GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用
阅读：682发布：2020-05-18
专利汇可以提供GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能 力 方面的应用。具体是苹果酸脱氢酶基因GmMDH12控制根瘤苹果酸合成及其在促进豆科作物根系结瘤方面的应用。本发明研究发现，GmMDH12具有调控大豆根瘤苹果酸合成的功能，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株根瘤内源苹果酸浓度，增加了根瘤数和根瘤 生物 量，从而提高了植株氮含量和生物量。依据本发明，GmMDH12基因具有通过转基因技术提高豆科作物生物固氮功能的潜力，对提高作物养分高效利用以及环境友好型 可持续农业 的发展具有重要的理论和实践意义。，下面是GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用专利的具体信息内容。
1.一种大豆GmMDH12基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 权利要求1所述GmMDH12基因编码蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述GmMDH12基因在增强豆科植物根瘤苹果酸合成方面的应用。
4.权利要求1所述GmMDH12基因在促进豆科植物结瘤固氮能力方面的应用。
5.权利要求1所述GmMDH12基因在培育根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的豆科植物方面的应用。
6.根据权利要求3～5任一所述应用，其特征在于，所述豆科植物为大豆。
7.一种构建根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的转基因大豆的方法，其特征在于，将GmMDH12基因在大豆中过表达。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将GmMDH12基因连接到载体PTF101S上得超量表达载体后，转入K599中，并利用农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，获得转基因大豆。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤如下：
S1.构建超量表达载体
以大豆根瘤cDNA为模板，用SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示上下游特异引物PCR扩增GmMDH12基因序列；
PCR扩增片段回收测序无误后，通过Sac I和Xba I对扩增片段及目的载体PTF101S分别进行双酶切后，将扩增片段连接到目的载体PTF101S上，得到表达载体；
S2.转化：随后通过冻融法将构建好的表达载体转入到K599中，利用农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，得到转基因复合植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，得到的转基因复合植株需经过验证：提取转基因复合植株根系和根瘤RNA，反转录成cDNA，通过定量PCR检测GmMDH12基因表达效果。
GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用
技术领域
背景技术
[0002] 豆科植物根系能够和根瘤菌形成互利互补的共生系统--根瘤。宿主植物能够为根瘤菌的生长提供碳源和合适的生长环境，而根瘤菌则通过固氮酶的作用进行生物固氮，为宿主生长提供氮源。将根瘤菌接种技术应用于农业生产，改善作物氮营养，是豆科作物节肥增产的有效措施，在农业生产中发挥着重要的作用 (Qin et al., 2012)。豆科植物根瘤菌的生长、根瘤的形成以及生物固氮是一个复杂的生理生化过程，由许多代谢途径共同参与完成，其中包括碳代谢途径 (Hernández et al., 2009)。大豆 [Glycine max (L.) Merr] 是全世界范围内一种重要的油料和蛋白质作物，是食用油和食用蛋白的重要原料，也是我国最重要的豆科作物。大豆能够和根瘤菌互利共生形成根瘤，可以改善大豆的氮营养，降低氮肥投入。
