方面, 与从SEQ ID N0:2,4,SEQ ID NO:6,8,SEQ ID NO:10,11,13列 出的表位分别特异结合的抗体,将分别用于治疗VEOF,HER-2,P SA异构体相关疾病药剂的制备。另一方面,某一抗体被用于制 备治疗蛋白质异构体相关疾病的药物,该抗体可特异结合一种由 这里所述方法鉴定的与疾病相关的蛋白异构体的外显子结合点 表位。

另一方面,提供了一些疾病相关外显子结合点表位抑制子的 应用方法,其被认为是一种疾病相关外显子结合点表位的抑制 子,用于制备一种治疗疾病的药物。这些疾病可能是癌症。此方 法可能额外包括给予病人其他化疗药剂治疗。

其他的方法包括与以下所列表位(SEQ ID NO:2或4;SEQ ID NO:6或8;SEQ ID NO:10,11或13;SEQ ID NO:15;S EQ ID NO:16;SEQ ID NO:20-21;SEQ ID NO:22-24;或SE Q ID NO:25)特异结合的抗体的应用,分别用于治疗VEGF,HE R-2,PSA PDGFRβ,PSMA,CD86,催乳素,或胰岛素受体的异构体 相关疾病药物的制备。另一方法包括与一种由这里所述方法鉴定 的疾病相关蛋白质异构体外显子结合点表位特异结合的抗体的 应用方法,用于治疗蛋白质异构体相关疾病的药物制备。

另外提供了一些从众多抗体中鉴定与目标蛋白结合的抗体 的方法:(1)提供相互不同的连接有载体蛋白的众多抗体,其中 至少有一种抗体可与包含目标蛋白部分结构的融合蛋白特异结 合;(2)将部分或全部抗体连接到一个固相表面,从而得到覆盖 有抗体的固相表面,不同的抗体连接在固相表面的不同部位; (3)将覆盖有抗体的固相与融合蛋白相连;(4)通过实验方法验 证载体蛋白的存在与否,存在载体蛋白的表明存在针对目标蛋白 的抗体。这些抗体可以是纯化或未纯化的抗体制备物。它们可以 是免疫或未免疫动物的血清,或杂交瘤细胞培养上清。

目标蛋白可以是一种蛋白或配基的异构体,可有效引发针对 它的抗体。某一方面,一种蛋白的异构体是与疾病相关的异构体, 例如:VEGF异构体VEGF165和VEGF121,或一种可以有效引 发针对其抗体的配基。连接了目标蛋白的载体蛋白可以包含分 泌性磷酸脂酶(SEAP),辣根过化物酶,β-半乳糖酶,荧 光素酶,或酶活性基团,以及IgG Fc(γ链)或其配基。提供 的抗体可能与一固体表面相连,如蛋白质A,蛋白质A琼脂糖 或其他蛋白质A偶联物;蛋白质G,蛋白质G琼脂糖或其他蛋 白质G偶联物。分析载体蛋白存在情况的测定方法可以包括化学 发光分析,荧光分析或比色分析。从众多抗体中鉴定目标蛋白抗 体的方法需进一步在步骤3和4之间包含一洗脱步骤用于移去未 绑定的目标蛋白。

目标蛋白可以是一种蛋白或配基的异构体,可有效引发针对 它的抗体。某一方面,一种蛋白的异构体是与疾病相关的异构体, 如病毒蛋白或可有效引发针对它的抗体的一种蛋白。连接了目标 蛋白的载体蛋白可以包含分泌性碱性磷酸脂酶(SEAP),辣根过 氧化物酶,β-半乳糖酶,荧光素酶或酶活性基团以及IgG Fc(γ 链)。融合蛋白或编码融合蛋白的核酸(例如:表达载体)的集 合物,可以导入宿主体(例如:老鼠)。宿主能够同时接受至少 310100种融合蛋白或100种编码蛋白的核酸。

另外提供了一种生产单克隆抗体集合物的方法,其中至少有 一种单克隆抗体能够结合疾病相关蛋白质异构体,包括:(1) 将融合蛋白或编码融合蛋白的核酸的集合物导入某一宿主,其中 每一融合蛋白至少包含疾病相关蛋白异构体的配基和一个载体 蛋白;(2)从宿主脾细胞中制备单克隆抗体分泌细胞的集合物; (3)由权利1所述方法筛选细胞,得到至少一种可以结合疾病相 关蛋白异构体的单克隆抗体。

这些融合蛋白可以包括血管内皮生长因子异构体165(VEG F165)多肽DRARQENPCGPCSE(SEQ IN NO:2);血管内皮生长 因子异构体121(VEGF121)多肽DRARQEKCDKPRR(SEQ IN NO:4);HER-2接合异构体1多肽INCTHSPLTS(SEQ IN NO:6); HER-2接合异构体2多肽CTHSCVASPLT(SEQ IN NO:8)或任何 SEQ IN NOS:10,11,13或15-25。载体蛋白可包含分泌性碱性磷 酸脂酶(SEAP),辣根过氧化物酶,β-半乳糖酶,荧光素酶,或 酶活性基团以及IgG Fc(γ链)。融合蛋白或编码融合蛋白的核 酸(例如:表达载体)的集合物,可以导入宿主体(例如:老 鼠)。宿主(例如:老鼠)能够同时接受至少310100种融合蛋白 或100种编码蛋白的核酸。

这里提供了一些方法,从大量的抗体集合物中分离特异绑定 目标蛋白的抗体,这些抗体与编码这些抗体的核酸相关,包括(1) 将目标蛋白的至少一个配基与一个在固体表面的突起相连,(2) 在适合抗原/抗体复合物形成的条件下,将连接有蛋白的突起与编 码这些抗体的核酸相关的抗体集合物相连;(3)分离与突起相连 的抗体,即分离到针对目标蛋白的抗体。

在某一方面,与编码这些抗体的核酸相关的抗体是噬菌体。 分离抗体的方法可额外包括将抗体从突起上分离下来的过程,并 且/或者在步骤(2)和(3)之间加入一步洗脱过程。与不同的 突起连接的不同蛋白可包含在与突起集合物连接的蛋白集合物 中。固相表面可以包含至少10100或1000个突起。目标蛋白的配 基可与钥孔嘁血蓝素(KLH),分泌型碱性磷酸酶(SEAP),IgG Fc (γ链),谷胱甘肽-S-转移酶(GST),或多聚组氨酸标记尾巴。固 相表面可包含生物素或链霉亲和素,镍,或谷胱甘肽。

这里还提供了一些测定在样本中抗原存在情况的方法,包括 (1)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下,将样本与固相连接, 该固相表面包含固定于特定位置的抗体集合物,(2)在适合抗原 /抗体复合物形成的条件下,将融合蛋白集合物与固相表面相连, 每一个融合蛋白包含一个与固相表面的抗体特异接合的多聚肽, 以及一个载体蛋白,(3)测定固相表面的每一个特定位置上载体 蛋白的存在情况,若在某特定位置有载体蛋白的缺失或减少,则 表明具有在特定位置与抗体接合的抗原,即表明样本中具有抗 原。

固相表面可以包含至少100或1000个抗体。固相表面也可 以是一种抗体阵列,每一个抗体固定于阵列的特定位置。载体蛋 白可以是酶或具有酶活性的配基,则此方法还可进一步包括将固 相表面与酶底物相连的过程。

在这里还提供了一种鉴定目标蛋白中的表位的方法,包括 (1)提供编码融合蛋白聚合物的核酸,这里的每一个融合蛋白包 含目标蛋白的6到15个或8到12个氨基酸多肽和一个载体蛋白, 并且这些多肽包括了目标蛋白的不同序列,(2)将核酸集合物导 入动物宿主;(3)从宿主细胞中制备单克隆抗体分泌细胞的集合 物;(4)由前述方法筛选细胞,以鉴定针对目标蛋白的抗体,若 存在针对某一多肽的抗体则表明该多肽对应于目标蛋白上的表 位。蛋白可以是细胞表面受体,融合蛋白还可包含受体胞外部分 上的氨基酸序列。

制备针对疾病的DNA疫苗的方法包括(1)鉴定疾病相关的蛋 白上的一个或多个表位,例如,通过这里描述的鉴定目标蛋白上 的表位的方法;(2)将编码一个或多个表位的核酸序列导入以个 表达载体,即制备针对疾病的DNA疫苗。这里还提供了制备针 对疾病的疫苗方法,包括(1)通过这里描述的鉴定目标蛋白上的 表位的方法,鉴定疾病相关的蛋白上的一个或多个表位;(2)制 备包含一个或多个表位的氨基酸序列的多肽,即制备了针对疾病 的疫苗。

图表的简单描述

图1显示一种筛选噬菌体显示文库的示范方法。

图2显示一种筛选表位的示范方法。

图3显示一种筛选抗体阵列的示范方法。

图4显示一种VEGF异构体121,165,206的陈列。

图5显示一种针对疾病相关VEGF异构体的示范抗体的设计 方法。

图6显示一种针对疾病相关CD44异构体的示范抗体的设计 方法。

详细描述

定义

出于方便,在说明,例子和附加声明中使用的术语都在这里 汇集。除非另有定义,这里使用的所有技术和科学术语拥有相同 的含义,被具备这项发明所属领域通常技能的人所共识。

在说明和声明中使用的单数形式“一个”,“一个”,“这个” 包括了复数情况,除非文中另有清楚说明。例如,术语“一个细 胞”包括了细胞的集合物,包括它的混合物。

这里所用的术语“试剂”表示一种化学成分,一种化学成分 混合物,一种生物大分子(如一种核酸,一种抗体,一种蛋白质 或其配基,例如:一种多肽),或一种来源于生物材料,如细菌, 植物真菌,或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织的提取物。 这些药剂的活性将作为“治疗试剂”或“诊断试剂”有效地实施, “治疗试剂”或“诊断试剂”指局部或系统地作用于主体的具有 生物学的,生理学的或药剂学的活性底物。

术语“氨基酸”是指包含所有分子,无论天然或人工合成的, 其包括氨基活性和酸活性,并可以被包括在自然发生的氨基酸聚 合体中。氨基酸的示范例子包括自然发生的氨基酸,类似物,派 生物和其同源物;具有不同侧链的氨基酸类似物;以及所有前述 的任何立体异构物。

这里所使用的术语:“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋 白分子上的抗原接合配基,例如:包含(“以免疫反应”)特异接 合抗原的抗原接合位点的分子。在一个示范性的例子中,术语“抗 体”特定地包括单克隆抗体(包括促效药,拮抗剂和抑制性或中 和抗体)。从结构上看,最简单的自然发生的抗体(如IgG)包括 四个多肽链,即以二硫键交联的两个重链(H)和两个轻链(L)。 术语“VH”指抗体重链上的可变区域。术语“VL”指抗体轻链上 的可变区域。天然的免疫球蛋白代表了包括数种分子,如IgD,Ig G,IgA,IgM,IgE的分子大家族。该术语也包括杂交抗体,嵌合体 抗体,人工化抗体,变更抗体,及其片段。包括但不仅限于Fab 片段,和Fv片段。抗体可以用常规的技术片段化,并且用已述 的完整抗体的筛选方法可筛选有效的片段。免疫球蛋白的Fab片 段是一个多聚体蛋白,由免疫球蛋白的配基构成,包含了免疫球 蛋白分子重链和轻链上的免疫活性部分,以共价键接合,并可以 特异接合抗原。通过在此领域中所熟知的方法,可用木瓜蛋白酶 将完整的免疫球蛋白分子解成Fab片段。然而,Fab片段还可 通过此领域中其他方法,在合适的宿主细胞中表达期望的免疫球 蛋白重链和轻链配基而获得。

这里使用的“抗原”指可以激发一种或多种抗体的物质。抗 原包括,但不仅限于多肽,蛋白,糖蛋白,多聚糖和脂类,其配 基和其接合物。

在众多其他抗原中,如果一种抗体更适宜结合某一抗原,那 么可称这种抗体“特异结合”该抗原或抗原上的表位。例如,抗 体可能具有少于50%,20%,10%,5%,1%,0.1%的与其他 一种或多种抗原的交叉反应。

这里使用的术语“载体蛋白”指一种蛋白或多肽,可以提高 与某蛋白相关的针对此蛋白的抗体产生量,并且/或者能够用于测 定与之相关的蛋白。出于免疫目的,许多不同的载体蛋白可以与 多肽联用。选择使用何种载体蛋白取决于免疫原性,可溶性,(使 之能获得与载体的最佳结合情况),以及鉴定针对目标蛋白的抗 体的筛选方法。两种最常用的载体是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH), 和血清白蛋白(BSA)。其他例子包括碱性磷酸酶(SEAP), 辣根过氧化酶,荧光素酶,β-半乳糖甘酶,IgG Fc(γ链),谷胱 甘肽-S-转移酶(GST),多聚组氨酸标记和其他酶,如β-内酰胺 酶,其他分泌蛋白或多肽。

这用到的术语“蛋白质异构体”指任何长度的氨基酸的聚合 体,起源于选择性拼接结果。选择性拼接是一种过程(在转录阶 段),在以给定的RNA分子中,可选择的外显子(例如:编码某 一蛋白上特定区域的基因的一部分)被合成(通过RNA聚合酶分 子),在同一基因中形成不同的mRNAs(信使RNA分子)。每一种 这样的mRNA称为“基因转录子”。通常,通过不同外显子的细 胞或组织特异性联合,一个单一的基因可以编码几种不同的mR NA转录。例如,VEGF165和VEGF121都源自VEGF基因。通 过删除外显子6得到VEGF165(例:外显子5和外显子7接合), 通过删除外显子6和7得到VEGF121(例:外显子5和外显子8 接合)。其他选择性拼接的产生原因/来源包括移码(例:mRNA/ 转录子中的不同的密码子被核糖体翻译)或翻译起始或终止位点 的改变(在mRNA上,并在其翻译时),作为结果,给定的内含 子仍保留在mRNA转录子中。不同的身体组织以及一些疾病可 以导致在给定的基因中产生选择性拼接(例:作为结果,在不同 组织或疾病组织中产生不同的蛋白)。

“疾病相关的蛋白质异构体”或“疾病相关的蛋白质异构体” 或“疾病相关的蛋白质异构体”指源自选择性拼接的任何蛋白质 或多肽,其存在或异常的水平与疾病相关。例如,与非疾病影响 的组织或细胞相比,可以发现其以异常水平或异常形式存在于受 疾病影响的组织或细胞中。它可以是一种异常高表达的蛋白质异 构体,或是一种异常低表达的蛋白质异构体,而其更改了的表达 情况与疾病的发生和/发展相关。一种疾病相关蛋白质异构体也可 以是一个突变或遗传变异过程中的基因翻译产物,其与其他与疾 病起因有关的基因直接相关,或与之不均衡联接。

术语“表位”指抗原上一段与抗体适宜并特异接合的区域。 一个单克隆抗体适宜结合某分子的单一特定表位,该分子可从分 子特性上鉴定。一个特别的蛋白质或蛋白质异构体的表位可由 有限的氨基酸残基构成,例如:5-15或8-12个残基,其在蛋白 质或蛋白质异构体上以线性或非线性形式存在。被抗体识别的表 位可以是,例如:5-15或8-12个残基构成的短肽,在疾病相关 的(不以正常蛋白质异构体形式存在的)蛋白质异构体中,其跨 越了两个区域,或两外显子,或两个多聚多肽片段的接合部位。 疾病相关的蛋白质异构体可以是一种选择性拼接的RNA多变形 式的翻译产物,其缺少一个或多个与编码正常蛋白的RNA相关 的外显子。

ADAPI表位是一线性的或非线性的表位,如8-10个或10-1 5个能用于提升抗体识别蛋白质异构体能力的氨基酸。而这种蛋 白质异构体起源于mRNA的选择性拼接或蛋白质的不同的翻译 后修饰,正如蛋白质的水解。对于横跨两个外显子“联接区域” 的线性表位而言,表位序列可能是在20个氨基酸残余区域之内 的邻近序列,包含例如,外显子结合点两边的各10个氨基酸残 余。

“疾病相关的蛋白质异构体的表位”指由外显子编码的表位, 且由于例如拼接,在相同基因编码的正常蛋白质中并不表达。它 也可以是由两个外显子结合点编码的表位,其外显子结合点在正 常蛋白质中不表达。

这里使用的“表达”指多聚核苷酸转录成mRNA的过程和/ 或被转录的mRNA随之被翻译成肽,多肽或蛋白质的过程。转 录和编码的多肽正确地被称为“基因产品”。如果多肽来源于染 色体DNA,表达可能包括在真核细胞中mRNA的拼接。

术语“免疫原”指在动物中引发免疫反应的化合物。这里使 用的免疫原也指融合蛋白和编码这些融合蛋白的核酸。

“单克隆抗体”指在抗体制备中的抗体分子,所有抗体具有 相同的特异性并且有相同的核酸产生。对于直接指向特异蛋白的 单克隆抗体的制备来说,任何由细胞系连续培养提供的抗体分子 产品的技术都可以利用。这种技术包括,但非限制于,杂肿瘤技 术(见Kohler和Milstein(1975)Nature 256:496-497);trioma技术; 人B-细胞杂肿瘤技术(见Kozbor,等。(Immunol Today 4:72), EBV杂交瘤技术(见Cole等,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)和噬菌体显示来生产 人单克隆抗体。人单克隆抗体可以被应用于这里所述的方法实践 中,并可由人杂交瘤(见Cote等。(1983).Proc.Natl.Acad.Sci. USA80:2026-2030)或EB病毒体外转化的人杂交瘤(见Cole等。 (1985):Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.Alan R.Lis s,Inc.,pp.77-96)生产。

短语“非肠道给药”或“非肠道地给药”被熟知,并指区别 于肠道内和局部给药的给药途径,通常通过注射方法,并包括但 不限于:静脉内,肌肉内,动脉内,鞘内的,囊内的,眶内的,心 脏内,皮内,腹膜内,气管,皮下,表皮下,关节内,包囊下的, 蛛网膜下的,脊髓内,胸骨内注射和输液。

“病人”,“主体”或“宿主”指人类或动物。

术语“多聚核酸”,“核酸”可替换使用。它们指任何长度的 核酸聚合体,无论是脱氧核糖核酸还是核糖核酸或其类似物。多 聚核酸可具有任何三级空间结构,具有任何功能,可以是已知也 可是未知的。以下是未受限的多聚核酸例子:基因或基因片段上 编码或非编码区域,由连接分析定义的位点,外显子,内含子,信 使RNA(mRNA),转运RNA,核糖体RNA,核酸酶,cDNA,重组多聚 核酸,分支多聚核酸,质粒,载体,分离的DNA或任何序列,分 离的RNA或任何序列,核酸探针,引物。多聚核酸可能包含修 正的核酸,如甲基化核酸和核酸类似物。如果出现(修正的核酸), 核酸结构将在聚合物的装配之前或之后被给予修正。核酸序列可 能被非核酸成分所中断。在聚合之后,多聚核酸能被进一步修正, 例如结合一个标记成分。术语“重组”多聚核酸指在自然中不存 在,或相连于其他多聚核酸以非自然形式排列的基因组,cDNA, 源自半合成,或合成的核酸。“寡聚核酸”指少于100,75,50, 25,或10个核苷酸的单链核酸。

术语“多聚肽”,“多肽”和“蛋白质”(单链)在这里可交 替使用,指任何长度的氨基酸聚合体。聚合体可以是线性或环状, 可能包含修正的氨基酸,并可能被非氨基酸所中断。该术语也包 含被修正的,如:二硫化物结合形式,糖基化,脂化,乙酰化, 磷酸化,或其他任何处理,如联接标记成分的氨基酸聚合物。这 里使用的术语“氨基酸”指天然或非天然或合成的氨基酸,包括 氨基乙酸和D或L型异构体,及氨基酸类似物和拟肽。

