CTRP3蛋白的应用
阅读：667发布：2020-05-26
专利汇可以提供CTRP3蛋白的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种CTRP3蛋白的应用，属于 生物 技术及医药领域。本发明提供了CTRP3蛋白可以增强发育中卵泡对卵泡刺 激素 的敏感度。并通过鉴定CTRP3蛋白在人和小鼠卵巢中的表达表明其为卵巢自体就拥有的一种蛋白，可作为一种药物安全开发利用。并从离体卵巢组织培养、离体窦前卵泡培养及活体卵巢系膜注射三个不同的 水 平验证了CTRP3作为卵泡刺激素增敏剂对卵泡发育的促进作用，表明了CTRP3蛋白作为卵泡刺激素增敏剂促进窦前及窦状卵泡发育的有效性。本发明提供了CTRP3参与卵泡发育调控的作用及机制，并表明CTRP3蛋白可作为卵泡刺激素增敏剂用于女性卵巢发育不良性 疾病 中从而增强卵泡刺激素对卵泡发育的作用效果。，下面是CTRP3蛋白的应用专利的具体信息内容。
1.一种CTRP3蛋白用于制备卵泡刺激素增敏剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的CTRP3蛋白为CTRP3蛋白的球状结构域蛋白或全长蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的CTRP3蛋白为小鼠、人的CTRP3蛋白的球状结构域蛋白或全长蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的卵泡刺激素增敏剂用于治疗女性卵泡发育不良性不孕性疾病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的女性卵泡发育不良性不孕性疾病为卵巢低反应、多囊卵巢综合征、卵巢功能储备低下。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的卵泡刺激素增敏剂用于增强机体卵泡对卵泡刺激素敏感反应度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的卵泡刺激素增敏剂用于增强窦前卵泡及窦状卵泡发育对卵泡刺激素敏感反应度。
CTRP3蛋白的应用
技术领域
背景技术
[0002] 在妇女正常的月经周期中，一般会有20个左右的窦前卵泡，但是分泌极低的雌二醇，到月经周期的卵泡发育晚期阶段，仅有一个发育为成熟卵泡排卵，同时分泌高水平的雌二醇刺激子宫内膜增生。在正常月经周期的妇女中，采用外源激素如卵泡刺激素(FSH)能够诱导15～30个左右的排卵前卵泡生长。然而有些患者内源性的促性腺激素水平升高，卵巢内存在卵泡，但是对外源性的促性腺激素刺激却呈低反应者，经FSH刺激后仅能够获得2～3个排卵前卵泡，这种对外源促性腺激素反应不敏感称之为卵巢低反应(poor ovarian response，POR)。卵巢低反应指在控制性卵巢刺激中卵巢对外源性FSH反应性下降，表现为获卵数减少，取消率增加和妊娠率下降。在辅助生殖促排卵过程中卵巢低反应发生率约为9％～24％，是不育症治疗最棘手的问题之一。这部分患者生长的卵泡数量少，获得的卵子数目不足，可移植胚胎少，临床妊娠率低。目前有大量不同的方案正应用于卵巢低反应患者，以期改善治疗解决，但是遗憾的是所有这些方案的成功率都非常有限。
[0003] 引起卵巢低反应的常见原因包括：卵巢储备功能减退，FSH受体表达不足，FSH受体基因多态性及LH基因变异。增加FSH剂量是卵巢低反应控制性卵泡刺激治疗的常用方案。而在临床使用中FSH剂量必须达到卵泡FSH阈值才能促进卵泡发育，FSH的剂量必须克服敏感性卵泡的FSH抑制。在卵泡刺激治疗中，卵泡早期使用超过FSH阈值的大剂量外源性FSH可增加卵泡募集，卵泡发育中、晚期持续给予外源性的FSH可干扰FSH的下降，维持FSH阈值窗，以促进多个卵泡发育。但FSH剂量过高并无益处，因为当FSH受体达饱和或FSH受体处于降调状态时，增加FSH剂量不能改善卵巢反应性；此外，大剂量FSH还可能增加胚胎的非整倍体率，可利用的胚胎数并无增加(卵巢低反应人群在控制性卵巢刺激中的FSH剂量有无极限。生殖医学杂志，2015，24(10)：808-810.)。因此在不增加FSH剂量的前提下通过药物提高卵泡对FSH的敏感度，以此来提高卵巢的反应，增加获卵数，且降低由于高FSH引起的畸形胚胎率。FSH增敏药物的使用为一种新的卵巢低反应卵泡刺激的治疗策略。
