[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其微生物蛋白质合成领域。具体地说，本发明涉及一种通过经过基因修饰的微生物生产蛋白质的方法，另外，还涉及能用于这种类型的方法的微生物。本发明还涉及这种类型的微生物在蛋白质生产中的应用。

[0002] 可以使用微生物来制造有用物质。例如，有用物质是低分子化合物，例如，食品补充材料或制药学上有效的化合物，或蛋白质，由于其多样性而具有广大的技术应用范围。在第一种情况下，利用和/或改变相关微生物的代谢特性来制造有用物质用；在第二种情况下优选使用能表达目的蛋白质的基因的微生物。

[0003] 为了进行大规模的生物技术生产，在发酵罐中培养微生物，根据其新陈代谢特性配置该发酵罐。在培养期间微生物代谢所提供的底物,并形成所希望的产品，后者在发酵结束之后通常从生产微生物中分离出来，并从发酵罐肉汤和/或发酵培养基中提纯和/或浓缩。在蛋白质的发酵生产中，除碳源(一般为葡萄糖)外，一般使用复杂的富含蛋白质的原料作为底物。因此，蛋白质生产相当于底物蛋白质向目的蛋白质的生物转化。这要求把蛋白质完全水解为各氨基酸，其可供目的蛋白质生物合成使用。

[0004] 因而在微生物发酵方面有大量现有技术，从优化相关菌株，例如在形成速度和养分利用方面，通过发酵罐的技术设计，直至从相关微生物和/或发酵培养基分离有用物质。

[0005] 在微生物发酵中采用细菌原则上是期望的。

[0006] 细菌的特征在于，传代时间短和对培养条件要求低。因此可以建立成本低廉的培养方法或生产方法。本领域技术人员在发酵技术上有丰富的经验。优选采用格兰氏阳性细菌，因为它们将要生产的蛋白质(目的蛋白质)分泌至其周围的培养基中。

[0007] 通常在微生物发酵时期望获得尽可能高的成品收率(product yield)。例如,国际专利申请WO 91/02792公开了在来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因调节序列，尤其是地衣芽孢杆菌启动子的控制下,在优化的地衣芽孢杆菌菌株中，经过改善地生产来自迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶。

[0008] 在现有技术中还没有令人满意地可与地衣芽孢杆菌相比，籍此达到高的或者甚至更加改善的成品收率的替代生产微生物可供使用。此外，对于使高成品收率成为可能的微生物发酵方法，还存在一种较高的需求。

[0009] 本发明的目的在于，在微生物发酵中达到产品，尤其蛋白质的高成品收率。

[0010] 本发明的提供通过微生物生产蛋白质的方法,包括下列方法步骤：

[0011] (a)在微生物中引入包括启动子和编码蛋白质的核酸的表达构建体；

[0012] (b)在该微生物中表达蛋白质，其中该微生物属于短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)种。

[0013] 另外，根据本发明的方法还可选地包括另一方法步骤:

[0014] (c)培养该微生物。

[0015] 因此，在根据本发明优选的实施方案中，根据本发明的方法指的是一种发酵方法。

[0016] 令人意外地发现，在这种方法中采用短小芽胞杆菌种的细菌使高的成品收率成为可能，并因此是有利的。通过采用短小芽胞杆菌作为生产生物可以达到有利的，尤其是提高的成品收率。在这方面,用地衣芽孢杆菌作为参考，这是在现有技术中确立的在大量微生物发酵中工业采用的生产微生物。

[0017] 因此，在优选的实施方案中，根据本发明的方法提高蛋白质在微生物中表达的方法。如果根据本发明的方法与可比较的方法相比获得数量较大的蛋白质时，则提高了蛋白质表达，该可比较的方法与根据本发明的方法的差异只在于它采用地衣芽孢杆菌种细菌，优选野生型。待比较的两方法，在这方面都在相同的、尽可能最优的微生物条件下和相同的持续时间进行。

[0018] 表达构建体是一种可使蛋白质在微生物中表达的核酸序列。它包含基因信息，因此包括编码蛋白质的核酸序列(基因)。核酸序列的表达，就是它翻译成该一个或多个该序列所编码的基因产物，即翻译成多肽(蛋白质)或多个多肽(多个蛋白质)。在本申请中，多肽和蛋白质作为同义词使用的。因此，在本发明的意义上，表达表示核糖核酸(RNA)和蛋白质从基因信息中的生物合成。表达一般包括转录，即根据基因的DNA(脱氧核糖核酸)序列合成信使核糖核酸(mRNA)及其相应地翻译成多肽链，在某些情况下还可能进行翻译后的修饰。因此，蛋白质表达描述从根据本发明存在于微生物中的基因信息的蛋白质合成。

[0019] 另外，表达构建体还包括至少一个核酸序列，优选DNA，其具有对编码蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列表达的控制功能(所谓基因调控序列)。这里,基因调控序列是存在于该微生物中，并影响，优选提高编码该蛋白质的核酸序列的转录频率的任何核酸序列。这优选是指启动子序列，因为这样的序列对于核酸序列的表达是必须的。但是，根据本发明的表达构建体还可以包括其他基因调控序列，例如一个或者多个增强子序列。因此，在本发明的范围内表达构建体包括基因和启动子的至少一个功能单位。它们可以，但不一定必须作为物质单元存在。至少一个启动子的存在对于根据本发明的表达构建体是必须的。据此，启动子理解为使基因表达的调节成为可能的DNA序列。当然，启动子序列是基因的组成部分，并常常处于其5'端，并以此处于RNA编码区域之前。启动子序列在根据本发明的表达构建体中优选处于编码蛋白的核酸序列5’上游方向。启动子最重要的特性是与至少一个DNA结合蛋白质或多肽特异性相互作用，它介导基因通过RNA聚合酶进行的转录起始并被称为转录因子。往往多个转录因子和/或其他蛋白质参与通过RNA聚合酶进行的转录起始。据此，启动子优选为具有启动子活性的DNA序列，亦即，是至少短暂地结合至少一个转录因子，以便启动基因转录的DNA序列。启动子强度可以通过表达基因的转录频率测量，即通过每时间单位产生的RNA分子，特别是mRNA分子数衡量。根据本发明的表达构建体的启动子可以是微生物的内源启动子。因此，这样的启动子序列天然存在于微生物中。备选地，根据本发明的表达构建体的启动子也可以通过重组引入微生物。相应地对于所有其他根据本发明的表达构建体可以具有的基因调控序列也是如此。根据本发明的方法使用的表达构建体中的启动子导致在表达构建体中的编码蛋白(目的蛋白质)的核酸序列表达。