预防性的”或“治疗性的”治疗此领域是熟知的,指给予 宿主一种药物治疗。若在有害情况(如:疾病或其他对宿主动物 有害的情况)的临床表现出现之前给予治疗,那么这种治疗是预 防性的,例如,它保护宿主免受有害情况;而若在有害情况的临 床表现出现之后给予治疗,那么这种治疗是治疗性的(例如:将 减少,改良或改善现有的有害情况或其副作用)。

术语“药物可接受的载体”在此领域是熟知的,指药物可 接受的材料,成分或媒介,如液体或固体填充物,稀释山梨(糖) 醇液,赋形剂,溶剂包装材料,起着将任何主体成分或组成, 从一个器官,或身体部分,承载或转运到另一个器官,或身体部 分的作用。每一个载体必须是可接受的,即与主体成分或组成具 有同一性,并对病人无害。可作为药物可接受的载体的材料例子 有:(1)糖,如乳糖,葡萄糖蔗糖,(2)淀粉,如玉米淀粉和 铃薯淀粉;(3)纤维素,和其派生物,如羧甲基纤维素钠,乙 烷基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉状黄芪胶;(5)麦芽;(6)凝 胶;(7)滑石;(8)赋形剂,如可可油和蜡栓剂;(9)油,如花 生油,籽油,红花油,芝麻油,橄榄油,玉米油,大豆油;(1 0)乙二醇,如丙烯乙二醇;(11)多羟基化合物,如甘油,山梨 (糖)醇,甘露醇和聚乙二醇;(12)脂,如乙烷油酸盐,乙烷十 二酸酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化;(1 5)褐藻酸;(16)去除热源的水;(17)等渗盐溶液;(18)Ring er’s液;(19)乙醇;(20)磷酸盐缓冲液;(21)其他药物学使用 的无毒可兼容物质。

短语“系统治疗”,“系统地治疗”,“外周治疗”,“外周地治 疗”在此领域是熟知的,指某些成分,治疗剂或其他材料,不 直接针对中枢神经系统,而是进入病人的其他系统,从而影响新 陈代谢和其他类似的过程。

“目标蛋白”指一种蛋白质,例如:一种蛋白的异构体,其 可以引发抗体增高。

“治疗”一种疾病指至少改善疾病的症状或至少阻止疾病的 恶化。

“载体”是一种能转化并导入核酸分子进入宿主细胞,并且/ 或者在宿主细胞间,可自我复制的核酸分子。该术语包括了最初 功能为将一种核酸分子导入细胞的载体,最初功能为核酸复制的 载体,及表达载体,其功能为转录并/或翻译DNA或RNA。也 可包括不只具有以上一种功能的载体。这里使用的“表达载体” 被定义为多聚核酸,当导入合适的宿主细胞时可以被转录并翻译 成多肽。“表达系统”通常指包含了表达载体的合适的宿主细胞, 具有产生期望的表达产物的能力。

生产和筛选抗体的方法

这里提供了从众多的抗体中鉴定可以绑定目标蛋白的抗体 的方法,包括(1)提供至少特定地绑定一种融合蛋白,至少包 括连接载体蛋白的目标蛋白的部分的抗体。(2)至少某些抗体连 接到一个固相表面,从而得到覆盖有抗体的固相表面,从而不同 的抗体连接在不同的固相表面或在一个或更多个固相表面的不 同位点。(3)将覆盖有抗体的固相与融合蛋白相连;(4)通过实 验方法验证载体蛋白的存在与否,载体蛋白的存在表明存在针对 目标蛋白的抗体。这些抗体可以是纯化的抗体制备物,如免疫球 蛋白制备物(血清,免疫动物的多克隆抗血清),单克隆抗体, 细胞培养基(如杂交瘤细胞培养上清),或是实验动物的腹水。 相反的,抗体和融合蛋白连接后它们再与固相表面连接。这种方 法也包括,首先生产结合融合蛋白的单克隆抗体,例如,给宿主注 射融合蛋白并且从宿主得到的细胞中准备产生抗体的细胞。在某 种情况下,生产单克隆抗体包括,(1)给宿主注射众多融合蛋白 或融合蛋白编码的核酸,每种融合蛋白至少包含目标蛋白和载体 蛋白的一部分。(2)准备产生大量单克隆抗体的细胞,如杂交瘤 细胞,来源于宿主的细胞。(3)筛选产生单克隆抗体的细胞来分 离那些希望得到的特征,例如通过检测载体蛋白。例如,至少3 10100300或1000种融合蛋白或编码融合蛋白的核酸被注射入宿 主。通过使用这里描述的筛选分析方法可便利地筛选针对每种融 合蛋白产生抗体的细胞,如通过检测抗体绑定到融合蛋白后的载 体蛋白可以检测希望得到的抗体的存在。在有些情况下,对宿主 注射的所有融合蛋白而言,载体蛋白是相同的或基本相同。在后 者的情况下,筛选相当简单,因为相同的分析将允许鉴定产生大 量不同抗体的细胞。

这里描述的任何方法将进一步包括决定是否鉴定的绑定蛋 白异构体的抗体是与疾病无关的,例如鉴定特异地或优先地绑定 疾病相关的蛋白异构体的抗体。例如,抗体绑定与疾病相关的蛋 白异构体的Km值或亲和力至少高于与疾病无关的疾病蛋白异构 体的Km值或亲和力的2,3,5,10,30或100倍。

这一领域的技术人员将认识到针对目标蛋白的抗体也许并 不连接载体蛋白,用包含至少一部分目标蛋白和载体蛋白的融合 蛋白筛选抗体产生的细胞。因此,在有些情况下,注射入宿主的 蛋白质不同于用于筛选抗体产生细胞的蛋白质。当然,即使宿主 注射的蛋白质不包含用于鉴定抗体的载体蛋白的氨基酸序列,但 是此蛋白质必定包含提高宿主免疫反应的蛋白质或多肽的氨基 酸序列。

在有些情况下,通过给宿主注射众多蛋白质来得到抗体,例 如融合蛋白。在另一些情况下,通过给宿主注射一种或多种编码 众多蛋白质的核酸来得到抗体,例如融合蛋白。例如,编码众多 蛋白质的一种核酸被注射入宿主来准备众多蛋白质的抗体。相 反,编码两种或更多蛋白质的两种或更多核酸被注射入宿主来准 备两种或更多蛋白质的抗体。当一种核酸编码两种或更多蛋白 时,核酸包含两种或更多启动子和/或其他调控元件。核酸也可能 在编码两个或更多蛋白质的开放式阅读框之间包含数个核糖体 结合位点。

在有些情况下,载体蛋白是便于从众多抗体中鉴定绑定目标 蛋白抗体的蛋白质。载体蛋白可通过多种方法鉴定。适当的方法 以载体蛋白的种类而定。例如,

载体蛋白可以用特定绑定载体蛋白的抗体来鉴定。因此,载 体蛋白可以是获得或准备抗体的任何蛋白质或分子。例如,载体 蛋白可以是一种标签,如组氨酸标签。载体蛋白可以是免疫球蛋 白分子的不变区域,如IgG区域。载体蛋白也可以是被标记的 蛋白质或其他分子,如荧光,磷光放射性标记。其他载体蛋白 可以是使酶活性增强的酶或酶的部分。例如,载体蛋白可以是分 泌性的碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶,荧光素酶,β-半乳糖甘 酶或使酶活性增加的它们中的部分。酶可以是任何希望得到的种 类,如人或非人的,如鼠。

这里也提供了制备绑定疾病相关蛋白或疾病相关蛋白异构 体的抗体的方法,入疾病相关的外显子结合点蛋白。在某些情况 下,与载体蛋白相同地,从数据库和编码包含在表达载体中的1 0-15或8-12个目标序列的寡核苷酸中选择人目标基因序列。然 后,核苷酸被引入动物(如鼠)在体内引起抗原的表达并且促进 免疫反应。从动物中分离B细胞并且产生杂交细胞。根据这里所 述的方法筛选杂交细胞,如通过载体蛋白的鉴定。

可以根据这一领域的蛋白质合成的方法,通过化学合成制备 蛋白质(如融合蛋白)。也可以通过重组获得蛋白质。尤其,可 以通过融合编码目标蛋白或其一部分的核酸和编码载体蛋白或 其一部分的核酸来制备融合蛋白。

编码目标蛋白和载体蛋白的核酸可以通过如聚合酶链反应 (PCR),从基因组DNA中扩增基因片段,cDNA,RNA(如通过 RT-PCR)或克隆序列来获得。根据已知的基因或cDNA序列选 择PCR初始序列,致使得到相对唯一的扩增片段。为了达到特 异性和最佳扩增目的的需要,计算机程序可以用于初始序列的设 计。参见如,Oligo version 5.0(National Biosciences)。用于设 计和选择扩增初始序列的因素在例如bv Rylchik,W.(1993)“S election of pimers for Polymerase Chain Reaction。”In Meth ods in Molecular Biology,vol.15,White B.ed.,Humans Pres s,N.J中被述及。可以从基因库或其他公共资源中得到序列。相 反地,这项发明的核酸也可以通过这一领域的标准方法来合成, 如通过使用DNA自动合成器。(这种合成器可以从Biosearch, Applied Biosystems,等购买)

在宿主或细胞中表达蛋白质的合适的克隆载体可以根据标 准技术构建,或从这一领域提供的大量的克隆载体中选择。尽管 选择的克隆载体根据宿主细胞被用的意图而变,但是有用的克隆 载体通常具有自我复制的能力,拥有独特的核酸限制性内切酶单 一位点或带有能用于选择包含载体的克隆的标记基因。合适地, 但非限制性地例子有,质粒和细菌病毒,如PUC18,mp18,mp19, pBR322,pMB9,ColE1,pCR1,RP4,噬菌体DNAs和穿梭载体 如pSA3和Pat28。这些和许多其他载体可以从商业卖主购买,如 BioRad,Stratagene,和Invitrogen。

如果可适用,在这里描述的方法中使用的表达载体通常是包 含编码目标蛋白或其一部分并且连接一种载体蛋白或其一部分 的多聚核苷酸的可复制多聚核苷酸结构。这里描述的多聚核苷酸 有效地连接合适的转录控制元件,例如启动子,增强子和终止子。 对表达而言(如翻译),一种或更多的翻译控制元件通常也是需 要的,如核糖体结合位点,翻译起始位点和终止代码。这种转录 和翻译的调控元件起源于目标蛋白或其同源序列(来源于其他基 因或生物体)。编码信号肽的多聚核苷酸序列也能包括允许穿越 或横跨细胞膜或从细胞分泌的多肽。大量的表达载体适合在真核 细胞中表达,包括在这领域已知的酵母细胞,类细胞,哺乳动 物的细胞。表达载体的其中一个例子是pcDNA3(Invirogen,S an Diego,Calif.),其转录起始于细胞巨化病毒(CMV)早期启 动子/增强子。这个载体也包含用于多聚核苷酸插入的多个核酸限 制性内切酶识别位点。合适的克隆和表达载体包括任何这一领域 已知的用于细菌,哺乳动物,酵母和昆虫的表达系统。特殊的表 达载体和合适的宿主细胞已被这一领域所知并且无需在这里详 细描述。可参见Gacesa and Ramji(1994)Vectors,John Wile y&Sons。

克隆和表达载体典型地包含一个可选择标记(如,与载体一 起转化的编码宿主细胞存活或生长必需的蛋白质基因),尽管这 种标记基因可能携带其他多聚核苷酸序列共同转染入宿主细胞。 只有选择性基因被转染进入宿主细胞的那些细胞才能在选择性 条件培养下生长。典型的选择性基因有下列特点之一(a)对抗 生素或其他毒性物质(如氨苄青霉素,新霉素,氨甲叶酸)有抗 性作用;(b)补充营养缺陷形缺失物质;(c)提供从培养基中不 能获得的必要营养。合适的标记基因的选择有宿主决定,不同宿 主合适的基因已被这一领域所知。克隆和表达载体典型地包含被 宿主识别的复制系统。

在宿主细胞中表达蛋白质的表达质粒可以是,例如:基于病 毒的载体。

当给予宿主动物以蛋白治疗时,真核和原核宿主系统都可以 用于生产重组蛋白质。聚合多肽可从细胞裂解物或培养基中分 离,并按照其使用需要的程度进行纯化。这项发明中使用的合适 的原核宿主细胞例子是埃希氏菌属大肠杆菌。真核宿主细胞的例 子包括禽类,昆虫,植物,动物细胞如COS7,HeLa,CHO细胞。 来源于真核生物的哺乳动物细胞系也经常作为表达聚合多肽的 宿主细胞。培养的哺乳动物细胞的繁殖是众所周知的。见组织培 养,学院出版社,Kruse和Patterson,eds.(1973)。

“转化”指通过已知的方法将带有期望的核酸的载体介导入 宿主细胞。转化的方法,其依赖于宿主细胞的类型,包括电刺激 转化;用于转化的氯化,氯酸铷磷酸钙,DEAE-右旋糖苷,或 其他试剂;微注射轰击;脂质体;感染(载体是一种感染性的试 剂);及其他方法。一般地,见Sambrook等。(1989)和Ausub el等(ed),(1987).上述核酸转入的参照细胞也包括这些细胞的 子代细胞。

当转化入一个合适的宿主细胞,如,E.coli或COS-7,通过这 里所述的方法可以检测到融合蛋白的表达。例如,基于鉴定连接 了融合蛋白的载体蛋白,可以通过对培养上清或细胞裂解物进行 化学发光,荧光,或比色分析来测定聚合多肽的存在情况。

通过酶切完整聚合多肽可以制备整个分子的特定聚合多肽 片段。蛋白水解酶的例子包括,但不局限于,胰岛素,胰凝乳蛋 白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,V8蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶,血 纤维蛋白溶酶,凝血酶。完整聚合多肽可以同时,或分别与一种 或多种蛋白酶反应。可选地,或另外,完整的聚合多肽还可被二 硫化物去除试剂进行处理。通过此领域中所知的方法,多肽可以 被相互分离,包括但不局限于,凝胶过滤色谱层析,凝胶电泳, 和反相HPLC。

通过大量的熟知的生产抗体的方法,可以制备抗体,例如, 多克隆抗体和单克隆抗体。抗体可从许多物种中被激发并分离, 如鸡,老鼠(mouse),老鼠(rat),兔子,山羊,绵羊,马,骆驼, 猴子和人类。生产单克隆抗体的典型的方法,包括,用设计好的 免疫原注射宿主动物,通常是老鼠。在某一方面,蛋白的集合物 被用于注射,如一些融合蛋白,另一方面,一些核酸的集合物被 用于注射,这些核酸编码蛋白,例如融合蛋白,其每一个融合蛋 白包括了目标蛋白的至少一部分及一个载体蛋白。在某一特别方 面,宿主是一种啮齿动物,例如,老鼠。如在U.S.Pat.No.5721.1 22中所述,作为一种例子,用于免疫的老鼠可以是“零-抗原”。

在某一方面,宿主是一种转基因动物,其带有人类免疫球蛋 白位点.例如,转基因动物可以是包含了人免疫球蛋白基因的老 鼠,其内生免疫球蛋白基因已经被部分或完全地抑制活性。通过 应答,在转基因宿主中观察到人类抗体的产生,其在所有方面与人 类中观察到的(抗体)十分相似,包括了基因重排,装配,抗体 库.这些方法在以下专利,例如,U.S.Pat.Nos.5545,807;5545,806; 5569,825,5625,126;5633,425;5661,016,及下列发表刊物:Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 36 8:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-13(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845-51(1996);Neuberger,Natur e Biotechnology 14.826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.I mmunol.13:65-93(1995)中有所阐述。

一种或多种抗原可以通过运用各种不同的方法免疫宿主动 物。例如,通过皮下,肌肉内,皮内,静脉内,并且/或者腹膜内 的注射。此外,淋巴器官,腿弯部的淋巴结,并且/或者脚垫内 的注射也是可行的。分别地并且/或者同时地联合运用两种或更多 不同的免疫途径,对于动物免疫可能是更适合的。

用于宿主动物免疫的融合蛋白的用量,例如,可以在0.01ug -250ug之间,1ug-100ug之间是比较合适的用量。可选地,用于 宿主动物免疫的编码融合蛋白集合物的核酸的用量,例如,可以 在0.01ug-100ug之间,1ug-25ug之间是比较合适的用量。例如, 一只老鼠可注射10ug蛋白或10ug核酸。

在一特定方面,一只宿主动物可以注射三种或更多不同的蛋 白,如融合蛋白,或其编码核酸,例如,至少3,10,30,100, 300,或1000种不同蛋白或核酸或其联合物。在此项发明中的某 一方面,一种宿主动物注射了包含2或更多不同蛋白或编码蛋白 的核酸的混合物,可选地,还包含生理可接受的稀释液,如PBS 或其他缓冲液。更适宜地,用于制备混合成分的融合蛋白已经至 少经过一步的纯化过程。

这里所述的方法容许生产特异针对鉴定了的表位的抗体。更 适宜地,被抗体识别的用于制备抗体的抗原,其氨基酸数量具有 最少值,例如,至少具有6个氨基酸长度。抗原也可至少具有1 0,15,20,50,100个氨基酸长度。因此,抗原的氨基酸长度可 以在6到15或8-12的范围。此外,针对线性表位(连续的氨基 酸)的抗体,针对三维结构表位,例如,非线性表位,也可以通 过例如,基于蛋白质结晶数据的方法进行制备。含有蛋白期望区 域重叠序列的聚合多肽可以用于注射宿主。例如,短抗原(或多 肽抗原)可以被设计成某蛋白质氨基酸线性序列的串联结构,或 蛋白质氨基酸线性序列的交错形式。包含期望目标蛋白的不同 长度的多肽,也可以用于注射宿主动物。在抗体集合物中,期望 至少有一种抗体可以和自身抗原全长或部分区域相结合。具备生 物抑制功能的抗体或中和抗体也可以期望通过这里所述的方法 进行鉴定。

短抗原的集合物,例如,具备某一表位的长度,可以(基于 一个目标蛋白)被设计并用于注射宿主。可选地,具备不同蛋白 序列的短抗原的集合物也可注射入一个宿主。

某一方面,可以产生蛋白质异构体抗体,如外显子结合点特 异抗体。这些抗体可以针对短肽序列,其存在于(1)一种特殊 的蛋白质异构体外显子中,(2)跨越特殊蛋白质异构体的外显子 -外显子区域(3)跨越一个外显子删除位点。由于其特异针对一 种特殊的异构体,这些短序列称为“标记表位”。“标记表位” 可由非线性氨基酸序列构成三维表位形式。它可以,例如,代表 了一种三维表位,其代表目标蛋白质异构体的一种构象特征,而 这种构象特征在目标蛋白质其他异构体中未有出现。

在抗体集合物中鉴定针对某一蛋白质异构体的抗体的示范 方法包括(1)提供彼此不同的抗体集合物,其中至少有一种抗 体可特异结合融合蛋白,该融合蛋白至少包含了蛋白质异构体的 一部分区域,并连接了一个载体蛋白;(2)将抗体集合物与某一 固相表面相连,得到覆盖了抗体集合物的固相表面,不同的抗体 结合在此固相表面上的不同位置,(3)将覆盖了抗体集合物的固 相表面与融合蛋白相连,(4)执行一项可鉴定载体蛋白存在情况 的实验方法,若存在载体蛋白则表面存在有针对某一蛋白质异构 体的抗体。