[0003] 在根瘤碳代谢过程中，磷酸烯醇丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate, PEP) 是一个重要的中间代谢产物。在根瘤中，PEP主要通过两个途径被同化，一个是合成有机酸进入根瘤的三羧酸循环途径，另一个则是进入氮同化的氨基酸代谢途径 (White et al., 2007)。研究认为，在根瘤菌中，碳代谢的主要方向是经PEP生成草酰乙酸 (Oxaloacetate, OAA)，最后合成苹果酸的途径 (Le Roux et al., 2008)。通过14C标记试验，发现在根瘤中的苹果酸具有标记信号，暗示苹果酸可能作为碳代谢的产物在根瘤中积累，苹果酸被认为是根瘤菌呼吸代谢过程中的重要碳源，进一步被用于根瘤菌的代谢消耗 (Rosendahl et al., 1990; Le Roux et al., 2006)。
[0004] 苹果酸脱氢酶基因MDH (EC.1.1.1.37) 能催化苹果酸与OAA的可逆转化，是三羧酸循环途径中的关键酶。在苜蓿、豌豆和菜豆等豆科作物中，发现接种根瘤菌可以显著提高MDH酶活性，而根瘤中MDH酶活性的增加被认为主要作用于调控根瘤碳代谢途径中苹果酸的合成 (Miller et al., 1998; Colebatch et al., 2002; Le Roux et al., 2008; Hernández et al., 2009)。并且，大量研究也表明，超量表达MDH基因，能够增加苜蓿，大豆和烟草等植株内源苹果酸的含量 (Tesfaye et al., 2001; Lü et al., 2012)。但是，调控根瘤苹果酸合成的重要基因，以及增加苹果酸的合成是否能够促进根系结瘤、提高豆科作物的氮营养仍不清楚。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过蛋白质组学和定量PCR等分析方法，在大豆根瘤中同源克隆了一个GmMDH12基因（序列如SEQ ID NO.3所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示），发现其在蛋白及转录水平上同时受到低磷增强表达，证明了GmMDH12基因编码的蛋白具有促进根瘤苹果酸合成的生物学功能，进而促进了根系结瘤，并最终提高了转基因材料根瘤固氮能力及生物量。
[0006] 本发明的目的是提供GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。
[0007] 本发明另一目的是提供GmMDH12基因增强根瘤苹果酸合成方面的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明涉及一个基因的功能和应用。具体的，本发明提供一种利用苹果酸脱氢酶基因GmMDH12增加豆科根瘤苹果酸合成，促进结瘤固氮、提高植物氮效率的方法，通过超量表达GmMDH12，转基因大豆复合植株具有增加根瘤内源苹果酸浓度，增加根瘤数量和生物量，以及提高植株氮含量的表型。
[0009] 本发明首先进行了苹果酸脱氢酶GmMDH12基因全长cDNA的克隆，并进行了如下研究（1）采用大肠杆菌蛋白表达和纯化系统，分析GmMDH12酶学性质；采用构建大豆转基因复合植株方法，在大豆毛根中分析了GmMDH12基因的组织定位，在大豆毛根中超量表达GmMDH12，比较研究了GmMDH12转基因株系与对照株系在根系结瘤等方面的表型。
[0010] （2）获得了GmMDH12启动子驱动GUS报告基因的大豆转基因复合植株，分析了GmMDH12基因的组织化学定位。
[0011] （3）获得了GmMDH12-GST融合蛋白。
[0012] （4）获得了超量表达GmMDH12的大豆转基因复合植株。
[0014] （2）本发明所述GmMDH12基因编码的蛋白具有体外催化草酰乙酸合成苹果酸的活性。
[0015] （3）本发明所述基因的超量表达转基因复合植株根瘤苹果酸浓度显著高于对照株系，即超量表达GmMDH12增加转基因复合植株根瘤内源苹果酸浓度。
[0016] （4）在低氮处理和接种根瘤菌条件下，本发明所述基因的超量表达转基因复合植株的根瘤数量和生物量均显著高于对照株系，且植株氮含量和干重显著高于对照株系。即超量表达GmMDH12增加转基因复合植株根瘤数和根瘤生物量，增加转基因复合植株干重和氮含量。
[0017] （5）本发明通过对GmMDH12在大豆转基因复合植株的功能分析，明确了GmMDH12在豆科根瘤生长过程中的功能，阐明GmMDH12参与的根系结瘤机制，为包括大豆在内的豆科作物氮高效利用提供了基因资源和理论基础，具有节肥高产的应用前景，对发展环境友好型可持续农业具有重要的实践意义。
[0018] 因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：GmMDH12基因在增强豆科植物根瘤苹果酸合成方面的应用。
[0019] GmMDH12基因在促进豆科植物结瘤固氮能力方面的应用。
[0020] GmMDH12基因在培育根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的豆科植物方面的应用。