[0020] 在优选的实施方案中，根据本发明的方法中，该启动子包括选自以下的核酸序列[0021] (a)与SEQ ID No.1给出的核酸序列至少有80％，依次更优选至少有81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,
98％,99％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列。

[0022] (b)与SEQ ID No.2给出的核酸序列至少有80％，依次更优选至少有81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,
98％,99％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0023] (c)与SEQ ID No.3给出的核酸序列至少有80％，依次更优选至少有81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,
98％,99％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0024] (d)与SEQ ID No.4给出的核酸序列至少有80％，依次更优选至少有81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,
98％,99％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列。

[0025] 在备选的实施方案中，该启动子具有如上列出的核酸序列。

[0026] 已经发现，采用这种启动子序列,用根据本发明的方法可以得到特别高的蛋白质成品收率。

[0027] 该启动子包含与Seq ID No.1给出的核酸序列至少有80％，和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,
92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,
99.5％和特别优选的有100％同一的核酸序列，而该启动子使得通过其表达的基因的转录频率至少与根据SEQ ID No.1的启动子的转录频率相当。备选地，该启动子包括与Seq ID No.2给出的核酸序列至少有80％，和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,
85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,
96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的有100％同一的核酸序列，而该启动子使得通过其表达的基因的转录频率至少与根据SEQ ID No.2的启动子的转录频率相当。

[0028] 根据本发明另一个备选实施方案，该启动子包含与Seq ID No.3给出的核酸序列至少有80％，和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,
98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的有100％同一的核酸序列，而该启动子使得通过其表达的基因的转录频率至少与根据SEQ ID No.3的启动子的转录频率相当。

[0029] 根据另一个备选实施方案，该启动子包含与Seq ID No.4给出的核酸序列至少有80％，和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,
88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,
99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的有100％同一的核酸序列，而该启动子使得通过其表达的基因的转录频率至少与根据SEQ ID No.4的启动子的转录频率相当。

[0030] 在另一个备选实施方案中，该启动子具有如上所述的核酸序列。

[0031] 核酸或氨基酸序列同一性的测定是通过序列比较进行的。这样的比较是在核苷酸序列或氨基酸序列中指定彼此相似的序列进行的。这种序列比较优选根据在现有技术中确立的和通常采用的BLAST算法进行(例如，参见Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,DJ.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403-410,和Altschul,Stephan F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Hheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997):"Gapped BLAST and PSI-BLAST:
a new generation of protein database search programs"；Nucleic Acids Res.,25,S.3389-3402),并原则上是在核苷酸序列或氨基酸序列中指定彼此相似的核苷酸或氨基酸序列进行。相关位置的列表分配亦称比对。在现有技术中另一个可供使用的算法是FASTA算法。序列比较(比对)，尤其多个序列的比对，通常用计算机程序进行。例如，往往采用Clustal系列(例如，参见Chenna et al.(2003):Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.Nucleic Acid Research31,3497-3500),T-Coffee(例如，参见Notredame et al.(2000):T-Coffee:A novel method for multiple sequence alignments.J.Mol.Biol.302,205-217)或基于这些程序或算法的程序。在本发明的全文中，序列比较和比对优选用计算机程序Vector Suite10.3(nvitrogen Corporation,
1600Faraday Avenue,Carlsbad,Kalifornien,USA)进行，使用预先给定的标准(缺省)参数。

[0032] 这样的比较揭示被比较的序列彼此的相似性。通常给出百分数的同一性，就是说，在相同位置或在比对中彼此对应的位置上同一的核苷酸或氨基酸残基占的比例。对于氨基酸序列，定义更宽泛的术语同源性考虑保守的氨基酸取代，即具有类似的特性的氨基酸，因为它们在蛋白质中多数情况下赋予类似的活性或功能。因此，所比较的序列的相似性还可以以同源性百分数或相似性百分数给出。可以给出完整多肽或基因，或只是个别区域的同一性和/或同源性数值。因此，不同的核酸或氨基酸序列的同源或同一的区域，通过序列中一致性定义。它们同样具有相同的或者相似的功能。它们可以很小和只包括少量核苷酸或氨基酸。这样的小区域通常行使蛋白质的整体活性的主要功能。因此，只把序列一致性联系到个别的，可能很小的区域可以是有用的。但除非另外说明，在本申请书中同一性或同源性值涉及各自给出的核酸或者氨基酸序列的总长度。对于蛋白质，尤其酶特别是蛋白酶，除非另外说明，这些值另外还涉及各自成熟的蛋白质。因此，若不专门说明，蛋白质序列总是涉及成熟的，已经加工完成的蛋白质，即使当所属的基因编码为不成熟的形式，它在翻译之后进一步加工为成熟的形式时，也是如此。

[0033] 用根据本发明的方法引入微生物的表达构建体另外还编码蛋白质。因此，它包括编码该蛋白质的核酸序列。为此可以翻译成蛋白质的任意期望的核酸序列，基本上均可使用。这里指的是用根据本发明的方法生产的蛋白质(目的蛋白质)。这优选指的是酶，更优选指的是下文将要描述的酶。

[0034] 根据本发明的核酸和表达构建体可以通过关于核酸的改造本身已知的方法产生。这样的方法，例如，在有关的参考书,诸如Fritsch,Sambrook und Maniatis,"Molecular cloning:a laboratory manual",Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,
1989,显示，并是生物技术领域的技术人员熟知的。这样的方法的实例是化学合成或者聚合酶链式反应(PCR)，可选与其他分子生物学和/或化学和/或生物化学的标准方法的结合。

[0035] 本发明尤其适用于蛋白质，尤其是酶的重组生产。为此，该表达构建体优选通过转化引入微生物。在这方面各种表达构建体或其部分的引入优选通过载体，尤其是表达载体进行。但也可以只把表达构建体的部分，优选至少编码蛋白的核酸部分，这样地引入微生物，使得完成的表达构建体只在该微生物中形成。例如，这可以通过载体进行，它可以使蛋白质的基因插入宿主细胞中已经存在的基因元件，诸如染色体、染色体DNA或者其他载体，以便，例如，利用内源的启动子来表达蛋白质基因。术语引入包括把表达构建体完全引入，优选经过转化进入微生物的可能性，也可能只把表达构建体的一部分，特别优选编码蛋白质的核酸引入，优选经转化进入该微生物，于是该完全的表达构建体只在微生物中形成。但是，在本发明的范围内至少表达构建体的一部分总是引入微生物内。