在注射了编码期望蛋白的核酸集合物后的不同时期,可以通 过检测被注射动物的血清,判断源自这些核酸的蛋白质的产生情 况。用于检测的方法将依赖于该蛋白是否连接有载体蛋白,以及 载体蛋白的类型。在某一方面,载体蛋白是分泌性碱性磷酸酶(S EAP)。检测SEAP融合蛋白或其他产物的方法包括:从被注射动 物静脉中抽取血液样本,血清经盐溶液稀释。SEAP融合蛋白的 水平可以通过检测加入碱性磷酸酶底物后其激发的信号的方法 进行检测。商业化的SEAP利用方法包括,但不仅限于Clontech’ s Great EscAPcTM SEAP方法。其他融合蛋白的分析方法包括, 但不仅限于一些商业化的方法,色度,半乳糖苷酶荧光或化学发 光底物,HRP,内酰胺酶和lusiferase。这些方法擅长于抗体的高通 量筛选。

当最初的反应较弱时,需要间隔性地加强免疫动物,直到抗 体滴度升高或稳定。免疫后,(实验取血)获得样本血清,以检 测特异抗体的产生。更适宜地,从宿主动物分离免疫细胞的前3 -5天再给予最后一次免疫追加。

通过筛选,可以从被注射动物中得到针对一个目标蛋白的短 抗原或针对各种目标蛋白的抗体。所制备的针对一个多肽的抗体 可以测试其与多肽以及自身目标蛋白的活性。抗体与多肽和/或自 身目标蛋白的亲和力可以至少为10-6M,10-7M,10-8M,10-9M,1 0-10M,10-11M,10-12M。

单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备,最初在Kohler et al., Nature,256:495(1975)中阐述。如前所述,在杂交瘤方法中, 生产抗体或具备抗体生产能力的脾细胞可以从被免疫的动物中 获得。运用合适的“融合试剂”,如聚乙二醇或仙台病毒,这些 细胞可以和骨髓瘤细胞融合,从而形成杂交瘤细胞。(Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Acade mic Press,1986))

杂交瘤细胞在合适的培养基中生长,其中含有可地恰当地抑 制未融合的父代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如,如果父 代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT 或HPRT),那么杂交瘤细胞培养基中可特别包含次黄嘌呤,氨喋 呤,和胸(腺嘧啶脱氧核)苷(HAT培养基),这些物质可抑制HG PRT-缺失细胞的生长。

首选的骨髓瘤细胞是那些可高效地融合,为已选择的抗体生 产细胞提供高水平的稳定的抗体生产能力,及对HAT等培养基 敏感。在这之中,首选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞,如美国 加利福尼亚州圣地亚哥Salk细胞分配中心提供的MOPC-21和 MPC-11鼠肿瘤,和美国弗吉尼亚洲马纳萨斯的American Type Culture Collectailable提供的P3X63AgU.1,SP-2,X63-AG8-653细 胞。210-RCY3.Ag1.2.3鼠骨髓瘤细胞系也是适用的。人骨髓瘤和 鼠-人无限骨髓瘤细胞系在人单克隆抗体生产中已有叙述(Kozbo r,j.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibod y Production Techniques and Applicaations,pp.51-63(maredl Dek ker,Inc.,New York,1987))

可选择地,可以通过其他方法从被免疫动物的免疫细胞中制 备杂交瘤细胞系,例如,通过一种病毒(如,Epstein Barr病毒) 或一种癌基因作用于免疫细胞使之无限生长,从而获得生产期望 的单克隆抗体的无限生长细胞系。见Babcook et al.PNAS(USA), 93:7843-7848(1996),涉及将来源于产生特异单克隆抗体细胞的免 疫球蛋白cDNAs进行克隆,从而生产单克隆抗体,而其他生产 单克隆抗体的策略为使用被免疫动物的免疫细胞。

产生抗体的细胞随之通过筛选,鉴定出那些产生针对期望蛋 白的抗体的细胞。筛选那些与已经进行动物免疫的每一个抗原结 合的抗体的工作,通常在培养上清和/或纯化抗体中进行,例如, 从这里叙述的源自融合过程的杂交瘤细胞培养上清中。

在某一方面,将要测定的单克隆抗体可以于一个固相连接, 例如,包含蛋白A,蛋白A琼脂糖(凝胶),或其他蛋白A络合物, 蛋白G,蛋白G琼脂糖(凝胶),或其他蛋白G络合物。通常在多 孔板中筛选生产抗体的细胞。固相表面与抗原连接。可选地,在 测定的单克隆抗体与固相结合之前,抗体-抗原复合物可以通过 免疫沉淀反应形成。当抗体-抗原复合物结合到固相表面是,未 结合的抗原可以通过冲洗除去,从而可以通过测定抗原来鉴定阳 性结果。

在某一方面,可以包含一个载体蛋白。在这种情况下,可以 通过测定载体蛋白的试剂来测定与抗体结合的抗原的存在情况。 例如,载体蛋白可以通过使用一种特异结合载体蛋白的试剂,如 一种抗体来测定。如果这种载体蛋白是一种酶或其具备酶活性的 配基,该载体蛋白的测定可以通过酶学方法进行。相应地,可以 根据此领域中已知的方法,进行化学发光方法,荧光方法,或比 色方法。

当生产抗体杂交瘤细胞期望的特异性,亲和力和/或活性经鉴 定后,单细胞克隆可以通过有限稀释方法进行亚克隆(Goding, Monoclonal antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academ ic Press,1986));单细胞通过挑选进行克隆,或在软琼脂上生长进 行克隆(Harlow and Lane,antibodies:A laboratory Manual Cold Spring harbor Laboratory(1988);pps 224-227)。

杂交瘤克隆何以由标准方法进行培养。用于培养的适合的培 养基包括,例如DMEM或RP-1640培养基,杂交瘤细胞可以作 为动物腹水瘤进行体内培养。(Harlow and Lane,Antibodies:A laboratory Manual Cold Spring harbor Laboratory(1988);Chapter 7)。

亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常用的方法从培养基,腹 水,血清中分离,例如G蛋白或A琼脂糖凝胶,羟磷灰石色谱, 凝胶电泳,透析,亲和色谱。

针对期望抗原的抗体分离过程之后,抗体可以进一步被利用 或改良。在某一方面,嵌合体抗体被生产。“嵌合体”抗体是由 经过遗传工程改造的基因编码的,这样其轻链和重链基因由不同 物种的免疫球蛋白基因片段构成。例如,鼠单克隆抗体基因可变 (V)片段,例如这里所述方法得到的,可以和人恒定(C)片段 相连接。这样的嵌合体抗体对于人的抗原性可能比具有鼠恒定 区和鼠可变区的抗体低。

这里使用的术语,人工化抗体(HuAB)指一种嵌合体抗体, 其结构与人类结构具有充分的同一性(例如至少85%),具有从 非人源抗体中获得的CDRs,并其任何恒定区中至少85-90%,更 适宜地,95%的多肽序列与人免疫球蛋白恒定区相一致。见示例, PCT出版WO90/07861和欧洲专利号0451216。因此,一个HuA b的所有部分,除了CDRs,都与一个或多个人免疫球蛋白序列 对应部分具有充分的同一性。这里使用的术语“结构区域”,指 免疫球蛋白轻链和重链上可变区域的部分,其(与CDR’s不同) 在同一物种的不同免疫球蛋白中是相对保守的,见kabat,et al.(19 87)Esequences of Proteins of Immunologic Interest,4th Ed.,US Dept.Health and Human Servieds。

根据已知的方法,可从大量人细胞,但首选免疫B细胞中分 离人类恒定区域的DNA序列。根据已知的方法,生产人类抗体 的可变区域或CDRs可以从与此区域结合的单克隆抗体中分离, 单克隆抗体可从任何方便的哺乳动物资源,包括老鼠,老鼠,兔 子或其他可生产抗体的脊椎动物中产生。

用于DNA测序和表达并分泌抗体的细胞可以充许多地方得 到,如American type culture collection(“Catalogue of Cell Line s and Hybridomas”5th edition(1985)Rodkville,Md.,USA)。在上 述提到的获得抗体的方法(通过一种或多种抗原免疫动物)以外, 还有其他合适的生产抗体的方法。Cole et al.和Boerner et al. 提供的技术也可以用于制备人单克隆抗体。(Cole et al.,Monoc lonal antibodies and Cancer therapy,Alan r.Liss,p.77(1985)and Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。

在某些方面,抗体文库,其中每一个抗体对应于编码其的核 酸,如噬菌体显示系统,被用于高通量筛选对应一种或多种抗原 的抗体。在某种特定情况下,一种或多种抗原,如目标蛋白的配基, 与固相表面上的一个或多个突起或延伸相连接,其中不同的抗原 与不同的突起相连。固相表面可以具有众多突起,例如,至少为 2,5,10,25,50,100,300,1000,或3000个突起。带有突 起集合物的固相表面称之为“多突起表面”。固相表面可以是具 有大量突起的平板。连有突起的固相表面的一个示例是那些做成 适合于承载的模式,如多孔板。商业性公司如Nelge NUNC或 V&P Scientific,Inc.,可以提供或制造连有突起的固相表面。蛋白 和融合蛋白可以通过合成或重组的方法进行制备,例如,在CO S细胞中表达。根据此领域中已知的方法,可以将蛋白质与固相 表面进行连接。例如,固相表面可以被抗生物素蛋白,链菌素抗 体,镍,谷氨酸盐抗-标志抗体或抗-人Fc抗体覆盖。接着固相表 面可以被抗体文库覆盖,例如,噬菌体显示文库,其中每一个抗 体对应于编码该抗体的核酸。结合一段时间,有效形成或产生抗 原-抗体复合物。接着冲洗以去除未连接的抗体,将置于一多孔 容器上,使每一个突起或延伸都处于容器的不同孔中。根据此领 域中已知的方法,通过酸溶液洗涤,抗原或抗原/抗体复合物可以 从固相表面上分离下来,并进入的孔中。更多的抗体可以从对应 该抗体的编码核酸中生产出来,例如噬菌体。这个方法可以重复 多次。一个多孔容器可以含有12,24,48,96,384,1536个孔。 其他可利用的固相表面包括多孔容器或珠子(例如Dynabeads), 其中,抗原存在于不同的孔或珠子上。这里包括了以此目的设计 的,并可选择地连接抗原的固相表面。

用于此方法的抗原可以由连接或未连接载体蛋白的蛋白质 构成。当载体蛋白与抗原相连时,抗原/抗体复合物的检测可以通 过检测载体蛋白的存在情况进行。可选地,载体蛋白可以用于使 抗原和固相表面相连。当使用载体蛋白时,应排除抗体仅和载体 蛋白反应的情况,例如,将文库覆盖于已经予连接载体蛋白的固 相表面。

一种包括了筛选噬菌体显示文库的方法的某一方面在图1中 有所阐明。

抗体文库,例如,噬菌体显示文库,可以从自身的人源文库 或疾病关联文库中分离的核酸中制备。Hoogenboom和Winter 对噬菌体显示文库进行了进一步阐述,J.Mol.Biol.,227:381(1992); Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。制备噬菌体文库的适 合方法已经有所综述和阐明,见Wnter et al.,Annu.Rev.Immun ol.,12:433-55(1994);Soderlind et al.,Immunological Reviews,1 30:109-123(1992);Hoogenboom.Tibtech February 1997,Vol.15;N eri et al.,Cell Biophysics,27:47-61(1995)。单链抗体文库的制 备方法也有论述,见WO92/01047,WO92/20791,WO93/06213,WO 93/11236,WO93/19172,WO95/01438,WO95/15388。抗体文库也有 商业化的供应,例如,剑桥抗体技术(C.A.T),英国剑桥。

抗体纯化的方法是此领域中所熟知的。见,Hriow和lane(1 988)antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab oratory,N.Y.纯化方法包括盐沉淀(例如,铵盐),离子交换色 谱(例如,在阳离子或阴离子交换色谱柱上,以中性PH开始并 以离子强度逐渐加强的梯度洗脱),凝胶过滤色谱(包括凝胶过 滤HPLC),和亲和树脂色谱,例如蛋白A,蛋白G,羟磷灰石, 抗-抗体。抗体还可以通过此领域中熟知的方法进行亲和柱纯化。

这里叙述的方法也可以用于“表位筛选”(作为一种示范方 法,见图2,)。在某一方面,生产蛋白,如融合蛋白的表达载体 上包含的寡聚核酸,具有特异目标蛋白的短重叠和交错序列。 表达载体可以导入宿主以产生抗体,则可以鉴定受限于生产的抗 体的表位。例如,免疫宿主中得到的血清可与融合蛋白相作用, 测定对应于每个融合蛋白的抗体的总量。在特定情况下,编码多 肽的寡聚核酸或多肽可以用于免疫宿主,包含多肽和载体蛋白的 融合蛋白被用于血清筛选。方法还包括从被免疫宿主中制备单克 隆抗体,并用包含载体蛋白的融合蛋白筛选单克隆抗体。

短重叠氨基酸序列也可以通过化学合成,并与一个载体蛋白 相连。这些融合蛋白可用于覆盖固相表面的多-突起板,随后用 抗体文库,例如噬菌体显示文库,进行覆盖。扫描区域上每一个 表位的抗体可以从抗体文库中被分离,并用于中和或“抑制功能” 活性试验。

抗体可以作为,例如抑制抗体,被使用。此外,序列的混合 物,根据分离出抗体或未分离出抗体的情况,可以表明表位在目 标蛋白上的位置。蛋白质上的表位定位信息可以用于生产治疗 剂,例如小分子。这也可以应用于,例如,测定受体胞外区域上 的表位位置,例如G蛋白结合受体(GPCRs)。此方法也可用于 制备GPCRs抑制抗体,包括趋化因子和激素受体。

在有些情况下,检测针对目标蛋白表位的方法包括:(1)提 供编码众多融合蛋白的核酸,其中每种融合蛋白包含目标蛋白和 载体蛋白的6-15或8-12个氨基酸多肽,而这些多肽又包含不同 序列的目标蛋白。(2)给动物宿主注射众多融合蛋白。(3)从宿 主动物中获得血清;筛选血清检测或确定目标蛋白表位的抗体数 量,存在针对多肽的抗体表明此抗体对应于目标蛋白多肽。在另 一些情况下,方法包含上面(1)、(2),(3)从宿主细胞中制备 产生众多单克隆抗体的细胞。(4)根据这里描述的方法筛选细胞 来鉴定目标蛋白抗体,存在针对多肽的抗体表明此抗体对应于目 标蛋白多肽。多肽可能包含目标蛋白的交错序列。

这些方法,如这里描述的对于抗原与抗体绑定的探测分析, 能进一步用于筛选抗体组。在某些方面,抗体组与测试蛋白(如, 血清,细胞或组织蛋白)一起在抗原/抗体复合物能够形成的条件 下孵育。(见图3)没有绑定的蛋白质被洗去。然后,抗体组与包 含多肽的融合蛋白接触,如绑定抗体组其中之一抗体并连接载体 蛋白(如,SEAP)的多肽。在洗脱未绑定蛋白后,探测载体蛋 白(如,通过增加碱性磷酸酶基质),可读取抗体组。读取抗体 组特定区域是阳性将表明无多肽-载体蛋白的抑制绑定蛋白质被 加入,并且测试的样品不包含由特定抗体识别的蛋白质。因此, 在样品中,越少的载体蛋白被特定抗体检测,则越多被抗体识别 的蛋白质存在。

与靶标疾病相关的蛋白质异构体的成分

特定绑定与疾病相关的蛋白质异构体的药剂能用于治疗和 诊断的目的。这种药剂可以绑定由外显子编码且仅存在于mRNA 中编码疾病相关的蛋白质异构体的蛋白质的一个区域,如由相同 基因编码,在正常蛋白质中并不存在。这种药剂可以绑定包含外 显子结合点的且仅存在于mRNA中编码疾病相关的蛋白质异构 体的蛋白质的一个区域。药剂可以是绑定与疾病相关的蛋白特定 区域的任何分子或分子络合物(或化合物)。

药剂可以是与疾病相关的蛋白质异构体的拮抗物或抑制剂, 如与疾病相关的结合表位的拼接变异体的拮抗物或抑制剂。抑制 剂可能先前并不知道或先前以为是疾病特定表位拼接变异体的 抑制剂。抑制剂可能已经被测定为疾病特定表位拼接变异体的抑 制剂。这种拮抗物或抑制剂可以被用于治疗或阻止与特殊拼接变 异体相关的疾病,将进一步在这里被描述。

判断药剂是拮抗物或抑制剂的方法,包括用疾病的细胞或动 物模型的方法,如包括将癌细胞的移植入裸鼠。

药剂可能是一种先前不知道的绑定疾病相关表位的蛋白质。 例如,它可以是一种先前未知的抗体或先前未知的绑定表位的抗 体。药剂可以是已经被测定的绑定疾病相关蛋白表位的药剂。药 剂可以是由这里描述的任何方法鉴定的药剂。

在某些方面,药剂是一种抗体,其中的片段或其中的派生物, 如嵌合的或乳化的抗体。抗体可以根据这一领域已知的或这里描 述的方法获得。绑定特定疾病相关的蛋白质异构体的抗体将进一 步在这里被描述,如疾病相关的表位可能包含一个外显子结合 点。

抗体可以绑定特定的疾病相关蛋白异构体,如在表1中描述 的那些。抗体可以是绑定特定的疾病相关蛋白质异构体的表位, 如在表1中描述的那些。

已经被证明与疾病相关的蛋白质异构体可以通过如下数据 库确定:

PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/),

PubMed Central(http://www.pubmedcentral.nih.gov/about/i ntro.html),

OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db =OMIM),

PROW(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PROW/)。

一旦被鉴定,疾病相关异构体的序列可以从基因库得到( htt p://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenbankSearch.html)。表1列出了与疾 病相关蛋白异构体的例子和异构体的基因库编号。

