CPN20蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
阅读：129发布：2020-06-06
专利汇可以提供CPN20蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种CPN20蛋白及其编码基因在调控 植物 对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用具体为由 序列表 中序列3所示的 氨 基酸序列组成的 蛋白质 在如下a1）或a2）中的应用：a1）调控植物对ABA耐受性；a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。本发明可应用于将植物 激素 ABA作为一种选择性 除草剂 ，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用CPN20基因调节植物对ABA的敏感性或耐受性，获得CPN20基因高表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合 可持续农业 发展需求，对于改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法和途径等方面具有重要的实用价值和市场前景。，下面是CPN20蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利的具体信息内容。
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控拟南芥对ABA耐受性；
a2）选育对ABA耐受性提高的拟南芥品种。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控拟南芥对ABA耐受性；
a2）选育对ABA耐受性提高的拟南芥品种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列1所示的DNA分子。
4.培育对ABA耐受性提高的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：
a）向目的拟南芥中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因拟南芥；
b）从步骤a）所得转基因拟南芥中得到与所述目的拟南芥相比，对ABA耐受性提高的转基因拟南芥。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列1所示的DNA分子。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的拟南芥中的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤b）中，所述从步骤a）所得转基因拟南芥中得到与所述目的拟南芥相比，对ABA耐受性提高的转基因拟南芥，是通过如下方法实现的：用所述目的拟南芥不能耐受的浓度的ABA溶液处理所述步骤a）所得转基因拟南芥，从而获得所述与所述目的拟南芥相比，对ABA耐受性提高的转基因拟南芥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目的拟南芥不能耐受的浓度的ABA溶液为浓度为0.5μM-20μM的ABA水溶液。
10.一种对权利要求4-9任一中所述的转基因拟南芥进行除草的方法，其特征在于：所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因拟南芥来说能耐受。
CPN20蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应
用
技术领域
背景技术
[0002] 植物激素ABA在植物发育的各个阶段，包括胚胎成熟、种子发育及幼苗生长过程中发挥重要调节作用。ABA也是植物适应逆境，例如干旱、高盐及低温胁迫的关键激素。ABA信号转导机制已经被广泛研究，许多ABA信号转导相关组分被发现，其中也包括ABA受体。有报道称可能的G蛋白偶联受体GCR2以及GPCR类G蛋白GTG1和GTG2是候选的ABA质膜受体。但是，GCR2是否参与调控ABA调节的种子萌发和萌发后生长还存在争议。GTGs是ABA信号转导的正调节子，它能够与拟南芥G蛋白α亚基GPA1相互作用，GPA1通过抑制GTG与ABA结合活性负调节ABA信号转导。属于START超家族的PYR/PYL/RCAR蛋白被鉴定为ABA细胞质受体，其可以调节ABA核心信号通路。2C类蛋白磷酸酶（PP2Cs）直接作用于PYR/PYL/RCAR受体下游，抑制SNF1相关蛋白激酶2s（SnRK2s）活性，继而调节ABF/AREB/ABI5等bZIP类转录因子继而调控ABA信号反应。
[0003] 镁螯合酶H亚基（CHLH/ABAR）是拟南芥ABA潜在受体，它能够拮抗一组WRKY转录因子进而解除其对ABA响应基因的抑制作用。虽然CHLH/ABAR是否能够结合ABA还有待研究，但是已经有证据表明CHLH/ABAR参与ABA信号转导。在拟南芥已经鉴定出的四个abar相关突变体abar-2，abar-3，cch和rtl1中ABA敏感性均发生改变。独立研究小组发现CHLH/ABAR参与调控拟南芥及桃子叶片气孔保卫细胞对ABA的响应过程。近期本实验室的研究发现CHLH/ABAR也参与调控烟草叶片保卫细胞中ABA信号转导。另外CHLH/ABAR也参与调控了桃子及草莓的果实成熟过程。以上证据均表明CHLH/ABAR是植物细胞必须的ABA信号调节子。但是，ABAR/CHLH介导的信号转导机制尚待研究，筛选该通路中的关键功能组分是了解ABA信号转导的复杂作用机制所必须的。
[0004] Chaperones（分子伴侣）是一类功能性伴侣蛋白，具有平衡蛋白质折叠、装配、定位和降解的作用。大部分分子伴侣在高温或其它胁迫条件下表达量上调，因此它们也被称为热激蛋白（HSPs）。在植物中，根据蛋白分子量不同将分子伴侣分为五个家族，分别为HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族，伴侣蛋白（HSP60）和小HSP家族。共伴侣蛋白能够与分子伴侣例如HSP60、HSP70或HSP90相互作用，辅助特异底物折叠。近期有研究表明，共伴侣蛋白与其相应的分子伴侣也参与了一些信号转导过程。例如，HSP40是HSP70的共伴侣蛋白，它在植物适应高盐环境中发挥重要作用。HSP40类蛋白J3通过调控PSK5活性参+与拟南芥耐盐信号转导过程，J3能够通过抑制PKS5激酶活性进而促进质膜H-ATP酶的活性。SGT1是HSP70/HSP90复合体的支架蛋白，其在植物生长素和茉莉素以及SCF E3泛素连接酶依赖的信号转导中发挥重要作用。近期研究表明，HSP90及SGT1b在ABA调控种子萌发和气孔运动中发挥负调控作用。