[0036] 对于生物技术领域的技术人员，载体是已知的。特别是在细菌中利用时，其为特定质粒，即环形遗传元件。本发明的范围内，该表达构建体优选克隆进载体。载体可以包括例如，从细菌质粒、病毒或噬菌体衍生的，或者主要合成的载体或质粒，其具有各种来源的元件。采用其他各自已有的基因元件,载体可在微生物中作为稳定的单元在多个世代中确立。在本发明的意义上，它们在染色体外作为独立单元建立或者整合在染色体DNA中是无关紧要的。在很多系统中选择哪一个系统取决于具体情况。例如，决定性因素可以是可能达到的拷贝数、可用的选择系统，特别包括抗生素抗性，或者能吸收载体的微生物的可培养性。

[0037] 另外，表达载体可以通过改变培养条件，例如，细胞密度或添加某些化合物来调节。这样的化合物的示例是用作细菌乳糖操纵子((lac operon))的激活物的半乳糖衍生物异丙基β-D硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。

[0038] 在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法中，该蛋白质并非自然存在于微生物中。

[0039] 并非自然存在在这方面意味着该蛋白质不是微生物的内源蛋白质或酶。因此，该蛋白质在微生物中可以不从作为野生型微生物染色体DNA的部分的核酸序列表达。因此，各蛋白质和/或其编码核酸序列不存在于微生物野生型中，和/或无法从微生物野生型中分离。并非自然存在于微生物中的蛋白质或其编码核酸序列优选借助于基因技术方法特异性引入该微生物，以便该微生物富含该蛋白质或编码该蛋白质的核酸序列。然而，蛋白质当然可以自然存在于另一微生物中，——在此仅考虑在本发明方法中采用的微生物。

[0040] 在本发明的另一个实施例中，该方法的特征在于，该蛋白质是一种酶，尤其是酸性纤维素酶、α淀粉酶、α-乙酰脱羧酶(alpha-aceto  decarboxylase)、氨肽酶(aminopetidase)、淀粉酶、阿聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-甘露糖苷酶、卡拉胶酶(Carageenase)、糖酶、过氧化氢酶、纤维二糖-氧化酶、纤维素酶、凝乳酶、内切-1,3-β葡聚糖酶(endo-1,3-beta-glucanase)、内切-1,3(4)-β葡聚糖酶、内切-1,4-β木聚糖酶、内肽酶、酯酶、外肽酶、G4-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、糖脂酶(glycolipase)、半纤维素酶、漆酶、脂肪酶、溶血磷脂酶(Lysophospholipase)、生麦芽糖淀粉酶、甘露聚糖酶、中性蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶(pectate lyase)、果胶酶、果胶酯酶、戊聚糖酶(pentosanase)、过水解酶(perhydrolase)、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、蛋白水解酶(proteinase)、支链淀粉酶、粗制凝乳酶(rennet enzyme)、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、鞣酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、黄原胶酶(xanthanase)、木聚糖酶、木葡聚糖酶(xyloglucanase)或其混合物。特别优选的是，该蛋白质是蛋白酶。在根据本发明的方法特别有利的实施方案中，要生产的蛋白酶(＝目的蛋白酶)同时也参与微生物蛋白质底物的水解，并可以有利地造成进一步改善底物蛋白消化的结果。因此，微生物可得到改善的营养条件。

[0041] 例如，采用根据本发明的方法可以有利地生产上述酶。

[0042] 蛋白酶优选枯草杆菌蛋白酶。为此的示例是枯草杆菌蛋白酶BPN'和Carlsberg、蛋白酶PB92、枯草杆菌蛋白酶147和309、来自迟缓芽胞杆菌的碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶DY，和狭义上可归入枯草杆菌酶(subtilase)，而不再归入枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)的酶，即热酶、蛋白酶K和蛋白酶TW3和TW7。枯草杆菌蛋白酶Carlsberg可以以进一步开发的形式在Novozymes A/S， Daenemark公司以商品名 购买。枯草杆菌蛋白酶147和309以商品名 或 由Novozymes公司经销。从来自迟缓
芽胞杆菌DSM 5483的蛋白酶得到名为 的蛋白酶变体。另外，例如，其他优选的蛋白酶还有名为PUR的酶。另外，其他蛋白酶还有以商品名
和 由Novozymes公司销
售，以商品名 OxP, Prime, 和
由Genencor/Danisco公司销售，以商品名 由Advanced 
Biochemicals Ltd,Thane,Indien,公司销售、以商品名 由Wuxi Snyder 
Bioproducts Ltd.,China公司销售、以商品名 和 由Amano 
Pharmaceuticals Ltd.,Nagoya,Japan公司销售，和以名称蛋白酶K-16由Kao Corp.,Tokyo,Japan销售的酶。另外，优选还有在国际专利申请WO2008/086916和WO2007/131656公开的来自Bacillus gibsonii和短小芽胞杆菌的蛋白酶。

[0043] 淀粉酶的示例是来自地衣芽孢杆菌，来自解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或者来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)以及尤其还有用于洗涤或者清洁剂改善了的进一步开发的α-淀粉酶。来自地衣芽孢杆菌的酶可从Novozymes以商品名 购得和从Danisco/Genencor以商品名 ST购
得。这种α-淀粉酶进一步开发的产品可从Novozymes以商品名 和Termamy 
Dultra购得、从Danisco/Genencor以商品名 OxAm购得和从Daiwa Seiko 
Inc.Tokyo,Japan作为 购得。该来自解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶由Novozymes
以商品名 销售，和来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶衍生的变体以商品名 销售和以 同样由Novozymes销售。另外，可以提及来自芽孢杆菌属种A 7-7(DSM 
12368)的α-淀粉酶和来自Bacillus agaradherens(DSM 9948)的环糊精葡萄糖转位酶(CGTase)。同样，所有上述分子的融合产物均可使用。此外，以商品名 可从
Novozymes购得的来自黑曲霉菌(Aspergillus niger)和米曲霉菌(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶的进一步开发物也适用。其他有利的商业产品，例如，淀粉酶 由
Danisco/Genencor销售，淀粉酶 和Stainzyme 由
Novozymes销售。根据本发明也可生产通过点突变可得的这些酶的变体。其他优选的淀粉酶是国际专利说明书WO00/60060、WO03/002711、WO03/054177和WO07/079938公开的，因此，明确参见其公开上或在此明确引入本专利申请书中。另外，根据本发明要生产的淀粉酶优选α淀粉酶。