                 表1:疾病相关的异构体蛋白示例   基因   编号   Spliced variant/   蛋白质异构体   关联疾病   P53   NM_000546   NP_000537.2   许多Spliced varia   nt和突变体   许多类型的肿瘤   Fas   M67454   AAA63174.1   跨膜区域缺失,溶   于血清   硅肺病   Factor   H   M17517   AAA52016.1   Spliced short vari   ant   卵巢癌,拼接因子H   在肿瘤中比正常组   织高5.5倍   CD86   BC040261   AAH40261.1   CD86(deltaTM)   白血病,AML   erb-B2/   Her2   M11730   AAA75493.1   HER-2(缺失胞外   区域,因此提高了   激酶活性和转化   活性)   乳腺等;在转移性乳   腺癌中HER2-splice   表达量有4.4倍升高   VEGF   P15692   GI:17380528   VEGF165(缺失外   显子6)   肺,结肠和胶质母细   胞瘤中的肿瘤转移;   黄斑恶化   VEGF121(缺失外   显子6&7)   乳腺癌,肺,胰腺b   eta细胞癌变,黑素   瘤   MDM2   BT007258   AAP35922.1   缺失外显子造成   的7个短异构体,   与恶化高度相关   乳腺癌   FGF-8   D38752   BAA22527.1   异构体FGF-8a,-   8b,-8c,-8f,肿瘤   相关的FGF-8b异   构体过量表达   乳腺癌   FGFR2-   IIIb   NM_022975   NP_0752642   缺失外显子7-10   软骨肉瘤   PSM   NM_004476   NP_004467.1   PSM”(226核酸缺   失)   前列腺癌-癌细胞中   高表达,正常细胞中   基础表达   PSA   BC005307   AAH05307.1   缺失氨基酸45-8   8,在肿瘤中发现   其他拼接变异体   KLK2   BC005196   AAH05196.1   缺失外显子4   前列腺癌   Insulin   R   NM_000208   NP_0001999.1   缺失外显子17(删   除IR,无酪氨酸激   酶区域)   糖尿病   Enovin   (PDNFO   AJ245628   CAB52396.1   组织特异拼接,疾   病/拼接形式   神经元不发生   (TCR)-z   eta   J04032   AAA60394.1   外显子IV/V间插   入密码子,缺失外   显子II,VI,VII,   (V+VI),(VI+   VII),(II+III+   IV),(V+VI+   VII)   红斑狼疮和其他疾   病   KST1   (钠/葡   萄糖转   运子)   NM_062944   NP_443176.2  外显子6缺失   BFIC,ICCA   综合症   Dystrop   hin   S73125   AAB20696.1  外显子缺失造成  的几种异构体   肌营养不良症   IL-6受   体   NM_000565   NP_000556.1  可溶的IL6R   RA   CD44   NM_000610  CD44R1(V8-10)   结肠,肺  CD44v7/8   湿性关节炎(仅见   于疾病连接)  CD44v6   乳腺癌  CD44v5   Wilms癌;其高表达   与肿瘤关联  CD44v7   自体免疫,肠  CD44v3   自体免疫,皮肤   TGF-alp   ha   NM_003236  变异体I(Va I)   在数种肿瘤系中提   高转化活性  变异体II(Va II)   在数种肿瘤系中提   高转化活性   Tenascin   -C   NM_002160  缺失FN III区域   大泡性膜病变,人   角膜   肌钙蛋   白T2   NM_000364.1  缺失外显子7(12  个氨基酸)   原发性心肌炎   肌钙蛋   NM_000363  血清可溶形式   原发性心肌炎   白I   PRL-3   NM_032611   NM_007079   异构体I   异构体II   结肠直肠癌转移,心   肌肥大   EGFR-1   210a.a     618a.a       405a.a     705a.a     934a.a       NM_005228.3   NM_201282.   1       NM_201283.1     NM_201284.1             异构体a     异构体b       异构体c(可溶的)     异构体d         EGFRvIII(缺失外   显子2-7)   黑色素瘤,粘液瘤     乳腺,胰腺癌,肝转     移;       NSCLC,鳞片细胞   瘤,肾细胞瘤;   胶质母细胞瘤         雌激素   受体-alp   ha         缺失外显子5   缺失外显子6       缺失外显子7     乳腺癌增长   乳腺转移性癌/tomax     ifen抗性   雌激素-敏感和toma   xifen抗性   雌激素   受体-bet   a2     beta-delt   a3   I在外显子5和6   间缺失一部分(54   核酸,18a.a)   缺失外显子3(11   7核酸,39a.a)   在卵巢和肿瘤位点   异常表达;   对促效剂Estrogm,和   拮抗剂Tomaxifen响   应   GPCR:   BC069611   第一个胞内环具   骨瘤   降血钙   素R   1674bp;   474a.a   AAH69611.1   有16个a.a   GPCR:   多巴胺   R(D2)   第三个胞内环具   有29个a.a   调整激素转录和分   泌   GPCR:O   PRM1   NM_000914   NP_000905.1   插入外显子10(5   8个a.a)   与阿片样物质高度   亲和   Ca-感知   受体   D50855   BAA09453   前列腺转移   原肌球   蛋白3-   异构体   5   NM_152263   NP_689476   TM5异构体   膀胱癌   PDGF   A   NM_002607   NP_002598   外显子6   许多生长调节恶性   因子   PDGF   B(通过   染色体   转移融   合)   NM_002608   NP_002599   COL1A1-PDGFB   融合体(der922)   t(17;22))   表皮纤维肉瘤,纤维   胚细胞癌   PDGFβ   受体(通   过染色   体转移   NM_002609   NP_002600.1   CEV14-PDGFRbet   a(q33;q32);   NIN-PDGFRB(q3   3;q24)   AML;   慢性骨髓及外骨髓   增殖失调;   形成几   个融合   蛋白)   tel-PDGFR beta   融合体(q33;p11.   2);   RABPT5/PDGFR   B融合体(q33;p1   3);   AML;   CMML   泌乳刺   激素受   体   BC059392   AAH59392.1   许多异构体,例如   外显子6缺失和外   显子11缺失   乳腺癌

         表2:疾病相关的病毒蛋白示例   病毒疾病   病毒蛋白   基因库编号   SARS   铆钉表面蛋白   GI:30027620   HIV   HIV-1(env)   AY223790   AAP57385.1   HCV,C肝炎病毒   聚合蛋白   NC_004102   NP_67149.1   Mycoplasma hyorhihis   P37   X14140   CAA32357.1

于不同蛋白质异构体相关的疾病的示例包括,但不仅限于: 风湿性关节炎,糖尿病,急性骨髓白血病(AML),慢性淋巴细胞 白血病(CLL),卵巢癌,前列腺癌,乳腺癌,结肠癌,胶质母 细胞瘤,黑色素瘤,肺癌,肾癌,肌肉萎缩症,神经精神异常, 常染色体多囊肾病(ADPKD),心血管疾病,阿尔茨海默氏病。 与肺癌和结肠癌相关的蛋白质异构体包括血管内皮生长因子(V EGF)165和VEGF121(见示例和图5)。膀胱,乳腺,卵巢和肺 癌相关的蛋白质异构体包括HER2异构体1和HER异构体2(见 示例)。与许多癌症和自身免疫疾病相关的蛋白质异构体包括CD 44异构体CD44R1,CD44v5,CD44v7,CD44v3(见示例和图6)。

疾病相关的表位可以包含仅在疾病相关蛋白质异构体中表 达的,该外显子不在正常蛋白质中,例如不与疾病相关的蛋白质 中表达。这些多肽的氨基酸序列包含了疾病相关外显子结合点, 并在表3中列出。

            表3:疾病相关多肽的氨基酸序列   多肽氨基酸序列   疾病相关异构体   DRARQE/NPCGPCSE(SEQ ID NO;2)   DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO;4)   INCTHS/PLTS(SEQ ID NO;6)   CTHSCV/ASPLT(SEQ ID NO;8)   AHCIR/KPGDD(SEQ ID NO;10)   HCIR/KPGDDS(SEQ ID NO;11)   PQWVLTAAHCIR/KPGDDSSH(SEQ ID NO;13)   EQIEELKRQT/LPFKVVVIS(SEQ ID NO;15)   QVTVQSSPNF/TQHVREQSLV(SEQ ID NO;16)   SERLQDFDKS/NPIVLRMMND(SEQ ID NO;17)   (a.a646-666)   GLPDRPFYR/HVIYAPSSHN(SEQ ID NO;18)   (a.a.680-700)   NEATNITPKHN(SEQ ID NO;19)(a.a.47-57;在   PSMA中序列缺失)   TRLLSSPFSI/VLPTVIICV(SEQ ID NO;20)(a.a   235-251)   VEGF-165   VEGF-121   HER-2结合异构体1   HER-2结合异构体2   PSA-delta44   PSA-delta44   PSA-delta44   CEV14-PDGFRβ     FGF-8b   PSMA异构体-2     PSMA异构体-2     PSMA异构体-1     CD86(delta TM)     ACTCTTATAAATGTG/AGAAAAAATCCATAT   (SEQ ID NO;21)   LLFLNTCLLN/VQPDPPLELAVE   (SEQ ID NO;22)     APVLVALALIESGMKYEDAIQFIRQ(SEQ ID   NO;23)(a.a 111-135)   AVHCVAGLGR/KRRGAINSKQ(SEQ ID NO;24)   CGGCCAGAGGCTGAG/ACTTTGGAATGACCA   (SEQ ID NO;25)     CD86(delta TM)     泌乳刺激素受体,异构   体-2,(缺失a.a 24-   124,101个氨基酸)   PRL-3异构体-1     PRL-3异构体-2   胰岛素受体(IR,   CD220),糖尿病中缺失   外显子17(160bp)

“/”指外显子结合点处。

试剂也可以是一种蛋白质(除了抗体以外),一个多肽或其 派生物或类似物,如拟肽。鉴定例如蛋白质,多肽或其他分子或 重组分子等试剂的方法在此领域中是熟知的。

其他针对疾病相关蛋白质异构体的试剂包括那些抑制疾病 相关蛋白质异构体的生产的物质。例证性的试剂包括小干扰RN As(siRNAs)或核酸,反义核酸,核酸酶,三重核酸密码子,显性 负性突变,小干扰RNAs(siRNAs)或核酸,反义核酸,核酸酶, 三重核酸密码子可以针对那些编码只存在于疾病相关蛋白质中 的配基的核酸序列,该配基在同样基因编码的正常蛋白质中不存 在。例如,这些试剂可以针对一种核酸序列,其中的外显子只存 在于疾病相关蛋白质异构体中,而不存在于正常蛋白中。它们也 可以针对那些跨越了外显子-外显子结合点区域,并特异对应于 疾病相关蛋白质异构体的核酸序列。

siRNA分子可以包含一种核酸序列,本质上由存在于与疾病 相关的拼接变异体中的一个序列组成,但不存在于相同基因的与 疾病无关的拼接变异体中。例如,siRNA分子可以包含一种核酸 序列包含或本质上由列出的SEQ ID NOs:1(VEGF 165特定 核酸序列),SEQ ID NOs:3(VEGF 121特定核酸序列),SE Q ID NOs:5或7(Her2拼接变异体特定核酸序列)序列组成。 或任何编码多肽的核酸序列:SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,11, 13,或15-25。

siRNA分子可能包含两条链,每条链原则上包含至少相互互 补的核酸序列。这种序列原则上对应于疾病相关的拼接变异体序 列,作为siRNA“正义序列”或更常见地作为“正义目标序列” 被提及并且这种序列原则上作为补充序列,作为siRNA“反义序 列”或“反义目标序列”被提及。正义和反义目标序列可以是1 5-30左右的连续分子长;19-25左右的连续分子长;19-23左右的 连续分子长或大约19,20,21,22或23左右分子长。正义和反 义序列的长度由这种情况决定,具有上述长度的正义和反义靶标 序列的siRNA能抑制目标基因的表达,更适宜地,并不显著引发 宿主的干扰反应。

siRNA的正链目标序列可以是至少与目标基因部分“本质上 相同”或“充分地相同”,如至少有95%,98或99%相同,提 供的siRNA包含的序列可以干扰基因序列的表达。

正链目标序列的核酸碱基构成可以是约50%的腺腺嘌呤(A s)和胸腺嘧啶脱氧核苷(Ts)和50%的胞嘧啶(Cs)和鸟嘌呤(Gs)。 可选地,碱基的构成中Cs/Gs的含量也可以至少为50%,例如含 60%,70%,80%的Cs/Gs。相应地,正链目标序列的选择将基 于核酸的碱基构成。关于siRNA对于目标核酸的可及性,以下的 方面是应考虑的,例如Lee等在Nature Biotech.(2002)19:500中 描述的。此项应用包括寡核酸链的使用,其作为探针可与目标蛋 白互补,以测定底物的可及性,例如在细胞提取物中。当与寡聚 核酸探针形成二聚体后,该底物对于RNase H敏感。因此,通 过(例如PCR)测定RNase H对于给定探针的敏感性,反映了 选择位点的可及性,并可能体现相应的siRNA对于抑制目标基因 转录能力的预测值。可以通过算法来鉴定引物,用于聚合酶链反 应(PCR)方法或者用于鉴定反义寡聚核酸以鉴定首个目标序列。

正链和反链目标序列是合适地、高效互补的,siRNA包含的 两条序列可以抑制目标基因的表达,例如,可介导RNA干扰。 作为示例,该序列在期望的条件下可以高效地互补从而形成杂交 链,例如在一种细胞中。相应地,正义链和反义链目标序列可以 至少为95%,97%,98%,99%或100%同一性,例如,至少有 5,4,3,2,1,或0个核酸的不同。

正义链和反义链靶序列是一些合适的序列,除了目标核酸或 其互补链,它们可能不与其他序列相互作用。这一点可以通过以 下例子证实,将选择的序列和其他目标细胞基因组的序列进行比 较。序列比较可以通过此领域中的方法进行,例如运用BLAST 运算方法,在此将进一步阐述。当然,还可以进行小范围的试验, 以验证特异的首个目标序列可以特异抑制目标核酸,而非其他基 因的表达。

除了正义链和反义链以外,siRNA还可以包含其他序列。例 如,siRNA可以由两股RNA构成的RNA双链,其中至少一股链 具有3’突出端。另一股链可以是平末端或具有突出端。当RN A分子由双链构成,并且每条链都包含突出端的情况下,两条链 的突出端可以是同样长度或不同长度。在一特别情况下,siRNA 包含正义链和反义链序列,其每一条序列存在于一条RNA链上, 并由约15-30,例如19-25个成对核酸构成,并在RNA3’端具有 1-3个,更常见为2个核酸构成的突出端。为了进一步提高此发 明涉及的RNA的稳定性,3’突出端可以增加抵抗降解的能力。 在某一方面,加入嘌呤核苷酸,例如腺嘌呤或鸟嘌呤,可以加强 RNA的稳定性。可选地,通过嘧啶替换形成改良的类似物,例 如将2个尿嘧啶核酸形成的3’突出端替换成2’胸腺嘧啶,可 以增强siRNA的稳定性,并不会影响其效力。在组织培养液中, 2’羟基的缺失可以增强核酸突出端的稳定性。SiRNA的RNA链 拥有5’磷酸基和3’羟基。

在某一方面,siRNA分子包含两条RNA链,形成双链结构。 在另一情况,siRNA分子由一条RNA链构成,形成发卡环,其 中正义链和反义链靶序列进行杂交,并且在两个序列间是一段空 间结构,有效地形成发卡结构环。空间序列可以包含任何长度的 任何核酸聚合物,具有此序列的空间结构连接的两条互补寡聚核 酸可以形成发卡结构,其中至少空间结构的一部分可在发卡的近 端形成环结构。例如,空间序列可以是3到30个核酸,或3到2 0个核酸,或5到15个核酸,或5到10个核酸,或3到9个核 酸。该序列可以包含任何序列,只要不干扰发卡结构的形成。特 别地,空间序列最好不应包含第一或第二靶序列的重要同源物, 因其可以干扰发卡结构的形成。空间序列也不宜于其他序列相 似,例如将要引入核酸的细胞基因组序列,因这将在细胞中造成 不良情况。

具备此领域中一般技术的人可以理解,当特指一个核酸时, 例如RNA,此RNA可以包含自然发生的核酸或其派生物,只要该 派生物可以增强核酸的稳定性。任何派生物都是可接受的,只要 该核酸能够具备所期望的功能。例如,siRNA可以包含核酸派生 物,只要该siRNA仍能够抑制靶基因的表达。

例如,siRNA可以包含一个或多个改良的碱基,和/或一个为 了增强稳定性或其他原因而改良的主链。例如,自然RNA的磷 酸二酯键可以被改良,从而至少包含氮或硫原子中的一种。此外, 磷酸二酯包含不常见的碱基,如次黄(嘌呤核)苷,或改良碱基如 三苯甲基化碱基,作为两个例子,在此发明中也可以被使用。对 RNA的大量的改良提供了许多有用的效果,并作为此领域中的 技术被熟知。这里使用的术语“siRNA”包含了如化学的,酶的 或代谢的siRNA的改良形式,它们是从内源模板演化而来。

合成和纯化siRNA的方法是此领域中所熟知的。介导siRNA 进入细胞的方法也是此领域中所熟知的。SiRNA可以通过细胞外 的介导进入体腔,空隙,哺乳动物循环系统,或通过口服。口服 介入的方法包括直接将RNA和哺乳动物的食物混合,或通过工 程技术,将经工程改造后可表达RNA的物种作为食物,然后喂 食给实验动物。例如,食用细菌,如乳酸乳球菌,可以通过转化生 产dsRNA(间WO93/17117,WO97/14806)。血管或血管外环境,血 液或淋巴系统即脑髓液也是注射RNA的位点。

siRNA也可以在细胞内生产,例如来源于编码siRNAs的载 体。此类载体在以下有所论述,例如,Paul et al(2002)Nature Biotechnology 29:505;Xia et al.(2002)Nature Biotechnology 20: 1006;aeng et al.(2002)Mol.Cell 9:1327,thijn et al.(2002)Scie nce 296:550;BMCBiotechnol.2002 Aug 28;2(1):15;Lee et al.9 2002)Nature Biotechnology 19:500;mmccmcanus et al.92002)R NA 8:842;Miyagishi et al.(2002)Nature Biotechnology 19:49 7;Sui et al.(2002)PNAS 99:5515;Yu et al.(20020PNAS 99:60 47;Shi et al.(2003)Trends Genet.19():9;Gaudilliere et al.(2 002)J Biol Chem.277(48):45442;US2002/0182223;US 2003/00 27783;WO 01/36646;WO03/006477。也有商业化的载体供应。例 如,pSilencer可从Gene Therayp Systems,Inc.获得,pSUPER RNAi系统可从Oligoengine获得。

反义链核酸,核酸酶,及三重核苷酸可以作为siRNAs作用 于基因上的同样区域。制备,纯化或介导这些核酸进入细胞或物 体的方法是此领域所熟知的。

在某一方面,一种试剂,如一个小分子,是通过合理的药物 设计而被鉴定的。该方法使用三维坐标资料库,其中包含蛋白 质疾病相关异构体的至少一个配基,如蛋白质疾病相关异构体特 异的表位。合理的药物设计方案包括计算机相关的方法,来鉴定 结合蛋白质表位的试剂,包括(1)提供一个计算机模型应用软 件,一套分子或分子复合物的结构坐标,分子或分子复合物包含 表位上的至少一个配基;(2)提供一个计算机模型应用软件,一 套试剂或化学物的结构坐标;(3)测定化学物是否可以结合分子 或分子复合物。测定是否结合分子或分子复合物的更适宜的方 法,包括在化学物和分子或分子复合物之间提供一个合适的操 作,通过计算机分析合适的操作的结构,以量化化学物和分子或 分子复合物之间的关联程度。该方法包括对化学物文库的筛选。 该方法还包括提供和合成化学物,并分析其与表位的结合能力。 也包括测定化学物是否是表位的抑制物或对抗物,例如,通过测 定化学物能否治疗或预防表位相关的疾病。可选地,该方法进一 步包括了测定化学物是否适合用于诊断方法。

这里还提供了一种方法,制备结合蛋白质的疾病相关表位的 试剂,例如,通过计算机相关方法设计,并通过化学或酶合成该 化学物,如上所述。

此发明还提供了一种设备,其包含了分子或分子复合物和化 学物间形成的复合物的表现情况,如结合了的抗体。其中一种设 备是在其记忆中包括了复合物表现情况的计算机。在某一方面, 计算机包含一个可机器识别的记忆存储介质,其包含的数据存储 材料,是由机器识别的包含复合物的原子坐标的数据编码的。计 算机可能还包括一个贮存处理机器可识别的数据指令的工作记 忆,其主要处理设备连接工作记忆和用于处理代表复合物三维空 间的机器可识别数据的机器可识别数据贮存介质。计算机也可 以包含连接显示三维空间表示的中央处理设备的显示。

