一种人造卵巢及其制备和应用
阅读：1024发布：2020-06-12
专利汇可以提供一种人造卵巢及其制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人造卵巢及其制备和应用，具体地，公开了一种人造卵巢，其包括 生物 相容性 支架 、卵泡细胞以及包被 混合液 ，其中，包被混合液包裹于卵泡细胞外部，并嵌合于生物相容性支架的空隙内部，本发明的包被混合液由包被辅料和生物 激素 制成。生物相容性支架以3D打印制成。本发明的人造卵巢适用于针对任何物种的原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡整体或部分组成细胞研究的研究工具，也适用于针对原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡相关因子、药物前体等的筛选模型，也适用于任何因素引起的卵巢受损的直接相关 疾病 或间接相关疾病的 预防 或 治疗 工具。，下面是一种人造卵巢及其制备和应用专利的具体信息内容。
1.一种人造卵巢，其包括生物相容性支架、卵泡细胞以及包被混合液，其中，包被混合液包裹于卵泡细胞外部，并嵌合于生物相容性支架的空隙内部。
2.根据权利要求1所述的人造卵巢，其中，包被混合液由包被辅料制成的流动性液体；
其中，包被辅料选自琼脂、琼脂糖、藻酸钙、透明质酸、基质胶、聚乙醇多聚物、聚乙烯醇多聚物，胶原蛋白凝胶、胶原蛋白、细胞外基质蛋白混合凝胶，或海藻酸盐与钙发生交联形成的水凝胶中的一种或多种；
优选地，包被混合液中还包含和生物激素，生物激素选自促进卵泡发育所需的激素或生长因子，优选地，生物激素选自卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、表皮细胞生长因子(EGF)。
3.根据权利要求1所述的人造卵巢，生物相容性支架的材料选自胶原Ⅰ、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、基质胶(Matrigel)、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖中的一种或者几种组合。
4.根据权利要求1所述的人造卵巢，所述生物相容性支架上具有空隙，空隙的直径为卵泡细胞直径的1倍-2倍，优选为1-1.5倍。
5.根据权利要求1所述的人造卵巢，所述卵泡细胞选自原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡、包含原始卵泡细胞的组织、包含腔前卵泡细胞的组织、包含有腔卵泡细胞的组织中的一种或者多种。
6.根据权利要求4所述的人造卵巢，其中，人造卵巢上具有针对不同卵泡细胞的一种以上的空隙尺寸，优选为1-4种空隙尺寸，更优选为2-4种空隙尺寸。
7.根据权利要求1-6任一项所述的人造卵巢，其中生物相容性支架通过3D打印制成，包裹卵泡细胞的包被混合液灌注于生物相容性支架的内部；或者
生物相容性支架材料与包裹卵泡细胞的包被混合液依次以逐层打印的方式通过3D打印制成。
8.根据权利要求1-7任一项所述的人造卵巢的制备方法，其包括以下步骤：
1)制备生物相容性支架材料；
2)制备包被混合液，并包被卵泡细胞；
3)以生物相容性支架材料，通过3D打印获得生物相容性支架，并将含卵泡的包被混合液灌注于生物相容性支架的内部空隙，或者
3)生物相容性支架材料与包裹卵泡细胞的包被混合液依次以逐层打印的方式通过3D打印制成。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤2)中以包被混合液包被卵泡细胞前，还包括将卵泡细胞进行培养的步骤。
10.本发明的人造卵巢做作为药物筛选、卵泡研究模型的用途。
一种人造卵巢及其制备和应用
技术领域
背景技术