[0044] 脂肪酶或角质酶的示例是最初从Humicola lanuginosa(Thermomyces lanuginosus)可获得的，或进一步开发的脂肪酶，尤其具有氨基酸取代D96L的脂肪酶。它们，例如，由Novozymes公司以商品名 Ultra、
和 销售。另外，例如，可生产角质酶，它最初从
Fusarium solani pisi和Humicola insolens分离出来的。由公司Danisco/Genencor生产的,例如,脂肪酶，或角质酶，其原始酶最初从门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)和Fusarium solanii分离出来。作为其他重要的商业产品，可以列举最初由Gist-Brocades(interim Danisco/Genencor)公司销售的制剂M1 和 和由Meito 
Sangyo KK,Japan公司以商品名Lipase Lipase 和Lipase 销售的酶，另
外，还有来自Danisco/Genencor公司的产品

[0045] 纤维素酶(内切葡聚糖酶,EG)的示例包括富含真菌内切葡聚糖酶(EG)序列的纤维素酶制剂，或由Novozymes以商品名 出售的其进一步开发的产品。同样可由Novozymes购买的产品 和 基于50kD-EG，或43kD-EG来自Humicola 
insolens  DSM  1800。来自该公 司可 用于 制备的其他 商业产品 是
和 此外可制备例如纤维素酶,可从AB 
Enzymes,Finnland以商品名 和 购买，其至少部分地基于来自
Melanocarpus的20kD-EG。来自AB  Enzymes的其他纤维素酶还有 和
其他适用的纤维素酶来自芽孢杆菌属种CBS670.93和CBS 669.93，其中来自芽
孢杆菌属种CBS 670.93的可从Danisco/Genencor以商品名 购买。来自Danisco/Genencor可用于制备的其他商业产品有“Genencor洗涤剂纤维素酶L”和
Neutra。

[0046] 这种酶的变体也可以根据本发明通过点突变获得。特别优选的纤维素酶是在国际专利公开WO98/12307上公开的Thielavia terrestris纤维素酶变体、在国际专利公开WO97/14804公开的来自Melanocarpus，尤其来自Melanocarpus albomyces的纤维素酶、在欧洲专利申请EP 1 305 432公开的来自Trichoderma reesei的EGIII型的纤维素酶、及其变体，尤其在欧洲专利申请EP 1240525和EP 1305432公开的纤维素酶，以及在国际专利公开WO 1992006165、WO96/29397和WO02/099091公开的纤维素酶。因此，明确地参见其各自的公开或其在这方面公开内容因此明确地包括在本专利申请书中。

[0047] 另外，还可以制备术语半纤维素酶涵盖的其他酶。属于此的有，例如，甘露聚糖酶、黄原胶裂合酶、黄原胶酶、果胶裂合酶(＝果胶酶)、果胶酯酶、果胶酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、支链淀粉酶和β-葡聚糖酶。在这方面适用的酶是，例如，以商品名Pektinex 和 由Novozymes公司购买的、以商品名 B1 L由AB Enzymes公司购买的、或以商品名 由公司Diversa Corp,San Diego,CA,USA购
买的。由枯草芽孢杆菌制取的β-葡聚糖酶可以商品名 从Novozymes公司购买。根据本发明特别优选的半纤维素酶是甘露聚糖酶，例如，以商品名 由Novozymes
销售的,或者由Genencor销售的

[0048] 另外，还可以生产氧化还原酶，例如，氧化酶、氧合酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、例如卤素-、氯-、溴-、木质素(lignin)-、葡萄糖-或锰-过氧化物酶、双加氧酶或漆酶(酚氧化酶、多酚氧化酶)。作为适用的商业产品可以提及Novozymes公司的 1和2。其他酶在国际专利申请WO 98/45398、WO2005/056782、WO2004/058961以及WO2005/124012中公开。

[0049] 在本发明的另一实施方案中，方法中的微生物为短小芽胞杆菌DSM14395。该菌株在2001年3月1日保藏于DSMZ(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德意志微生物保藏中心)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Deutschland)，并由DSMZ鉴定为短小芽胞杆菌菌株(DSMID 01-197)。正如实施例在本专利申请中显示的，采用该菌株在微生物发酵中达到非常良好的成品收率。

[0050] 在本发明的另一个实施方案中，在根据本发明的方法采用的菌株是经过基因修饰的。通过该基因修饰，成品收率有利地进一步提高或者产物的特性发生有利的改变。产物在这里理解为表达出来的存在于发酵培养基中的蛋白质。例如，其气味减小、其颜色减弱和/或该产品澄清(亦即，较不浑浊)或其密度降低。采用基因修饰在这方面不是指根据方法步骤(a)中的引入表达构建体。而是根据本发明的方法所采用的短小芽胞杆菌种的微生物，更确切地说在根据方法步骤(a)在该微生物中引入表达构建体之前，已经发生基因修饰。与野生型短小芽胞杆菌，尤其短小芽胞杆菌DSM14395相比，优选存在基因修饰。作为基因修饰在这方面考虑取代、插入和/或缺失。该基因修饰有利地导致功能的改变，例如，使微生物中的基因功能失活。这时，基因功能的改变，例如，功能的失活继而导致提高和/或改善蛋白质生产，并以此改善产物产率和/或获得一种其一个或多个特性改善了的产物。功能失活理解为该基因所编码的一个或多个基因产物不再形成，或者以生物学上失活的形式形成，从而不再发挥其在微生物中的功能。在这方面，基因的功能失活也可通过被另一基因完全或部分地取代实现。这时，这个替代基因可以取代原有的基因进行表达。因此原有的基因功能失活，代之以该替代基因表达，并以此导致功能的改变。替代基因可以是与原基因有关系的基因(与原基因的同一性大于50％)或者是与原基因没有关系的基因(与原基因的同一性为50％或更低)。例如，该替代基因可以通过插入引入原基因的编码序列。从而原基因功能失活而表达该替代基因。该基因修饰可以存在于编码该基因产物的序列中，或存在于属于该基因的基因调控序列中。

[0051] 根据本发明采用的微生物可以在其培养条件的要求方面进行改变，在其活动性能方面改变，在其孢子形成能力方面改变、在某些代谢途径方面改变，例如在发酵期间抑制臭味形成，或者具有其他或者额外的选择标记。

[0052] 在这方面可以发生基因改变的是在根据本发明的方法所采用的短小芽胞杆菌菌株中的所有基因，对应于在Gioia et al.,PLoS ONE,9:e928(2007)的公开中公开的短小芽胞杆菌基因组。该公开描述第一个完全测序的短小芽胞杆菌基因组。明确地参见该参考并将其包括在本专利申请的公开内容中。

[0053] 另外，在根据本发明的方法采用的短小芽胞杆菌菌株中所有基因都可以发生基因修饰，对应于下面给出的微生物在一个或多个基因组中存在：

[0054] Agrobacterium radiobacter K84,Agrobacterium

[0055] tumefaciens str.C58,Agrobacterium vitis S4,Arcobacter butzleri ED-1,Arcobacter nitrofigilis DSM 7299,

