ZTL蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
阅读：303发布：2020-06-03
专利汇可以提供ZTL蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种ZTL蛋白及其编码基因在调控 植物 对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用为由序列3所示 蛋白质 在如下任一中的应用：a1)调控植物对ABA耐受性；a2)选育对ABA耐受性提高的植物品种。本发明可应用于将植物 激素 ABA作为一种选择性 除草剂 ，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用ZTL调节植物对ABA的敏感性或耐受性，通过基因工程手段获得ZTL基因高表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合 可持续农业 发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法和途径等方面具有重要的实用价值和市场前景。，下面是ZTL蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利的具体信息内容。
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)-a2)任一中的应用：
a1)调控植物对ABA耐受性；
a2)选育对ABA耐受性提高的植物品种。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：
a1)调控植物对ABA耐受性；
a2)选育对ABA耐受性提高的植物品种。
3.培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高。
4.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第171至2000位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.一种对权利要求3-7任一中所述的转基因植物进行除草的方法，其特征在于：所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。
ZTL蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物激素ABA在植物发育的各个阶段，包括胚胎成熟、种子发育及幼苗生长过程中发挥重要调节作用。ABA也是植物适应逆境，例如干旱、高盐及低温胁迫的关键激素。ABA信号转导机制已经被广泛研究，许多ABA信号转导相关组分被发现，其中也包括ABA受体。有报道称可能的G蛋白偶联受体GCR2以及GPCR类G蛋白GTG1和GTG2都是候选的ABA质膜受体。但是，GCR2是否参与调控ABA调节的种子萌发和萌发后生长还存在一定的争议。
GTGS是ABA信号转导过程的正调节子，它能够与拟南芥G蛋白a亚基GPA1相互作用，GPA1通过抑制GTG与ABA结合活性负调节ABA信号转导。属于START超家族的PYR/PYL/RCAR蛋白被鉴定为ABA细胞质受体，其可以调节ABA核心信号通路，蛋白磷酸酶(PP2Cs)直接作用于PYR/PYL/RCAR受体下游，抑制SNF1相关蛋白激酶(SnRK2S)活性，继而调节ABF、AREB等bZIP类转录因子继而调控ABA信号反应。
GTGS是ABA信号转导过程的正调节子，它能够与拟南芥G蛋白a亚基GPA1相互作用，GPA1通过抑制GTG与ABA结合活性负调节ABA信号转导。属于START超家族的PYR/PYL/RCAR蛋白被鉴定为ABA细胞质受体，其可以调节ABA核心信号通路，蛋白磷酸酶(PP2Cs)直接作用于PYR/PYL/RCAR受体下游，抑制SNF1相关蛋白激酶(SnRK2S)活性，继而调节ABF、AREB等bZIP类转录因子继而调控ABA信号反应。
[0003] 镁鳌合酶H亚基(CHLH/ABAR)是拟南芥ABA潜在受体，它能够拮抗一组WRKY转录因子进而解除其对ABA响应基因的抑制作用。目前已经有证据表明CHLH/ABAR参与ABA信号转导。在拟南芥已经鉴定出的四个abar相关突变体abar-2，abar-3，cch和rtll中ABA敏感性均发生改变。独立研究小组发现CHLH/ABAR参与调控拟南芥及桃子叶片气孔保卫细胞对ABA的响应过程。本发明的发明人所在团队前期研究发现CHLH/ABAR也参与调控烟草叶片保卫细胞中ABA信号转导。另外CHLH/ABAR也参与调控了桃子及草毒的果实成熟过程。以上证据均表明CHLH/ABAR是ABA信号调节子，已经通过酵母双杂交筛选到很多与CHLH/ABAR相互作用的蛋白，表明CHLH/ABAR参与调控ABA信号调控网络是复杂的。
[0004] 光是影响植物生长发育最重要的环境因子之一，主要是通过光强、光量、光质、光向和光周期来影响植物的生长发育过程。光信号通过光受体进入生物钟，使中央振荡器产生振荡，从而改变生物钟的输出信号，引起植物各种生理生化反应。光能够调控植物从种子萌发到开花过程的每个阶段。近年来，光信号转导途径的研究非常广泛，但由于光信号的转导网路极其复杂，目前对于完整的光信号转导通路仍没有研究透彻。
[0005] 生物钟(circadian clock)是指生物体存在的昼夜节律的调控机制，它使生物的基因表达、生理生化行为及新陈代谢表现出以近似24h为周期的昼夜节律性，这个昼夜调控机制在大多数生物体中都存在，最早由法国天文学家Mairan观察到植物的“睡眠运动”，通过简单的实验，认为这种运动受植物内源性控制。植物生物钟研究，尤其是在拟南芥中关于生物钟分子机制的研究已取得了很大的进展。为了便于对生物钟的理解，高等植物体内生物钟被人为简单地化分为3个功能组分：(1)输入途径(input pathway)根据外界的光照、温度、水分等环境信号通过光受体或信号分子向中央振荡器初步传输的过程；(2)中央振荡器(central oscillator)，控制并产生近似24小时的昼夜节律振荡(3)输出途径(output pathway)，产生与昼夜节律一致的振荡，这3个组分相互联系相互影响，并在各组分之间存在着重叠，其中中央振荡器是生物钟的核心部分。
