技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，涉及一种通过下调PAB4和PAB8提高植物对NaCl耐受性的方法。
背景技术
[0002]
盐胁迫是影响
农作物产量的主要因素之一。盐胁迫主要是通过NaCl作为胁迫来对植物造成损伤。
土壤中高浓度的钠离子会直接影响植物的
蛋白质合成、光合作用以及
能量代谢等等，进而导致植物发芽率降低、发育迟缓、蛋白合成减少以及新陈代谢减缓等等，最终严重影响作物的产量。截止到目前为止，全球盐渍地的总面积约为9.5438亿hm2，而其中2
我国占到了9913万hm，并且全球及我国盐渍的面积每年都在不断增加。
[0003] 在我国盐渍地不断增加的严峻形势下，快速且有效改善和利用盐渍地资源以及提高盐渍化土地上的作物产量具有极其重大的现实意义。目前为止，改善和利用盐渍地的方式主要有两种：一是通过合理
灌溉、
淡水洗盐等土地改良工程措施；但是，这些措施耗资巨大且有很强的
副作用，进而实施难度较大且很难维持。另一有效利用盐渍化土地的方法是培育出高效耐盐新品种，这将成为今后农业发展的重要方向。
[0004] 植物的
耐盐性是由多基因数量性状控制，并受环境影响的复杂性状；因此，传统的育种方法在提高作物耐盐性的效果上往往不是特别理想。随着大量耐盐基因的鉴定以及科学家们对植物耐盐分子机制研究的不断深入，通过基因工程等手段提高作物的耐盐性受到极大重视。基因工程技术手段的优势在于可以精确、稳定和高效地改变基因表达，进而可以有效提高植物耐盐性，极大地加快了育种速度，成为培育高效耐盐新品种的重要途径。而鉴定出更多的耐盐基因及深入研究植物耐盐分子机制是培育高效耐盐新品种的首要任务。
[0005] 几乎所有真核生物的mRNA 3’端都存在Poly(A)尾巴，Poly(A)影响着mRNA几乎所有的代谢活动，例如转运、降解和翻译。Poly(A)结合蛋白[Poly(A)-binding protein,PABP/PAB]是RNA结合蛋白超家族中一类高度保守的蛋白亚族，广泛存在于
酵母、
线虫和拟南芥等真核生物不同类型的细胞中。PABP/PAB蛋白是重要的翻译起始因子之一，它能与mRNA末端poly(A)尾巴相结合，控制poly(A)的长度，参与mRNA的翻译、降解以及合成等重要过程。
[0006] 酵母和动物中对PABP基因的研究较为深入，而高等植物有关PABP基因的研究较少。在酵母细胞中，PABP基因的缺失突变体是致死型的，说明该基因在对酵母细胞极其重要。拟南芥PABP5基因是花药特异性表达的，它的缺失可能会引起植物的败育。拟南芥中PAB4基因的基因号为At2g23350，PAB8基因的基因号为At1g49760；另外，拟南芥中PAB2，PAB4和PAB8这三个基因被报道参与调控病毒的复制。
[0007] 随着植物耐盐分子机制研究的深入及应用的拓展，如何利用已发现的耐盐基因改变植物对NaCl耐受性，如何培育高效耐盐新品种来提高盐
碱化土地作物的单位产量成为研究前沿。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种通过下调PAB4和PAB8提高植物对NaCl耐受性的方法。
[0009] 本发明所提供了如下A-C中任一的应用：
[0010] A.蛋白质1和蛋白质2作为靶标在如下任一中的应用：
[0011] a1)提高植物的耐盐性；
[0012] a2)选育耐盐性提高的植物品种；
[0013] 所述蛋白质1为PAB4蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0014] 在所述应用中，所述“蛋白质1和蛋白质2作为靶标”具体可为：以所述蛋白质1和所述蛋白质2作为靶标，下调所述蛋白质1和所述蛋白质2的表达。
[0015] B.能够抑制植物中蛋白质1和蛋白质2表达和/或活性的物质在如下任一中的应用：
[0016] a1)提高植物的耐盐性；
[0017] a2)选育耐盐性提高的植物品种；
[0018] 所述蛋白质1为PAB4蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0019] C.能够抑制植物中蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因表达的物质在如下任一中的应用：
[0020] a1)提高植物的耐盐性；
[0021] a2)选育耐盐性提高的植物品种；
[0022] 所述蛋白质1为PAB4蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0023] 更进一步，所述蛋白质1(PAB4蛋白)为由
序列表中序列3所示的
氨基酸序列组成的蛋白质；所述蛋白质2(PAB8蛋白)为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0024] 在本发明中，以上所有a2)中的所述选育耐盐性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述蛋白质1(PAB4蛋白)和所述蛋白质2(PAB8蛋白)表达量均较低的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0025] 本发明还提供了一种培育耐盐性提高的转基因植物的方法。
[0026] 本发明所提供的培育耐盐性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：在受体植物中对蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因均进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐盐性增强；
[0027] 所述蛋白质1为PAB4蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0028] 更进一步，所述蛋白质1(PAB4蛋白)为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述蛋白质2(PAB8蛋白)为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0029] 其中，所述“在受体植物中对蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因均进行抑制表达”可为任何能够抑制所述受体植物中所述蛋白质1的编码基因和所述蛋白质2的编码基因表达的方法。在本发明中，是从拟南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http://www.arabidopsis.org/]获得的PAB4和PAB8基因双敲除突变体，该双突变体对NaCl耐受性增强。当然，也可以通过基因工程手段(RNAi技术)获得PAB4和PAB8低表达、对NaCl耐受性增强的转基因植物。