[0004] 多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)也是女性不孕的常见病因，表现为以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱。尽管PCOS的原始卵泡能够从静止期进入发育阶段，但大部分卵泡在成为优势卵泡之前的小窦状卵泡阶段发育闭锁。有研究表明PCOS患者经FSH刺激治疗后正在发育中的卵泡数多于正常人群，但是由于过量雌激素的产生，形成负反馈调节，抑制了体内FSH的水平，从而使大量正在发育的卵泡由于FSH不足从而引起卵泡闭锁，排卵数量减少。在此过程中增加外源使用FSH剂量也为一种常规治疗PCOS的治疗策略，但是大剂量的FSH使用会增加非正常胚胎的概率。通过提高卵泡对FSH的敏感性可以降低外源性FSH剂量的使用，同时也促进小卵泡向大的成熟卵泡发育，增加优势卵泡的数量及排卵数。
[0005] C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3(C1qTNF related protein 3，CTRP3)，又称为carductin，CORS26以及C1qTNF3，是C1q蛋白家族成员，也是一类新发现的脂肪因子。研究发现CTRP3在抗炎、代谢调控及减轻缺血损伤等方面发挥重要作用(CTRP3的认识及研究进展。心脏杂志，2016，28(3)：341-343)。目前尚未有CTRP3对卵泡发育调节的研究报道。
发明内容
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种CTRP3蛋白作为卵泡刺激素(FSH)增敏剂的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 本发明提供一种CTRP3蛋白作为卵泡刺激素(FSH)增敏剂的应用。
[0009] 所述的CTRP3蛋白为CTRP3蛋白的球状结构域蛋白或全长蛋白。
[0010] 所述的CTRP3蛋白为小鼠、人及其他物种的CTRP3蛋白的球状结构域蛋白或全长蛋白。
[0011] 所述的卵泡刺激素(FSH)增敏剂在制备治疗女性卵泡发育不良性不孕性疾病的药物中的应用。
[0012] 所述的女性卵泡发育不良性不孕性疾病为卵巢低反应、多囊卵巢综合征、卵巢功能储备低下等女性卵泡发育不良性不孕性疾病。
[0014] 所述的卵泡刺激素(FSH)增敏剂在制备增强窦前卵泡及窦状卵泡发育对卵泡刺激素敏感性的药物中的应用。
[0015] 确定CTRP3在人与小鼠卵巢中的内源性表达；通过离体卵巢组织培养系统检测CTRP3蛋白对离体培养卵巢重量改变，卵巢形态及卵泡动态变化；利用离体窦前卵泡系统检测CTRP3蛋白对卵泡直径变化；采用卵巢系膜注射CTRP3抗体研究CTRP3对窦状卵泡发育的影响。
[0016] 所述的卵泡刺激素(FSH)增敏剂为CTRP3蛋白。
[0017] 所述的所用的CTRP3蛋白可为小鼠及人的CTRP3蛋白的球状结构域蛋白及全长蛋白，购自于美国AVISCERA BIOSCIENCE,INC.公司。本发明中所用的人源及鼠源性的蛋白也可通过蛋白表达系统制备纯化或者购自其他生物原材料供应公司。
[0018] 所述的促卵泡刺激素(FSH)增敏剂以CTRP3的球状结构域为有效成分，通过增强促卵泡刺激素(FSH)对次级卵泡及窦状卵泡的生长参与卵泡发育调控；且该药物为FSH促进卵泡发育的增强效应可以被CTRP3抗体所抑制；CTRP3通过增强FSH诱导的Akt及mTOR磷酸化的激活效应，上调卵巢颗粒细胞中细胞增殖调控基因Cyclin D2的表达促进卵泡生长。
[0019] 所述的小鼠为昆明雌性小鼠。
[0020] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021] 本发明提供了CTRP3蛋白可以增强发育中卵泡对卵泡刺激素(FSH)的敏感度。并通过鉴定CTRP3蛋白在人和小鼠卵巢中的表达表明CTRP3为卵巢自体就拥有的一种蛋白，可以作为一种药物安全开发利用。并从离体卵巢组织培养、离体窦前卵泡培养及活体卵巢系膜注射三个不同的研究水平验证了CTRP3作为卵泡刺激素增敏剂对卵泡发育的促进作用，表明了CTRP3蛋白作为卵泡刺激素增敏剂促进窦前及窦状卵泡发育的有效性。本发明提供了CTRP3参与卵泡发育调控的作用及机制，并表明CTRP3蛋白可以作为卵泡刺激素增敏剂用于女性卵巢发育不良性疾病中从而增强卵泡刺激素对卵泡发育的作用效果。附图说明
