技术领域
[0001] 本
发明涉及酶活性测定技术领域，具体为一种直接双酶电极及其在植酸酶活性测定中的应用。
背景技术
[0002] 植酸酶是催化植酸及其植酸盐
水解为肌醇和
磷酸的一类水解酶的统称，在
饲料、食品、环境和医药等领域有着广泛应用。植酸酶的应用主要取决于植酸酶的酶活性，在环保和节源的前提下，
发酵法制备植酸酶的应用越来越多，而发酵法制备植酸酶的过程中，植酸酶活性测定对发酵的过程控制具有重要的意义，也是产品
质量控制的关键环节。
[0003] 植酸酶活性测定最早采用比色法，然而由于比色法存在对样品的预处理复杂、样品
颜色和
浊度对测定结果干扰大等问题，因此，逐渐被
生物感应器测定法取代。生物感应器测定酶活性具有快速、灵敏、准确且操作简单的优点，生物感应器测定酶活性，需要制作酶膜，将酶膜套装在电极上，通过读取生物感应器上的
电流值计算酶活性，此测定过程具有酶膜更换麻烦、酶膜的使用寿命短、且在酶膜的制备过程中酶膜组份浪费多的缺点；直接双酶电极的出现解决了酶膜更换麻烦的缺点，但是对于酶膜的使用寿命短、酶膜的制备材料浪费多的缺点并没有更好的解决，且现有的直接双酶电极对植酸酶活性定量测定的过程中，具有准确度和重复性差的缺点。
发明内容
[0004] 鉴于此，本发明提供了一种直接双酶电极及其在植酸酶活性测定中的应用，该直接双酶电极的制备方法具有直接酶电极制备方法简单、成本低、易于学习的优点；该直接双酶电极具有酶活衰减慢、使用寿命长且成本低的优点；将该直接双酶电极安装在生物感应器上，获得的生物感应器具有电极易于更换、对于植酸酶活性测定准确度和重复性高、使用寿命长且使用成本低的优点。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 本发明提供了一种直接双酶电极，其制备方法如下：
[0007] (1)将
氧化
石墨烯溶胶滴涂于金电极表面并烤干，然后采用
电沉积法使次黄嘌呤
氧化酶(XOD)0.04～0.06U和壳聚糖水溶液在金电极的表面直接共沉积成膜，其中，壳聚糖水溶液的pH为5.7～6.3；
[0008] (2)取嘌呤核苷磷
酸化酶(PNP)0.15～0.25U、5％血红蛋白3.5～4.5ul、0.1％非离子
表面活性剂TX-10 0.5～1.5ul，混匀，静置5～10min，获得
混合液[0009] A；然后向混合液A中加入2.5％戊二
醛1～3ul，混匀，获得混合液B，将混合液B在1min之内
喷涂于步骤(1)获得的电极表面，静置
固化18～22min；
[0010] (3)用蒸馏水冲洗步骤(2)获得的电极表面，然后
对电极冷冻干燥，获得直接PNP-XOD双酶电极。
[0011] 其中，在直接双酶电极的制备方法中，5％血红蛋白、0.1％非离子表面活性剂TX-10、2.5％戊二醛、0.2％～0.6％氧化
石墨烯溶胶和0.1％～0.3％壳聚糖水溶液中的“％”均为质量分数。
[0012] 优选的，在直接双酶电极制备方法的步骤(1)中，将0.2％～0.6％氧化石墨烯溶胶滴涂于金电极表面并烤干，烤干
温度为50～66℃，然后在金电极的表面共沉积次黄嘌呤氧化酶(XOD)0.05U和0.1％～0.3％壳聚糖水溶液，并用氧化还原法进行修饰，其中，壳聚糖水溶液的pH为6.0。
[0013] 优选的，在直接双酶电极制备方法的步骤(1)中，将0.4％氧化石墨烯溶胶滴涂于金电极表面并烤干的过程时，烤干温度为58℃。
[0014] 优选的，在直接双酶电极制备方法的步骤(2)中，取嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)0.2U、5％血红蛋白4ul、0.1％非离子表面活性剂TX-10 1.0ul，混匀，静置7min，获得混合液A；然后向混合液A中加入2.5％戊二醛2ul，混匀，获得混合液B，将混合液B在1min之内喷涂于步骤(1)获得的电极表面，静置固化20min。
[0015] 非离子表面活性剂TX-10本身不带电荷，在水溶液中不会因为电离产生静电斥
力，因此它的加入不会影响酶与底物的结合，另外，非离子表面活性剂可以提高酶在反应液中的分散性，降低溶液表面