[0021] 优选地，所述豆科植物为大豆。
[0022] 另外，基于本发明，还提供了一种构建根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的转基因大豆的方法，是将GmMDH12基因在大豆中过表达。
[0023] 具体地，构建超量表达GmMDH12转基因复合大豆的方法如下：S1.构建超量表达载体
以大豆根瘤cDNA为模板，用SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示上下游特异引物PCR扩增GmMDH12基因序列；
PCR扩增片段回收测序无误后，通过Sac I和Xba I对扩增片段及目的载体PTF101S分别进行双酶切后，将GmMDH12基因扩增片段连接到目的载体PTF101S上，得到表达载体；
S2.转化
随后通过冻融法将构建好的表达载体转入到K599中，利用农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，得到转基因复合植株；
S3.验证
提取转基因复合植株根系和根瘤RNA，反转录成cDNA，通过定量PCR检测GmMDH12基因表达效果。
以大豆根瘤cDNA为模板，用SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示上下游特异引物PCR扩增GmMDH12基因序列；
PCR扩增片段回收测序无误后，通过Sac I和Xba I对扩增片段及目的载体PTF101S分别进行双酶切后，将GmMDH12基因扩增片段连接到目的载体PTF101S上，得到表达载体；
S2.转化
随后通过冻融法将构建好的表达载体转入到K599中，利用农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，得到转基因复合植株；
S3.验证
提取转基因复合植株根系和根瘤RNA，反转录成cDNA，通过定量PCR检测GmMDH12基因表达效果。
[0024] 本发明具有以下有益效果：本发明研究发现，苹果酸脱氢酶基因GmMDH12在大豆根瘤生长代谢方面的功能：
GmMDH12在成熟根瘤类菌体的侵染细胞、维管束和皮层等根瘤组织中均有表达，且随着根瘤生长时间的延长，该基因表达量逐渐增加。在大豆根瘤苹果酸合成方面的功能：GmMDH12在体外具有催化草酰乙酸合成苹果酸的功能。并且，与对照相比，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株根瘤苹果酸浓度。在促进根系结瘤方面的功能：与对照相比，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株的根瘤数和根瘤生物量，提高了植株氮含量和生物量。
GmMDH12在成熟根瘤类菌体的侵染细胞、维管束和皮层等根瘤组织中均有表达，且随着根瘤生长时间的延长，该基因表达量逐渐增加。在大豆根瘤苹果酸合成方面的功能：GmMDH12在体外具有催化草酰乙酸合成苹果酸的功能。并且，与对照相比，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株根瘤苹果酸浓度。在促进根系结瘤方面的功能：与对照相比，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株的根瘤数和根瘤生物量，提高了植株氮含量和生物量。
[0025] 因此，提供了基因GmMDH12在增加大豆根瘤苹果酸合成、促进大豆结瘤固氮、培育高效结瘤固氮转基因豆科植物和提高作物氮效率方面的新应用，可为提高包括大豆在内的豆科作物生物固氮能力，以及氮高效利用和高产的分子育种提供候选基因资源。依据本发明，GmMDH12基因具有通过转基因技术提高豆科作物生物固氮功能的潜力，对提高作物养分高效利用以及环境友好型可持续农业的发展具有重要的理论和实践意义。附图说明
[0026] 图1：GmMDH12蛋白和基因表达分析。
[0027] 图2：GmMDH12启动子驱动GUS的表达部位分析。
[0028] 图3：GmMDH12酶学性质分析。
[0029] 图4：超量表达GmMDH12对大豆转基因复合植株结瘤的影响。
[0030] 图5：超量表达GmMDH12对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响。
具体实施方式
[0032] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0033] 实施例1 GmMDH12基因克隆及表达分析1、GmMDH12蛋白表达分析
根瘤蛋白组学分析实验设计：大豆品种“HN66”种子萌发5天后，幼苗接种根瘤菌BXYD3