[0006] 目前为止共发现3类蓝光受体，它们分别是：隐花色素(CRY1，CRY2，CRY3)，趋光色素(phot1、phot2)及含LOV/F-box/Kelch结构蓝光受体(ZTL，FKF，LKP2)。这8个蓝光受体，是光信号的一个输入因子，通过它们共同感受外界环境中光的变化，从而调节植物自身生理发育过程。ZTL、FKF和LKP2它们介导一些关于生物钟或者开花相关的基因的表达或蛋白的降解。作为光受体FKF1是目前研究的相对较为透切。fkf1突变体在长日条件下是晚花，在蓝光及红光下较之野生型其下胚轴变短。FKF1的mRNA是生物钟调控的，但是其本身没有任何生物钟的功能，这也许是因为它是生物钟输出基因。研究发现FKF1调控CO的表达，其中蓝光起着增强性的作用。CDF1是CO转录的抑制子，FKF1作为CDF1的E3在蓝光下特异地结合，并泛素化CDF1，使其被26S蛋白酶体降解。ZTL作为TOC1与PRR5(PSEUDORESPONSE REGULATOR5)的E3促进它们通过26S蛋白酶体降解。ZTL、FKF1都是蓝光依赖地与GI(GIGATEA)相互作用，进而使得两个蛋白在蓝光下变的更稳定。
[0007] 随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平，控制植物生长以达到所需要的状态，调控植物抗逆性，以及利用天然植物激素实现的选择性除草等成为研究前沿。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种ZTL蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0009] 本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
[0011] a1)调控植物对ABA耐受性；
[0012] a2)选育对ABA耐受性提高的植物品种。
[0013] B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(ZTL蛋白)的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：
[0014] a1)调控植物对ABA耐受性；
[0015] a2)选育对ABA耐受性提高的植物品种。
[0016] 在本发明中，以上a1)中的所述调控植物对ABA耐受性均体现为：ZTL蛋白的表达量越高，则所述植物对ABA的耐受性越强；ZTL蛋白的表达量越低，则所述植物对ABA的耐受性越弱。
[0017] 在本发明中，以上所有a2)中的所述选育对ABA耐受性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述ZTL蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0018] 其中，所述ZTL蛋白的表达量为具有正常功能的未突变的ZTL蛋白的表达量。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法。
[0020] 本发明所提供的培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高。
[0021] 本发明中，所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高，具体体现在：在0.8μM和1.2μM的ABA浓度下，与所述受体植物相比，无论叶片大小还是主根系长短，所述转基因植物都生长的更好，所述转基因植物相对于所述受体植物表现出更好的ABA耐受性。
[0022] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即ZTL基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0023] 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第171至2000位核苷酸所示的DNA分子；
[0024] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0025] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0026] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0027] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0028] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0029] 其中，序列1由3164个核苷酸组成，为所述ZTL基因在拟南芥基因组中序列，其中第416-1245位均为内含子序列；序列2由2334个核苷酸组成，为所述ZTL基因的cDNA序列，其中第171-2000位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由609个氨基酸残基组成。
[0030] 在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
[0031] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pRTL2、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0032] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
[0033] 更为具体的，所述重组表达载体为将所述ZTL基因插入pRTL2载体的多克隆位点Kpn I与BamH I之间后得到的重组质粒。
[0034] 在上述方法中，将携带有所述ZTL基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0035] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物(如十字花科植物)，也可为单子叶植物。