张力，使酶活性中心集团更易贴近底物，从而增加酶的催化能力。
[0016] 血红蛋白作为辅助酶交联的第二“载体”蛋白，可以增加蛋白浓度，保护酶蛋白交联过程免受化学修饰而失活，同时，血红蛋白具有氧化活性，作为辅助载体蛋白交联时，可提高直接双酶电极的酶活性和
稳定性，降低直接双酶电极的衰减速率。
[0017] 将根据上述直接双酶电极的制备方法获得的直接双酶电极安装于生物感应器上，获得的生物感应器对H2O2的
检测限为0.005mmol/L，检测限的RSD为0.33％；回收率为99.7％，RSD为0.50％。
[0018] 使用安装有本发明制备的直接双酶电极的生物感应器在植酸酶活性测定中的应用，包括以下测定步骤：
[0019] (1)标准品定标1：1)生物感应器清洗：将生物感应器开机，开启清洗
泵、排空泵使三反应体系缓冲液注入并排出检测池，重复操作3～5次；2)生物感应器平衡：将三反应体系缓冲液注入检测池中，开启搅拌混匀装置；3)标准品测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I(n)始，然后向检测池内注入植酸酶标准品，记录电流数值I(n)终，计算标准品的电流差值Bn，公式如下：Bn＝I(n)终-I(n)始；n为大于等于1的正整数；
[0020] (2)标准品定标2：1)重复步骤(1)中生物感应器的清洗、平衡步骤，待用；2)标准品测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I(n+1)始，然后向检测池内注入植酸酶标准品，记录电流数值I(n+1)终，计算标准品的电流差值Bn+1，公式如下：Bn+1＝I(n+1)终-I(n+1)始；
[0021] 当Bn+1和Bn的RSD小于等于1％时，生物感应器标定通过；
[0022] (3)植酸酶活性的测定：1)重复步骤(1)中生物感应器的清洗、平衡步骤，待用；2)植酸酶活性的测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I样始，然后向检测池内注入植酸酶发酵液，记录电流数值I样终，计算样品的电流差值B样，并根据公式计算发酵液中植酸酶的活性Q样，公式如下
[0023] B样＝I样终-I样始
[0024]
[0025] 其中，Q标为植酸酶标准品的活性；
[0026] 其中，所述三反应体系溶液包括下述重量份数的组份：
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)90～110份、植酸2.0～2.5份、肌苷7.0～8.0份、FAD 0.05～0.15份、苯
甲酸钠1.0～2.0份、EDTA 0.05～0.15份。
[0027] 本发明的检测方法中，首先通过标准品定标的方式，对包括生物感应器和直接双酶电极的生物传感系统的稳定性进行测定，当仪器系统的稳定性良好时，对样品进行检测，具有酶活性测定结果准确的优点，为发酵过程的控制提供可靠的数据参考。
[0028] 优选的，在上述生物感应器对植酸酶活性测定的方法，所述三反应体系溶液包括下述重量份数的组份：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)100份、植酸2.2份、肌苷7.5份、FAD 0.1份、
苯甲酸钠1.5份、EDTA 0.1份。
[0029] 生物感应器测定植酸酶活性的原理：植酸酶具有催化植酸生成磷酸的催化活性，而磷酸可作为底物，与肌苷作用，由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化为次黄嘌呤；次黄嘌呤由次黄嘌呤氧化酶(XOD)高效、专一催化生成H2O2，H2O2产量与植酸酶活性正相关，通过定量H2O2可实现对植酸酶活性的测定。在测定过程中，使用的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、次黄嘌呤氧化酶(XOD)具有催化效率高、酶活性稳定、易于固定化、固定化后酶活较高、稳定，且酶活衰减慢、寿命长的优点。