1小时，然后转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中，培养25天后，收获地上部、根部及根瘤样品，并于-80 ℃保存，用于根瘤蛋白和RNA的提取。不同时间点基因表达分析实验设计：大豆HN66种子萌发5天后，幼苗接种根瘤菌BXYD3 1小时，然后转移至低磷 (LP, 25 μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 500 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (250 μM NH4NO3) 中培养，于培养的第14、21、30和40天，分别收获根部及根瘤样品于-80 ℃保存，用于苹果酸和RNA的提取。
根瘤蛋白组学分析实验设计：大豆品种“HN66”种子萌发5天后，幼苗接种根瘤菌BXYD3
1小时，然后转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中，培养25天后，收获地上部、根部及根瘤样品，并于-80 ℃保存，用于根瘤蛋白和RNA的提取。不同时间点基因表达分析实验设计：大豆HN66种子萌发5天后，幼苗接种根瘤菌BXYD3 1小时，然后转移至低磷 (LP, 25 μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 500 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (250 μM NH4NO3) 中培养，于培养的第14、21、30和40天，分别收获根部及根瘤样品于-80 ℃保存，用于苹果酸和RNA的提取。
[0034] 双向电泳分析：3 g根瘤样品加入8.0 mL提取缓冲液 (50 %苯酚，0.45 M蔗糖，25 mM EDTA，2 % β-巯基乙醇，250 mM Tris-HCl pH 8.8，2 mM PMSF，2 % PVPP，0.3-1.4 M NaCl，10-40 %乙醇) 研磨，混匀，在4 ℃下12000 rpm离心15分钟，吸取上层苯酚溶液，加入1/10倍体积5 M NaCl，加入5倍体积预冷的甲醇 (含0.1 M醋酸铵和1 % β-巯基乙醇)，混匀，-20 ℃静置2小时后，在4 ℃下12000 rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用预冷的甲醇 (含
0.1 M醋酸铵) 冲洗2次，然后用80 %丙酮洗2次，最后用70 %酒精洗1次，收集沉淀，真空干燥，-80 ℃保存备用。蛋白质样品加入600 μL裂解液 (7 M尿素，2 M硫脲，4 % CHAPS，80 mMDTT，1 % IPG Buffer) 充分混合，涡旋振荡15分钟，在4 ℃下12000 rpm离心15分钟，上清即为蛋白质样品液。采用蛋白定量试剂盒 (2-D Quant-Kit, GE-Healthcare, USA) 对蛋白质样品进行浓度测定，制备牛血清蛋白BSA (GE-Healthcare, USA) 标准曲线，测定样品吸光度值，计算样品蛋白质浓度。
0.1 M醋酸铵) 冲洗2次，然后用80 %丙酮洗2次，最后用70 %酒精洗1次，收集沉淀，真空干燥，-80 ℃保存备用。蛋白质样品加入600 μL裂解液 (7 M尿素，2 M硫脲，4 % CHAPS，80 mMDTT，1 % IPG Buffer) 充分混合，涡旋振荡15分钟，在4 ℃下12000 rpm离心15分钟，上清即为蛋白质样品液。采用蛋白定量试剂盒 (2-D Quant-Kit, GE-Healthcare, USA) 对蛋白质样品进行浓度测定，制备牛血清蛋白BSA (GE-Healthcare, USA) 标准曲线，测定样品吸光度值，计算样品蛋白质浓度。
[0035] 向胶条槽中加入430 μL蛋白样品液，放入IPG胶条 (24厘米) 后滴加覆盖油，盖上胶条槽盖子，置于IPGphor上 (GE-Healthcare, USA)，等电聚焦 (IEF) 程序为25 ℃，50 μA·胶-1，电压和时间参数为：30 V (快速12小时)→50 V (快速2小时)→100 V (线性2小时)→200 V (线性2小时)→500 V (线性2小时)→1000 V (线性2小时)→8000 V (线性4小时)→8000 V (快速90000伏小时)→500 V (快速10小时)。将聚焦完成的IPG胶条进行平衡。胶条平衡分两步进行：第一步用含有1 % DTT的平衡液 [平衡液: 50 mM Tris-HCl (pH 8.8)、6 M尿素、30 % (V/V) 甘油、2 % (W/V) SDS、微量溴酚蓝] 平衡15分钟；第二步用含有2.5 %碘乙酰胺的平衡液平衡15分钟。