[0005] 分子伴侣/共伴侣蛋白中研究比较深入的是伴侣蛋白HSP60，或称CPN60/CPN10。伴侣蛋白HSP60/CPN60包括两组。第一组存在于细菌和真核生物的叶绿体和线绿体中。在大肠杆菌（E.coli）中，桶装伴侣蛋白GroEL/CPN60具有一个顶端疏水区，其在共伴侣蛋白GroES/CPN10帮助下形成亲水笼，辅助蛋白质折叠。折叠后蛋白在GroES/CPN10与GroEL/CPN60解离后从亲水笼中被释放。第二组伴侣蛋白存在于真核细胞的胞质中，其具有的外延的帽状结构在功能上与共伴侣蛋白GroES/CPN10。
[0006] CPN20是CPN60的共伴侣蛋白，其在豌豆的叶绿体基质中首次被发现。CPN20由一个前导肽和两个同源性为46%的CPN10类似结构顺次连接构成。对拟南芥伴侣蛋白相应基因表达进行分析，发现CPN20表达量远高于其相应的CPN60家族，且其表达量也高于叶绿体中另外两个共伴侣蛋白（CPN10s）。由此推测，CPN20可能具有独立于其共伴侣蛋白功能的其它功能。而最近的报道表明，拟南芥叶绿体CPN20调节铁超氧化物歧化酶（FeSOD）活性的功能独立于共伴侣蛋白功能。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种CPN20蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0009] a1）调控植物对ABA耐受性；
[0010] a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。
[0011] 在本发明中，以上a1）中的所述调控植物对ABA耐受性均具体为提高植物对ABA耐受性；以上a2）中的所述选育对ABA耐受性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述CPN20蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0012] 本发明还提供一种培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法。
[0013] 本发明所提供的培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
[0014] a）向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
[0015] b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物。
[0016] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（即CPN20基因）是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：
[0017] 1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子；
[0018] 2）序列表中序列2所示的DNA分子；
[0019] 3）序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] 4）在严格条件下与1）-3）任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0021] 5）与1）-4）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0022] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
[0023] 其中，序列1由1813个核苷酸组成，为所述CPN20基因在拟南芥基因组中序列，其中第80-339位、第519-788位、第971-1069位、第1229-1315位、第1393-1514位为5个内含子序列；序列2由975个核苷酸组成，为所述CPN20基因的cDNA序列，其中第87-848位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由253个氨基酸残基组成。
[0024] 在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
[0025] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0026] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子（具体为花椰菜花叶病毒35S启动子）。
[0027] 更为具体的，所述重组表达载体为将所述CPN20基因插入到pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点XbaI和Kpn I之间后得到的重组质粒。
[0028] 在上述方法中，将携带有所述CPN20基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0029] 在上述应用或方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。
[0030] 在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型（Col-0生态型）。
[0031] 在上述方法的步骤b）中，所述“从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物”可通过如下方法实现的：用所述目的植物不能耐受的浓度的ABA处理所述步骤a）所得转基因植物，从而获得所述“与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物”。
[0032] 在上述方法中，所述目的植物不能耐受的浓度的ABA为浓度可为0.5μM-20μM的ABA，如0.5μM-5μM，或5μM-20μM，具体如5μM。所述目的植物不能耐受的浓度是指所述目的植物的生长状态与不用ABA处理的对照相比具有统计学差异的ABA浓度。
[0033] 在上述方法中，所述“用所述目的植物不能耐受的浓度的ABA处理所述步骤a）所得转基因植物”具体为：将所述步骤a）所得转基因植物的种子或幼苗置于含有所述目的植物不能耐受的浓度的ABA的MS培养基中培养。
[0034] 本发明的又一个目的是提供一种对所述转基因植物进行除草的方法。
[0036] 在上述方法中，所述“所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受”是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述待除杂草死亡；但向所述转基因植物喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述转基因植物不死亡，且生长状态与喷洒所述浓度为M的ABA溶液前相比无统计学差异。