[0003] 国家统计局当日发布第六次全国人口普查主要数据公报数据显示，全国总人口为1,339,724,852人。与2000年第五次全国人口普查相比，十年增加7390万人，增长5.84％，年平均增长0.57％，比1990年到2000年的年平均增长率1.07％下降0.5个百分点。数据表明，我国人口增长处于低生育水平阶段。
[0004] 2015年10月，中国共产党第十八届中央委员会第五次全体会议公报指出：促进人口均衡发展，坚持计划生育的基本国策，完善人口发展战略，全面实施一对夫妇可生育两个孩子政策，积极开展应对人口老龄化行动。
[0005] 然而近些年来，快节奏的工作和生活方式，高消费的压力，方方面面都挑战着婚育年龄的女性。因此，女性的健康，尤其是女性的生殖健康是不容忽视的社会问题。
[0006] (一)卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指初潮以后到40岁之前发生的低雌激素和高促性腺激素状态，伴随闭经、不孕，性器官萎缩及绝经期综合征等症状。近年来，临床上POF的发病率有逐年上升趋势，流行病学调查显示，POF发生率为1％，其中30岁之前的妇女人群发生率约0.1％，由于POF导致生育力丧失及低雌激素状态，成为影响女性生殖健康和社会稳定不可忽视的因素。卵巢早衰发生的原因很多，主要是由于卵巢中的原始卵泡过早耗竭或者原始卵泡不能发育而致。目前，辅助生殖技术如试管婴儿技术等已经成为治疗不孕不育症的关键技术。尤其是试管婴儿技术从建立之初的20多年的时间里发展迅速，令千千万万的家庭成功的拥有了自己的后代。然而，这项技术并不是万能的，并不能解决所有的不孕不育问题。试管婴儿技术的关键是必须要求母亲提供一枚高质量的成熟卵子，如果母亲无卵可排或排卵功能低下，比如对于卵巢早衰症患者，那么这项技术则爱莫能助。
[0007] (二)多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)
[0008] 多囊卵巢综合征是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，发病率占育龄期妇女的6～10％，其主要表现为月经稀发或闭经、不孕、卵巢多囊性变、肥胖、多毛、高雄激素血症等。对于PCOS患者的治疗，包括手术治疗、药物治疗和辅助生育技术。
[0009] 目前PCOS的药物治疗已取代手术治疗作为一线治疗方法，治疗的目的主要与病人的生育要求相关。如采用降低高雄激素血症的药物治疗，促排卵药物治疗，或胰岛素增敏剂(insulin-sensitizing drugs,ISD)治疗等。
[0010] PCOS的手术治疗可以减少卵巢中部分颗粒细胞，卵巢间质产生雄激素减少，从而使循环中的雄激素水平降低,进而GnRH降低，引起血清雄激素浓度进一步降低，这也说明卵巢间质亦受垂体-卵巢轴调控。主要包括双侧卵巢楔形切除术(BOWR)，.腹腔镜下卵巢电灼或激光打孔治疗(Laparoscopic ovariandrilling,LOD)和经阴道水腹腔镜(Transvaginalhydrolaparoscopy，THL)。
[0011] 也有PCOS患者采用辅助生育技术，尤其是对于应用6个月以上标准的促排卵周期治疗后有排卵但仍未妊娠的PCOS患者，或多种药物促排卵治疗及辅助治疗无排卵并急待妊娠的患者，可以选择胚胎移植的辅助生育技术。包括体外受精技术(In vitro fertilization,IVF)和.卵母细胞体外成熟技术(In vitro maturation,IVM)。
[0012] 然而以上治疗方法均有优缺点，关键是迄今为止，PCOS的发病机制仍不清楚，所以目前采用的治疗方法也只是治标。
[0013] (三)卵巢癌(Ovarian Cancer,OAC)
[0014] 雌性生殖癌症中，有的与内分泌相关。如，乳腺癌(Breast Cancer)，子宫内膜癌(Endometrial Cancer)和卵巢癌(Ovarian Cancer,OAC)等。其中，卵巢癌是发生于卵巢的一种恶性肿瘤，90％～95％为卵巢原发性的癌，另外5％～10％为其它部位原发的癌转移到卵巢。虽然我国的卵巢癌发病率不如欧美国家高，但根除性的手术治疗，以及细胞毒性的化疗，均缺乏有效降低卵巢癌的死亡率的效用。由于卵巢癌早期缺少症状，即使有症状也不特异，筛查的作用又有限，因此早期诊断比较困难，就诊时60％～70％已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。