[0031] 1、本发明提供的直接双酶电极具有酶活衰减慢、使用寿命长且成本低的优点。
[0032] 2、本发明制备的直接双酶电极的制备方法具有过程简单、易于操作的优点，获得的直接双酶电极具有酶催化利用率高，电
信号传输快、酶活性降低速率慢的优点。
[0033] 3、使用直接双酶电极对直接植酸酶活性测定的方法具有实用性高、精
密度高且重复使用稳定性高的优点。
[0034] 4、使用直接双酶电极的生物感应器具有稳定性高、精密度高的优点，从而实现对发酵液中植酸酶准确的定量检测。
[0035] 5、将本发明提供的直接双酶电极应用的生物感应器上，对植酸酶活性测定，具有系统稳定性高、设备的良好性能，测定结果的准确度高的优点，为发酵过程的控制提供可靠的数据参数。
[0036] 6、将直接双酶电极应用到生物感应器上，获得的生物感应器对H2O2的检测限为0.005mmol/L，检测限的RSD为0.33％；回收率为99.7％，RSD为0.50％，具有检测限低、灵敏度高的优点，说明本发明提供的直接双酶电极具有检测性能高的优点。
具体实施方式
[0037] 下面结合
实施例对本发明进行详细说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下，可以对本发明的技术方案细节进行
修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
[0038] 实施例1：
[0039] 一种直接双酶电极，其制备方法如下：
[0040] (1)将0.4％氧化石墨烯溶胶滴涂于金电极表面并烤干，烤干温度为[0041] 58℃，然后在金电极的表面共沉积次黄嘌呤氧化酶(XOD)0.05U和0.2％壳聚糖水溶液，并用氧化还原法进行修饰，其中，壳聚糖水溶液的pH为6.0；
[0042] (2)取嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)0.20U、5％血红蛋白4.0ul、0.1％非离子表面活性剂TX-10 1.0ul，混匀，静置7min，获得混合液A；然后向混合液A中加入2.5％戊二醛2ul，混匀，获得混合液B，将混合液B在1min之内喷涂于步骤(1)获得的电极表面，静置固化20min；
[0043] (3)用蒸馏水冲洗步骤(2)获得的电极表面，然后对电极冷冻干燥，获得直接PNP-XOD双酶电极。
[0044] 将根据上述直接双酶电极的制备方法获得的直接双酶电极安装于生物感应器上，获得的生物感应器分别对H2O2的检测限、回收率及回收率的RSD进行测定，测定方法如下：
[0045] 检测限的测定：
[0046] 检测限的测定步骤如下：
[0047] (1)生物感应器清洗：将生物感应器开机，开启清洗泵、排空泵，使醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)注入并排出检测池，重复操作3～5次；
[0048] (2)生物感应器平衡：将醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)注入检测池中，开启搅拌混匀装置；
[0049] (3)H2O2检测限的测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I始，然后向检测池内注入H2O2溶液，记录电流数值I终，计算标准品的电流差值B，公式如下：B＝I终-I始；
[0050] 其中，H2O2溶液的浓度为：0.005mmol/L。
[0051] 重复步骤(1)～步骤(3)6次，计算六次测定的Bn的平均值及RSD，结果如下：
[0052]
[0053] 通过上述表格可以看出，本发明提供的直接双酶电极安装在生物感应器上，获得的生物感应器对H2O2的检测限为0.005mmol/L，RSD为0.33，这表明，将本发明提供的直接双酶电极安装在生物感应器上具有仪器稳定性高、测定的检测限低的优点。
[0054] 回收率的测定：