[0022] 图1是实施例1中免疫组化分析CTRP3在小鼠卵巢中的组织定位图；其中，A为7周龄小鼠卵巢CTRP3染色图。B为CTRP3在始基卵泡(primordial follicle，ProF)的颗粒细胞无表达，在正在向初级卵泡(primary follicle，PF)转化的卵母细胞中有少量表达；C为CTRP3蛋白在初级卵泡(PF)及早窦期卵泡(early antral follicle，EAF)的卵母细胞及颗粒细胞中表达；D为CTRP3蛋白在早次级卵泡(early secondary follicle，ESF)、晚次级卵泡(later secondary follicle，LSF)及晚窦期卵泡(later antral follicle，LAF)的卵母细胞及颗粒细胞中表达，在卵泡膜细胞无表达。E为CTRP3蛋白在排卵前卵泡(preovulation follicle，POF)的颗粒细胞中表达。F为CTRP3在黄体(corpus luteum)中少量表达。G和H为阴性对照，CTRP3在各级卵泡如图H的晚次级卵泡(LSF)及早窦卵泡(EAF)中都没有表达。
[0023] 图2是实施例2中免疫荧光分析CTRP3在人卵巢的组织定位图；其中，A为DAPI染色人卵巢组织切片在荧光显微镜下观测细胞核显蓝色，在灰色图中显暗白色；B为CTRP3抗体孵育人卵巢组织切片，用Jackson Alexa Fluor 594二抗染色，CTRP3蛋白显红色，在灰色图中显亮白点信号；C为细胞核(DAPI染色，蓝色，在灰色图中显暗白色)及CTRP3蛋白定位合并图；D为阴性对照仅DAPI着色。
[0024] 图3是实施例3中CTRP3对离体培养的小鼠卵巢组织重量的影响；其中，A为离体卵巢组织培养示意图。B为小鼠CTRP3球状结构域蛋白对10日龄小鼠卵巢组织体外培养4天后重量改变的结果。C为小鼠CTRP3球状结构域蛋白对12日龄小鼠卵巢组织体外培养4天后重量改变结果。D为人CTRP3全长蛋白(fhCTRP3)对12日龄小鼠卵巢组织体外培养4天后重量改变结果。CTRP3蛋白使用浓度如图中标示，FSH浓度为0.25IU/mL。图中柱状图上的数字表示实验统计用的卵巢数量。
[0025] 图4是实施例3中小鼠CTRP3球状结构域蛋白对12日龄小鼠卵巢组织体外培养4天后的卵巢形态改变结果。其中，FSH浓度为0.25IU/mL，CTRP3浓度为3μg/mL。
[0026] 图5是实施例3中小鼠CTRP3球状结构域蛋白对12日龄小鼠卵巢组织体外培养4天后的各级卵泡数量动态变化结果。其中，FSH浓度为0.25IU/mL，CTRP3浓度为3μg/mL。
[0027] 图6是实施例4中小鼠CTRP3球状结构域蛋白对窦前卵泡发育的影响；其中，A为窦前卵泡培养过程中卵泡形态动态监测图。每隔24小时拍照。B为3μg/mL的CTRP3蛋白对离体培养的90～120μm直径大小的窦前卵泡直径变化结果图。C为3μg/mL的CTRP3蛋白对离体培养的120～150μm直径大小的窦前卵泡直径变化结果图。
[0028] 图7是实施例5中小鼠CTRP3球状结构域蛋白对12日龄小鼠卵巢组织体外培养后Akt及mTOR等信号通路的改变结果；其中，A为Western blot检测CTRP3与FSH处理对体外培养卵巢组织中Akt、mTOR、FOXO3a及ERK1/2磷酸化的示意图。B为Akt及mTOR磷酸化变化的灰度值分析示意图。
[0029] 图8是实施例5中小鼠CTRP3球状结构域蛋白对卵巢内的Cyclin D2的表达变化；其中，A为定量PCR分析小鼠CTRP3球状结构域蛋白对体外培养的12日龄小鼠卵巢组织内的Cyclin D2的表达变化示意图；B为原代小鼠颗粒细胞经小鼠CTRP3球状结构域蛋白处理0、6、12、24小时，定量PCR分析CyclinD2的表达变化示意图。
[0030] 图9是实施例6中CTRP3抗体对孕马血清促性腺激素(PMSG)诱导的活体小鼠卵泡重量改变的影响；其中，CTRP3抗体(Ab)使用剂量为10ng/卵巢及100ng/卵巢。PMSG注射后24小时或者48小时候分离卵巢称取重量。深色格子为CTRP3抗体对PMSG注射24小时后的重量变化柱状图；浅色为CTRP3抗体对PMSG注射48小时后的重量变化柱状图。
[0031] 图10是实施例6中CTRP3抗体对PMSG诱导48小时后的小鼠卵泡形态改变示意图。
[0032] 图11是实施例6中CTRP3抗体对PMSG诱导48小时后的窦状卵泡大小改变示意图。
具体实施方式
[0033] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0034] 实施例1：免疫组化分析CTRP3蛋白在小鼠卵巢组织中的表达分布。