[0015] 以上三种危害妇女的疾病，均造成女性正常卵子的发生、发育和排卵，导致不育不孕。除此而外，很多女性也患有多因素引发的内分泌紊乱、月经不调等症状，严重影响生理和心理状态。因此，开发具有分泌激素、发育卵泡或具有排卵功能的3D打印卵巢，将它植入卵巢功能不全的雌性，缓解内分泌失调、月经不调，甚至能够帮助雌性排卵并生下了健康的后代，为应用于治疗人类的不孕不育提供新的可能具有十分重要的社会意义。
[0016] 本项申请发明的几种类型的3D打印卵巢生物假体，无论是卵巢结构形态、支架通道的设计、细胞类型和培养方案等方面，更接近生理条件的卵巢，既可以作为筛选原始卵泡始动募集、卵泡周期募集、卵泡发育、排卵机制的有力研究工具，也可以为内分泌功能紊乱、月经不调患者、或不孕不育患者提供一个更可靠的预防或治疗方案的选择。
[0017] 充分结合生物学、细胞学与材料学，利用3D打印机技术，开发出含有不同发育时期卵泡的功能性3D打印卵巢生物假体，或用于体内外机制研究；或将它植入卵巢功能不全的雌性，恢复雌性生理特征，且能帮助雌性生下了健康的后代，为揭示不孕不育的机制提供新的工具，也为应用于缓解、预防或治疗人类的月经不调、不孕不育等提供新的选择。
发明内容
[0019] 在一个具体的技术方案中，包被混合液由包被辅料制成的流动性液体；
[0020] 其中，包被辅料选自琼脂、琼脂糖、藻酸钙、透明质酸、基质胶、聚乙醇多聚物、聚乙烯醇多聚物，胶原蛋白凝胶、胶原蛋白、细胞外基质蛋白混合凝胶，或海藻酸盐与钙发生交联形成的水凝胶中的一种或多种；
[0021] 在本发明的具体技术方案中，包被混合液由海藻酸钠盐和明胶分别配置成1.5％浓度，然后尝试按不同比例混合，配比选择为1:1，4:6，3:7，2:8，1:9。以各配比进行实验均能制成浓度合适的包被混合液。
[0022] 优选地，包被混合液中还包含生物激素，生物激素选自促进卵泡发育所需的激素或生长因子，优选地，生物激素选自卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、表皮细胞生长因子(EGF)。
[0023] 在本发明的技术方案中，生物相容性支架的材料选自胶原Ⅰ、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、基质胶(Matrigel)、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖中的一种或者几种任意组合。
[0024] 在本发明的技术方案中，所述生物相容性支架上具有空隙，空隙的直径为卵泡细胞直径的1倍-2倍，优选为1-1.5倍。
[0025] 在本发明的技术方案中，所述卵泡细胞选自原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡、包含原始卵泡细胞的组织、包含腔前卵泡细胞的组织、包含有腔卵泡细胞的组织中的一种或者多种。
[0026] 在本发明的技术方案中，人造卵巢上具有针对不同卵泡细胞的一种以上的空隙尺寸，优选为1-4种空隙尺寸，更优选为2-4种空隙尺寸。
[0027] 在本发明的技术方案中，生物相容性支架通过3D打印制成，包裹卵泡细胞的包被混合液灌注于生物相容性支架的内部；或者
[0028] 生物相容性支架材料与包裹卵泡细胞的包被混合液依次以逐层打印的方式通过3D打印制成。
[0029] 本发明所用的材料采用生物相容性材料，其组成成份模拟卵巢组织中包含的组分，其可以选自以下材料中的一种或者几种的组合。
[0030] 胶原Ⅰ是从动物体内提取出来的一种水凝胶基质，其生物相容性好、来源丰富、可塑性高、临床应用方便、无免疫原性等特点。其形成的凝胶网络利于营养物质的自由进出，具有良好的亲水性和细胞相容性。