[0036] 平衡好的IPG胶条移至凝胶上端，放入Ettan DALTsix电泳仪 (GE-Healthcare, USA) 进行电泳，10 mA·胶-1电泳1小时后，40 mA·胶-1电泳至结束。电泳结束后，用去离子水冲洗凝胶，固定液 [40 % (V/V) 无水乙醇、10 % (V/V) 冰乙酸] 固定1小时以上后，用考马斯亮蓝G-250染色液 [0.08 % (W/V) 考马斯亮蓝G-250、25 % (V/V) 甲醇、1 % (V/V) 磷酸] 染色过夜，然后用去离子水冲洗数次，直到凝胶背景清晰为止，用EPSON 1640´L型扫描仪进行扫描。采用PD-Quest 7.0 (Bio-Rad, USA) 软件对2-DE胶进行分析，筛选出在低磷与高磷处理下显著差异表达的根瘤蛋白点，经胰蛋白酶 (Trysin) 胶内酶解之后，采用ABI 4700 TOF-TOF 质谱仪 (Applied Biosystems, USA) 进行MALDI-TOF /TOF MS质谱分析。
[0037] 2、GmMDH12基因克隆及表达分析在大豆基因组数据库Phytozome上进行同源比对，预测出大豆苹果酸脱氢酶家族共有
16个成员，结合蛋白组学分析，确定根瘤中受磷调控的GmMDH12基因及蛋白序列信息，设计GmMDH12基因全长引物，上游特异引物5’-ATGATGAAGCCATCGATGCTCAGAT-3’ (SEQ ID NO:
1)，下游特异引物5’-TTACTGGTTGGCAAATTTGATTCCCTT-3’ (SEQ ID NO:2)，以大豆根瘤cDNA为模板，PCR扩增GmMDH12基因开放阅读框 (ORF) 全长序列，并测序比对，获得GmMDH12基因ORF全长序列为1038 bp (SEQ ID NO:3)，编码345个氨基酸残基 (SEQ ID NO:4)，蛋白分子量为36 kD。
16个成员，结合蛋白组学分析，确定根瘤中受磷调控的GmMDH12基因及蛋白序列信息，设计GmMDH12基因全长引物，上游特异引物5’-ATGATGAAGCCATCGATGCTCAGAT-3’ (SEQ ID NO:
1)，下游特异引物5’-TTACTGGTTGGCAAATTTGATTCCCTT-3’ (SEQ ID NO:2)，以大豆根瘤cDNA为模板，PCR扩增GmMDH12基因开放阅读框 (ORF) 全长序列，并测序比对，获得GmMDH12基因ORF全长序列为1038 bp (SEQ ID NO:3)，编码345个氨基酸残基 (SEQ ID NO:4)，蛋白分子量为36 kD。
[0038] 提取不同时间点收获的大豆根瘤RNA，将RNA样品反转录所得的cDNA稀释50倍后作为定量PCR反应的模板。运用SYBR Green (Takara, Japan) 定量试剂盒进行定量PCR分析，用Rotor-Gene 3000 qRT-PCR 系统 (Corbett Research, Australia) 进行反应。20 μL反应体系为，10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，6.4 μL Mili-Q水，0.8 μL 10 μM的引物，2 μL稀释100倍的cDNA模板。反应程序为，95 ℃ 1分钟，94 ℃ 15秒，60 ℃ 15秒，72 ℃ 30秒，40次循环。以大豆GmEF1a作为看家基因，相对表达量=目的基因表达量/看家基因 (GmEF1a) 表达量。GmMDH12基因定量PCR的引物为：F: 5’-CTCACTCACTAATCGCCACTCTCAC-3’ (SEQ ID NO:5)，R: 5’-GCGGAGTGGAGAGATCTGAGCA-3’ (SEQ ID NO:6)。大豆看家基因GmEF1a定量PCR引物为：F: 5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’ (SEQ ID NO:7)，R: 5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’ (SEQ ID NO:8)。
[0039] 3、大豆根瘤内源苹果酸提取与测定取 0.2克大豆根瘤样品，用0.6 mL 0.5 M HCl 研磨，再用0.6 mL蒸馏水洗研钵后一起转入离心管，80 ℃水浴20分钟，期间充分混匀几次，4 ℃，12000 rpm离心15分钟，吸上清，取1 mL上清液过0.45 μm微孔滤膜。采用高效液相色谱仪1260 Infinity LC系列 (Agilent, USA)，柱温35 ℃，流动相为0.2 %偏磷酸，样品通过C18柱 (4.6 mm×250 mm) 后，检测波长220 nm的吸收值，通过制作苹果酸标准曲线计算样品中苹果酸的浓度。