[0035] 取7周龄正常雌性小鼠，颈椎脱臼处死后分离卵巢组织，将卵巢组织用质量百分比4％多聚甲醛固定3小时后进行石蜡包埋切片，步骤如下：倒掉固定液，用PBS缓冲液洗3次，每次10分钟。体积百分比70％乙醇脱水45分钟，体积百分比85％乙醇脱水45分钟，体积百分比95％乙醇脱水45分钟，体积百分比100％乙醇脱水45分钟，体积百分比100％乙醇脱水45分钟。1/2乙醇+1/2二甲苯透明30分钟，二甲苯透明5分钟，二甲苯透明5分钟，观察组织块至透明。于62℃透蜡120分钟。然后将组织块放入模具中，摆好位置，浇上石蜡包埋，于石蜡包埋机的冷台上冷却，4℃保存备用。将包埋好的组织块于切片机中切片(厚度5μm)，放于展片机中展开，再将切片捞于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，编号，60℃烘箱中1h，贴片后
40℃烘箱过夜，之后收集于载玻片盒里，4℃密封保存。
40℃烘箱过夜，之后收集于载玻片盒里，4℃密封保存。
[0036] 将脱蜡、水化的切片用磷酸缓冲液(PBS)缓慢冲洗3次，每次5分钟。3％H2O2滴于玻片组织上，室温孵育10分钟，以消除内源性的过氧化物酶的活性。PBS缓慢冲洗5分钟×3次，将切片置于10mmol/L pH 6.0枸橼酸缓冲液中，微波依次高火(98℃)10分钟、解冻20分钟，取出自然冷却至室温。PBS缓慢冲洗5分钟×3次，滴加10％正常山羊血清封闭，保湿盒中37℃孵育30分钟，甩去多余液体，不清洗。滴加CTRP3一抗(美国abcam公司，封闭液1：500稀释)，4℃孵育过夜。封闭液代替一抗作为阴性对照。PBS缓慢冲洗5分钟×3次，滴加HRP羊抗兔标记二抗(1：1000)，保湿盒中孵育60分钟。PBS缓慢冲洗5分钟×3次，用DAB显色剂显色5～10分钟，在显微镜下观察染色程度，控制显色时间，清水终止显色。自来水冲洗3遍，蒸馏水1遍。苏木精轻度复染2分钟，盐酸酒精中分色片刻、饱和碳酸锂显蓝30秒后镜下观察细胞核呈蓝色。自来水冲洗5分钟×3次，依次梯度酒精脱水、透明，中性树胶封片。显微镜下观察结果并拍照。结果发现在原始卵泡(ProF)的卵母细胞中没有检测到CTRP3的表达(图1A)，在原始卵泡向初级卵泡(PF)发育的过程中，CTRP3开始在卵母细胞中表达(图1B)。CTRP3蛋白主要表达于初级卵泡(PF)、小的窦状卵泡(EAF)以及大的窦状卵泡(LAF)的卵母细胞和颗粒细胞中，在卵泡膜细胞和髓质间质中无表达(图1C及D)。在卵丘细胞(图1E)和黄体(图1F)颗粒细胞中检测到CTRP3蛋白的表达。在较大卵泡的颗粒细胞及卵丘细胞中CTRP3的表达量明显高于较小的卵泡(图1B，C，D)，能在窦状卵泡中检测到最强的CTRP3信号。空白对照中无CTRP3信号(图1G和H)。结果表明CTRP3主要在发育中卵泡的颗粒细胞中表达，在卵母细胞中也有分布。
[0037] 实施例2：免疫荧光分析CTRP3蛋白在人卵巢组织中的表达分布。
[0038] 人卵巢组织样品由暨南大学附属第一医院妇产科子宫颈癌卵巢切除术患者自愿捐赠且知情同意。取下的人卵巢组织固定、包埋、切片及孵育一抗等操作同实施例1中的免疫荧光步骤。一抗过夜后，滴加Alexa Fluor 594标记羊抗兔二抗，保湿盒中避光孵育60分钟。PBS缓慢冲洗5分钟×3次，DAPI(武汉博士德)染色，避光，10分钟。PBS洗3次，每次2分钟。滴加抗荧光淬灭剂(武汉博士德)，封片后于荧光显微镜下拍照。结果表明CTRP3在人卵巢组织中主要表达于各级卵泡颗粒细胞中，在间质细胞中也有CTRP3的分布(图2)。
[0039] 实施例3：CTRP3蛋白对体外培养卵巢的卵泡发育的影响
[0040] 离体卵巢组织培养示意图，如图3A所示。于体视镜下使用美国BD公司的胰岛素注射器小心分离10日龄及12日龄昆明雌鼠卵巢，避免损伤。将每只小鼠的两个卵巢配对置于两个0.4μm孔隙的Millipore培养小室中，将培养小室置于添加400μL卵巢组织培养基的24孔板中，于37℃、5％CO2的条件下细胞培养箱培养。卵巢组织培养基成分为：DMEM/F12基础培养基(GIBCO)+质量百分比0.1％牛血清白蛋白+质量百分比0.1％高级牛血清白蛋白Albumax II(GIBCO)+1：20稀释的ITS(GIBCO，100×，insulin-transferrin-selenium)+0.5mg/mL L-抗坏血酸(Sigma)+1：100稀释的青霉素-链霉素溶液(penicilin-streptomycin，GIBCO，100×)。