[0056] Arcobacter sp.L,Aromatoleum aromaticum EbN1,

[0057] Arthrobacter aurescens TC1,Arthrobacter chlorophenolicus A6,Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3,Arthrobacter sp.FB24,Bacillus 
amyloliquefaciens DSM 7,Bacillus amyloliquefaciens FZB42,Bacillus anthracis str.Ames,

[0058] Bacillus atrophaeus 1942,Bacillus cellulosilyticus DSM

[0059] 2522,Bacillus cereus ATCC 10987,Bacillus cereus ATCC

[0060] 14579,Bacillus cereus B4264,Bacillus clausii KSM-K16,Bacillus coagulans 36D1,Bacillus cytotoxicus NVH 391-98,Bacillus halodurans C-125,地衣芽孢杆菌ATCC 14580,Bacillus megaterium DSM 319,Bacillus pseudofirmus OF4,Bacillus pseudomycoides DSM 12442(305parts in a CON entry),短小芽胞杆菌SAFR-032,Bacillus selenitireducens MLS10,Bacillus subtilis BSn5,Bacillus subtilis subsp.spizizenii str.W23,Bacillus subtilis subsp.spizizenii TU-B-10,Bacillus subtilis subsp.subtilis RO-NN-1,Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168,Bacillus thuringiensis BMB1713,Bacillus thuringiensis serovar konkukian str.97-27T,Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis str.T01001,Bacillus tusciae DSM 2912,Bacillus weihenstephanensis KBAB4,Bifidobacterium 
adolescentis ATCC 15703,Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9,
Bifidobacterium bifidum PRL2010,Bifidobacterium breve UCC2003,Bifidobacterium dentium Bd1,Bifidobacterium longum DJO10A,Bifidobacterium longum NCC27051,Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697,Bradyrhizobium sp.ORS 278,Brevibacillus brevis NBRC 100599,Corynebacterium aurimucosum ATCC700975,Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129,Corynebacterium efficiens YS-314,Corynebacterium glutamicum  ATCC 13032,Corynebacterium glutamicum R,
Corynebacterium jeikeium K411,Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385,Corynebacterium pseudotuberculosis FRC41,Corynebacterium resistens DSM45100,Corynebacterium ulcerans BR-AD22,Corynebacterium urealyticum DSM 7109,Corynebacterium variabile DSM 44702,Desulfovibrio aespoeensis Aspo-2,Desulfovibrio alaskensis G20,Desulfovibrio desulfuricans subsp.desulfuricans str.ATCC 27774,Desulfovibrio magneticus RS-1,Desulfovibrio salexigens DSM 
2638,Desulfovibrio vulgaris RCH1,Desulfovibrio vulgaris str.Miyazaki F,Desulfurobacterium thermolithotrophum DSM 11699,Enterobacter aerogenes KCTC 
2190,Enterobacter asburiae LF7a,Enterobacter cloacae subsp.cloacae ATCC 13047 Enterobacter sp.638 Escherichia coli 536,Escherichia coli APEC O1,Escherichia coli CFT073,Escherichia coli O103:H2 str.12009,Escherichia coli SE11,Escherichia coli SE15-,Escherichia fergusonii ATCC 35469T chromosome,Ethanoligenens harbinense YUAN-3,Eubacterium cylindroides T2-87 draft,Eubacterium eligens ATCC 27750,Eubacterium limosum KIST612,Eubacterium rectale M104/1 draft,Eubacterium siraeum 70/3 draft,Exiguobacterium sibiricum 
255-15,Exiguobacterium sp.AT1b,Flavobacteriaceae  bacterium 3519-10,
Flavobacterium branchiophilum FL-15,Flavobacterium johnsoniae UW101,
Flavobacterium psychrophilum JIP02/86,Geobacillus kaustophilus HTA426,Geobacillus sp.C56-T3,Geobacillus sp.WCH70,Geobacillus sp.Y4.1MC1,Geobacillus sp.Y412MC52 Geobacillus sp.Y412MC61,plasmid pGYMC6101,Geobacillus 
thermodenitrificans NG80-2,Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93,Geobacter bemidjiensis Bem Geobacter lovleyi SZ,Geobacter metallireducens GS-15 Geobacter  sp.FRC-32,Geobacter  sp.M18,Geobacter  sp.M21,Geobacter 
sulfurreducens PCA,Geobacter uraniireducens Rf4,Gloeobacter violaceus PCC 
74212,Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5,ATCC 49037,Gluconacetobacter xylinus NBRC 3288,Gluconobacter oxydans 621H,Hydrogenobaculum sp.Y04AAS1,Lactobacillus acidophilus30SC,Lactobacillus amylovorus GRL 1112,Lactobacillus brevis ATCC 367,Lactobacillus buchneri NRRL B-30929,Lactobacillus casei ATCC 
334,Lactobacillus casei BD-II,Lactobacillus casei BL23,Lactobacillus casei LC2W,Lactobacillus crispatus ST10,Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND02,Lactobacillus fermentum CECT 5716,Lactobacillus gasseri ATCC 33323,Lactobacillus helveticus H10,Lactobacillus johnsonii NCC 533,Lactobacillus kefiranofaciens ZW3,Lactobacillus plantarum WCFS1,Lactobacillus reuteri SD2112,Lactobacillus rhamnosus GG,Lactobacillus rhamnosus GG ATCC 53103,Lactobacillus ruminis ATCC 27782,Lactobacillus sakei subsp.sakei 23K,Lactobacillus salivarius CECT 5713,Lactobacillus sanfranciscensis TMW 1.1304,Mannheimia succiniciproducens MBEL55E,Mycobacterium abscessus chromosome,Mycobacterium africanum GM041182,Mycobacterium avium 104,Mycobacterium bovis BCG str.Tokyo 172,Mycobacterium canettii CIPT 140010059,Mycobacterium gilvum PYR-GCK,Mycobacterium marinum M,Mycobacterium smegmatis str.MC2 155,
Mycobacterium sp.JDM601,Mycobacterium sp.JLS,Mycobacterium sp.KMS,
Mycobacterium sp.MCS,Mycobacterium sp.Spyr1,Mycobacterium vanbaalenii PYR-1,Pseudomonas  aeruginosa  NCGM2.S17,Pseudomonas  brassicacearum 
subsp.brassicacearum NFM421,Pseudomonas entomophila L48 chromosome,
Pseudomonas fluorescens Pf-5,Pseudomonas fulva 12-X,Pseudomonas mendocina NK-
01,Pseudomonas putida KT2440+,Pseudomonas syringae pv.phaseolicola 1448A,Pseudomonas stutzeri DSM 4166,Pseudomonas syringae pv.syringae B728a+,Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000/,Stenotrophomonas maltophilia K279a strain K279a,Streptobacillus moniliformis DSM 12112,Streptomyces avermitilis MA-4680,Streptomyces bingchenggensis BCW-1,Streptomyces cattleya NRRL 8057 main chromosome,Streptomyces clavuligerus ATCC27064,Streptomyces coelicolor,Streptomyces flavogriseus ATCC 33331,Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 
13350,Streptomyces scabiei 87.22,Streptomyces sp.SirexAA-E,Streptomyces venezuelae ATCC 10712,Streptomyces violaceusniger Tu 4113,Sulfobacillus acidophilus TPY,Thermobifida fusca YX,Thermotoga lettingae TMO,Thermotoga maritima MSB8,Thermotoga naphthophila RKU-10,Thermotoga neapolitana DSM 4359,Thermotoga petrophila RKU-1,Thermotoga sp.RQ2,Thermovibrio ammonificans HB-1,Thermus thermophilus HB27,Xanthomonas albilineans,Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo F1,Xanthomonas axonopodis pv.citri str.306/,Xanthomonas campestris pv.campestris str.8004,Xanthomonas euvesicatoria,Xanthomonas oryzae pv.oryzae.