[0040] 4、实验结果图1为GmMDH12蛋白和基因表达分析。其中A：GmMDH12蛋白在根瘤中的表达；B：GmMDH12基因在根和根瘤中的表达；C：GmMDH12在不同发育时期根瘤中的表达；D：不同发育时期根瘤内源苹果酸浓度。图中数据是3个生物学重复的平均值和标准误差。结果表明：GmMDH12蛋白和基因在根瘤中均受到磷有效性调控表达 (图1 A，B)。如图1 C所示，在高、低磷处理下，随着根瘤生长时间的延长，GmMDH12基因表达量均逐渐增加，在30天时表达量最高，而在40天的根瘤中表达量有所降低。与GmMDH12基因表达模式相似，随着生长时间的延长，根瘤内源苹果酸浓度呈现先增加后降低的趋势，在21天根瘤中的苹果酸浓度最高，在40天的衰老根瘤中最低。结果表明GmMDH12参与了根瘤的生长代谢过程。
[0041] 实施例2 GmMDH12基因启动子克隆、载体构建及组织定位分析1、实验方法
GmMDH12基因启动子克隆与GUS表达载体构建：提取大豆根部基因组DNA，以大豆基因组DNA为模板，用上游特异引物5’-GGGATCCCCGTGCATGTGTTGA-3’ (SEQ ID NO:9)和下游特异引物5’-ATGAATTCAGTGGCGATTAGTGAG-3’ (SEQ ID NO:10) 扩增GmMDH12启动子2182 bp (SEQ ID NO:11)，PCR片段回收测序后，通过BamH I和EcoR I对回收片段及目的载体pCAMBIA1391进行双酶切后，将启动子片段连接到pCAMBIA1391上，随后通过冻融法将构建好的GUS表达载体转入到发根农杆菌K599中 (K599菌株由澳大利亚昆士兰大学豆科综合研究中心惠赠，保存于华南农业大学根系生物学研究中心实验室，具体描述见文献Kereszt et al., 2007)。
GmMDH12基因启动子克隆与GUS表达载体构建：提取大豆根部基因组DNA，以大豆基因组DNA为模板，用上游特异引物5’-GGGATCCCCGTGCATGTGTTGA-3’ (SEQ ID NO:9)和下游特异引物5’-ATGAATTCAGTGGCGATTAGTGAG-3’ (SEQ ID NO:10) 扩增GmMDH12启动子2182 bp (SEQ ID NO:11)，PCR片段回收测序后，通过BamH I和EcoR I对回收片段及目的载体pCAMBIA1391进行双酶切后，将启动子片段连接到pCAMBIA1391上，随后通过冻融法将构建好的GUS表达载体转入到发根农杆菌K599中 (K599菌株由澳大利亚昆士兰大学豆科综合研究中心惠赠，保存于华南农业大学根系生物学研究中心实验室，具体描述见文献Kereszt et al., 2007)。
[0042] 农杆菌介导的大豆转基因复合植株的构建：大豆品种HN66种子在沙培中萌发5天后用于毛根的诱导，用1 mL注射器沾上上述培养好的K599菌体，在幼苗下胚轴位置来回扎刺，并于伤口处涂布菌体，使菌体充分侵染伤口。把侵染后的幼苗转移至正常营养液中培养，大约14天后可见毛根从伤口处理长出，期间注意保持侵染伤口的湿度。待毛根长出后去除主根，把毛根置于营养液中继续培养。待毛根长出10厘米左右时，对毛根接种根瘤菌1小时，在低氮 (50 mM NH4NO3) 和低磷 (5 µM KH2PO4) 营养液中培养21和30天后，进行GUS染色和石蜡切片分析该基因在根和根瘤中的组织定位情况。
[0043] 2、实验结果图2为GmMDH12启动子驱动GUS的表达部位分析。结果表明，在根部中，GUS基因主要在根尖和中柱等部位中表达 (图2B-D，标尺均为10 mm)。图2E和2F分别是生长21天根瘤纵切和横切图，图2G为生长30天根瘤横切图，图2H为图2G局部放大图，标尺均为200 mm。
[0044] 结果表明，在根瘤中，GUS基因主要在根瘤类菌体、维管束和皮层细中均表达，且随着根瘤生长时间的延长，在类菌体侵染细胞中的表达量逐渐增加，表明GmMDH12参与了根瘤的生长过程。
[0045] 实施例3 GmMDH12酶学性质分析1、实验方法
（1）原核表达载体的构建：以大豆根瘤cDNA为模板，用上游特异引物5’-
GGATCCATGATGAAGCCATCGA-3’ (SEQ ID NO:12)和下游特异引物5’-
ACATGAATTCTTACTGGTTGGCAAATT-3’ (SEQ ID NO:13) 扩增GmMDH12基因全长，PCR片段回收测序无误后，通过BamH I和EcoR I对片段及原核表达载体pGEX6P-3 (GE-Healthcare, USA) 进行双酶切后，将GmMDH12基因连接到目的载体pGEX6P-3上，随后通过冻融法将构建好的表达载体转入BL21大肠杆菌中。
（1）原核表达载体的构建：以大豆根瘤cDNA为模板，用上游特异引物5’-
GGATCCATGATGAAGCCATCGA-3’ (SEQ ID NO:12)和下游特异引物5’-