[0055] 回收率的测定步骤如下：
[0056] (1)重复检测限测定步骤中的步骤(1)和步骤(2)；
[0057] (2)80％水平的H2O2溶液的测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I始，然后向检测池内注入80％水平的H2O2溶液，记录电流数值I终，计算标准品的电流差值B，公式如下：B＝I终-I始；
[0058] (3)100％水平的H2O2溶液的测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I始，然后向检测池内注入100％水平的H2O2溶液，记录电流数值I终，计算标准品的电流差值B，公式如下：B＝I终-I始；
[0059] (4)120％水平的H2O2溶液的测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I始，然后向检测池内注入120％水平的H2O2溶液，记录电流数值I终，计算标准品的电流差值B，公式如下：B＝I终-I始；
[0060] 其中，80％水平的H2O2溶液的浓度为：4mmol/L；100％水平的H2O2溶液的浓度为：5mmol/L；120％水平的H2O2溶液的浓度为：6mmol/L；
[0061] 采用上述方法，将80％水平的H2O2溶液和120％水平的H2O2溶液分别测定三次，100％水平的H2O2溶液测定两次；将100％水平的H2O2溶液作为标准品，并根据100％水平的H2O2溶液的浓度和测定的电流差值，用外标法分别计算80％水平的H2O2溶液和120％水平的H2O2溶液的浓度，并计算回收率和RSD，公式如下：
[0062]
[0063] C标准为100％水平的H2O2溶液的浓度；
[0064] B平均为100％水平的H2O2溶液测定两次电流差值的平均值；
[0065] B样品为80％水平的H2O2溶液测定的电流差值或100％水平的H2O2溶液测定的电流差值；
[0066] C样品为80％水平的H2O2溶液或100％水平的H2O2溶液测定的浓度；
[0067] C实际为80％水平的H2O2溶液或100％水平的H2O2溶液实际制备的浓度。
[0068] 测定结果如下：
[0069]
[0070] 通过上述表格可以看出，本发明提供的直接双酶电极安装在生物感应器上，获得的生物感应器对H2O2的回收率为99.7％，RSD为0.50％，表明使用本发明提供的生物感应器对H2O2测定的准确度高，而生物感应器的性能主要由酶电极的性能决定，因此，可以判断出，本发明提供的直接双酶电极具有测定过程稳定性高的优点。
[0071] 实施例2：
[0072] 一种直接双酶电极，其制备方法如下：
[0073] (1)将0.2％氧化石墨烯溶胶滴涂于金电极表面并烤干，烤干温度为50℃，然后在金电极的表面共沉积次黄嘌呤氧化酶(XOD)0.04U和0.1％壳聚糖水溶液，并用氧化还原法进行修饰，其中，壳聚糖水溶液的pH为5.7；
[0074] (2)取嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)0.15U、5％血红蛋白3.5ul、0.1％非离子表面活性剂TX-10 0.5ul，混匀，静置5min，获得混合液A；然后向混合液A中加入2.5％戊二醛1ul，混匀，获得混合液B，将混合液B在1min之内喷涂于步骤(1)获得的电极表面，静置固化18min；
[0075] (3)用蒸馏水冲洗步骤(2)获得的电极表面，然后对电极冷冻干燥，获得直接PNP-XOD双酶电极。
[0076] 实施例3：
[0077] 一种直接双酶电极，其制备方法如下：
[0078] (1)将0.6％氧化石墨烯溶胶滴涂于金电极表面并烤干，烤干温度为66℃，然后在金电极的表面共沉积次黄嘌呤氧化酶(XOD)0.06U和0.3％壳聚糖水溶液，并用氧化还原法进行修饰，其中，壳聚糖水溶液的pH为6.3；