在培养伊始加入不同浓度的小鼠CTRP3球状结构域蛋白(0、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL，美国AVISCERA BIOSCIENCE，INC.公司)或者人CTRP3全长蛋白(hfCTRP3，3μg/mL，美国AVISCERA BIOSCIENCE，INC.公司)/或者FSH(0.25IU/mL，宁波第二激素厂)。每24小时添加终浓度为0.25IU/mL的FSH，每48小时更换一次培养基(培养基内含有处理蛋白或者激素)。培养4天后停止培养，将卵巢组织用质量百分比4％的多聚甲醛固定
3小时，然后称取卵巢重量。对于10日龄小鼠卵巢而言，相对对照未处理组，FSH显著的促进了卵巢生长，10μg/mL小鼠CTRP3球状结构域蛋白相比对照组而言，虽然能够促进卵巢生长，但差异不显著，低剂量浓度(1μg/mL、3μg/mL)对卵巢的生长没有明显的影响。3μg/mL的小鼠CTRP3球状结构域与FSH共同作用也明显的促进了卵巢生长，卵巢重量明显重于FSH单独处理组(图3B)。相似的情况在对12日龄小鼠卵巢培养中也发现，3μg/mL小鼠CTRP3球状结构域蛋白也能够促进12日龄小鼠卵巢组织的生长，但与对照组相比，差异不显著；3μg/mL小鼠CTRP3球状结构域与FSH共同作用也较FSH单独处理对卵泡重量的增加效果更为明显，且相比10日龄小鼠卵巢重量的增加而言，差异更明显(图3C)。我们采用人的CTRP3全长蛋白用于
12日龄的小鼠卵巢组织体外培养，结果与小鼠CTRP3球状结构域蛋白类似，人的CTRP3全长蛋白与FSH共同作用能够增加FSH对卵巢重量获得的增加效应(图3D)。结果表明，不论是人还是小鼠的CTRP3全长或者球状结构域蛋白都能够增强卵泡对FSH应激的敏感度，能够促进FSH导致的卵巢重量的获得，但是单独用CTRP3蛋白培养卵巢效果卵巢重量的增加效果并不明显。
3小时，然后称取卵巢重量。对于10日龄小鼠卵巢而言，相对对照未处理组，FSH显著的促进了卵巢生长，10μg/mL小鼠CTRP3球状结构域蛋白相比对照组而言，虽然能够促进卵巢生长，但差异不显著，低剂量浓度(1μg/mL、3μg/mL)对卵巢的生长没有明显的影响。3μg/mL的小鼠CTRP3球状结构域与FSH共同作用也明显的促进了卵巢生长，卵巢重量明显重于FSH单独处理组(图3B)。相似的情况在对12日龄小鼠卵巢培养中也发现，3μg/mL小鼠CTRP3球状结构域蛋白也能够促进12日龄小鼠卵巢组织的生长，但与对照组相比，差异不显著；3μg/mL小鼠CTRP3球状结构域与FSH共同作用也较FSH单独处理对卵泡重量的增加效果更为明显，且相比10日龄小鼠卵巢重量的增加而言，差异更明显(图3C)。我们采用人的CTRP3全长蛋白用于
12日龄的小鼠卵巢组织体外培养，结果与小鼠CTRP3球状结构域蛋白类似，人的CTRP3全长蛋白与FSH共同作用能够增加FSH对卵巢重量获得的增加效应(图3D)。结果表明，不论是人还是小鼠的CTRP3全长或者球状结构域蛋白都能够增强卵泡对FSH应激的敏感度，能够促进FSH导致的卵巢重量的获得，但是单独用CTRP3蛋白培养卵巢效果卵巢重量的增加效果并不明显。
[0041] 将称重后的用小鼠CTRP3球状结构域(后面实验用的CTRP3蛋白都是用小鼠CTRP3球状结构域蛋白)培养的12日龄小鼠卵巢经石蜡包埋，5μm连续切片然后伊红-苏木素(HE)染色(图4)。将连续切片每隔一张进行计数。卵母细胞外仅有一层扁平的颗粒细胞层的计为始基卵泡；卵母细胞外仅有一层立方的颗粒细胞层计为初级卵泡；卵母细胞外有2层立方的颗粒细胞计为早期次级卵泡；卵母细胞外有3～6层的颗粒细胞但没有窦腔的计为晚期次级卵泡；卵泡不规则或者无卵母细胞的计为退化卵泡。为避免重复计数，仅计入有明显的卵母细胞核的卵泡。为避免人为因素所引起的偏差，采用双盲计数各级卵泡数量。各级卵泡所占总卵泡数量的百分比用于表示卵泡动态变化情况。相比为处理对照组而言，CTRP3单独处理始基卵泡数量略有减少，初级卵泡数量略有增多，晚期次级卵泡数量有所增加。而FSH与CTRP3共同处理较FSH单独作用，颗粒细胞层明显增厚，晚期次级卵泡的数量明显增多，相对而言始基卵泡及初级卵泡数量减少(图5)。上述结果表明，CTRP3能够增强卵泡刺激素(FSH)对体外培养卵巢的窦前卵泡发育的促进效果。
[0042] 实施例4：CTRP3蛋白对离体窦前卵泡发育的影响