治疗的效用

那些这里描述的或这里描述得到的药剂,如抗体,可以用于 疾病的治疗或防治,其中该试剂,例如抗体的存在对于一个特异 分子是收益的。在有些情况下,抗体用来做目标药剂,如作为特 殊细胞的毒素。例如,可以用特定绑定癌细胞表面的蛋白质的抗 体释放的一种癌细胞毒素杀死癌细胞。在另外情况下,这种目标 抗体不绑定存在于正常细胞的蛋白质。如,我们可以用绑定特定 的疾病相关的蛋白质的异构体或拼接变异体的抗体,如在癌细胞 中本质上仅存在于疾病的蛋白异构体。当然,如果异构体出现在 位于身体不同部位的正常组织,抗体可能会绑定该异构体,假设 目标抗体并不杀死所有正常组织的细胞。

除了在外显子中的疾病相关异构体的目标序列,药剂(如抗 体)也可以绑定并不于疾病相关的在蛋白异构体中未发现的外显 子-外显子结合点。药剂还可以绑定并不在正常的蛋白质异构体 中发现的与疾病相关的三维表位。除了绑定线性表位的药剂之外 (continguous氨基酸),基于蛋白质异构体的结晶数据,绑定三维 空间表位不绑定线性表位的药剂也能被制备。

在某些情况下,单一的药剂如抗体,被注射入病人体。在另 些情况下,众多的抗体被注射入病人体。抗体可以是针对相同抗 原的不同抗体,如抗原的不同的表位,或抗体可以是针对不同抗 原的抗体。特定的治疗可以包括两种计划的结合。不同的抗体可 以根据这里描述的方法来制备。如,与特定的疾病相关的蛋白质 或编码蛋白质的核酸的众多多肽,能被注射入宿主动物来制备单 克隆抗体。

这里也提供包含编码疾病相关蛋白质异构体的表位的核酸 序列的DNA疫苗,这种疫苗可用于防治或治疗如癌的疾病。表 位可以是10-15或8-12个来源于疾病相关蛋白质异构体的线性或 非线性序列的短小多肽的氨基酸残余。表位可以横跨两个外显子 的连接位点,这种连接点对与疾病相关的特殊蛋白质异构体是唯 一的,并且不存在于正常主体或疾病主体的正常组织中发现的蛋 白质异构体中。在某种特定情况下,DNA疫苗编码两个或更多 来源于单一蛋白质异构体的或多个蛋白质异构体的表位并且可 以用于这样如特定的疾病指示的结合。DNA疫苗也可以是与载 体蛋白(如血清蛋白,SEAP或其他分泌多肽或蛋白质)融合, 编码特殊序列的表位,如编码10-15个氨基酸。DNA疫苗可用于 在这里进一步描述的疾病的防治与治疗。可仿效地,DNA疫苗 包括编码或鉴定这里描述的多肽的核酸序列。

被绑定的蛋白质异构体和相关的疾病在这里进一步被描述, 如表1,2和3。

治疗性的抗体也可以绑定与蛋白质G连接的受体(GPCRS)。 事实上,目前被标记的药物有60%绑定不同GPCRS,并且目前 没有有效的方法用于提高针对这些受体的抗体。因此,如这里所 述,可制备位于那些受体胞外区域的短小序列抗体。

能被抗体绑定的致病的疾病和蛋白质的例子包括细菌,病 毒,微等离子和寄生虫的感染。病毒包括流行性感冒病毒,人免 疫缺陷病毒(HIV),肝炎病毒(如肝炎病毒C)和冠状病毒(如 严重急性呼吸道综合症(SARS-CoV)),引起肺结核的结核菌和 引起疟疾的疟原虫。

抗体可以是多克隆的或单克隆的,整个分子或分子片段。许 多保留整个抗体绑定活性的抗体片段被典型地使用。这种抗体片 段非限制性的包括Fab,Fab2,

Fab’,Fab’2和单链Fv(scFv)。

裸露的或非络合的,单克隆抗体能用于治疗。一种可能的机 制是宿主效应机制的补充,如抗体覆盖的肿瘤细胞单克隆抗体上 具有的抗体依赖的细胞细胞毒性,和噬菌作用/白细胞郁滞。多项 在动物和病人中的研究表明了当单克隆抗体与白介素2结合并补 充其功能效应时的抗肿瘤效应。一个示例是针对非何杰金淋巴 瘤的抗CD-20抗体retuximab。

通常,另一种利用裸露单克隆抗体的机制策略是其对于恶性 细胞生长和分化的抑制。这可以通过阻止肿瘤生长和分化刺激分 子的通路而完成。示例包括herceptin(赫赛汀)和抗表皮生长因 子受体(EGFR)抗体C-225。

抗体或其片段可以和一种检测标签相联合,连接,匹配,结 合,或其他任何连接。与测定标签间的连接可以是共价或非共价 的;牢固的连接是较适宜的。检测标签可以直接与特异针对目标 的抗体相连接,或可以通过一个第二部分进行连接,如通过特异 针对一抗的二抗,通过蛋白A或通过生物素/抗生物素蛋白或 生物素/链酶亲和素型连接。在抗体特异结合目标的同时或随后, 检测标签可以被释放。这些检测标签包括放射同位素或放射核 酸,荧光基团,化学发光染料,生物发光复合物,磁性微粒,酶 标,底物,辅助因子,抑制子和其他类似物。见,指,导这些标签 使用的专利,U.S.Pat.Nos.3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996, 345;4,277,437;4,275,149;4,366,241。标签可以在物体中对细胞进 行追踪和放射。可以使用非侵入技术进行检测的标签是更适宜 的,虽然内窥镜也可以用来测定被检测的标签的位置。

抗体可与其他功能部分结合。当与毒素,药物或前药物如化 学治疗试剂或放射核酸结合时,该抗体可被称为“免疫毒素”。 适合与抗体结合的试剂包括capecitabine,mitoxantrone(米托蒽 醌),aflotoxin,阿霉素,环磷酰胺,5-氟尿嘧啶,irinotecan,丝裂霉 素,紫杉醇,cisplatinum,假单胞菌毒素,金环蛇毒素,篦麻毒 素。正如这里进一步阐述的,这些试剂可以共价结合抗体,或通 过带有特异结合配对成分的连接基团进行连接,如生物素/抗生物 素,生物素/链霉亲和素,抗体/抗原。出于这些治疗目的,多肽 和其他试剂,也可以和细胞毒素试剂和化学治疗试剂相结合,而 该多肽可与已经鉴定的目标物质之一,如与一种疾病相关蛋白质 异构体特异结合。

抗体与细胞毒素或标签之间的连接可以通过许多异种双功 能交叉连接无物完成,如双功能蛋白结合试剂,如N-succinimid yl-3-(2-pyridyldithiol)丙酸盐(SPDP),化二亚胺戊二, 巯醇亚胺(TT),imidoesters双功能派生物(如二甲基adipimida te HCL),活性脂(如二琥珀酰亚胺底物),醛(如戊二醛),叠 氮复合物(如叠(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺),叠-重氮派生物 (如叠-(p-diazoniumbenzoyl)-ehtylenediamine),二异氰酸化物(如2, 6-二异氰酸甲苯),和双-活性氟复合物(如1,5-双氟-2,4-二硝基 苯)。例如,篦麻毒素抗毒素可以通过以下方法制备,Vitetta et al.Science,238:1098(1987).Carbon-14-labeled 1-isothiocyana tobenzyl-3-methylaiethylene triaminepentaacetic acid(MX-DTPA) 是一种螯合试剂,可以将放射核酸与抗体相连接。见WO94/110 26。它们可以通过合成或重组制备。

抗毒素,包括单链分子,可以通过重组方法制备。许多生产 抗毒素的方法是该领域中所熟知的,并且可以在“单克隆抗体- 毒素结合:瞄准魔力子弹,”Thorpe et al.(1982)Monoclonal An tibodies in Clinical Medinine,Academic Press,pp.168-190; vitatta,Science(1987)238:1098-1104;和Winter,Milstein(1991),Nat ure 349:293-299。

许多细胞毒素试剂都适宜作为抗毒素被使用。毒素试剂包 括,但不仅限于,放射核酸,如碘-131,钇-90,铼-188,铋-212; 许多化学治疗试剂,如长春地辛,氨甲蝶呤,阿霉素,cisplatinu m;细胞毒素蛋白如核糖体抑制蛋白,如美洲商陆抗病毒蛋白, 假单胞菌外毒素A,篦麻毒素,白喉毒素,篦麻毒素A链,等, 或在细胞表面具备活性的试剂,如磷脂酶(例如,磷脂酶C)。 通常见,“Chimeric Toxins,”Olsnes和Phil Pharmac.ther.,15:355- 381(1981);和“Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,”等。Baldwin和Byers,pp.159-179,224-266,Academic Press(1985)。

另一方面,抗体可以和一个受体连接(如链霉亲和素),形 成抗体-受体联合物并施用于病人作为肿瘤预定位运用,随后用 洗涤试剂从循环系统中除去未结合的联合物,然后施用与细胞毒 素试剂(如放射核酸)结合的“配基”(如抗生物素蛋白)。抗体 也可以与前药物激活酶连接,该酶可以使前药物(如肽基化学治 疗试剂,间WO81/01145)转变为具活性的抗肿瘤药物。见,例 如,WO88/07378和U.S.Pat.No.4,975,278。相应地,免疫联合物 的镁成分可以包括一种酶,其能以上述过程作用于一种前药物, 是其转变成更具活性的,细胞毒性的形式。此发明中的方法使用 的酶包括,但不仅限于,可将包含磷酸的前药物转变为自由药物 的碱性磷酸酶;可将包含硫酸盐的前药物转变为自由药物的ary lsulfatase;可将非-毒性5-氟胞嘧啶转变为抗肿瘤药物,5-氟尿嘧 啶的胞嘧啶脱氨(基)酶;可将含多肽的前药物转变为自由药物的 蛋白酶,如沙雷氏菌蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶, 羧基肽酶,组织蛋白酶(如B和L);丙氨酰羧基肽酶,具有转 变含有D-氨基酸替代物前药物的功能;碳水化合物-裂解酶如β- 半乳糖苷酶和神经氨(糖)酸苷酶,可将含糖基化前药物转变为自 由药物;β-内酰胺酶,可以将来源于β-内酰胺的药物转变为 自由药物;青霉素酰胺酶,如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺 酶,可以将药物的胺氮替换为苯氧乙酰或苯乙酰,从而转变为自由 药物。可选地,具备酶活性的抗体,在此领域中称为“抗体酶”, 可以用于将前药物转变为自由活性药物(见,例,Massey,Nature 328:457-458(1987))。抗体-抗体酶联合物可以如此所述被制备, 并用于将抗体酶介导入肿瘤细胞中。

利用此领域中熟知的技术,如使用异相双功能交联试剂,可 以将酶共价地和抗体结合。可选地,可以通过此领域中熟知的重 组DNA技术构建酶/抗体融合物,此发明中,该融合物至少包括 抗体的抗原-结合区域及其连接的酶活性功能配基。(见,例,Ne uberger et al.,nature,312:604-608(1984))。

这里论述的抗体和其他试剂可以用于病人的治疗,当其与化 学治疗试剂或方法(如手术)联用时。“联用”并不需要同时使 用。例如,绑定了疾病相关蛋白质表位的试剂可以同时或连续地 与化学治疗试剂联用。在某一方面,每一试剂在任何一天都可以 用于病人治疗。

肿瘤的化学治疗可以通过抑制DNA合成来完成,或直接地, 或非直接地抑制三磷酸脱氧核糖核酸前体的生物合成,以阻止D NA复制和随后的细胞裂解。(见,例如,Gilman et al.,Goodma n and Gilman’s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Eig hth Ed.(Pergamom Press,New York,1990))。这些包含烷[]化 剂的试剂,如亚硝基脲,抗-代谢物,氨甲蝶呤和羟基脲,和其 他试剂,如etoposides,campathecins,bieomycin,doxorubicin, daunorubicin,等,虽然不特异针对细胞周期,但由于其对于DN A复制的影响,都在S阶段杀死细胞。其他试剂,特别是秋水仙 素和长春藤碱,如长春碱和长春新碱,影响微管的装配,并导致 有丝分裂的停滞。化学治疗方案通常包括运用化学治疗试剂来提 高治疗的效果。

在某种特定情况下,这里叙述的试剂将用于那些对于先前的 治疗无反应或仅有有限反应的病人的治疗。例如,一种试剂可以 用于一位肿瘤病人,化学治疗对于他没有产生有效的效果。这样, 作为已经接受了化学治疗的病人,他可以应用这里论述的方法。

用此领域中的任何方法,可以将抗体介导入病人体内。通常 包括静脉内,肌肉内,皮下的,肿瘤内的注射或灌输。抗体被特 异设计成水溶形式,使其保持正常结构和抗体结合能力,并对于 病人是药物可接受的。期望的形式是无菌的并无热源的。

抗体能以药物复合物形式施用于病人,其包含了一些具治疗 效果的抗体和一个药物可接受的载体(附加的)和/或稀释液。例 如,对于固体肿瘤,包含抗体的复合物可以注射入肿瘤、或肿瘤 的周围。对于血液肿瘤,如白血病,复合物可以输入血液或骨髓。 作为治疗的抗体的起效量依赖于作治疗的疾病的类型,疾病的发 展阶段和病人的年龄。

适合注射治疗的药物成分可以包含一种或多种抗体,其可与 一种或多种药物可接受的成分相结合,如无菌等渗水或非水溶 液,分散剂,悬浮剂,或乳化剂,或在使用前能溶解入无菌注射 剂或分散剂的注射无菌粉末,它们可以包含糖,乙醇,抗氧化剂, 缓冲液,抑菌剂,溶质,提供与血液等渗的环境期望所易接受 的,或混悬或增稠剂。这些成分也包括佐剂,如防腐剂,湿润剂, 乳化剂和分散剂。为防止复合物受微生物影响,可以加入许多 抗细菌和抗真菌试剂,如paraben,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸, 和类似物。在复合物中加入等渗试剂如糖,氯化钠,和类似物也 是合适的。另外,通过加入可延迟吸收的试剂,如单硬脂酸铝和 凝胶,来延长注射药物制剂的吸收时间。

在一些情况下,为了延长药物的作用时间,在皮下或肌肉内 注射时,通过设计来减缓抗体的吸收。这可以通过使用具备低水 溶性的结晶悬浮液体或无定形材料实现。随之,抗体的吸收速度 依赖于分解速度,而其依赖于结晶的大小和结晶的形态。可选地, 可以通过将抗体溶解或悬浮在油相中,来减缓注射-治疗抗体的 吸收。

抗体的微囊形式包含于可生物降解的聚合物,如聚交酯-聚糖 脂之中,可以制备出注射存储库形式。依赖于抗体结合聚合体的 速度和使用的聚合体的自然特异性,抗体释放的速度可以被控 制。其他生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚合(酐)。 也可以通过将人体组织可接受的脂质体或微乳液包裹抗体,可以 制备注射存储库形式。

作为预防应用,包含抗体或其鸡尾酒的成分可以给予受到疾 病发展阶段的病人的治疗,以提高病人的抵抗力。其使用量定义 为“疾病预防起效量”。在使用中,精确的用量依赖于病人的健 康程度和综合免疫水平,通常在每剂量0.1到100mg的范围内, 特别是每人1到10mg。

在一些治疗方法中,与单独使用抗体相比,第二种试剂(例 如,白介素)以可以激活细胞效应的用量,与抗体联合使用作为 治疗,可增强对于恶性细胞的细胞毒作用。白介素-2作为治疗的 剂量可以是约500000U/kg。

除了使用抗体之外,其他治疗方法包括给予病人一种试剂。 至少使用这些试剂的意义与使用抗体相同。例如,和抗体结合表 位的过程向类似,一条多肽可以被设计并结合于一个表位。结合 疾病相关蛋白质的异构体或表位的多肽或其他分子,siRNA,反义 链,核酸酶,或三重核酸或特异针对疾病相关蛋白质异构体的显 性阴性突变,都可以给予患有疾病的病人治疗。包含这些试剂的 药物复合物的治疗方法,包括了这里叙述的抗体的,和其他在此 领域所熟知的方法。

这里叙述的方法,特别是表位的筛选方法,也可以被用于鉴 定用于疫苗使用的多肽和其编码核酸。在某一方面,针对疾病如 癌症或一种病源疾病的DNA疫苗,通常基于对目标疾病蛋白编 码基因上表位筛选的结果。例如,大量覆盖了整个目标蛋白的多 肽,或其编码的核酸,与载体相融合,给予宿主动物治疗后以激 发其体内的免疫反应。通过测定被免疫动物的抗血清,可以鉴定 表位多肽的免疫原性。装载表位多肽的融合蛋白,或目标异构体 全长蛋白的一个片段,可以通过上述的方法用于检测抗血清的滴 度。基于这些结果可以设计疫苗。特别地,疫苗可以包含多肽或 其编码核酸,它们在宿主动物中已经生产出抗体。特别地,针对 某多肽的高滴度血清表明此多肽具有特别好的免疫原性。几种高 免疫原性的表位,无论其来源于单一目标蛋白异构体或几种蛋白 异构体,都可以被联合选择并应用,作为针对一种给定疾病的联 合疫苗。

为了测定DNA疫苗的效力,该疫苗可以对实验动物模型进 行免疫。在此领域中,针对许多疾病,例如针对人类肿瘤的动物 模型是熟知的。在一个例证中,无论在接受DNA疫苗免疫之前 或之后,该动物将被接种人肿瘤。通过实验动物中肿瘤的减小情 况可以反映该疫苗的保护性或积极效果。不受特异过程的限制, 肿瘤-特异的DNA疫苗可以激发任一或全部身体的免疫反应,例 如,细胞免疫和体液免疫。

这里也提供了一种制备疫苗,如DNA疫苗的方法,以应对 某疾病,包括(1)鉴定疾病相关蛋白的一个或多个表位,(2)制备 包含一个或多个表位的氨基酸序列的多肽,或将编码一个或多个 表位的核酸序列插入一个表达载体。在目标蛋白中鉴定表位的放 债将在此进一步叙述。“疾病相关蛋白”或“与疾病相关的蛋白” 指某些蛋白,通过作用其本身可以进行疾病治疗或预防。

包含至少一个疾病相关蛋白表位,如一个外显子结合点表位 的多肽,及其编码的核酸,也可以被用于治疗的目的。多肽本质 上也可以由疾病相关蛋白表位构成。该表位可以是已经鉴定为疾 病相关的表位。多肽可以用于,例如,疫苗应用,来保护病人, 以使特异表位相关的疾病不再发展。多肽也可以用于疾病患者的 治疗,例如,癌症。这样,如上所述,多肽可以和DNA疫苗以 类似的方法使用。

多肽可以是5到30,5到20,5到15,或5到10个氨基酸 长度。多肽也可以是50个氨基酸长度,或至少40,30,20,10 个氨基酸长度。多肽可以包含单个或多个表位,如2,3,5个表 位。

示范的多肽包含一个表位,如疾病相关表位,其包含在SEQ ID Nos:2,4,6,8,10,11,13,或15-25中的任一个。表位 可以包含SEQ ID Nos:2,4,6,8,10,11,13,或15-25中 任何一个中的外显子结合点区。多肽可以由,或本质上由一个表 位或一个外显子-连接构成。多肽可以包含或本质上由蛋白质上 的表位或外显子-连接构成,此多肽不包含全长蛋白质。

多肽可以有自然-发生的氨基酸,或非-自然发生的氨基酸构 成。可以是D-或L-型氨基酸。多肽的虚拟缩氨酸也可以被使用。 例如,多肽可以包含反相氨基酸。反相氨基酸可以是D镜像体。 不同的氨基酸可以是一个内在多肽,一个附属多肽或一个转运基 团。一个内在的多肽可以包含果蝇触角足蛋白(ant)的42-58位 氨基酸。