[0030] 在上述应用或方法中，所述蛋白质1的编码基因(即PAB4基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0031] 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第157至2145位核苷酸所示的DNA分子；
[0032] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0033] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0034] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0035] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0036] 在上述应用或方法中，所述蛋白质2的编码基因(即PAB8基因)是如下6)至10)中任一所述的DNA分子：
[0037] 6)编码序列为序列表中序列5自5’末端第261至2276位核苷酸所示的DNA分子；
[0038] 7)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0039] 8)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0040] 9)在严格条件下与6)-8)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0041] 10)与6)-9)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0042] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0043] 其中，序列1由3217个核苷酸组成，为所述PAB4基因在拟南芥基因组中序列，其中第455-666位、第786-869位、第1527-1623位、第1702-1794位、第1885-1965位、第2101-2201位、第2370-2452位、第2636-2728位均为内含子序列；序列2由2373个核苷酸组成，为所述PAB4基因的cDNA序列，其中第157-2145位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由662个氨基酸残基组成。
[0044] 序列4由3568个核苷酸组成，为所述PAB8基因在拟南芥基因组中序列，其中第556-886位、第1006-1141位、第1799-1883位、第1962-2062位、第2153-2243位、第2379-2455位、第2651-2738位、第2943-3031位均为内含子序列；序列5由2570个核苷酸组成，为所述PAB8基因的cDNA序列，其中第261-2276位为编码序列(ORF)；序列4和序列5均编码序列表中序列
6所示的蛋白质，序列6由671个氨基酸残基组成。
[0045] 在上述应用或方法中，所述植物既可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0046] 在本发明的一个
实施例中，所述植物为双子叶植物，进一步为十字花科植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。
[0047] 本发明研究发现，从拟南芥生物研究中心(ABRC)获得的PAB4和PAB8基因双敲除突变体对NaCl耐受性增强；因此，可利用PAB4和PAB8调节植物对NaCl的耐受性。另外，也可通过基因工程手段(RNAi技术)获得PAB4和PAB8低表达、耐盐转基因作物。本发明符合
可持续农业发展需求，对于研究植物耐受NaCl分子机制、改良遗传特性，培育高效耐盐新品种等方面具有重要的实用价值和市场前景。
附图说明
[0048] 图1为PAB4和PAB8基因T-DNA插入双突变体pab4-1 pab8-1的鉴定。图中WT代表拟南芥野生型，即Col-0生态型；图中4/8代表pab4-1 pab8-1双突变体。从图中可以看出，pab4-1 pab8-1双突变体植株为纯合体植株。
[0049] 图2为用实时
荧光定量PCR检测PAB4基因T-DNA插入突变体pab4-1中PAB4基因表达量的分析结果。从图中可以看出，pab4-1突变体为PAB4基因敲除突变体。
[0050] 图3为用实时荧光定量PCR检测PAB8基因T-DNA插入突变体pab8-1中PAB8基因表达量的分析结果。从图中可以看出，pab8-1突变体为PAB8基因敲除突变体。
[0051] 图4为用实时荧光定量PCR检测pab4-1 pab8-1双突变体中PAB4和PAB8基因表达量的分析结果。图中WT代表拟南芥野生型，即Col-0生态型；图中pab4/8代表pab4-1pab8-1双突变体。从图中可以看出，pab4-1 pab8-1双突变体为PAB4和PAB8基因双敲除突变体。
[0052] 图5为NaCl对pab4-1 pab8-1双突变体
幼苗生长的影响分析结果。图中pab4/8代表pab4-1 pab8-1双突变体。
具体实施方式
[0053] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0054] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055] 拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型
种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http://www.arabidopsis.org/]产品。
[0056] PAB4和PAB8基因双敲除突变体pab4-1 pab8-1为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品，种子号为CS8178，背景为拟南芥野生型(Col-0生态型)；其中，pab4-1单突变体种子号为SALK_113383，pab8-1单突变体种子号为SALK_022160。pab4-1pab8-1双突体具体信息在已发表的文章中也有详细描述(Dufresne,P.J.,Ubalijoro,E.,Fortin,M.G.,and Laliberte,J.F.(2008).Arabidopsis thaliana class II poly(A)-binding proteins are required for efficient multiplication of turnip mosaic virus.Journal of General Virology 89,2339-2348.)。