[0061] 除了上述公开以外，可修饰的基因，尤其序列本身，还有公共可查询的数据库可供使用，例如在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库,地址：http://www.genome.jp/kegg或者在数据库NCBI(National Center for  Biotechnology Information,U.S.National Library of Medicine,8600Rockville Pike,Bethesda,MD 20894,USA)地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov.KEGG数据库自1995由Kanehisa等于"Kyoto University Bioinformatics Center"和"Human Genome Center of the University of Tokyo"名下的的实验室研发。除了单个基因以外，该数据库还包含不同微生物的完全基因组或其基因组的大部分的信息和序列。

[0062] 在本专利申请的意义上基因对应的特征在于，一方面根据本发明采用的短小芽胞杆菌菌株的基因和Gioia等人公开的短小芽胞杆菌菌株的基因和/或上列给出的微生物基因之间有尽可能高的序列同一性。另一方面，基因对应的特征在于同种的功能，亦即，根据本发明采用的短小芽胞杆菌菌株和Gioia等人公开的短小芽胞杆菌菌株和/或上文给出的微生物彼此对应的基因在各自微生物上有相似类型的功能。

[0063] 采用这些基因和/或基因组信息,便可能根据序列比较识别在根据本发明的方法采用的短小芽胞杆菌菌株中的各基因。根据该基因信息，尤其根据该序列信息，从Gioia等人公开的短小芽胞杆菌菌株的基因组和/或从上文给出的微生物的基因组，技术人员可以通过序列比较和/或分子生物学标准方法，确定短小芽胞杆菌菌株基因组中序列一致性最高的、待进行基因修饰的，从而在根据本发明的方法中采用的核酸序列。相似功能的确认，亦即，功能对应的确认，可以通过各微生物的对比实验提供，其中在各自的序列比较的基础上要比较的基因，用相同的方法改变(优选功能失活)，并观察在两个微生物中是否发生了同种的改变，尤其是否出现表型的变化。若例如，在Gioia等人公开的短小芽胞杆菌菌株和/或在上文给出的微生物中,所考虑的基因发生了改变，尤其是功能失活,与代谢活性、活动性或孢子形成特性的改变相关，且在根据本发明要修饰的和采用的短小芽胞杆菌菌株中观察到相应的改变，则在这里确认正确的分配。相应的方法在遗传学领域，尤其是在微生物遗传学上是标准的，而且是这个领域的技术人员广泛已知的。

[0064] 在特别优选的实施方案中，微生物是孢子形成抑制的。这优选通过如下方法达到，即其基因spolV(yqfD)或其基因对应物功能失活，尤其是通过基因spolV(yqfD)或其基因对应物或其部分的缺失实现。已经确定，采用这样的孢子形成抑制的短小芽胞杆菌菌株，用根据本发明的方法可以达到特别高的成品收率。

[0065] 用根据本发明的方法采用的微生物可以在常用的，例如,在间断的或连续的系统中培养并发酵。在第一种情况下，适当的营养培养基用该微生物接种,经过一段由实验确定的时间段之后，从该培养基收获蛋白质。连续发酵的特征在于达到流动平衡，其中通过一个比较长的时间段细胞部分死亡，但是还会重新生长，同时可以从该培养基获得形成的蛋白质。

[0066] 根据本发明的方法优选是发酵方法。发酵方法本身是现有技术已知的，而且是实际的大规模的生产步骤，一般后跟所生产的蛋白质适当的纯化方法。根据本发明的方法用来生产蛋白质的所有发酵方法，都是根据本发明的方法的实施方案。

[0067] 发酵方法，其特征在于，尤其考虑该发酵通过给料策略进行。这里添加在培养过程中消耗的培养基成分。以此可以达到细胞密度显著提高，而且达到细胞质量或干质量的显著提高。另外，发酵还可以这样设置，使得滤除不期望的代谢产物，或者通过添加缓冲液或者各适当的抗衡离子进行中和。

[0068] 从发酵培养基可以收获所生产的蛋白质。这样的发酵方法相比从微生物分离蛋白质，亦即，从细胞质量(干质量)进行产物制备更优选。例如，这可以通过提供适当的分泌标记和/或机制和/或输送系统达到，从而使微生物将蛋白质分泌至发酵培养基中。没有分泌的情况下，备选地，可以从宿主细胞分离蛋白质，亦即，从细胞质量提纯蛋白质，例如，通过用硫酸铵或者乙醇沉淀，或者通过色析法纯化。

[0069] 本发明的还提供用这样的方法获得的微生物，该方法包括下列方法步骤：

[0070] (a)在微生物中引入包括启动子和编码蛋白质的核酸的表达构建体；

[0071] (b)在微生物中表达蛋白质；

[0072] 其中该微生物属于短小芽胞杆菌种。

[0073] 这里指的是所有可以作为根据本发明的方法用料(subject)的微生物。针对根据本发明的方法所描述的所有材料、用料和实施方案，均可应用于这些发明主题。因此，在这里明确的参见在相应的位置上的公开，并指示这个公开对于根据本发明的微生物也有效。

[0074] 根据本发明的微生物特别优选的实施方案为，

[0075] (a)该启动子包含选自如下的核酸序列

[0076] (i)与SEQ ID No.1给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0077] (ii)与SEQ ID No.2给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0078] (iii)与SEQ ID No.3给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0079] (iv)与SEQ ID No.4给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0080] 和/或