[0043] 12～14日龄小鼠脱臼处死后用70％乙醇消毒，迅速剪下卵巢及附近组织，置于1mL提前预热的含有100IU/mL的青霉素-链霉素，0.1％牛血清白蛋白，0.5mg/mL L-抗坏血酸，1×ITS的DMEM/F12的培养基中，于体式解剖镜下使用BD胰岛素注射器小心将卵巢外围包膜及脂肪组织分离去除后用BD公司的胰岛素注射器分离各种大小卵泡，并尽量去除卵泡外附着的残余基质。挑选外周基底膜完整的圆形或卵圆形直径为90～160μm，并且卵泡明亮有质感，有完整单层或者多层颗粒细胞，颗粒细胞与卵母细胞紧密相连的卵泡用于培养。将分离出的健康卵泡用移卵管小心的移到96孔细胞培养皿中，1个卵泡/孔，每孔中培养液为100μL。培养液成分同上述，分别加入3μg/mL的CTRP3蛋白及/或0.25IU/mL的FSH于37℃，5％CO2培养箱中培养，每24小时拍照一次，隔日更换一半的培养液，培养4天停止培养。每处理组卵泡数量24～50个，采用Image Pro Plus 6.0软件测定卵泡直径。
[0044] 将培养的窦前卵泡按照起始培养直径又分为90～120μm组和120～150μm组，对CTRP3及FSH对卵泡生长的直径检测发现，对于不同起始直径大小的窦状卵泡，FSH与CTRP3共同处理对卵泡生长的促进作用最明显，卵泡随时间依赖性增大，在培养4天时达到最大。FSH组处理的卵泡变化较为明显，但卵泡直径小于FSH+CTRP3组。CTRP3处理组卵泡随着时间略有变化，对于直径90～120μm的略小的窦前卵泡而言，仅培养第4天是卵泡直径与对照组有较大差异(图6A和B)；而对于直径120～150μm稍大的窦前卵泡而言，在培养的第3天CTRP3处理组的卵泡直径就较未处理对照有所增大，在培养的第4天差异更为明显(图6C)。直径为
90～120μm的窦前卵泡在没有外源蛋白及激素的条件下，卵泡发育基本没有明显变化，生长缓慢，而直径120～150μm稍大的窦前卵泡在没有外源蛋白及激素的条件卵泡生长速度较小卵泡快，卵泡直径略有提高。结果表明CTRP3可以促进FSH诱导的窦前卵泡发育，增加体外培养的窦前卵泡对FSH的敏感度。
90～120μm的窦前卵泡在没有外源蛋白及激素的条件下，卵泡发育基本没有明显变化，生长缓慢，而直径120～150μm稍大的窦前卵泡在没有外源蛋白及激素的条件卵泡生长速度较小卵泡快，卵泡直径略有提高。结果表明CTRP3可以促进FSH诱导的窦前卵泡发育，增加体外培养的窦前卵泡对FSH的敏感度。
[0045] 实施例5：CTRP3促进窦前卵泡发育的分子机制
[0046] 由实施例3和4可知CTRP3可以促进FSH诱导的离体培养卵巢组织及离体培养卵泡的窦前卵泡生长，为了进一步明确CTRP3在此过程中的作用机制，我们12日龄卵巢组织分别用含有0.25IU/mL的FSH或者0.25IU/mL FSH及3μg/mL CTRP3蛋白于37℃，5％CO2培养箱中培养0，30分钟，60分钟及120分钟后收集卵巢组织样品，Western Blot发现FSH能够激活Akt(T308)、mTOR及ERK1/2，并抑制FOXO3a的磷酸化，而CTRP3能够放大培养的卵巢外植体内的由FSH刺激引起的Akt(T308)及mTOR信号通路激活，且激活效应可以持续到120分钟；对FSH诱导的ERK1/2磷酸化激活没有明显的影响(图7A和B)。12日龄的卵巢组织在含有0.25IU/mL的FSH或者0.25IU/mL FSH及3μg/mL CTRP3蛋白培养中于37℃，5％CO2培养箱中培养6小时候采用定量PCR分析发现离体培养经FSH处理6小时后Cyclin D2的表达略有上调，增加了1.25倍，而在培养基中一起添加CTRP3与FSH处理6小时的卵巢组织中Cyclin D2的表达相比对照增加了2.32倍(图8A)。表明CTRP3可以促进CyclinD2的表达。
[0047] 在实施例1和2中我们发现CTRP3在小鼠与人卵巢组织中的定位发现，CTRP3主要在颗粒细胞中表达。因此我们将21日龄小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG，宁波第二激素厂，5IU/小鼠)，42小时后分离卵巢置于含有2％胎牛血清(FBS，Gibco)及1×青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养基，用BD胰岛素针刺破卵泡分离原代颗粒细胞。弃去大的组织碎片，1500rpm离心后用上述培养基重悬细胞，均分到24孔培养板中，每孔细胞种植密度为2×105个。2小时后更换新鲜培养基待培养24小时后，使用饥饿培养基培养12小时后于培养基中加入终浓度为3μg/mL CTRP3蛋白于37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于0、6、12、24小时收集颗粒细胞后采用TRIZOL抽提RNA进行，Toyoba公司的cDNA一链合成试剂盒合成cDNA进行定量PCR分析。CTRP3的引物：5′-GGCAGACAAATGGATGCAAAGT-3′(上游引物)；5′-TAGGCAAAAACCATCTAGCACCT-3′(下游引物)。Cyclin D2引物序列：5′-