多肽可以包含在治疗或药物成分中,包括,例如,治疗性的 可接受载体。一个或多个多肽,或其派生物或类似物可包括在内。 其他分子或试剂也可以包含在复合物中,如提高免疫应答的试 剂。

其他成分,例如,治疗成分,可以包含至少一条核酸,其编 码疾病相关蛋白质异构体,例如,一个疾病相关的外显子结合点 表位。一个核酸的例证是这里所叙述的编码一条多肽的核酸。

一条核酸可以是15到120,或15到90,或15到60,15到 45个核苷酸长度。一条核酸也可以至多为120,90,60,45核苷 酸长度,核酸可以是DNA或修改的DNA。核酸的例证包括,由 SEQ IN Nos:1,3,5,7,9,12所列出的核酸序列本质上构 成或构成的。在特定情况下,核酸可以包含或本质上由SEQ IN D Nos:1,3,5,7,9,12中列出的核酸序列构成,附带条件 为这些核酸不包含SEQ IND Nos:1,3,5,7,9,12中自然- 发生的全长蛋白质。

核酸可以进一步包含一个或多个转录控制元素,如启动子和 终止子。核酸可以是载体,如表达载体。载体可以是病毒载体, 如腺病毒或腺病毒相关病毒(AAV)载体。这里还包括了含有所 述核酸的细胞。

根据标准药物操作,在药物成分中,单独或和药物可接受载 体,赋形剂或稀释液联合使用的治疗方法,可以对哺乳动物,尤 其是人类进行治疗。可以直接对组织,如肿瘤组织进行治疗。可 选地,治疗方法可以通过口服或注射进行,包括静脉内,肌肉内, 腹膜内,皮下,直肠和局部。

治疗方法的毒性和治疗性效果可以通过在细胞培养或实验 动物中进行标准药物程序来测定,例如,测定LD50(50%数量死 亡的剂量)和ED50(50%产生疗效的剂量)。毒性和疗效剂量间的比 例作为治疗指标,可以表示为LD50/ED50的比值。治疗指标较大 的试剂是跟合适的。当具有毒副作用的试剂被使用时,应当注意 设计一种药物传输系统,使试剂准确针对所影响的组织位置,例 如,使对于正常细胞的潜在的损害最小化,从而减少副作用。

在细胞培养方法和动物研究中得到的数据可以用于人的 剂量范围。治疗的剂量最好处在包括ED50并毒性较少或无毒性 的循环浓度范围之内。在此范围内,依赖于剂量形式和治疗的路 径,用药剂量可以有交大变动。

对于任何治疗而言,治疗的有效剂量可以通过最初的细胞培 养实验进行评估。如同在细胞培养中测定,通过动物实验可以得 到剂量,将反映包括IC50的循环血浆浓度范围(例如,获得半 数最高抑制症状的实验治疗浓度)。这些信息可以用于测定人类 精确的起效剂量。

治疗所用的剂量将依赖于所治疗的疾病的程度或情况和其 他临床因素,例如人类或动物的重量和情况及药物治疗的路径。 当对人类和动物进行治疗时,治疗用量可以从0.5mg/千克到500 mg/千克之间。其他的用量范围可以是从1mg/千克到100mg/千克 之间;2mg/千克到50mg/千克之间;2mg/千克到10mg/千克之间。 依赖于治疗药物在特殊动物和人类中的半衰期,治疗的频率可以 是每天数次或每周一次。应用于人类和动物的治疗方法也将需要 了解。单独或联合进行治疗的方法,可以同时地或长时期地进行。

包含药剂的药物成分可以制成适合口服的形式,例如,药片, 片剂,止咳糖,水或油溶液,分散粉末或颗粒,乳剂,硬或软 胶囊,糖浆或西也剂。药物生产商可以通过此领域中熟知的技术 制备用于口服的药物成分,该药物成分可以选择包含以下试剂: 甜味剂调味剂,增色剂,保存剂,以使药物更优化及具备良好 口感。无毒的适合于药物制备的药物可接受赋形剂,可与活性成 分(例如治疗剂)联合包含在药片中。这些赋形剂可以是例如, 惰性稀释液,如碳酸钙,碳酸钠,乳糖,磷酸钙或磷酸钠;粒化 和崩解剂,如微结晶纤维素,交联羧甲基纤维素钠,玉米淀粉, 或褐藻酸;结合剂,如淀粉,凝胶,聚乙烯吡咯烷或阿拉伯树 胶,和润滑剂,例如,硬脂酸酶,硬脂酸和母。药片可以是裸 露的或用此领域中熟知的技术进行包裹,以避免药物的不好的口 感,或减缓其在肠胃中的分解和吸收速度,使其发挥长期的稳定 效力。例如,水溶性味道屏蔽材料如hydroxypropylmethl-纤维 素或羟丙基纤维素或缓释试剂如乙基纤维素,乙酸丁酸纤维素都 可以被使用。

为制备药剂的口服形式,可以将药物活性成分与固体稀释剂 混合并包裹在硬凝胶胶囊中,固体稀释剂的例子有,碳酸钙,磷 酸钙或瓷土,或将活性成分与水溶性载体混合并包裹在软凝胶胶 囊,水溶性载体的例子有聚乙二醇或油介质,例如花生油石蜡 油,或橄榄油。

水悬液中可以包含与赋形剂混合的活性材料,使之适合于水 悬液的生产。这些赋形剂是悬浮试剂,例如羧甲基纤维素钠,甲 基纤维素,羟基甲基纤维素-纤维素,藻酸钠,聚乙烯吡咯烷酮, 黄芪树胶,阿拉伯树胶;分散剂或湿润剂事业是自然发生的磷脂, 例如卵磷脂,或氧杂环烷脂肪酸的浓缩产物,例如聚氧乙烯硬脂 酸盐,或带有长链脂肪乙醇的环氧乙烷浓缩产物,例如heptadec aethylene-oxycetanol,或来源于脂肪酸的部分醇化的环氧乙烷浓 缩产物,及己糖醇,例如聚氧乙烯山梨醇油基化合物,或来源于 脂肪酸和己糖醇酐的部分醇化的环氧乙烷浓缩产物,例如聚乙烯 山梨聚糖油酸基化合物。水悬液还可以包含一种或多种防腐剂, 如乙烷基,或n-苯基p-羟基安息香酸盐,一种或多种增色剂, 一种或多种调味剂,及一种或多种甜味剂,如蔗糖,糖精或天() 冬氨酰苯丙氨酸甲酯。

油悬液可以通过将活性药物成分悬浮在植物油中制成,例如 花生油,橄榄油,芝麻油或椰子油,或在矿物油如液体石蜡中制 成。油悬液可以包含增稠剂,如蜂蜡,硬石蜡或十六(烷)醇,。上 述的甜味剂,及调味剂也可以加入其中使其具备较好的口感。这 些成分可以通过加入抗-氧化剂,如丁基化羟基苯甲醚或α-维生 素E。

分散粉末和颗粒通过水的加入,使之适合于水悬液的制备, 并提供了与分散剂或湿润剂,悬浮剂和一种或多种防腐剂相混合 的活性成分。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂的例子在前面已经 叙述了。更多的赋形剂,如甜味剂,调味剂和着色剂,也可以使 用。这些成分可以通过加入抗-氧化剂如抗坏血酸维生素C进行 储存

药物成分可以以水包油乳剂的形式存在,油相可以是植物 油,如橄榄油或落花生油,也可以是矿物油,如液体石蜡或其混 合物。合适的乳化剂可以是自然-产生的磷脂,如大豆卵磷脂, 从脂肪酸或己糖醇酐中提取的脂或偏脂,如山梨聚糖油酸基化合 物,和上述的偏脂与环氧乙烷的浓缩产物,如聚氧乙烯山梨糖醇 酐单油酸酯。乳剂也可以包含甜味剂,调味剂,防腐剂和抗氧化剂。

糖浆和西也剂可以制成甜味剂,例如丙三醇,丙烯丙三醇, 山梨(糖)醇或蔗糖。这些配方也可以包含缓和剂,防腐剂,调味 剂和着色剂,抗氧化剂。

药物成分可以是注射的无菌水溶液形式。可接受的介质和溶 剂是水,Ringer’s液,等渗氯化钠溶液。

无菌的注射制备物也可以是水包油微乳液,其中活性药物成 分溶解在油相中。例如,活性药物成分首先溶解在大豆油和卵磷 脂混合物中。油相被加入水和甘油混合物,并被制成微乳化剂。

注射溶液或微乳化剂可以通过局部注射进入病人的血液。可 选地,通过某种方法给予病人溶液或微乳化剂的治疗,使其混合 物保持一个恒定的循环浓度,将是更适合的。为了维持这一恒定 浓度,可以使用一种连续的静脉内输送装置。示例是Deltec CA DD-PLUSTM 5400型静脉内

药物成分可以制成注射水剂或油悬液用于肌肉内或皮下注 射。这种悬液可以通过此领域中熟知的方法,利用上述合适的分 散剂或湿润剂,悬浮剂,进行配制。这种无菌的注射制备物可以 是一种含有无菌注射溶液或悬液的无-毒素、注射-可接受的稀释 液或溶剂,例如含有溶液的1,3-丁烷二醇。此外,无菌,不易 发挥的油通常作为溶剂或悬液被使用。基于此目的,任何柔和的 不挥发油都可以被利用,包括合成的单一或二倍甘油酯。此外, 脂肪酸乳油酸也可用于注射剂的制备。

治疗剂也可以药栓形式在直肠内给予药物治疗。这些成分可 以通过将药物和合适的非-刺激性赋形物混合制备,该赋形物在 通常温度下是固态,而在直肠内的温度下是液态,从而在直肠内 可融化并释放药物。这些材料包括可可油,甘油凝胶,氢化蔬菜 油,大量不同分子量的聚乙二醇和聚乙二醇脂肪酸脂混合物。

基于局部应用,包含治疗剂的奶油,油膏,凝胶剂,溶剂或 悬浮剂等都可以被使用。对于此应用的目的,局部应用包括口腔 洗剂和含漱剂。

治疗剂可以鼻内吸收的形式给予治疗,通过合适的鼻内介质 或输送装置在鼻内使用,或通过使用这些此领域熟知的透皮小片 进行透皮吸收。为了以这种透皮输送系统形式进行治疗,治疗的 剂量,当然,在剂量控制过程中其持续性要强于间歇性。

这里使用的术语“成分”规定为包括一种产物,其包含了特 定有效成分的特定数量,如同任何产品,其源于特定量的特定的 有效成分相结合的,直接或非直接的结果。

一种试剂或成分,例如,一种治疗成分,可以被包含在一种 装置中,使试剂可以用于病人的治疗,例如,注射器支架或管 子。

治疗方法可以包括给予病人注射药剂,该病人被检测为患有 特殊的疾病相关蛋白质异构体引起的疾病。此方法包括首先对病 人进行诊断,确定其是否患有可用这里所述方法进行治疗的疾 病,例如,癌症。包括这里所述的诊断方法都可以被使用。

诊断应用

抗体可以应用于诊断方法,以测定例如,在特定细胞,组织, 或体液如血清中的抗原。在某一方面,一份生物学样本从患有或 怀疑患有疾病(例如癌症)的病人身上获得,并且测定一种或 多种癌症相关蛋白质异构体的含量。癌症相关的异构体的含量可 以表明病人患有或容易患有癌症。相似地,抗体可以用于测定在 病人中或体内任何组织或细胞或样本中病原体的含量。

诊断方法包括使用两中或更多抗体,其中,例如,仅有一种 抗体特异针对疾病-相关蛋白,对于特异地清楚第诊断是不充足 的。可选地,一种抗体可以是特异针对疾病相关蛋白质异构体的, 第二种抗体是特异针对蛋白质正常形态的,其由编码疾病相关蛋 白质异构体的同一基因编码。在样本测定中,两种或更多抗体可 以同时或分别使用。

在“治疗剂”章节中叙述的同样的抗体和其他试剂可以用于 诊断实验。

此领域中许多熟知的诊断实验技术都可以使用,如在异源或 同源情况下操作的竞争结合实验,直接或非直接三明治实验和免 疫沉淀反应。(Zola,Monoclonal AntibodiesL a Manual of techni ques,CRC Press,Inc.91987)pp.147-158)。免疫组化测定,例如, 对于外科手术样本或活组织的检查也可以进行。此外,在体外实 验中,如MRI,CAT扫描,PET扫描,电子束CT扫描,SPECT 成像,γ成像,血管造影术,血管内超声正电子放射X线断层 摄影术(Renee M Moadel,et al.,Breast Cancer Res 2003,5:R1 99-R205),放射性或荧光检测也可以是诊断方法的一部分。

                                      「以用检测基团

如上所述,用于诊断实验的抗体或其他试剂可,可检测的信 标记。该检测基团应该能够产生,无论直接或间接性同位素,如 号。例如,检测基团可以是上述的一种,一种放射物,如异硫氰 3H,14C,32P,35S,125I,一种荧光或化学发光复合性磷酸酶,β 酸荧光素,若丹明,或虫萤光素,或一种酶,如碱抗体于检测基 -半乳糖苷酶或辣根过氧(化)物酶。此领域中任何以及Hunter et 团连接的方法都可以应用,包括这里叙述的方法nistry,13:1014 al.,Nature,144:945(1962);David et al.,Biochegnl);Nygren,J. (1974);Pain et al.,J.immunol.Meth.,40:219(1981)。 Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)中所论述的

诊断方法包括将病人的生物样品与一种试剂向连接,该试剂 可以特异结合疾病相关蛋白质异构体,随后测定该试剂和生物样 品的结合情况,当结合发生时则表明存在疾病相关蛋白质异构 体,因此病人患有或容易患有该疾病。

测定样品(例如,一种生物样品如体液或细胞或组织)中抗 原的存在情况的方法,包括(1)在适合抗原/抗体复合物形成的 条件下,将样本与固相连接,该固相表面包含固定于特定位置的 抗体集合物,(2)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下,将融合 蛋白集合物与固相表面相连,每一个融合蛋白包含一个与固相表 面的抗体特异接合的多聚肽,以及一个载体蛋白,(3)测定固相 表面的每一个特定位置上载体蛋白的存在情况,若在某特定位置 有载体蛋白的缺失或减少,则表明具有在特定位置与抗体接合的 抗原,即表明样本中具有抗原。该固相表明可以是抗体阵列,其 已有商业化供给或通过此领域中的方法制备。固相表明可以包含 至少10,100,1000,10000,100000个抗体。具备该领域技术 的人员可以识别其他与抗体相似的可以使用的分于,假若该分子 可特异结合蛋白质。图3显示了一个示范性的方法。固相表明可 以包含特异结合一种抗原,或不同抗原的抗体的集合物。抗原可 以是疾病-相关抗原,如癌-相关或病原体相关抗原。

除抗体之外,其他分子或分子复合物或试剂,只要其特异识 别疾病相关蛋白质异构体,都可以用于诊断实验。示例的试剂, 如多肽或其派生物,例如,虚拟缩肽,在这里将进一步叙述。

抗体也可以用于从重组细胞培养物中或自然源中亲和纯化 抗原。此过程中,运用此领域中熟知的方法,抗体将被固定在合 适的支持物上,如交联葡聚糖树脂或滤纸。固定的抗体接着与含 有将纯化抗原的样品接触,接着该支持物用合适的溶液冲洗,去 除样品中除抗原外的其他与固定抗体结合的物质。最后,该支持 物用另一种冲洗,使抗原从抗体上释放出来。

Kits

目前的发明提供了试剂盒,如诊断和治疗试剂盒,以及制备 和/或筛选抗体的试剂盒。例如,一种试剂盒可以包含一种或多种 成分,例:一种药物成分,如这里所述以及可选地说明其用途。 试剂盒还可以包含一种或多种装置来完成这些成分的治疗过程。 例如,一种试剂盒主体可以包含一种药物成分和注射器或导管, 以完成药物对于肿瘤的动脉直接注射。在另一方面,试剂盒主体 可以包含预-灌装安瓿瓶,其中含有蛋白异构体的特异抗体结构, 可选地做成药物或冻干形式,并通过输送装置使用。

试剂盒可以包含带有标签的容器。合适的容器包括,瓶子, 小瓶,和试管。容器可以由多种材料制备成,如玻璃或塑料。容 器可以装有一种药物成分,包括有效进行治疗或非-治疗应用的 抗体,如上所述。容器上的标签能表明药物成分的特殊治疗或非 -治疗应用,也可以表明其体内或体外的应用方法,如上所述。 试剂盒可以包含一种上述的容器,和一种或多种其他容器,其含 有适合于商业或使用者的标准的材料,如缓冲液,稀释液,滤器, 针,注射器,和含有说明书的包装盒。

一个示范性的试剂盒是治疗或诊断试剂盒,其包含一种包括 了外显子结合点的的表位的抑制子,例如,该表位被鉴定为疾病 相关的表位。

该发明已经进行了概括性的描述,参考下列的例子将加深对 此发明的理解,这些例子仅出于说明此发明的某一特定方面和情 况的目的,并非意图限定该发明。

范例

例1:制备特异结合VEGF的疾病相关异构体的单克隆抗体

血管内皮生长因子(VEGF)已经被鉴定为在生理和病理情 况下介导血管生成的一种重要的因素。人VEGF基因由8个外显 子构成,对应于下列cDNA的核酸序列,其来源于GenBank Ac cession Number P15692和NM_003376,及专利SEQ ID NO:14.。 SEQ ID NO:14编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:15列出。

人VEGF编码序列

                 NT

外显子1:        1-66           23aa

外显子2:        67-108         14aa

外显子3:        109-315        69aa

外显子4:        316-392        25aa

外显子5:        393-42         10aa

外显子6:        423-542        40aa

外显子7:        543-674        44aa

外显子8:        675-69         24aa

总和                            231aa

信号肽                          26aa

通过选择性拼接,至少4中VEGF的异构体被发现,分别包 含206,189,165,121氨基酸,表示为VEGF206,VEGF189, VEGF165,VEGF121。形态206,165,121的阵列在图4中表示。 4种异构体共享VEGF同样的155个N末端氨基酸残基。在生物 药效率上不同于VEGF165和VEGF121,较长的形态(VEGF206 和VEGF189)是矩阵绑定,较短的形态是可自由扩散的。这些 形态表达的位置是多变的:VEGF165和VEGF121在肺癌和结肠 中表达量显著提高;VEGF189在正常肺中表达;VEGF206作为 precursor,在任何组织中都难以检测到(Houck K A,Ferrara N, Winer j,Cachianes G,Li B,Leung DW.,Mol Endocrinol.1991 Dec;5(12)L1806-14))。VEGF165和121的核酸序列由基因库 提供,编号为AAM0318/AF486837-1和AAF19659/AF214570-1。

绑定在癌组织中表达的两种异构体的单克隆抗体的制备见 下面(图5)。两种异构体的每种核酸核酸序列将与编码鼠SEAP 的核酸序列一起插入表达载体。对VEGF-165特异抗体而言,5’ cta tct cgt tct gtt ctt tta ggg aca ccc gga acg agt ctc 3’(SE Q ID NO:1)编码下列的氨基酸序列:DRARQE/NPCGPCSE(SE Q ID NO:2);对VEGF-121特异抗体而言,5’cta tct cgt tct gtt ctt ttt aca ttc ggc tcc gcc 3’(SEQ ID NO:3)编码下列氨基酸 序列:DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO:4)。/代表2个外显子之 间的连接位点。融合蛋白或是SEAP多肽或是多肽SEAP。这些 序列的变异体也能被使用,如环绕外显子结合点的但是与所列序 列有一或更多个氨基酸不同的序列,尤其是在N和C末端。异 构体的氨基酸序列在图4列出,任何环绕在外显子结合点的序列 能被使用,如包括在连接处末端或其他位置的3,5,7,10或1 5个氨基酸序列。