[0079] (2)取嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)0.25U、5％血红蛋白4.5ul、0.1％非离子表面活性剂TX-10 1.5ul，混匀，静置10min，获得混合液A；然后向混合液A中加入2.5％戊二醛3ul，混匀，获得混合液B，将混合液B在1min之内喷涂于步骤(1)获得的电极表面，静置固化22min；
[0080] (3)用蒸馏水冲洗步骤(2)获得的电极表面，然后对电极冷冻干燥，获得直接PNP-XOD双酶电极。
[0081] 将实施例1～实施例3提供的直接双酶电极安装在生物感应器上，采用以下样品检测方法，对发酵液中植酸酶活性进行测定，步骤如下：
[0082] (1)标准品定标1：1)生物感应器清洗：将生物感应器开机，开启清洗泵、排空泵使三反应体系缓冲液注入并排出检测池，重复操作3～5次；2)生物感应器平衡：将三反应体系缓冲液注入检测池中，开启搅拌混匀装置；3)标准品测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I(n)始，然后向检测池内注入植酸酶标准品，记录电流数值I(n)终，计算标准品的电流差值Bn，公式如下：Bn＝I(n)终-I(n)始；n为大于等于1的正整数；
[0083] (2)标准品定标2：1)重复步骤(1)中生物感应器的清洗、平衡步骤，待用；2)标准品测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I(n+1)始，然后向检测池内注入植酸酶标准品，记录电流数值I(n+1)终，计算标准品的电流差值Bn+1，公式如下：Bn+1＝I(n+1)终-I(n+1)始；
[0084] 当Bn+1和Bn的RSD小于等于1％时，生物感应器标定通过；
[0085] (3)植酸酶活性的测定：1)重复步骤(1)中生物感应器的清洗、平衡步骤，待用；2)植酸酶活性的测定：运行检测样品程序，记录电流初始数值I样始，然后向检测池内注入植酸酶发酵液，记录电流数值I样终，计算样品的电流差值B样，并根据公式计算发酵液中植酸酶的活性Q样，公式如下
[0086] B样＝I样终-I样始
[0087]
[0088] 其中，Q标为植酸酶标准品的活性。
[0089] 采用上述方法，对同一发酵液进行测定，计算发酵液中植酸酶活性；在测定过程中，记录以下内容：
[0090] (1)实施例1～实施例3提供的直接双酶电极安装在生物感应器上对标准品定标过程中的定标次数，用以观察直接双酶电极和生物感应器的稳定性结果如下：
[0091] (2)当生物感应器标准品定标后，对样品采取双样双平行的方式测定其电流差值，观察样品测定的准确度；
[0092] 植酸酶发酵及发酵过程中取样：
[0093] 植酸酶发酵菌种：毕赤
酵母工程菌SWS218，本实验室收藏。
[0094] YPD
种子培养基(g/L)：酵母粉20g，蛋白胨40g，
葡萄糖20g。
[0095] 诱导培养基(g/L):无
氨基酵母氮源(YNB)13.4g，酵母粉10g，蛋白胨10g，KH2PO4 11.8g，K2HPO4 2.9g。
[0096] 无菌条件下，将生长状态好的单个菌落接种于YPD培养基中，并将其置于装液量为50ml的250mL摇瓶中，于30℃、220r/min培养24h，作为发酵种子液。将种子液按10％接种量转接于7L诱导培养基中，于27℃、220r/min诱导培养24h，后按7mL/L补料甲醇，继续发酵
24h，每个取样口取样2个，用以测定植酸酶活性。
[0097] 对上述发酵液样品进行测定，将获得的植酸酶活性进行记录，结果如下：
[0098]
[0099] 注[1]：标定通过的记录是指：当Bn+1和Bn的RSD小于等于1％时，n的数值。
[0100] 通过上述结果可以看出，采用本发明提供的直接双酶电极对发酵液中植酸酶的活性进行测定，具有测定的结果准确度高的特点，标定通过中n的数值为1，表明仪器稳定性高；6次植酸酶活性测定结果的RSD为0.91％，表明本发明提供的直接双酶电极应用到生物感应器上，具有测定过程稳定性高、双酶活性高、结果准确度高的优点，为发酵过程的控制提供可靠的数据参数。