[0081] (b)该蛋白质并非天然存在于该微生物中，和/或

[0082] (c)该蛋白质是酶，尤其酸性纤维素酶、α-淀粉酶、α-乙酰脱羧酶、氨肽酶、淀粉酶、阿聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-甘露糖苷酶、卡拉胶酶、糖酶、过氧化氢酶、纤维二糖氧化酶、纤维素酶、凝乳酶、内切-1,3-β-葡聚糖酶、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内肽酶、酯酶、外肽酶、G4-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、糖脂酶、半纤维素酶、漆酶、脂肪酶、溶血磷脂酶(lysophospholipase)、生麦芽糖淀粉酶、甘露聚糖酶、中性蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶酶、果胶酯酶、戊聚糖酶、过水解酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、蛋白水解酶、支链淀粉酶、粗制凝乳酶(rennet enzyme)、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、枯草杆菌蛋白酶、鞣酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、黄原胶酶(xanthanase)、木聚糖酶、木葡聚糖酶，特别是蛋白酶或α-淀粉酶，或其混合物，

[0083] 和/或

[0084] (d)该微生物是短小芽胞杆菌DSM 14395，和/或

[0085] (e)该微生物是孢子形成抑制的，优选通过基因spolV(yqfD)的改变，尤其通过基因spolV(yqfD)或其部分的缺失，和/或

[0086] (f)该微生物是经过基因修饰的。

[0087] 根据本发明的微生物尤为特别优选的实施方案为，

[0088] (a)该启动子包含选自如下的核酸序列

[0089] (i)与SEQ ID No.1给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0090] (ii)与SEQ ID No.2给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0091] 和/或

[0092] (b)该蛋白质并非天然存在于该微生物中，和/或

[0093] (c)该蛋白质是蛋白酶，优选枯草杆菌蛋白酶或α淀粉酶，

[0094] 和/或

[0095] (d)该微生物是短小芽胞杆菌DSM14395，

[0096] 和/或

[0097] (e)该微生物是孢子形成抑制的，优选通过基因spolV(yqfD)的改变，尤其通过基因spolV(yqfD)或其部分的缺失，和/或

[0098] (f)该微生物是经过基因修饰的。

[0099] 根据本发明的微生物另一特别优选的实施方案为，

[0100] (a)该启动子包含选自如下的核酸序列

[0101] (i)与SEQ ID No.1给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0102] (ii)与SEQ ID No.2给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0103] (iii)与SEQ ID No.3给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0104] (iv)与SEQ ID No.4给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,
93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0105] 和/或

[0106] (b)该蛋白质并非天然存在于该微生物中，和/或

[0107] (c)该蛋白质是α淀粉酶

[0108] 和/或

[0109] (d)该微生物为短小芽胞杆菌DSM 14395，和/或

[0110] (e)该微生物是孢子形成抑制的，优选基因spolV(yqfD)的改变，尤其通过基因spolV(yqfD)或其部分的缺失，和/或

[0111] (f)该微生物是经过基因修饰的。

[0112] 根据本发明的微生物质量最为特别优选的实施方案为，

[0113] (a)启动子包含与SEQ ID No.3给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,
92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,99.4％,
99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0114] 和/或

[0115] (b)该蛋白质并非天然存在于该微生物中，和/或

[0116] (c)该蛋白质是α淀粉酶

[0117] 和/或

[0118] (d)该微生物是短小芽胞杆菌DSM14395，和/或

[0119] (e)该微生物是孢子形成抑制的，优选通过基因spolV(yqfD)的改变，尤其是通过基因spolV(yqfD)或其部分的缺失，和/或

[0120] (f)该微生物是经过基因修饰的。

[0121] 根据本发明的微生物另一最为特别优选的实施方案为，

[0122] (a)该启动子包含与SEQ ID No.1给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,
99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0123] 和/或

[0124] (b)该蛋白质并非天然存在于该微生物中，和/或

[0125] (c)该蛋白质是α淀粉酶，和/或

[0126] (d)该微生物是短小芽胞杆菌DSM14395，和/或

[0127] (e)该微生物是孢子形成抑制的，优选通过基因spolV(yqfD)的改变，尤其是通过基因spolV(yqfD)或其部分的缺失，和/或

[0128] (f)该微生物是经过基因修饰的。

[0129] 根据本发明的微生物最为特别优选的实施方案为，

[0130] (a)该启动子包含与SEQ ID No.2给出的核酸序列至少有80％和依次更优选至少有81.0％,82.0％,83.0％,84.0％,85.0％,86.0％,87.0％,88.0％,89.0％,90.0％,91.0％,92.0％,93.0％,94.0％,95.0％,96.0％,97.0％,98.0％,99.0％,99.2％,99.3％,
99.4％,99.5％和特别优选的是100％同一的核酸序列；

[0131] 和/或

[0132] (b)该蛋白质并非天然存在于该微生物中，和/或

[0133] (c)该蛋白质是α淀粉酶，

[0134] 和/或

[0135] (d)该微生物是短小芽胞杆菌DSM14395，和/或

[0136] (e)该微生物是孢子形成抑制的，优选通过基因spolV(yqfD)的改变，尤其是通过基因spolV(yqfD)或其部分的缺失，和/或

[0137] (f)该微生物是经过基因修饰的。

[0138] 根据本发明的方法有利地使用根据本发明的微生物来生产蛋白质。因而，据此，本发明还提供根据本发明的微生物在生产蛋白质，尤其是酶中的用途。

[0139] 针对根据本发明的方法或微生物所描述的所有原料、用料和实施方案，也都可以应用于本发明主题。因此，在这里明确地参见在相应的位置上的公开，并指示该公开对于根据本发明的用途也是适用。实施例

[0140] 所有分子生物学工作步骤都遵循标准方法，正如它们，例如，在手册Fritsch,Sambrook and Maniatis"Molecular cloning:a laboratory manual",Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,1989，或者相似的有关著作给出的。酶，试剂盒和装置根据各制造商的说明书使用。

[0141] 实施例1：

[0142] 用短小芽胞杆菌和地衣芽孢杆菌发酵生产蛋白酶(目的蛋白质)比较

[0143] 下文给出三种不同的表达质粒，各自包含编码蛋白酶(目的蛋白质)的基因以及功能启动子，转化地衣芽孢杆菌和短小芽胞杆菌菌株。该转化后的菌株用于蛋白酶的发酵生产。所用的地衣芽孢杆菌菌株是在国际专利申请WO91/02792公开的。使用的短小芽胞杆菌菌株为短小芽胞杆菌DSM 14395，其中基因spolV(yqfD)通过缺失而功能失活。使用的启动子为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核酸序列。启动子在各自的表达质粒中各自被安排在编码蛋白酶的核酸序列5’上游的位置上。使用下列质粒(表1)：