[0031] 海藻酸钠是运用最为广泛的卵泡体外三维培养系统，支架成型效果好，可以简单地模拟天然组织。
[0032] 琼脂糖凝胶，已经成功地应用于人和仓鼠的腔前卵泡培养中。同时由于低熔点的琼脂糖熔融温度低，更适合于卵泡的包埋。
[0033] 基质胶是一种孔径大约在20～50nm的水凝胶基质，其主要成分为层粘连蛋白Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖及巢蛋白，与胚胎基底膜类似，良好地模拟体内细胞生长的微环境。
[0034] 透明质酸是一种高分子多糖，是细胞外基质的主要成分，有营养细胞、促进细胞分化的生理作用。但是力学性能较差，可通过改性修饰的方法，或复合其它材料的方法，改善其力学性能，扩展应用范围。
[0035] 本发明另一个方面提供了人造卵巢的制备方法，其包括以下步骤：
[0036] 1)制备生物相容性支架材料；
[0037] 2)制备包被混合液，并包被卵泡细胞；
[0038] 3)以生物相容性支架材料，通过3D打印获得生物相容性支架，并将含卵泡的包被混合液灌注于生物相容性支架的内部空隙，或者
[0039] 3)生物相容性支架材料与包裹卵泡细胞的包被混合液依次以逐层打印的方式通过3D打印制成。
[0040] 在本发明的技术方案中，在步骤2)中以包被混合液包被卵泡细胞前，还包括将卵泡细胞进行培养的步骤。
[0041] 本发明的人造卵巢做作为药物筛选、卵泡研究模型的用途。
[0042] 本发明的人造卵巢作为任何因素引起的卵巢受损的直接相关疾病或间接相关疾病的预防或治疗工具。
[0043] 在一个优选的技术方案中，本发明生物相容性支架的3D打印尺寸为：孔隙尺寸(R)：50μm～800μm；线条堆积夹角:0°～180°。
[0044] 本发明的一个优选的实施方案中以海藻酸钠作为支架材料，以3D打印的方法制备各种形状的支架(例如：圆形、长方形、正方形)，3D打印支架中的空隙长度为150um，支架夹角：90°，其中包含由(1.5％(w/v))海藻酸钠盐明胶包被液包被的腔前卵泡。在将卵泡包被前，腔前卵泡以培养液(a-MEM+10％FBS+5.5mg/mlPNa+ITS+5ng/mlEGF+400mIU PMSG)进行培养。
[0045] 本发明的人造卵巢的支架部分可以设置为多个尺寸以容纳不同大小，处于不同阶段的卵泡，从而实现卵泡依次生长为优势卵泡。本发明的人造卵巢适用于任何针对任何物种的原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡整体或部分组成细胞研究的研究工具，也适用于针对原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡相关因子、药物前体等的筛选模型，也适用于任何因素引起的卵巢受损的直接相关疾病或间接相关疾病的预防或治疗工具。
[0046] 有益效果
[0047] 本发明的3D打印卵巢可以引用于任何因素引起的卵巢受损，只要还有部分含有原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡的卵巢皮质存在，均可使用本发明的人工卵巢的制备方案，制备卵巢生物假体，对假体内的原始卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡进行发育刺激，使之成为可进入发育成熟的卵泡，将能够继续行使卵巢分泌激素和排出卵子的功能，维持雌性生理特征，缓解内分泌失调和月经不调等症状。附图说明
[0049] 图2为3D打印卵巢生物支架流程示意图，
[0050] 其中a)为CAD设计，b)为3D打印，c)为三维卵巢支架示意图。
[0051] 图3为卵泡/基质胶混合液的制备流程示意图，
[0052] 1为原始卵泡(primodial follicle)、2为腔前卵泡(preantral follicle)、3为有腔卵泡(antral follicle)、4为基质胶、5为原始卵泡/基质胶混合液、6为腔前卵泡/基质胶混合液、7为有腔卵泡/基质胶混合液。