TCAAGTCCCGAGGTAGATGG-3′(上游引物)；5′-CACGGAAGAAAAGGAACCAA-3′(下游引物)。
Green Realtime PCRMaster Mix 10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，cDNA模板1μL，添加Nuclease-free Water将总体积补齐至20μL。反应条件：95℃60秒，(×40循环)
95℃15秒，60℃15秒(循环结束)，72℃45秒。经定量PCR分析CTRP3处理6小时后上调原代颗粒细胞中Cyclin D2的表达达到对照的5倍左右，处理12及24小时后Cyclin D2的表达持续上调(图8B)。以上研究结果表明CTRP3能够通过放大FSH对Akt及mTOR磷酸化的激活效应，进一步促进卵巢颗粒细胞中增殖相关基因Cyclin D2的表达，从而参与到FSH促进的卵泡发育调控中。
TCAAGTCCCGAGGTAGATGG-3′(上游引物)；5′-CACGGAAGAAAAGGAACCAA-3′(下游引物)。
Green Realtime PCRMaster Mix 10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，cDNA模板1μL，添加Nuclease-free Water将总体积补齐至20μL。反应条件：95℃60秒，(×40循环)
95℃15秒，60℃15秒(循环结束)，72℃45秒。经定量PCR分析CTRP3处理6小时后上调原代颗粒细胞中Cyclin D2的表达达到对照的5倍左右，处理12及24小时后Cyclin D2的表达持续上调(图8B)。以上研究结果表明CTRP3能够通过放大FSH对Akt及mTOR磷酸化的激活效应，进一步促进卵巢颗粒细胞中增殖相关基因Cyclin D2的表达，从而参与到FSH促进的卵泡发育调控中。
[0048] 实施例6：CTRP3对小鼠体内卵泡发育的影响
[0049] 由实施例1可知CTRP3蛋白在小鼠卵巢内表达，由实施例3和4得知外源性的CTRP3蛋白能够促进离体培养的卵巢组织以及离体培养的窦前卵泡的生长，为了进一步明了CTRP3在卵泡发育中的功能，我们采用卵巢系膜注射CTRP3抗体(美国abcam公司)来阻断CTRP3在卵巢内的作用，以对应的羊抗兔IgG(武汉博士德)为对照。孕马血清促性腺激素(PMSG)具有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的功能，以FSH为主，且半衰期较FSH长。在此我们通过腹腔注射5IU/小鼠的PMSG到21日龄的小鼠中促进小鼠卵巢中的窦状卵泡发育，以替代FSH的作用。具体操作如下：21日龄的昆明雌鼠，按照0.2mL/10g小鼠体重的剂量腹腔注射0.67％戊巴比妥钠浅层麻醉小鼠，然后剪开小鼠背部，小心用镊子将卵巢及周围脂肪组织拉出，避免直接接触卵巢组织损伤卵巢。将卵巢及卵巢外的脂肪垫一起用无齿镊子固定住后，使用胰岛素注射器从卵巢下方的脂肪垫入针注射相应的蛋白或抗体，一针注射且有明显囊状鼓起的认为成功注射。然后将卵巢及周围组织小心的送入体腔，伤口缝合，于稳定环境饲养小鼠。CTRP3抗体阻断总计分为4组，每组处理小鼠16只。第1组：左侧卵巢注射100ng兔源IgG，右侧卵巢注射相同体积的生理盐水。第2组：左侧卵巢注射10ngCTRP3抗体(Ab)，右侧卵巢注射10ng兔源IgG。第3组：左侧卵巢注射100ngCTRP3抗体，右侧卵巢注射