[0144] 表1：

[0145]质粒No. 启动子 蛋白酶基因
1 SEQ ID No.1 编码WO95/23221的变体F49
2 SEQ ID No.1 编码WO95/23221的变体F49
3 SEQ ID No.2 编码WO95/23221的变体F49

[0146] 表达质粒转入各微生物中之后，所得的生产菌株用标准发酵方法在2立升实验室发酵罐中使用(培养48小时)，通过从底物suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对位硝基苯胺(suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide，AAPF)释放生色团对位硝基苯胺(para-nitroaniline，pNA)测定所获得的蛋白酶活性。该蛋白酶裂解底物并释放pNA。pNA的释放在410nm处引起吸光度增大，其随时间的变化过程是酶促活性的衡量标准(参见Del Mar et al.,1979)。该测量在25℃温度，pH 8.6和波长410nm下进行。测量时间为5min，而测量间隔时间为20s至60s。

[0147] 与地衣芽孢杆菌相比，短小芽胞杆菌作为生产微生物的产出率明显上升(参见表2)。给出的数据是实测的短小芽胞杆菌的蛋白酶相对活性，换算到定义为100％的地衣芽孢杆菌各自获得的蛋白酶活性。

[0148] 表2：

[0149]

[0150]

[0151] 实施例2：

[0152] 在此实施例中，研究了蛋白酶(目的蛋白质)在短小芽胞杆菌中用包括不同启动子的表达构建体的发酵生产。正如在实施例1描述的，使用具有根据SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的启动子的表达质粒1和3。用作另一个表达质粒(对照)的表达质粒与质粒1和3的表达质粒的差异在于，不用来自短小芽胞杆菌的启动子，而使用来自地衣芽孢杆菌的启动子，后者在国际专利申请WO91/02792中公开("promotor of the ATCC 53926 alkaline protease gene"；参见WO91/02792的实施例5,6和图27)。作为短小芽胞杆菌菌株，如同实施例1使用的短小芽胞杆菌DSM14395，其中基因spolV(yqfD)通过缺失而功能失活。

[0153] 该菌株用上述表达质粒转化。所得的生产菌株用标准发酵方法在2立升实验室发酵罐中使用，并正如在实施例1中所描述的，通过从底物suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对位硝基苯胺(AAPF)释放生色团对位硝基苯胺(pNA)测定所获得的蛋白酶活性。与对照菌株相比，具有质粒1和3的产出率明显上升(参见表3)。给出的数据是该包括质粒1和3的菌株的实测的蛋白酶相对活性，换算到定义为100％的对照菌株的蛋白酶活性。

[0154] 表3：

[0155]质粒No. 蛋白酶相对活性(％)
对照 100
1 133
3 131

[0156] 实施例3：

[0157] 正如下文给出的两个不同的表达质粒，各自包含编码淀粉酶(目的蛋白质)的基因以及功能启动子，转化地衣芽孢杆菌和短小芽胞杆菌菌株。该转化后的菌株用于淀粉酶的发酵生产。所用的地衣芽孢杆菌菌株是在国际专利申请WO91/02792中公开的。使用短小芽胞杆菌DSM14395作为短小芽胞杆菌菌株，其中基因spolV(yqfD)通过缺失而功能失活。作为启动子使用根据SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核酸序列(来自解淀粉芽胞杆菌的淀粉酶启动子，正如在Palva,I.,Pettersson,R.F.,Kalkkinen,N.,Lehtovaara,P.,Sarvas,M.,Soderlund,H.,Takkinen,K.and Kaariainen,L."Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal Signal peptide region of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens"；Gene 15(1),43-51(1981)公开的。启动子在各自的表达质粒中各自被安排在编码蛋白酶的核酸序列5’上游的位置上。使用下列质粒(表4)：

[0158] 表4：

[0159]

[0160] 表达质粒转入各微生物中之后，所得的生产菌株用标准发酵方法在2立升实验室发酵罐中使用(培养48小时)，并测定所获得的淀粉酶活性。为了测定以TAU为单位(in TAU)的淀粉分解活性，使用修饰后的对硝基苯麦芽七糖苷(p-nitrophenylmaltoheptaoside)，它的处于端点的葡萄糖单元被苄叉(benzylidene)基团封闭；它通过淀粉酶分解为游离的对硝基苯基-低聚糖，其借助于辅助酶葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶转化为葡萄糖和对硝基酚。以此，释放的对硝基酚数量与淀粉酶活性成正比。该测量，例如，用Abbott,Abott Park,Illinois,USA公司的 检测试剂盒进行。在测试混合物中，在37℃下3min
借助于光度计对空白值检测吸光度增量(405nm)。标定用活性已知的酶标准(例如，Genencor公司的2900TAU/g的 2900)进行。数据评估通过用每分
钟的吸光度差dE(405nm)对标准酶浓度作图进行。表5中列出实测的短小芽胞杆菌的淀粉酶相对活性，它换算到定义为100％的地衣芽孢杆菌的用质粒4(启动子按Seq ID No3)获得的淀粉酶活性上。

[0161] 表5：

[0162]

[0163] 令人意外地发现，在短小芽胞杆菌(本身天然不生产淀粉酶)中根据Seq ID No3的启动子特别适用，达到异源性表达的淀粉酶非常高的产出率。

[0164] 实施例4：

[0165] 在此实施例中，研究了蛋白酶(目的蛋白质)在短小芽胞杆菌中用包括不同启动子的表达构建体的发酵生产。正如在实施例3中描述的，使用具有根据SEQ ID No.3,1和SEQ ID No.2的启动子的表达质粒4,6和7。作为短小芽胞杆菌菌株，正如实施例1，使用短小芽胞杆菌DSM 14395，其中基因spolV(yqfD)通过缺失而功能失活。该菌株用上述表达质粒转化。所得的生产菌株用标准发酵方法在2立升实验室发酵罐中使用，并正如在实施例3所描述的，测定所获得的淀粉酶活性。

[0166] 表6列出包括质粒4,6和7的上述短小芽胞杆菌菌株的实测淀粉酶相对活性，它换算到定义为100％的包括质粒4的短小芽胞杆菌菌株的淀粉酶活性。

[0167] 与已经对于短小芽胞杆菌中的异源性淀粉酶表达特别适用的质粒4相比(参见表5)，采用质粒7达到类似的高产出率，而用质粒6达到甚至更改善的淀粉酶产出率(参见表
6)。

[0168] 表6：

[0169]质粒No. 淀粉酶相对活性(％)
4 100
6 112
7 101