根据标准步骤载体被转染入鼠。选则性地,包括连接SEAP 的VEGF多肽的蛋白质能在COS细胞中合成并注射入老鼠。抗- 血清滴度在免疫后一到两周时被测定。具有高滴度的动物被用于 分离脾细胞。用脾细胞和骨髓瘤细胞纸币肿瘤细胞将根据标准操 作程序进行。

利用高通量ELISA方案,存在于杂交瘤细胞培养上清的抗体 将被测定其抗原结合情况。相应地,96孔培养板中杂交瘤的培养 上清被转移至96-孔或384-孔化验板,其中预先-包含了羊抗-鼠I gG(或兔抗-鼠)。在384-孔规格下,每次实验可使用5到10微升 的培养基。在室温下孵育30分钟后,化验板将被冲洗去除未结 合的抗体。SEAP-表位融合蛋白将被加入孔中并在室温下孵育30 分钟。未结合的SEAP-表位融合将被清洗。抗原-抗体结合情况 将通过加入碱性磷酸酶底物并在检测器上测量进行测定。高SE AP活性表明存在识别VEGF表位的抗体。

抗-VEGF165和-121抗体将通过标准免疫化学方法证实,如 利用重组VEGF-165和VEGF-121蛋白进行的Western blotting。 抗VEGF-165预期将特异结合VEGF-165,但不与其他VEGF异 构体结合,如VEGF-121和全长VEGF206。抗VEGF-121预期将 特异结合VEGF-121,但不与其他VEGF异构体结合。

这些抗体可用于测定从培养的肿瘤细胞系中,如非-小细胞肺 癌,和冻肿瘤组织切片中制备的蛋白质样品,例如,通过肿瘤 组织冰冻切片上的免疫-组化实验。根据先前叙述的程序,抗体 的生物学活性可以通过内皮细胞中有丝分裂发生实验测定(Hira tska et al.Proc Natl.acad.Sci.WSA.95:9349-54(1998),Shibu ya et al.Curr Top In Micro & Immu.237:59-83(1999))。具有中 和活性的抗-VEGF165或-121抗体可以抑制内皮细胞中VEGF介 导的功能。

例2:制备包含VEGF疾病相关异构体的DNA疫苗

带有上述的特异表位序列的针对VEGF165和VEGF121的D NA疫苗可以在实验动物中开展。原则上,编码特异表位的寡聚 核酸将被插入表达载体,并在体内产生分泌多肽。表达载体可以 包含一个编码序列,其编码的分泌蛋白作为一种载体蛋白可以促 进表位多肽的表达和/或分泌。载体蛋白的选择可以是血清白蛋白 或其他分泌多肽,或细胞因子。针对给定疾病的DNA疫苗,例 如结肠癌,其构成的表位序列可以来源于VEGF-165,寡聚核酸: 5’gat aga gca aga caa gaa aat ccc tgt gg cct tgc tca gag 3’(S EQ IN NO:1)编码以下氨基酸序列:DRARQE/NPCGPCSE(SEQ ID NO:2);以及来源于VEGF-121,寡聚核酸:5’gat aga gca aga caa gaa aaa tgt gac aag ccg agg cgg3’(SEQ ID NO:3)编 码以下氨基酸序列:DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO:4),“/” 表示两个外显子之间的结合位点。这些不同的序列也可以被使 用,例如:编码连续氨基酸的序列形成的外显子结合点,但与这 里所列的序列有一个或多个核酸的不同,特别是在5’和3’末 端。人VEGF的核酸序列见SEQ ID NO:14(GenBank Accession No.NM_003376),及任何编码包含外显子结合点连续氨基酸的序 列都可以使用,例如,在连接的一端或另一端包含10,20,30, 或50个核苷酸的序列。

如前所述,针对癌症相关VEGF异构体的DNA疫苗作为血 管生成抑制子可以在动物模型中进行试验。特别地,这些抗-VE GF异构体疫苗将用于给定的人肿瘤转移试验,针对VEGF165和 121异构体中的任一种或两种进行治疗。理想地,这些抗-VEGF 异构体疫苗可以用于早期诊断肿瘤病人的治疗,通过抑制血管生 成因子如VEGF165和/或VEGF121的活性,而阻止肿瘤的扩散。

例3:特异结合ErbB-2疾病相关异构体的单克隆抗体的制备

大量的抗-ErbB-2(鼠蛋白)或抗-Her2(人蛋白)抗体已经 被分离,其中一种抗体,4D5,是一种鼠科抗体,其用于产生治 疗性的人源化形式抗体herceptin。这中人源化的抗体已经证明其 在治疗转移性乳腺癌中的效果(Schaller et al.J.Cancer Res.Cl in.Oncol.125:520(1999)和Shak et al.Herceptin Multinational Investigator Group.Semin Oncol.26:71(1999))。然而,既然c- erbB-2也显示了在其他组织中的生理功能,针对HER2抗体的副 作用包括心力衰竭,其是许多死亡的起因(Horton et al.Cancer Control.9(6):499-507(2002)。具报道,4D5的表位存在于胞外 区域(ECD)529-627氨基酸之间(Sliwkowski et al.Semin On col.26:60(1999)。Her2(或HER2)的核酸序列在GenBank编号PO 4626和NM_004448及有提供。SEQ IN NO:16编码的氨基酸序 列罗列于SEQ IN NO:17。

针对Her2疾病相关异构体单克隆抗体的制备方法如下。为 了针对特殊的在其ECD缺少16个氨基酸的HER2-拼接异构体 (氨基酸634到649)(“拼接”或“HER2拼接异构体1”),下列 序列将被作为多肽使用:INCTHS/PLTS(SEQ ID NO:6)(”/”表示 外显子结合点)。为了针对特异的在ECD缺失12个氨基酸的HE R2(ECD DEL)异构体(氨基酸636到647)(“ECD DEL”或“H ER2拼接异构体2”),下列序列将被作为多肽使用:CTHSCV/A SPLT(SEQ ID NO:8)(“/”表示外显子结合点)。这些序列的变异 体也能被使用,如包含一个外显子结合点,但与这里所列的序列, 特别是在N-和C-末端有一个或多个氨基酸不同的序列。人HER 2的氨基酸序列罗列于SEQ ID NO:17并在图8中表示,并且包 含一个外显子结合点的序列都可以被使用,例如,包含结合点的 某端或另一端的3,5,7,10,或15个氨基酸的序列。

如上所述,单克隆抗体可以按照VEGF抗体的方法得到,无 论通过杂交瘤技术或噬菌体显示技术。

HER2多肽的抗体将被测试其针对HER2异构体的特异性: 抗体将预期结合两种表达两升高的异构体,而不结合野生型或其 他HER2异构体。抗-HER2(拼接)和抗-HER2(ECD DEL)将在来 源于乳腺癌的肿瘤组织芯片和非-小细胞肺癌细胞上进行试验。 这些肿瘤细胞表达HER2(拼接)和/或HER2(EDC DEL),通过免疫 -组化试验测定抗体的正信号。正常组织入心脏组织应该不表达 这些HER2的变异的异构体。HER2异构体的特异抗体的中和活 性可以根据先前所述的测序,在动物模型中进行检测。(Schaller et al.J.Cancer Res.Clin.Oncol.125:520(1999))。

例4:ErbB-2疾病相关异构体DNA疫苗的制备

针对HER2(拼接)和/或HER2(EDC DEL)的DNA疫苗可以用 于乳腺癌和卵巢癌的治疗和预防,如同上述的抗-VEGF异构体疫 苗。包含以下核酸序列的DNA载体将被制备:5’atc aac tgc a cc cac tcc/cct ctg acg tcc3’(SEQ IN NO:5)(HER2拼接)和5’t gc acc cac tcc tgt gtg/gcc agc cct ctg acg3’(SEQ ID NO:7) (HER2 ECD DEL)。这些序列的变体也可以使用,例如,编码连 续氨基酸的一个外显子结合点的序列,但与这里所列的序列有一 个或多个核苷酸的不同,特别在5’和3’端。人HER2核酸序列 罗列于SEQ ID NO:14(GenBank编码NM_004448),任何包含 一个外显子结合点的编码连续氨基酸的序列都可以使用,例如, 在junction某端或另一端包含1O,20,30,50个核苷酸的序列。

此疫苗可以在抑制的动物模型中试验。

例5:特异结合前列腺特异抗原(PSA)的前列腺癌相关异

            构体的单克隆抗体的制备

PSA,其由hKLK3基因编码,是用于针对和监控前列腺癌病 人最有力的工具。然而,它的弱点在大量报道中已有体现(见, 例如,Stamey.T.A.N Eng.J.Med,317:909-917(1987);Arai);Arai,., J.Urol.,144:1415-1419(1990);Catalona,W.J.,Eng.J.med,324:115 6-1161(1987);Heuze-Vourc’h,N,Eur J Biochem 268(16);4408-13(2 001);tanaka,T,Cancer Res.60(1):56-9(2000);Heuze Vourc’h, N,Eur J Biochem 270(4):706-14(2003))。作为差别抗原最佳特 点,PSA不是一种肿瘤-特异蛋白。PSA作为与几种分子混合的 形式存在于血清中。hKLK3基因的选择性拼接导致在良性和恶 性前列腺肿瘤中自由-PSA的分子异质性。特定的拼接形式显示 了其于前列腺癌的密切相关性。(见Tanaka.T,Cancer Res.610 (1):56-9(2000);Heuze-Vourc’h,N,Eur J Biochem 270(4):706-14(20 03))。这些PSA的分子类型可用于更好的诊断产品和治疗药物。

特异识别一种特殊的PSA异构体的单克隆抗体可通过下列 方法制备。该PSA异构体是选择性拼接的结果,其从成熟PSA 上缺失了44个氨基酸(氨基酸45-88)。异构体PSA-delta44的表 位设计如下所示。为了绑定PSA-delta44的异构体,缺失的结合点 生成序列作为多肽AHCIR/KPGDD(SEQ ID NO:10)或HCIR/KP GDDS(SEQ ID NO:11)被使用(“/”代表结合点)。多肽与载体蛋 白结合。结合的多肽通过杂交瘤技术或抗菌素显示技术作为免疫 原产生单克隆抗体。

此外,编码上述氨基酸序列的核酸将合成:5’gcc cac tgc atc agg/agg cca ggt gat gac 3’(SEQ ID NO:9)。合成的寡核酸 链被绑入表达载体产生带有PSA-delta44的表位的融合蛋白和载 体蛋白。这样的表达载体表达的融合蛋白,如多肽(HCIR/KPG DDS)-SEAP能用于免疫老鼠产生杂交瘤。特异识别PSA-delta4 4的单克隆抗体根据阳性绑定免疫原多肽(HCIR/KPGDDS)-SE AP被筛选。SEAP读出器提供被抗原绑定的PSA-delta44表位的 阳性测定。

这一领域的技术人员认可这些序列的变异体能被使用,如 基于人PSA的核酸和氨基酸序列,其PSA的人mRNA的原始序 列的基因库的编码为X05332和蛋白质的原始序列为CAA28947。 这些序列分别列在SEQ ID NO:18和19中。

绑定PSA的特异抗体的异构体由前列腺癌病人的血清样本 被确认。从健康组获得的血清样本用于作为阴性对照。

正常的PSA(划线部分表示在PSA-delta44中缺失的范围。)

PSA-delta44(黑体字母表示绑定PSA-delta44的抗体的表位。 字母间的“/”表示缺失后的间接位点。)

例6:特异绑定PDGFRβ融合蛋白的单克隆抗体的制备

这个例子描述了另一种ADAPI抗体,其作为一种治疗性的 试剂能用于绑定引起恶性疾病的蛋白质突变体,这些恶性疾病与 编码血小板起源生长因子β受体,PDGFRβ的基因中染色体的移 位有关。染色体移位,包括band 5q31-35(其属于PDGFRβ基 因定位处)出现某些血液类疾病。如PDGFRβ/HCMOGT-1t(5; 17)(q33;p11.2)的移位被发现出现在青少年脊髓(炎)白血病中 (Morerio C.等人,2004 Cancer Research 64:2649-51)。在急性 骨髓性的白血病(AML)中,作为染色体移位(q33;q32)的结 果,PDGFRβ与CEV14形成融合蛋白(Abe A等人,1997 Blo od 90:4271-77)。

CEV14-PDGFRβ融合基因被发现与攻击性白血病进程相 关,这就表明这种融合蛋白有致瘤的潜能。

CEV14-PDGFRβ,t(5;14)(q33;q32)融合基因在AML 病人的复发阶段出现,这种病人在起始的诊断中只有单独的染色 体移位,t(7;11)。在CEV14-PDGFRβ,t(5;14)(q33;q3 2)融合基因出现后,标记嗜曙红血球增多的白血病进程,结合 染色体治疗是无效的。DNA分析显示,在5q33位置PDGFRβ 基因的重组并不出现在初始诊断中。这种移位导致异常的转录, 使在5q33的PDGFRβ基因与位于14q32的新基因CEV14融合。

用于治疗和诊断的ADAPI抗体,能基于围绕在融合基因CE V14-PDGFRβ,t(5;14)(q33;q32)的断裂点的编码序列生 长。这种抗体特异识别融合蛋白CEV14-PDGFRβ能对AML有 特异的治疗作用。针对CEV14-PDGFRβ抗体的抗原决定簇序列 可以用30个邻近的核酸序列或10个包括下列融合蛋白CEV14- PDGFRβ区域的断裂点序列的氨基酸序列构建。(融合蛋白的断 裂点用“/”表示):

在CEV14和PDGFRβ融合蛋白之间的核酸序列(CEV14在 左或上游或5’末端;PDGFRβ在右或下游或3’末端):

AGA AGA AAT TGA AGA ACT TAA AAG ACA AA/C CTT GCC CTT TAA GGT GGT GGT GAT CTC(SEQ ID NO: 14)

在CEV14和PDGFRβ融合蛋白之间的氨基酸序列:EQIEE LKR QT/LPFKVVVIS(SEQ ID NO:15)

目前的发明将需要试验,除非有细胞生物学,细胞培养,分 子生物学,转基因生物学,微生物学,DNA重组和免疫学的常 用技术指导并且在这一领域的技术之内。这些技术都在文献有所 描述。见如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed., ed.by Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989);DNA Cloning,Volumes I and II (D.N.Glover ed.,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed, 1984);Mullis et al.U.S.Patent No:4683195;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,inc.,N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enaymology,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press, London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volume I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);Antibodies:A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed. (1987),Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。

参考整合

所有这里涉及的出版物,基因库编码和专利作为整体被参考 整合,正如通过参考整合每一单独的出版物或专利被特定地和单 独地阐明。以免争议,目前的应用,包括定义都受控制。

等效性

尽管主体发明的特定方面已经被讨论,但是上述特例只具阐 述性并无限制性。发明的许多变更将明显变为这一领域的技术, 通过上面说明的评论和下面的声明。发明的整个范围和整个等效 性的范围和说明书及变异体将通过参考声明被定义。

                                 序列表

<110>常小迦

<120>基于VEFG,HER-2,PSA蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂

<130>IGA-003.25

<160>6

<170>PatentIn version 3.0

<210>14

<211>1723

<212>DNA

<213>homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(1039)..(1686)

<400>14

tcgcggaggc ttggggcagc cgggtagctc ggaggtcgtg gcgctggggg ctagcaccag     60

cgctctgtcg ggaggcgcag cggttaggtg gaccggtcag cggactcacc ggccagggcg    120

ctcggtgctg gaatttgata ttcattgatc cgggttttat ccctcttctt ttttcttaaa    180

catttttttt taaaactgta ttgtttctcg ttttaattta tttttgcttg ccattcccca    240

cttgaatcgg gccgacggct tggggagatt gctctacttc cccaaatcac tgtggatttt    300

ggaaaccagc agaaagagga aagaggtagc aagagctcca gagagaagtc gaggaagaga    360

gagacggggt cagagagagc gcgcgggcgt gcgagcagcg aaagcgacag gggcaaagtg    420

agtgacctgc ttttgggggt gaccgccgga gcgcggcgtg agccctcccc cttgggatcc    480

cgcagctgac cagtcgcgct gacggacaga cagacagaca ccgccccaag ccccaagctac   540

cacctcctcc ccggccggcg gcggacagtg gacgcggcgg cgagccgcgg gcaggggccg    600

gagcccgcgc ccggaggcgg ggtggagggg gtcggggctc gcggcgtcgc actgaaactt    660

ttcgtccaac ttctgggctg ttctcgcttc ggaggagccg tggtccgcgc gggggaagcc    720

gagccgagcg gagccgcgag aagtgctagc tcgggccggg aggagccgca gccggaggag    780

ggggaggagg aagaagagaa ggaagaggag agggggccgc agtggcgact cggcgctcgg    840

aagccgggct catggacggg tgaggcggcg gtgtgcgcag acagtgctcc agccgcgcgc    900

gctccccagg ccctggcccg ggcctcgggc cggggaggaa gagtagctcg ccgaggcgcc    960

gaggagagcg ggccgcccca cagcccgagc cggagaggga gcgcgagccg cgccggcccc   1020

ggtcgggcct ccgaaacc atg aac ttt ctg ctg tct tgg gtg cat tgg agc    1071

                    Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser

                    1               5                   10

ctt gcc ttg ctg ctc tac ctc cac cat gcc aag tgg tcc cag gct gca    1119

Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala

            15                  20                  25

ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc    1167

Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe

        30                  35                  40

atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg    1215

Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val

    45                  50                  55

gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac atc ttc aag cca    1263

Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro

60                  65                  70                  75

tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag ggc    1311

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly

                80                  85                  90

ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg    1359

Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met

            95                 100                 105

cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta    1407

Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu

        110                 115                 120

cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca aag aaa gat aga gca aga caa    1455

Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln

    125                 130                 135

gaa aaa aaa tca gtt cga gga aag gga aag ggg caa aaa cga aag cgc    1503

Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg

140                 145                 150                 155

aag aaa tcc cgg tat aag tcc tgg agc gtt ccc tgt ggg cct tgc tca    1551

Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser

                160                 165                 170

gag cgg aga aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt    1599

Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys

            175                 180                 185

tcc tgc aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg cag ctt gag tta    1647

Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu

        190                 195                 200

aac gaa cgt act  tgc aga tgt gac aag ccg agg cgg tga gccgggcagg    1696

Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

    205                 210                 215

aggaaggagc ctccctcagg gtttcgg                                      1723

<210>15

<211>215

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>15

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1               5                   10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

    130                 135                 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145                 150                 155                 160

Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His

                165                 170                 175

Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr

            180                 185                 190

Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys

        195                 200                 205

Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

    210                 215

<210>16

<211>4530

<212>DNA

<213>homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(151)..(3918)

<400>16

aattctcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg agggcgcgcg     60

cccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccgg    120

agccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc     174

                                 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg

                                 1               5

tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa      222

Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln

    10                  15                  20

gtg tgc acc ggc aca gac atg aag ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag      270

Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu

25                  30                  35                  40

acc cac ctg gac atg ctc cgc cac ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg      318

Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val

                45                  50                  55

cag gga aac ctg gaa ctc acc tac ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc      366

Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser

            60                  65                  70

ttc ctg cag gat atc cag gag gtg cag ggc tac gtg ctc atc gct cac      414

Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His

        75                  80                  85

aac caa gtg agg cag gtc cca ctg cag agg ctg cgg att gtg cga ggc    462

Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly

    90                  95                  100

acc cag ctc ttt gag gac aac tat gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga    510

Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly

105                 110                 115                 120

gac ccg ctg aac aat acc acc cct gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc    558

Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly

                125                 130                 135

ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg    606

Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly

            140                 145                 150

gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag ctc tgc tac cag gac acg att ttg    654

Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu

        155                 160                 165

tgg aag gac atc ttc cac aag aac aac cag ctg gct ctc aca ctg ata    702

Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile

    170                 175                 180

gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag    750

Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys

185                 190                 195                 200

ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt tct gag gat tgt cag agc ctg acg    798

Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr

                205                 210                 215

cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc    846

Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro

            220                 225                 230

act gac tgc tgc cat gag cag tgt gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag    894

Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys

        235                 240                 245

cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc cac ttc aac cac agt ggc atc tgt    942

His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys

    250                 255                 260

gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc acc tac aac aca gac acg ttt gag    990

Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu

265                 270                 275                 280

tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg   1038

Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val

                285                 290                 295

act gcc tgt ccc tac aac tac ctt tct acg gac gtg gga tcc tgc acc    1086

Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr

            300                 305                 310

ctc gtc tgc ccc ctg cac aac caa gag gtg aca gca gag gat gga aca    1134

Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr

        315                 320                 325

cag cgg tgt gag aag tgc agc aag ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt    1182

Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly

    330                 335                 340

ctg ggc atg gag cac ttg cga gag gtg agg gca gtt acc agt gcc aat    1230

Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn

345                 350                 355                 360

atc cag gag ttt gct ggc tgc aag aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt    1278

Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe

                365                 370                 375

ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc    1326

Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu

            380                 385                 390

cag cca gag cag ctc caa gtg ttt gag act ctg gaa gag atc aca ggt    1374

Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly

        395                 400                 405

tac cta tac atc tca gca tgg ccg gac agc ctg cct gac ctc agc gtc    1422

Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val

    410                 415                 420

ttc cag aac ctg caa gta atc cgg gga cga att ctg cac aat ggc gcc    1470

Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala

425                 430                 435                 440

tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc    1518

Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg

                445                 450                 455

tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga ctg gcc ctc atc cac cat aac acc    1566

Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr

            460                 465                 470

cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac    1614

His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn

        475                 480                 485

ccg cac caa gct ctg ctc cac act gcc aac cgg cca gag gac gag tgt    1662

Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys

    490                 495                 500

gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc    1710

Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys

505                 510                 515                 520

tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg    1758

Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg

                525                 530                 535

ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg    1806

Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg

            540                 545                 550

gag tat gtg aat gcc agg cac tgt ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag    1854

Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln

        555                 560                 565

ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt ttt gga ccg gag gct gac cag tgt    1902

Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys

    570                 575                 580

gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc    1950

Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys

585                 590                 595                 600

ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt    1998

Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe

                605                 610                 615

cca gat gag gag ggc gca tgc cag cct tgc ccc atc aac tgc acc cac    2046

Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His

            620                 625                 630

tcc tgt gtg gac ctg gat gac aag ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc    2094

Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala

        635                 640                 645

agc cct ctg acg tcc atc gtc tct gcg gtg gtt ggc att ctg ctg gtc    2142

Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val

    650                 655                 660

gtg gtc ttg ggg gtg gtc ttt ggg atc ctc atc aag cga cgg cag cag    2190

Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln

665                 670                 675                 680

aag atc cgg aag tac acg atg cgg aga ctg ctg cag gaa acg gag ctg    2238

Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu

                685                 690                 695

gtg gag ccg ctg aca cct agc gga gcg atg ccc aac cag gcg cag atg    2286

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met

            700                 705                 710

cgg atc ctg aaa gag acg gag ctg agg aag gtg aag gtg ctt gga tct    2334

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser

        715                 720                 725

ggc gct ttt ggc aca gtc tac aag ggc atc tgg atc cct gat ggg gag    2382

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu

    730                 735                 740

aat gtg aaa att cca gtg gcc atc aaa gtg ttg agg gaa aac aca tcc    2430

Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser

745                 750                 755                 760

ccc aaa gcc aac aaa gaa atc tta gac gaa gca tac gtg atg gct ggt    2478

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly

                765                 770                 775

gtg ggc tcc cca tat gtc tcc cgc ctt ctg ggc atc tgc ctg aca tcc    2526

Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

            780                 785                 790

acg gtg cag ctg gtg aca cag ctt atg ccc tat ggc tgc ctc tta gac    2574

Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp

        795                 800                 805

cat gtc cgg gaa aac cgc gga cgc ctg ggc tcc cag gac ctg ctg aac    2622

His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn

    810                 815                 820

tgg tgt atg cag att gcc aag ggg atg agc tac ctg gag gat gtg cgg    2670

Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg

825                 830                 835                 840

ctc gta cac agg gac ttg gcc gct cgg aac gtg ctg gtc aag agt ccc    2718

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro

                845                 850                 855

aac cat gtc aaa att aca gac ttc ggg ctg gct cgg ctg ctg gac att    2766

Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile

            860                 865                 870

gac gag aca gag tac cat gca gat ggg ggc aag gtg ccc atc aag tgg    2814

Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

        875                 880                 885

atg gcg ctg gag tcc att ctc cgc cgg cgg ttc acc cac cag agt gat    2862

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp

    890                 895                 900

gtg tgg agt tat ggt gtg act gtg tgg gag ctg atg act ttt ggg gcc    2910

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala

905                 910                 915                 920

aaa cct tac gat ggg atc cca gcc cgg gag atc cct gac ctg ctg gaa    2958

Iys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu

                925                 930                 935

aag ggg gag cgg ctg ccc cag ccc ccc atc tgc acc att gat gtc tac    3006

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

            940                 945                 950

atg atc atg gtc aaa tgt tgg atg att gac tct gaa tgt cgg cca aga    3054

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg

        955                 960                 965

ttc cgg gag ttg gtg tct gaa ttc tcc cgc atg gcc agg gac ccc cag  3102

Phe Arg Glu Leu Val ger Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln

    970                 975                 980

cgc ttt gtg gtc atc cag aat gag gac ttg ggc cca gcc agt ccc ttg  3150

Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu

985                 990                 995                 1000

gac agc acc ttc tac  cgc tca ctg ctg gag  gac gat gac atg ggg    3195

Asp Ser Thr Phe Tyr  Arg Ser Leu Leu Glu  Asp Asp Asp Met Gly

                1005                 1010                 1015

gac ctg gtg gat gct  gag gag tat ctg gta  ccc cag cag ggc ttc    3240

Asp Leu Val Asp Ala  Glu Glu Tyr Leu Val  Pro Gln Gln Gly Phe

                1020                 1025                 1030

ttc tgt cca gac cct  gcc ccg ggc gct ggg  ggc atg gtc cac cac    3285

Phe Cys Pro Asp Pro  Ala Pro Gly Ala Gly  Gly Met Val His His

                1035                 1040                 1045

agg cac cgc agc tca  tct acc agg agt ggc  ggt ggg gac ctg aca    3330

Arg His Arg Ser Ser  Ser Thr Arg Ser Gly  Gly Gly Asp Leu Thr

                1050                 1055                 1060

cta ggg ctg gag ccc  tct gaa gag gag gcc  ccc agg tct cca ctg    3375

Leu Gly Leu Glu Pro  Ser Glu Glu Glu Ala  Pro Arg Ser Pro Leu

                1065                 1070                 1075

gca ccc tcc gaa ggg  gct ggc tcc gat gta  ttt gat ggt gac ctg    3420

Ala Pro Ser Glu Gly  Ala Gly Ser Asp Val  Phe Asp Gly Asp Leu

                1080                 1085                 1090

gga atg ggg gca gcc  aag ggg ctg caa agc  ctc ccc aca cat gac    3465

Gly Met Gly Ala Ala  Lys Gly Leu Gln Ser  Leu Pro Thr His Asp

                1095                 1100                 1105

ccc agc cct cta cag  cgg tac agt gag gac  ccc aca gta ccc ctg    3510

Pro Ser Pro Leu Gln  Arg Tyr Ser Glu Asp  Pro Thr Val Pro Leu

                1110                 1115                 1120

ccc tct gag act gat  ggc tac gtt gcc ccc  ctg acc tgc agc ccc    3555

Pro Ser Glu Thr Asp  Gly Tyr Val Ala Pro  Leu Thr Cys Ser Pro

                1125                 1130                 1135

cag cct gaa tat gtg  aac cag cca gat gtt  cgg ccc cag ccc cct    3600

Gln Pro Glu Tyr Val  Asn Gln Pro Asp Val  Arg Pro Gln Pro Pro

                1140                 1145                 1150

tcg ccc cga gag ggc  cct ctg cct gct gcc  cga cct gct ggt gcc    3645

Ser Pro Arg Glu Gly  Pro Leu Pro Ala Ala  Arg Pro Ala Gly Ala

                1155                 1160                 1165

act ctg gaa agg gcc  aag act ctc tcc cca  ggg aag aat ggg gtc    3690

Thr Leu Glu Arg Ala  Lys Thr Leu Ser Pro  Gly Lys Asn Gly Val

                1170                 1175                 1180

gtc aaa gac gtt ttt  gcc ttt ggg ggt gcc  gtg gag aac ccc gag      3735

Val Lys Asp Val Phe  Ala Phe Gly Gly Ala  Val Glu Asn Pro Glu

1185                 1190                 1195

tac ttg aca ccc cag  gga gga gct gcc cct  cag ccc cac cct cct      3780

Tyr Leu Thr Pro Gln  Gly Gly Ala Ala Pro  Gln Pro His Pro Pro

1200                 1205                 1210

cct gcc ttc agc cca  gcc ttc gac aac ctc  tat tac tgg gac cag      3825

Pro Ala Phe Ser Pro  Ala Phe Asp Asn Leu  Tyr Tyr Trp Asp Gln

1215                 1220                 1225

gac cca cca gag cgg  ggg gct cca ccc agc  acc ttc aaa ggg aca      3870

Asp Pro Pro Glu Arg  Gly Ala Pro Pro Ser  Thr Phe Lys Gly Thr

1230                 1235                 1240

cct acg gca gag aac  cca gag tac ctg ggt  ctg gac gtg cca gtg      3915

Pro Thr Ala Glu Asn  Pro Glu Tyr Leu Gly  Leu Asp Val Pro Val

1245                 1250                 1255

tga accagaaggc caagtccgca gaagccctga tgtgtcctca gggagcaggg         3968

aaggcctgac ttctgctggc atcaagaggt gggagggccc tccgaccact tccaggggaa  4028

cctgccatgc caggaacctg tcctaaggaa ccttccttcc tgcttgagtt cccagatggc  4088

tggaaggggt ccagcctcgt tggaagagga acagcactgg ggagtctttg tggattctga  4148

ggccctgccc aatgagactc tagggtccag tggatgccac agcccagctt ggccctttcc  4208

ttccagatcc tgggtactga aagccttagg gaagctggcc tgagagggga agcggcccta  4268

agggagtgtc taagaacaaa agcgacccat tcagagactg tccctgaaac ctagtactgc  4328

cccccatgag gaaggaacag caatggtgtc agtatccagg ctttgtacag agtgcttttc  4388

tgtttagttt ttactttttt tgttttgttt ttttaaagac gaaataaaga cccaggggag  4448

aatgggtgtt gtatggggag gcaagtgtgg ggggtccttc tccacaccca ctttgtccat  4508

ttgcaaatat attttggaaa ac                                           4530

<210>17

<211>1255

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>17

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1               5                   10                  15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

            20                  25                  30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

        35                  40                  45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

    50                  55                  60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65                  70                  75                  80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

                85                  90                  95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

            100                 105                 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

        115                 120                 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145                 150                 155                 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

                165                 170                 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

            180                 185                 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

        195                 200                 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

    210                 215                 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225                 230                 235                 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

                245                 250                 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

            260                 265                 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

        275                 280                 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

    290                 295                 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305                 310                 315                 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

                325                 330                 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

            340                 345                 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

        355                 360                 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

    370                 375                 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385                 390                 395                 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

                405                 410                 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

            420                 425                 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

        435                 440                 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

    450                 455                 460

Leu Ala Leu Ile His His Asr Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465                 470                 475                 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

                485                 490                 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

            500                 505                 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

        515                 520                 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

    530                 535                 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545                 550                 555                 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

                565                 570                 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

            580                 585                 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

        595                 600                 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

    610                 615                 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625                 630                 635                 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser

                645                 650                 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

            660                 665                 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

        675                 680                 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

    690                 695                 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705                 710                 715                 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

                725                 730                 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

            740                 745                 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

        755                 760                 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

    770                 775                 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785                 790                 795                 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

                805                 810                 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

            820                 825                 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

        835                 840                 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

    850                 855                 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865                 870                 875                 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

                885                 890                 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

            900                 905                 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

        915                 920                 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

    930                 935                 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945                 950                 955                 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

                965                 970                 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

            980                 985                 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu  Asp Ser Thr Phe Tyr  Arg Ser Leu

        995                 1000                 1005

Leu Glu  Asp Asp Asp Met Gly  Asp Leu Val Asp Ala  Glu Glu Tyr

    1010                 1015                 1020

Leu Val  Pro Gln Gln Gly Phe  Phe Cys Pro Asp Pro  Ala Pro Gly

    1025                 1030                 1035

Ala Gly  Gly Met Val His His  Arg His Arg Ser Ser  Ser Thr Arg

    1040                 1045                 1050

Ser Gly  Gly Gly Asp Leu Thr  Leu Gly Leu Glu Pro  Ser Glu Glu

    1055                 1060                 1065

Glu Ala  Pro Arg Ser Pro Leu  Ala Pro Ser Glu Gly  Ala Gly Ser

    1070                 1075                 1080

Asp Val  Phe Asp Gly Asp Leu  Gly Met Gly Ala Ala  Lys Gly Leu

    1085                 1090                 1095

Gln Ser  Leu Pro Thr His Asp  Pro Ser Pro Leu Gln  Arg Tyr Ser

    1100                 1105                 1110

Glu Asp  Pro Thr Val Pro Leu  Pro Ser Glu Thr Asp  Gly Tyr Val

    1115                 1120                 1125

Ala Pro  Leu Thr Cys Ser Pro  Gln Pro Glu Tyr Val  Asn Gln Pro

    1130                 1135                 1140

Asp Val  Arg Pro Gln Pro Pro  Ser Pro Arg Glu Gly  Pro Leu Pro

    1145                 1150                 1155

Ala Ala  Arg Pro Ala Gly Ala  Thr Leu Glu Arg Ala  Lys Thr Leu

    1160                 1165                 1170

Ser Pro  Gly Lys Asn Gly Val  Val Lys Asp Val Phe  Ala Phe Gly

    1175                 1180                 1185

Gly Ala  Val Glu Asn Pro Glu  Tyr Leu Thr Pro Gln  Gly Gly Ala

    1190                 1195                 1200

Ala Pro  Gln Pro His Pro Pro  Pro Ala Phe Ser Pro  Ala Phe Asp

    1205                 1210                 1215

Asn Leu  Tyr Tyr Trp Asp Gln  Asp Pro Pro Glu Arg  Gly Ala Pro

    1220                 1225                 1230

Pro Ser  Thr Phe Lys Gly Thr  Pro Thr Ala Glu Asn  Pro Glu Tyr

    1235                 1240                 1245

Leu Gly  Leu Asp Val Pro Val

    1250                 1255

<210>18

<211>1466

<212>DNA

<213>homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(44)..(829)

<400>18

agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtgtc acc atg tgg gtc ccg    55

                                                Met Trp Val Pro

                                                1

gtt gtc ttc ctc acc ctg tcc gtg acg tgg att ggt gct gca ccc ctc    103

Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu

5                   10                  15                  20

atc ctg tct cgg att gtg gga ggc tgg gag tgc gag aag cat tcc caa    151

Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln

                25                  30                  35

ccc tgg cag gtg ctt gtg gcc tct cgt ggc agg gca gtc tgc ggc ggt    199

Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly

            40                  45                  50

gtt ctg gtg cac ccc cag tgg gtc ctc aca gct gcc cac tgc atc agg    247

Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg

        55                  60                  65

aac aaa agc gtg atc ttg ctg ggt cgg cac agc ctg ttt cat cct gaa    295

Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu

    70                  75                  80

gac aca ggc cag gta ttt cag gtc agc cac agc ttc cca cac ccg ctc    343

Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu

85                  90                  95                  100

tac gat atg agc ctc ctg aag aat cga ttc ctc agg cca ggt gat gac    391

Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp

                105                 110                 115

tcc agc cac gac ctc atg ctg ctc cgc ctg tca gag cct gcc gag ctc    439

Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu

            120                 125                 130

acg gat gct gtg aag gtc atg gac ctg ccc acc cag gag cca gca ctg    487

Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu

        135                 140                 145

ggg acc acc tgc tac gcc tca ggc tgg ggc agc att gaa cca gag gag    535

Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu

    150                 155                 160

ttc ttg acc cca aag aaa ctt cag tgt gtg gsc ctc cat gtt att tcc    583

Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser

165                 170                 175                 180

aat gac gtg tgt gcg caa gtt cac cct cag aag gtg acc aag ttc atg    631

Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met

                185                 190                 195

ctg tgt gct gga cgc tgg aca ggg ggc aaa agc acc tgc tcg ggt gat    679

Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp

            200                 205                 210

tct ggg ggc cca ctt gtc tgt aat ggt gtg ctt caa ggt atc acg tca    727

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser

        215                 220                 225

tgg ggc agt gaa cca tgt gcc ctg ccc gaa agg cct tcc ctg tac acc     775

Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr

    230                 235                 240

aag gtg gtg cat tac cgg aag tgg atc aag gac acc atc gtg gcc aac     823

Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn

245                 250                 255                 260

ccc tga gcacccctatcaacccccta ttgtagtaaa cttggaacct tggaaatgac       879

Pro

caggccaaga ctcaagcctc cccagttcta ctgacctttg tccttaggtg tgaggtccag   939

ggttgctagg aaaagaaatc agcagacaca ggtgtagacc agagtgtttc ttaaatggtg   999

taattttgtc ctctctgtgt cctggggaat actggccatg cctggagaca tatcactcaa  1059

tttctctgag gacacagata ggatggggtg tctgtgttat ttgtggggta cagagatgaa  1119

agaggggtgg gatccacact gagagagtgg agagtgacat gtgctggaca ctgtccatga  1179

agcactgagc agaagctgga ggcacaacgc accagacact cacagcaagg atggagctga  1239

aaacataacc cactctgtcc tggaggcact gggaagccta gagaaggctg tgagccaagg  1299

agggagggtc ttcctttggc atgggatggg gatgaagtaa ggagagggac tggaccccct  1359

ggaagctgat tcactatggg gggaggtgta ttgaagtcct ccagacaacc ctcagatttg  1419

atgatttcct agtagaactc acagaaataa agagctgtta tactgtg                1466

<210>19

<211>261

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>19

Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly

1               5                   10                  15

Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

            20                  25                  30

Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala

        35                  40                  45

Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

    50                  55                  60

His Cys Ile Arg Asn Lys ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu

65                  70                  75                  80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe

                85                  90                  95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg

            100                 105                 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

        115                 120                 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln

    130                 135                 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu

                165                 170                 175

His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val

            180                 185                 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr

        195                 200                 205

Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

    210                 215                 220

Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro

225                 230                 235                 240

Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

                245                 250                 255

Ile Val Ala Asn Pro

            260

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