ACATGAATTCTTACTGGTTGGCAAATT-3’ (SEQ ID NO:13) 扩增GmMDH12基因全长，PCR片段回收测序无误后，通过BamH I和EcoR I对片段及原核表达载体pGEX6P-3 (GE-Healthcare, USA) 进行双酶切后，将GmMDH12基因连接到目的载体pGEX6P-3上，随后通过冻融法将构建好的表达载体转入BL21大肠杆菌中。
[0046] （2）取适量上述含有目的基因的BL21菌液至200 mL新鲜的LB液体培养基中于28 ℃培养至OD600为0.4，然后加入0.2 mM IPTG继续培养12小时，菌液于12000 rpm离心10分钟，收集菌体，用8 mL Binding buffer (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3) 重悬沉淀，并用超声波碎解菌体，离心，收集上清，上清与2 mL Glutathione Sepharose 4B (GE-Healthcare, USA) 在4 ℃下反应3小时，然后用Binding buffer洗脱杂蛋白3次，最后用Elution buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM Reduced glutathione, pH 8.0) 洗脱柱3次，收集GmMDH12目的蛋白。
[0047] （3）对最适反应温度的测定，将反应混合物先放在不同温度里 (20 ℃-90 ℃) 温育10分钟后，反应进行时在再加入等量的酶，混匀后置于紫外分光光度计中测定2分钟内OD340的变化值，记录数据变化情况。对最适反应pH的测定，将混合物中100 mM Tris-HCl配制成相同温度下pH为7.0-9.0不同梯度，再配制反应混合物，活性分析时加入酶液，混匀后置于紫外分光光度计中测定2分钟内OD340的变化值，记录数据变化情况。对不同底物浓度的测定，设置不同的OAA底物浓度(0.02-3 mM)，反应进行时在再加入等量的酶和反应混合物，混匀后置于紫外分光光度计中测定2分钟内OD340的变化值，记录数据变化情况，得到的数据利用双倒数方法 (Lineweaver-Burk) 求得酶学反应的Km值。不同金属离子对酶活性影响分析，分别于等量的酶和反应混合物中加入0.1 mM的不同金属离子 (Mn2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Al3+、Ag2+和Hg2+)，混匀后置于紫外分光光度计中测定2分钟内OD340的变化值。以每分钟催化反应NADH 1 μmol定义为1个酶活性单位 (U)，NADH的摩尔消光系数6.22 L mmol·cm-1。
[0048] 2、实验结果图3为GmMDH12蛋白酶学性质分析。其中，A：不同OAA底物浓度对酶活性影响；B：不同pH值对酶活性影响；C：不同温度对酶活性影响；D：不同金属离子对酶活性影响。
[0049] 结果显示：GmMDH12蛋白最适底物浓度为1.5 mM OAA，酶促反应的Km值为0.434 mM 2+ +
(图3A)，最适反应pH值和温度分别为pH 8.0和50 ℃ (图3B，C)，并且，0.1 mM Mg 、Ag 和Hg+离子显著抑制了GmMDH12的酶活性 (图3D)。
(图3A)，最适反应pH值和温度分别为pH 8.0和50 ℃ (图3B，C)，并且，0.1 mM Mg 、Ag 和Hg+离子显著抑制了GmMDH12的酶活性 (图3D)。
[0050] 实施例4 超量表达GmMDH12载体构建，大豆转基因复合植株的获得与检测超量表达载体的构建：以大豆根瘤cDNA为模板，用上游特异引物5’-ACAAAGAGCTCGAGAGAGAGAAA-3’ (SEQ ID NO:14)和下游特异引物5’-
ATATCTAGAAACCTACCAGACATGTATG-3’ (SEQ ID NO:15)扩增GmMDH12序列，PCR片段回收测序无误后，通过Sac I和Xba I对片段及目的载体PTF101S进行双酶切后，将GmMDH12基因连接到目的载体PTF101S上，随后通过冻融法将构建好的表达载体转入到K599中，按上述的农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，以转空载体PTF101S株系为对照 (CK)。
ATATCTAGAAACCTACCAGACATGTATG-3’ (SEQ ID NO:15)扩增GmMDH12序列，PCR片段回收测序无误后，通过Sac I和Xba I对片段及目的载体PTF101S进行双酶切后，将GmMDH12基因连接到目的载体PTF101S上，随后通过冻融法将构建好的表达载体转入到K599中，按上述的农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，以转空载体PTF101S株系为对照 (CK)。