[0037] 本发明研究发现CPN20蛋白负调控ABA信号转导，且该功能独立于共伴侣蛋白功能。本发明可应用于将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用CPN20调节植物对ABA的敏感性或耐受性，获得CPN20高表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合可持续农业发展需求，对于改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法和途径等方面具有重要的实用价值和市场前景。附图说明
[0038] 图1为CPN20基因相关T-DNA插入突变体的鉴定。测序比对结果，cpn20-1突变体中的T-DNA插入到CPN20基因的起始密码子（ATG）上游第393bp到第376bp之间，插入导致18bp缺失。cpn20-2突变体中T-DNA插入到CPN20基因的起始密码子（ATG）上游第301bp到第265bp之间，插入导致37bp缺失。
[0039] 图2为各遗传材料CPN20基因表达量的分析结果。其中，(a)为CPN20相关突变体的实时荧光定量PCR检测结果，CPN20基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）CPN20基因的表达为100；(b)为CPN20相关突变体免疫印迹检测结果。
[0040] 图3为ABA对CPN20各遗传材料种子萌发的影响分析结果。
[0041] 图4为ABA对CPN20各遗传材料幼苗生长的影响分析结果（在含ABA培养基上直接播种并观察生长表型）。
[0042] 图5为ABA对CPN20各遗传材料幼苗生长的影响分析结果（将正常萌发后的幼苗移到含ABA培养基上并观察生长表型）。其中，（a）为CPN20各遗传材料种子分别播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上（0μM和5μM），生长10d后的幼苗生长情况；（b）为（a）中对应幼苗的主根长度统计。
[0043] 图6为ABA促进气孔关闭和ABA抑制气孔开放实验结果。其中，（a）为ABA促进气孔关闭实验中CPN20各遗传材料的气孔孔径大小；（b）为ABA抑制气孔开放实验中CPN20各遗传材料的气孔孔径大小。
具体实施方式
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供（记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect proteinubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.）。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点（MCS）上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
[0047] 拟南芥野生型（Col-0生态型）：拟南芥野生型种子（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia-0），购自拟南芥生物研究中心（ABRC）。
[0048] CPN20基因相应T-DNA插入突变体cpn20-1、cpn20-2种子：购自拟南芥生物研究中心（ABRC）。背景为拟南芥野生型（Col-0生态型），cpn20-1、cpn20-2为CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体。种子编号信息：cpn20-1：SAIL_888_A09；cpn20-2：SALK_083054C。
[0049] 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供（记载文献：R.Berres,L.Otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.）。
[0050] 大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α（DE3）感受态，购自全式金生物有限公司。
[0051] CPN20蛋白抗体：以序列表中序列3所示CPN20蛋白作为免疫原，免疫兔子所得的兔源多克隆抗体。
[0052] 实施例1、CPN20转基因植物的获得及鉴定
[0053] 本实施例中所涉及的CPN20基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由1813个核苷酸组成，其中第80-339位、第519-788位、第971-1069位、第1229-1315位、第1393-1514位为5个内含子序列；所述CPN20基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由975个核苷酸组成，其中第
87-848位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质（CPN20蛋白），序列3由253个氨基酸残基组成。
87-848位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质（CPN20蛋白），序列3由253个氨基酸残基组成。
[0054] 一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CPN20的构建
[0055] 提取拟南芥野生型（Col-0生态型）的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约760bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第87-848位核苷酸序列（CPN20基因的编码序列，ORF）。
[0056] 引物1：5’-GGTCTAGAATGGCGGCGACTCAACT-3’（下划线部分为Xba I的识别位点，其后的序列为序列2的第87-103位）；
[0057] 引物2：5’-CGGGGTACCCTAAGAAAGTATAGCCATCACATCTG-3’（下划线部分为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列2的第823-848位的反向互补序列）。
[0058] 用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之间插入了序列表中序列2所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-CPN20。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CPN20中，启动所述CPN20基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子。
[0059] 在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CPN20的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的CPN20基因为模板。