[0053] 图4为几种不同类型的卵巢生物假体(I型、II型、III型、IV型、V型和VI型)的结构示意图。
[0054] 其中，1为原始卵泡/基质胶混合液、2为腔前卵泡/基质胶混合液、3为有腔卵泡/基质胶混合液、4为生物支架、5为I型或IV型卵巢生物假体、6为II型或V型卵巢生物假体、7为III型或VI型卵巢生物假体
[0055] 图5为本发明电镜图。
[0056] 图6为不同比例混合包被卵泡分泌孕酮(progesteron)的水平结果图。
具体实施方式
[0057] 实施例1 3D打印卵巢生物支架的设计及制备
[0058] (1)结合计算机辅助设计(computer aided design,CAD),采用三维打印技术构建卵巢支架，其中形状、组成成分及内部结构都具有良好可设计性；
[0059] (2)三维卵巢支架的形状，可以设计为圆形、长方形、正方形或类似卵巢形状，但保证内部结构联通，具有一定孔隙率；
[0060] (3)所用于三维卵巢支架的材料，选择发明所用的生物相容性材料，不仅能用于卵泡生长，还能起到支撑作用，且还方便于三维打印成型。供选择材料：胶原Ⅰ、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、基质胶(Matrigel)、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖中的一种或者几种任意组合分别打印。
[0061] (4)所构建三维卵巢内部结构参数(见图)：孔隙尺寸(R)：150μm(根据注入支架的不同发育时期卵泡大小而异)；线条堆积夹角(α):90°～180°。
[0062] (5)将制备好的支架置于-80℃储存备用。
[0063] 实施例2卵泡的获得
[0064] (1)腔前卵泡的获得
[0065] 自然获得法：对出生后12-14天的雌性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，消毒皮肤后，背位无菌摘取卵巢，放入分离培养基中(L-15+10％FBS+100IU/ml青霉素+100ug/ml链霉素)。在实体显微镜下剔除卵巢周围附带组织，在分离液中清洗3遍。然后在镜下用胰岛素计量注射针刺卵巢，释放小鼠卵巢内直径为100～130μm的腔前卵泡。
[0066] DES处理法：首先将对19日龄小鼠，皮下埋植DES，3天后，采用颈椎脱臼法处死，消毒皮肤后，背位无菌摘取卵巢，放入分离培养基中(L-15+10％FBS+100IU/ml青霉素+100ug/ml链霉素)。在实体显微镜下剔除卵巢周围附带组织，在分离液中清洗3遍。然后在镜下用胰岛素计量注射针刺卵巢，释放小鼠卵巢内直径为100～130μm的腔前卵泡。
[0067] (2)有腔卵泡的获得
[0068] 对21日龄的雌性小鼠腹腔注射PMSG，48小时后，采用颈椎脱臼法处死，消毒皮肤后，背位无菌摘取卵巢，放入分离培养基中(L-15+10％FBS+100IU/ml青霉素+100ug/ml链霉素)。在实体显微镜下剔除卵巢周围附带组织，在分离液中清洗3遍。然后在镜下用胰岛素计量注射针刺卵巢，释放小鼠卵巢内直径为200～3000μm的有腔卵泡。
[0069] (3)原始卵泡的获得
[0070] 对3日龄的雌性小鼠采用颈椎脱臼法处死，消毒皮肤后，背位无菌摘取卵巢，放入分离培养基中(L-15+10％FBS+100IU/ml青霉素+100ug/ml链霉素)。在实体显微镜下剔除卵巢周围附带组织，在分离液中清洗3遍。然后在镜下用胰岛素计量注射针刺卵巢，将小鼠卵巢分成含有原始卵泡的组织碎片。
[0071] 实施例3包被混合液的制备
[0072] 包被混合液以琼脂/琼脂糖、藻酸钙和透明质酸、基质胶、人工合成的聚乙醇或聚乙烯醇多聚物、胶原蛋白凝胶、胶原蛋白与细胞外基质蛋白混合凝胶、或海藻酸盐与钙发生交联进行稀释形成的具有流动性水凝胶。以海藻酸钠盐和明胶复配时的浓度为1.5％(w/v)。海藻酸钠盐和明胶分别配置成1.5％浓度，然后尝试按不同比例混合，配比选择为1:1，4:6，3:7，2:8，1:9。以各配比进行实验均能制成浓度合适的包被混合液。参见附图6。