[0036] 在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为十字花科植物拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(C24生态型)。
[0037] 本发明的又一个目的是提供一种对所述转基因植物进行除草的方法。
[0039] 在上述方法中，所述“所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受”是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述待除杂草死亡；但向所述转基因植物喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述转基因植物不死亡，且生长状态与喷洒所述浓度为M的ABA溶液前相比无统计学差异。
[0040] 在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pRTL2载体的多克隆位点Kpn I与BamH I之间插入序列2的第174-2000位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。
[0041] 本发明研究发现ZTL蛋白是ABA信号传导的核心负调节子。本发明可应用于将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用ZTL调节植物对ABA的敏感性或耐受性，通过基因工程手段获得ZTL基因高表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法和途径等方面具有重要的实用价值和市场前景。附图说明
[0042] 图1为ZTL基因突变体ztl-1的示意图。ztl-1点突变体突变位点位于ZTL基因第二个外显子区域，即序列1中从起始密码子(ATG)开始第2103个碱基G突变为A，导致序列3中第425个氨基酸天冬氨酸(D)置换为天冬酰胺(N)，从而使ZTL蛋白功能发生变化(Somers D E,Schultz T F,Milnamow M,et al.ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.Cell,2000(101),319-329)。
[0043] 图2为western blot检测ZTL过表达材料中ZTL蛋白的表达情况。
[0044] 图3为ABA对ZTL各遗传材料幼苗生长影响情况。其中，A为0μM ABA；B为0.8μM ABA；C为1.2μM ABA；D为A-C中各组分布示意图。
[0045] 图4为将图3中ZTL各遗传材料从培养皿中移出来后拍照，能更明显的观察ZTL各遗传材料下胚轴长度，以及更明显的观察ABA对ZTL各遗传材料幼苗叶片和主根长的影响。
具体实施方式
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0049] pRTL2载体：由Andrew J.Leinicke教授赠送(记载文献：Carrington J C,Freed D D,Leinicke A J.Bipartite Signal Sequence Mediates Nuclear Translocation of the Plant Potyviral Nla Protein.The Plant Cell,1991(3),953-962.)在pRTL2载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pRTL2载体中，含有YFP基因(Clontech,http://www.clontech.com/)。
[0050] 拟南芥野生型(C24生态型)：拟南芥野生型种子，为拟南芥生物研究中心(ABRC)产品。
[0051] ZTL突变体ztl-1种子：由Steve A.Kay教授赠送，背景为C24(记载文献：Somers D E,Schultz T F,Milnamow M,et al.ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.Cell,2000(101),319-329)。
[0052] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)。
[0053] 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。
[0054] GFP蛋白鼠源单克隆抗体：由北京亚太恒信生物公司提供，货号ZA009，由于YFP蛋白是GFP蛋白的衍生变种蛋白，蛋白质序列上只有几个氨基酸的区别，所以GFP抗体可以同时识别GFP和YFP(记载文献：Wu XY,Shi YP,Li JR,et al.A role for the RNA-binding protein MOS2in microRNA maturation in Arabidopsis.Cell Research,2013(23),645-657)。
[0055] 实施例1、ZTL转基因植物的获得及鉴定
[0056] 本实施例中所涉及的ZTL基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由3164个核苷酸组成，其中第416-1245位为内含子序列；所述ZTL基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2334个核苷酸组成，其中第171-2000位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由609个氨基酸残基组成。
[0057] 一、重组表达载体pRTL2-ZTL的构建
[0058] 提取拟南芥野生型(C24生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1800bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第174-2000位核苷酸序列。