[0057] 实施例1、pab4-1突变体、pab8-1突变体及pab4-1 pab8-1双突变体鉴定及表达量分析
[0058] 一、pab4-1突变体、pab8-1突变体及pab4-1 pab8-1双突变体的鉴定[0059] 根据图1中的引物组合，通过PCR技术鉴定出pab4-1 pab8-1双突变纯合体植株。另外，相同的方法鉴定出pab4-1突变体及pab8-1突变体纯合体植株。
[0060] 所用引物序列如下：
[0061] pab4-1 LP：5’-GAGAAGGCAATGCAGAAGTTG-3’(Left primer,LP)[0062] pab4-1 RP：5’-ACTACCTGCAGCTTAGCCCTC-3’(Right primer,RP)[0063] pab8-1 LP：5’-ATCAACAACAGCTTGTACCGG-3’(Left primer,LP)[0064] pab8-1 RP：5’-CAGTCTGTTTTCGGAAGCAAG-3’(Right primer,RP)[0065] LBb1：5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3’(Left border primer,LB)[0066] 二、pab4-1突变体、pab8-1突变体及pab4-1 pab8-1双突变中对应基因表达量分析[0067] 提取拟南芥野生型(Col-0生态型)、pab4-1突变体、pab8-1突变体以及pab4-1pab8-1双突变体株系总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中PAB4或/和PAB8基因在转录水平上表达情况。具体如下：
[0068] 1、转录水平分析(RNA表达量)
[0069] 以pab4-1突变体、pab8-1突变体、pab4-1 pab8-1双突变体以及拟南芥野生型(Col-0生态型)平皿中生长12天的幼苗做为实验材料。提取各实验材料的总RNA，反转录成单链cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析PAB4或/和PAB8基因在各实验材料中的表达情况。
[0070] 其中，扩增PAB4和PAB8基因的引物序列为：
[0071] PAB4 RT-F：5’-AGGTTATGCGGGACCCTAGT-3’(序列2的第1229-1248位)；
[0072] PAB4 RT-R：5’-GTGGAGGTCCTTGACCGTAA-3’(序列2的第1497-1516位的反向互补序列)。
[0073] 扩增PAB8基因的引物序列为：
[0074] PAB8 RT-F：5’-CATCGTGACTCGCCTACTTC-3’(序列5的第1947-1966位)；
[0075] PAB8 RT-R：5’-CTGGTGATTCCAGCAAGTGA-3’(序列5的第2135-2154位的反向互补序列)。
[0076] 以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
[0077] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
[0078] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
[0079] 上述引物的反应条件如下：
[0080] (1)反应体系的建立
[0081] 实时荧光定量PCR反应体系
[0082]
[0083] (2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0084] (3)反应程序的设定：
[0085] 实时荧光定量PCR反应程序
[0086]
[0087] (4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光
信号达到设定
阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
[0088] 实时荧光定量PCR检测结果如图2、图3及图4所示，PAB4和PAB8基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)的PAB4和PAB8基因的表达为100。从图中可以看出，pab4-1突变体中PAB4基因在转录水平上没有表达，为PAB4基因敲除突变体(图2)；pab8-1突变体中PAB8基因在转录水平上没有表达，为PAB8基因敲除突变体(图3)；pab4-1 pab8-1双突变体中PAB4和PAB8基因在转录水平上均没有表达，为PAB4和PAB8基因双敲除突变体(图4)。
[0089] 实施例2、pab4-1 pab8-1双突变体对NaCl耐受性分析试验
[0090] NaCl能够抑制植物幼苗的生长。随着外源NaCl浓度的升高，拟南芥野生型(Col-0生态型)受到的抑制得到增强，其主根和
叶片的生长都会受到不同程度的影响，实验重复3次。
[0091] 以拟南芥野生型(Col-0生态型)、pab4-1 pab8-1双突变体植株为实验材料。将各实验材料的种子
播种在不含有NaCl的MS平板上，4℃下低温层积3天，放到光照
培养箱中培养72h，然后将刚刚萌发的各实验材料幼苗移到含有不同浓度NaCl的MS培养基上(0mΜ、50mΜ、100mΜ、150mΜ和200mΜ)，竖直生长9天后观察拟南芥幼苗生长的情况。
[0092] 结果如图5所示，在含0mM NaCl的培养基上，各遗传材料幼苗长势(叶片生长和主根长度)基本一致；但是，在含不同浓度NaCl的MS培养基上，野生型幼苗生长受到了明显的抑制；而pab4-1 pab8-1幼苗相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)对NaCl敏感性较低，长势明显好于野生型，表现出耐盐的表型，即pab4-1 pab8-1双突变体对NaCl耐受性增强。
[0093] 另外，本发明的
发明人采用相同的方法检测了pab4-1突变体及pab8-1突变体对NaCl的耐受性，结果发现，无论在不含NaCl的培养基还是在含有不同浓度NaCl的MS培养基上，pab4-1突变体和pab8-1突变体与拟南芥野生型(Col-0生态型)幼苗长势均基本一致。