[0073] 实施例4包被混合液包被卵泡
[0074] (1)腔前卵泡/包被混合液的制备。
[0075] 将腔前卵泡在分离液中清洗1-2遍，并种入96孔板内的混合培养液中。
[0076] (其中，混合培养液成分为：a-MEM+10％FBS+5.5mg/mlPNa+ITS+5ng/mlEGF+100mIUrFSH)。混合培养液先在37℃，5％CO2的培养箱内平衡2-4小时。然后，用经灭菌处理的包被混合液包裹单个腔前卵泡。)
[0077] (2)有腔卵泡与基质胶混匀形成：有腔卵泡/基质胶混合液。
[0078] 将有腔卵泡在分离液中清洗1-2遍，然后在96孔板内种入混合培养液中。
[0079] (注：混合培养液：a-MEM+10％FBS+5.5mg/mlPNa+ITS+5ng/mlEGF+100mIUrFSH。混合培养液先在37℃，5％CO2的培养箱内平衡2-4小时。然后，用经灭菌处理的包被混合液包裹单个有腔卵泡。)
[0080] (3)原始卵泡与基质胶混匀形成：原始卵泡/基质胶混合液。
[0081] 将含有原始卵泡的卵巢皮质组织碎片在分离液中清洗1-2遍，然后在96孔板内种入混合培养液中。
[0082] (注：混合培养液：a-MEM+10％FBS+5.5mg/mlPNa+ITS+5ng/mlEGF+100mIUrFSH。混合培养液先在37℃，5％CO2的培养箱内平衡2-4小时。然后，用经灭菌处理的包被混合液包裹含有原始卵泡的组织碎片。)
[0083] 实施例5 I型3D打印卵巢生物假体的制备及功能测定
[0084] (1)储存备用的卵巢生物支架预处理：将在-80℃储存备用的卵巢生物支架取出，放置室温20分钟，然后在生理盐水中孵育30分钟。
[0085] (2)将原始卵泡/基质胶混合液注入卵巢生物支架：将经灭菌处理的CaCl2(50mM)-NaCl(150mM)混合液加入卵巢生物支架中，然后用加样枪将含有原始卵泡的包被混合液悬空打入支架不同部分中，2-5分钟后形成具有原始卵泡的卵巢生物支架，形成I型3D打印卵巢生物假体。
[0086] (3)I型3D打印卵巢生物假体及功能测定：
[0087] 将大小为长(5mm)×宽(2.5mm)×厚(2.5mm)的I型卵巢生物假体(含有20个原始卵泡基质胶溶液)使用100μM bpV(a PTEN inhibitor，Calbiochem)和/或500μg/mL 740Y-P(a PI3K agonist，Tocris)处理24小时；对照组在不加任何抑制剂的培养液中24小时。24小时后，对实验组和对照组的卵巢生物假体进行组织切片Foxo3染色，阳性信号着色的为激活的原始卵泡。结果显示：bpV和/或740Y-P处理过的卵巢假体中的组织，50％以上的原始卵泡显示Foxo3阳性信号。上述实验结果表明原始卵泡在卵巢生物假体中的状态正常。
[0088] 实施例6 II型3D打印卵巢生物假体的制备及功能测定
[0089] (1)储存备用的卵巢生物支架预处理：将在-80℃储存备用的卵巢生物支架取出，放置室温20分钟，然后在生理盐水中孵育30分钟。
[0090] (2)将腔前卵泡/基质胶混合液注入卵巢生物支架：将经灭菌处理的CaCl2(50mM)-NaCl(150mM)混合液加入支架中，然后用加样枪将含有单个腔前卵泡的包被混合液悬空打入支架不同部分中，2-5分钟后形成具有腔前卵泡的卵巢生物支架，形成II型3D打印卵巢生物假体。
[0091] (3)卵巢切除小鼠的制备：对8-10周龄的(C57BL6/6JxCBA/Ca)雌性小鼠进行卵巢摘除，术后休息4周。
[0092] (4)移植II型3D打印卵巢生物假体及功能测定：
[0093] 实验组：将大小为长(5mm)×宽(2.5mm)×厚(2.5mm)的卵巢生物假体(含有50个腔前卵移植到卵巢切除雌鼠颈背部皮下。
[0094] 对照组:将大小为长(5mm)×宽(2.5mm)×厚(2.5mm)的生物支架(含有基质胶溶液)移植到卵巢切除颈背部皮下。