[0059] 引物1：5’-CGGGGTACCGGGAGTGGGACAGTGGTTC-3’(下划线部分为Kpn I的识别位点，该序列的第12-28位为序列2的第174-190位)；
[0060] 引物2：5’-CGCGGATCCCTTACGTGAGATAGCTCGC-3’(下划线部分为BamH I的识别位点，该序列的第11-28位为序列2的第1983-2000位的反向互补序列)。
[0061] 用限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pRTL2载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pRTL2载体的酶切位点Kpn I和BamH I之间插入“GG+序列2的第174-2000位+G”所示DNA片段的重组质粒命名为pRTL2-ZTL。在重组表达载体pRTL2-ZTL中，启动所述ZTL基因转录的启动子为35S启动子。
[0062] 在重组表达载体pRTL2-ZTL的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的ZTL基因为模板。
[0063] 二、ZTL基因突变体鉴定
[0064] ZTL突变体，将其命名为ztl-1，由Steve A.Kay教授赠送，通过EMS诱变得到的点突变突变体，通过PCR技术鉴定出纯合体。
[0065] ztl-1突变体中的ZTL基因(序列1)从起始密码子(ATG)开始第2103位G突变为了A(图1)，导致序列3中第425个氨基酸天冬氨酸(D)置换为天冬酰胺(N)，从而使ZTL蛋白功能发生变化，丧失了其原有的功能(Somers D E,Schultz T F,Milnamow M,et al.ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.Cell,2000(101),319–329)。
[0066] 所用引物序列如下：
[0067] ZTL-WT-F：5’-CCGGCGTTCTTCTAAGTG-3’；
[0068] ztl-1-F：5’-CCGGCGTTCTTCTAAGTA-3’；
[0069] ZTL-R(gen)：5’-ACACACCTCCAACAAGGCTC-3’。
[0070] 三、ZTL转基因拟南芥的获得及鉴定
[0071] 1、ZTL转基因拟南芥及转入pRTL2空载体的拟南芥植株的获得
[0072] 将步骤一构建的重组表达载体pRTL2-ZTL及pRTL2空载体通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有ZTL基因(PCR目的条带大小为1800bp)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pRTL2-ZTL；将转入pRTL2空载体的农杆菌GV3101命名为空-YFP/pRTL2。
[0073] 采用用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pRTL2-ZTL(或空-YFP/pRTL2)转化拟南芥野生型(C24生态型)。
[0074] 转化后进行basta抗性筛选，在含12mg/L basta的MS培养基上培养，收集具有basta抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有basta抗性的两种转基因苗，即转入pRTL2-ZTL的拟南芥植株和转入pRTL2空载体的拟南芥植株(T1代)。
[0075] 2、ZTL转基因拟南芥鉴定
[0076] (1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
[0077] 根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计basta抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝ZTL转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。
[0078] (2)转基因拟南芥OE纯合系的筛选
[0079] 经上述鉴定分析后，因为已有文献报道在拟南芥中过表达ZTL基因会导致拟南芥幼苗下胚轴增长(Somers D E,Kim W-Y,Geng R S.The F-Box Protein ZEITLUPE Confers Dosage-Dependent Control on the Circadian Clock,Photomorphogenesis,and Flowering Time.The Plant Cell,2004(16),769–782.)，所以反过来就是只要转入ZTL基因下胚轴增长的拟南芥就是ZTL基因过表达的转基因植株。所以从其中下胚轴增长的单拷贝ZTL转基因拟南芥株系中随机选择一个，记为OE(T1代)，播种于含12mg/L basta MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具basta抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA耐受性试验分析。
[0080] 三、转基因拟南芥OE纯合系中ZTL基因蛋白表达分析
[0081] 提取拟南芥野生型(C24生态型)、T3代转基因拟南芥OE的总蛋白，同时以转入pRTL2空载体的植株为对照，利用免疫印迹技术，检测转基因拟南芥OE和对照中ZTL蛋白的表达情况。具体如下：
[0082] 1、ZTL蛋白表达检测
[0083] (1)拟南芥总蛋白提取
[0085] 2)按2mL/g加入拟南芥总蛋白提取缓冲液，混匀后在旋转仪上4℃上下颠倒混匀15分钟分钟；
[0086] 3)4℃下12000rpm离心2次，每次10分钟，取上清，液氮速冻，-80℃保存。
[0087] (2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE
[0088] 1)样品准备：蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水煮5～10min，12000rpm离心5min；