100ng兔源IgG。第4组：左侧卵巢注射10ngCTRP3抗体，右侧卵巢注射10ng CTRP3抗体及20ng CTRP3蛋白。待小鼠苏醒后，每只小鼠腹腔注射5IU的PMSG，然后分别于24小时及48小时颈椎脱臼处死小鼠，分离卵巢组织，4％PFA固定3小时后称重，结果发现注射100ng兔源IgG的卵巢重量与生理盐水接近，表明兔源IgG不影响PMSG诱导的卵泡发育。采用10ng及100ng的CTRP3抗体及兔源IgG卵巢系膜注射后发现PMSG注射24小时分离的小鼠卵巢重量没有明显改变；PMSG刺激卵泡发育48小时后10ng及100ng两个剂量CTRP3抗体注射一侧卵巢重量明显低于对照侧注射兔源IgG卵巢重量(图9)。在卵巢切片HE染色后观测到，注射CTRP3抗体一侧的卵巢较对照测卵巢，窦状卵泡的窦腔减小(图10)。采用Image J软件分析卵泡直径大小。
发现PMSG刺激卵泡发育48小时后10ng及100ng两个剂量CTRP3抗体注射一侧卵巢的窦状卵泡的平均直径小于对侧注射兔源IgG的卵泡平均直径(图11)。结果表明CTRP3抗体能够抑制PMSG诱导的卵泡发育。为了进一步验证CTRP3抗体对卵泡发育的抑制作用是经由CTRP3发挥作用给的，我们采用20ng的CTRP3蛋白提前与10ng的CTRP3抗体孵育后再通过卵巢外系膜注射，发现卵泡重量明显高于对侧单独10ng CTRP3抗体组，与生理盐水对照组的重量接近(图
9)。卵巢切片HE染色显示用CTRP3蛋白与对应的抗体提前孵育后，较对侧单独注射10ng CTRP抗体组的卵泡，有大量的晚窦期卵泡存在(图10)，窦状卵泡的直径也增大(图11)，表明CTRP3抗体对PMSG诱导的卵泡发育的抑制作用能够被CTRP3蛋白缓解。总而言之，CTRP3可以在活体动物水平参与PMSG诱导的卵泡发育过程。
100ng兔源IgG。第4组：左侧卵巢注射10ngCTRP3抗体，右侧卵巢注射10ng CTRP3抗体及20ng CTRP3蛋白。待小鼠苏醒后，每只小鼠腹腔注射5IU的PMSG，然后分别于24小时及48小时颈椎脱臼处死小鼠，分离卵巢组织，4％PFA固定3小时后称重，结果发现注射100ng兔源IgG的卵巢重量与生理盐水接近，表明兔源IgG不影响PMSG诱导的卵泡发育。采用10ng及100ng的CTRP3抗体及兔源IgG卵巢系膜注射后发现PMSG注射24小时分离的小鼠卵巢重量没有明显改变；PMSG刺激卵泡发育48小时后10ng及100ng两个剂量CTRP3抗体注射一侧卵巢重量明显低于对照侧注射兔源IgG卵巢重量(图9)。在卵巢切片HE染色后观测到，注射CTRP3抗体一侧的卵巢较对照测卵巢，窦状卵泡的窦腔减小(图10)。采用Image J软件分析卵泡直径大小。
发现PMSG刺激卵泡发育48小时后10ng及100ng两个剂量CTRP3抗体注射一侧卵巢的窦状卵泡的平均直径小于对侧注射兔源IgG的卵泡平均直径(图11)。结果表明CTRP3抗体能够抑制PMSG诱导的卵泡发育。为了进一步验证CTRP3抗体对卵泡发育的抑制作用是经由CTRP3发挥作用给的，我们采用20ng的CTRP3蛋白提前与10ng的CTRP3抗体孵育后再通过卵巢外系膜注射，发现卵泡重量明显高于对侧单独10ng CTRP3抗体组，与生理盐水对照组的重量接近(图
9)。卵巢切片HE染色显示用CTRP3蛋白与对应的抗体提前孵育后，较对侧单独注射10ng CTRP抗体组的卵泡，有大量的晚窦期卵泡存在(图10)，窦状卵泡的直径也增大(图11)，表明CTRP3抗体对PMSG诱导的卵泡发育的抑制作用能够被CTRP3蛋白缓解。总而言之，CTRP3可以在活体动物水平参与PMSG诱导的卵泡发育过程。
[0050] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 植物的生长促进 | 2020-05-24 | 718 |
| 一种生物刺激素及其制备方法 | 2020-05-19 | 457 |
| CTRP3蛋白的应用 | 2020-05-26 | 667 |
| 一种香蕉用肥料及其制备方法 | 2020-05-12 | 49 |
| 一种具有保水功能的腐植酸生物有机肥及其制备方法 | 2020-05-12 | 919 |
| 锂云母废料化肥及制备方法 | 2020-05-15 | 942 |
| 一种生物刺激素及其制备方法与应用 | 2020-05-19 | 198 |
| 包含无痕迹接头的持续释放递送系统 | 2020-05-17 | 982 |
| 具有降低之受體介導清除之生物活性多肽單體與免疫球蛋白質Ｆｃ片段之複合物及其製造方法 | 2020-05-16 | 198 |
| 免疫球蛋白Ｆｃ變體 | 2020-05-17 | 115 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物刺激素热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