[0095] 移植3天后，每48h给小鼠腹腔注射1IU FSH，直至4周。1周后，每天检测发情周期，眼部取血检测血清中雌激素孕激素水平。回收移植的卵巢生物假体36小时前，每只小鼠脾下注射20IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)。然后，取出移植的卵巢生物假体进行形态分析和卵巢计数。
[0096] 结果显示：与对照组相比，4周后，实验组小鼠开始有规律的生理周期，雌激素与孕激素水平明显升高；实验组中卵巢生物假体中具有优势卵泡和排卵后的新鲜黄体，提示II型卵巢生物假体中的腔前卵泡能够发育，分泌激素，维持雌性生理周期，并能够排卵。
[0097] 实施例7 III型3D打印卵巢生物假体的制备及功能测定
[0098] (1)储存备用的卵巢生物支架预处理：将在-80℃储存备用的卵巢生物支架取出，放置室温20分钟，然后在生理盐水中孵育30分钟。
[0099] (2)将有腔卵泡/基质胶混合液注入卵巢生物支架：将经灭菌处理的CaCl2(50mM)-NaCl(150mM)混合液加入支架中，然后用加样枪将含有单个有腔卵泡的包被混合液悬空打入支架不同部分中，2-5分钟后形成具有有腔卵泡的卵巢生物支架。
[0100] (3)卵巢切除小鼠的制备：对8-10周龄的(C57BL6/6JxCBA/Ca)雌性小鼠进行卵巢摘除，术后休息4周。
[0101] (4)移植III型3D打印卵巢生物假体及功能测定：
[0102] 实验组：将大小为长(5mm)×宽(2.5mm)×厚(2.5mm)的卵巢生物假体(含有50个有腔卵泡)移植到卵巢切除雌鼠颈背部皮下。
[0103] 对照组:将大小为长(5mm)×宽(2.5mm)×厚(2.5mm)的生物支架(只含有基质胶溶液)移植到卵巢切除雌鼠颈背部皮下。
[0104] 移植3天后，每48h给小鼠腹腔注射1IU FSH，直至4周。1周后，每天检测发情周期，眼部取血检测血清中雌激素孕激素水平。回收移植的卵巢生物假体36小时前，每只小鼠脾下注射20IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)。然后，取出移植的卵巢生物假体进行形态分析和卵巢计数。
[0105] 结果显示：与对照组相比，2周后，实验组小鼠开始有规律的生理周期，雌激素与孕激素水平明显升高；实验组中卵巢生物假体中具有优势卵泡和排卵后的新鲜黄体，提示III型卵巢生物假体中的腔前卵泡能够发育，分泌激素，维持雌性生理周期，并能够排卵。
[0106] 实施例8 IV型3D打印卵巢生物假体的制备
[0107] 准备卵巢支架打印材料和原始卵泡/包被混合液，卵巢支架打印材料的制备同实施例1，原始卵泡/包被混合液的制备同实施例4。在3D打印机上以双枪头分别打印卵巢支架材料和原始卵泡/包被混合液。打印一层支架材料后，打印一层原始卵泡/包被混合液，如此循环完成原始卵泡卵巢生物假体，即IV型3D打印卵巢生物假体。
[0108] 实施例9 V型3D打印卵巢生物假体的制备及功能测定
[0109] 准备卵巢支架打印材料和腔前卵泡/包被混合液，卵巢支架打印材料的制备同实施例1，腔前卵泡/包被混合液的制备同实施例4。在3D打印机上以双枪头分别打印卵巢支架材料和腔前卵泡/包被混合液。打印一层支架材料后，打印一层腔前卵泡/包被混合液，如此循环完成腔前卵泡卵巢生物假体，即V型3D打印卵巢生物假体。
[0110] 实施例10 VI型3D打印卵巢生物假体的制备及功能测定
[0111] 准备卵巢支架打印材料和腔前卵泡/包被混合液，卵巢支架打印材料的制备同实施例1，有腔卵泡/包被混合液的制备同实施例4。在3D打印机上以双枪头分别打印卵巢支架材料和有腔卵泡/包被混合液。打印一层支架材料后，打印一层有腔卵泡/包被混合液，如此循环完成有腔卵泡卵巢生物假体，即VI型3D打印卵巢生物假体。
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