[0089] 2)玻璃板洗净装好，配制适当浓度的分离胶与浓缩胶溶液，注入胶板制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。分离胶与浓缩胶配方如下所示：
[0090] 分离胶配方
[0091]
[0092] 浓缩胶配方
[0093]
[0094] 3)把胶板按Bio-Rad Mini III的要求装好后，加入400mL l×电泳缓冲液，上样，80V恒压电泳20～30min后，换150V恒压电泳约1h，至溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳。
[0095] (3)蛋白质免疫印迹Western blot
[0097] 2)用丽春红染色液染硝酸纤维膜2分钟，检测蛋白提取是否有问题，以及是否转到硝酸纤维膜上。
[0098] 3)用水将膜上的丽春红染色液完全洗掉。
[0099] 4)把膜放入封闭液中，在脱色摇床上室温慢摇3h；
[0100] 5)封闭结束后，把膜放入一抗(GFP蛋白抗体，鼠源单克隆抗体)溶液中，在脱色摇床上室温慢摇2h；
[0101] 6)用TBSTl洗膜3次，每次l0min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
[0102] 7)把膜放入二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品名称为Alkaline Phosphatase Horse Anti-Mouse IgG(H+L)，货号为ZB-2310，为马抗鼠抗体)溶液中，在脱色摇床上室温慢摇1h；
[0103] 8)用TBST2洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
[0104] 9)用TBS洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
[0105] 10)把膜放入显色液中进行显色，显色完成后将膜放入ddH2O中，终止反应。
[0106] 实验以Rubisco为对照。
[0107] ZTL蛋白表达的分析结果如图2所示。以Rubisco为对照，拟南芥野生型(C24生态型)和ZTL过表达植株OE中Rubisco量是一样的，证明野生型(C24)和ZTL过表达植株OE总蛋白提取没有问题，因为拟南芥野生型(C24生态型)中没有GFP蛋白，所以用GFP一抗孵育，拟南芥野生型(C24生态型)中检测不到信号，而ZTL过表达植株OE能检测到大小约为93KD的ZTL-YFP蛋白(标签蛋白YFP的大小约为27KD，ZTL蛋白大小约为66KD)。另外，由于转入pRTL2空载体的植株也表达了GFP抗体能够检测的YFP标签蛋白，所以也有检测信号，其条带大小约为27KD。各遗传材料所检测的结果，包括条带大小，均与预期结果一致。以上结果说明ZTL过表达植株OE中确实表达了ZTL蛋白。另外，下述实施例
2的图4中0μM ABA中ZTL过表达植株OE相对于拟南芥野生型(C24生态型)下胚轴增长，也进一步证明了ZTL过表达植株OE中ZTL基因表达量提高，确实为过表达系(Somers D E,Kim W-Y,Geng R S.The F-Box Protein ZEITLUPE Confers Dosage-Dependent Control on the Circadian Clock,Photomorphogenesis,and Flowering Time.The Plant Cell,2004(16),769–782.)。
2的图4中0μM ABA中ZTL过表达植株OE相对于拟南芥野生型(C24生态型)下胚轴增长，也进一步证明了ZTL过表达植株OE中ZTL基因表达量提高，确实为过表达系(Somers D E,Kim W-Y,Geng R S.The F-Box Protein ZEITLUPE Confers Dosage-Dependent Control on the Circadian Clock,Photomorphogenesis,and Flowering Time.The Plant Cell,2004(16),769–782.)。
[0108] 实施例2、ZTL转基因植物对ABA耐受性分析试验
[0109] ABA能够抑制植物幼苗的生长。随着外源ABA浓度的升高，拟南芥野生型(C24生态型)受到的抑制得到增强，其主根和叶片的生长都会受到不同程度的影响。实验重复3次。
[0110] 1、幼苗生长实验
[0111] 以拟南芥野生型(C24生态型)、ZTL基因点突变体ztl-1及实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体ZTL转基因株系OE，以及实施例1得到的转入pRTL2空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μM、0.8μM和1.2μM)(每种实验材料播种80-100粒)。4℃下低温层积3天后移入光照培养箱中，10天后观察各拟南芥幼苗生长的情况。
[0112] 结果如图3、图4所示，在含0μM ABA的培养基上，各种遗传材料的幼苗都能够正常生长。在含0.8μM ABA和1.2μM ABA MS培养基上，ztl-1相对于拟南芥野生型(C24生态型)长势较差，对ABA表现出明显超敏的表型(对ABA的耐受性降低)，而ZTL转基因株系OE，无论在叶片大小和主根长短，相对于拟南芥野生型(C24生态型)长势更好，对ABA表现出明显脱敏的表型(对ABA的耐受性提高)。值得注意的是，0.8μM ABA和1.2μM ABA MS培养基上，拟南芥野生型(C24生态型)主根受到特别明显的抑制，1.2μM ABA MS培养基上尤其明显，ZTL转基因株系OE还能很好的生根，足以说明ZTL转基因株系OE对ABA的耐受性非常强。而对于实施例1得到的转入pRTL2空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型(C24生态型)基本一致，无统计学差异。综合以上实验结果可见，实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体ZTL转基因株系OE对ABA表现出较高的耐受性。
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