[0051] 提取转基因复合植株根系和根瘤RNA，反转录成cDNA，进一步通过定量PCR检测GmMDH12基因表达的效果，检测方法和过程与上述实施例一中的GmMDH12基因表达模式分析相同。
[0052] 实施例5 超量表达GmMDH12对大豆转基因复合植株结瘤的影响1、实验方法
待实施例4所得大豆转基因复合植株和对照株系毛根长10 cm时，分别进行接种根瘤菌BXYD3 1小时，然后转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中，培养30天后，收获地上部、根部及根瘤样品，并测定相关生理指标，包括：根瘤数和根瘤鲜重，根瘤苹果酸浓度。
待实施例4所得大豆转基因复合植株和对照株系毛根长10 cm时，分别进行接种根瘤菌BXYD3 1小时，然后转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中，培养30天后，收获地上部、根部及根瘤样品，并测定相关生理指标，包括：根瘤数和根瘤鲜重，根瘤苹果酸浓度。
[0053] 2、实验结果图4为超量表达GmMDH12对大豆转基因复合植株结瘤的影响。其中，A：根瘤表型，标尺为
1 cm；B：转基因根瘤GmMDH12表达分析；C：转基因根瘤内源苹果酸浓度；D：根瘤鲜重；E：根瘤数。CK表示空载体对照株系；OX表示超量表达GmMDH12转基因复合植株。试验数据是5个生物学重复的平均值和标准误。*号表示对照CK 株系与OX株系之间的差异显著，p< 0.05；ns：表示差异不显著。
1 cm；B：转基因根瘤GmMDH12表达分析；C：转基因根瘤内源苹果酸浓度；D：根瘤鲜重；E：根瘤数。CK表示空载体对照株系；OX表示超量表达GmMDH12转基因复合植株。试验数据是5个生物学重复的平均值和标准误。*号表示对照CK 株系与OX株系之间的差异显著，p< 0.05；ns：表示差异不显著。
[0054] 结果显示：相对空载体对照株系CK，超量表达GmMDH12显著增加了转基因复合植株根瘤内源苹果酸浓度 (图4C)，以及根瘤数和根瘤生物量 (图4D，E)。
[0055] 实施例6 超量GmMDH12对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响1、实验方法
待大豆转基因复合植株和对照株系毛根长10 cm时，分别接种根瘤菌1小时，然后转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中，培养30天后，收获地上部和根部，并测定相关生理指标，包括：植株生物量和氮磷含量。
待大豆转基因复合植株和对照株系毛根长10 cm时，分别接种根瘤菌1小时，然后转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中，培养30天后，收获地上部和根部，并测定相关生理指标，包括：植株生物量和氮磷含量。
[0056] 植株生物量测定：收获的地上部和根部样品在105 ℃烘箱杀青30分钟，然后于75 ℃烘干至恒重，称取干重。
[0057] 植株氮、磷测定：分别称取地上部和根部样品0.1 g左右，加入5 mL 浓硫酸消煮，然后用蒸馏水定容致50 mL，将样品稀释4倍后，置于连续流动分析仪 (型号为SAN++，产自荷兰) 中进行测定。根据所测得样品的氮磷浓度和植株干重计算植株氮磷含量。
[0058] 2、实验结果图5为超量表达GmMDH12对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响。其中，A：植株干重；B：植株氮含量；C：植株磷含量。大豆转基因复合植株接种根瘤菌1小时后，转移至低磷 (LP, 5μM KH2PO4) 或高磷 (HP, 250 μM KH2PO4) 的低氮营养液 (50 μM NH4NO3) 中培养
30天。CK表示空载体对照株系；OX表示超量表达GmMDH12转基因复合植株。试验数据是5个生物学重复的平均值和标准误。*号表示对照CK 株系与OX株系之间的差异显著，p< 0.05；ns：
表示差异不显著。
30天。CK表示空载体对照株系；OX表示超量表达GmMDH12转基因复合植株。试验数据是5个生物学重复的平均值和标准误。*号表示对照CK 株系与OX株系之间的差异显著，p< 0.05；ns：
表示差异不显著。
[0059] 结果表明：相对空载体对照株系CK，超量表达GmMDH12显著增加了转基因复合植株干重 (图5A) 和氮含量 (图5B)，但对磷含量没有显著影响 (图5C)。
[0060] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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