[0060] 二、CPN20基因表达降低突变体鉴定
[0061] CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体，将其命名为cpn20-1和cpn20-2，购自拟南芥生物研究中心（ABRC），遗传背景为拟南芥野生型（Col-0生态型）。通过分子生物学方法鉴定出各自的纯合体，并通过测序对突变体T-DNA插入位点进行分析。
[0062] 测序比对结果如图1所示：
[0063] cpn20-1突变体中的T-DNA插入到CPN20基因的起始密码子（ATG）上游第393bp到第376bp之间，插入导致18bp缺失。
[0064] cpn20-2突变体中T-DNA插入到CPN20基因的起始密码子（ATG）上游第301bp到第265bp之间，插入导致37bp缺失。
[0065] 三、CPN20转基因拟南芥的获得及鉴定
[0066] 1、CPN20转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得[0067] 将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CPN20通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有CPN20基因（PCR目的条带大小为760bp）的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221-CPN20；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221。
[0068] 采用农杆菌花序侵染的方法（SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-743.）将 上述 所 得 的重 组 农杆 菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-CPN20（或GV3101/pCAMBIA-1300-221）转化拟南芥野生型（Col-0）。
[0069] 转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-CPN20的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株（T1代）。
[0070] 2、CPN20转基因拟南芥鉴定
[0071] （1）PCR鉴定
[0072] 从步骤1获得的T1代CPN20转基因拟南芥，以及转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于CPN20转基因拟南芥，以引物1和引物2（序列同步骤一所述）进行PCR扩增，经鉴定同时得到大小约为760bp（外源插入的序列2所示CPN20基因）和1800bp（拟南芥内源的序列1所示CPN20基因）两个目的条带的植株即为CPN20转基因阳性植株，而鉴定只得到大小为1800bp目的条带的植株为CPN20转基因阴性植株。对于转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，用GFP引物GFP-F1和GFP-R1（引物序列如下）进行PCR鉴定，经鉴定表明含有GFP基因的（PCR产物大小约为700bp）植株即为pCAMBIA-1300-221空载体转入阳性的植株。所用引物序列如下：
[0073] GFP-F1：5’-AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3’；
[0074] GFP-R1：5’-GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。
[0075] 经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中五个CPN20转基因拟南芥株系分别记作OE2、OE3、OE4、OE5和OE7。
[0076] （2）转基因拟南芥OE2、OE3、OE4、OE5和OE7纯合系的筛选
[0077] 经上述鉴定分析后，选择其中五个代表性CPN20转基因拟南芥株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7（T1代）。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性）的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE2、OE3、OE4、OE5和OE7的纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA耐受性试验分析。
[0078] 四、转基因拟南芥OE2、OE3、OE4、OE5和OE7纯合系中CPN20基因表达量分析[0079] 提取拟南芥野生型（Col-0生态型）与T-DNA插入突变体cpn20-1、cpn20-2，过表达植株OE2、OE3、OE4、OE5和OE7的总RNA和总蛋白，利用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术，分别检测材料中CPN20基因在转录水平和翻译水平上的RNA和蛋白表达情况。具体如下：
[0080] 1、转录水平分析（RNA表达量）
[0081] 以上述获得的转基因拟南芥OE2、OE3、OE4、OE5和OE7纯合系，T-DNA插入突变体cpn20-1、cpn20-2，以及拟南芥野生型（Col-0生态型）生长10天的幼苗为实验材料。提取各实验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析CPN20基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增CPN20基因的引物序列为：
[0082] 引物CPN20-F：5’-ATGGCGGCGACTCAACTTACAGCG-3’（序列2的第87-110位）；
[0083] 引物CPN20-R：5’-GACAACCAAACGACGGAACTGGCTC-3’（序列2的第209-233位的反向互补序列）。
[0084] 以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
[0085] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’，
[0086] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
[0087] 上述引物的反应条件如下：
[0088] （1）反应体系的建立
[0089] 实时荧光定量PCR反应体系
[0090]
[0091] （2）三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0092] （3）反应程序的设定：
[0093] 实时荧光定量PCR反应程序
[0094]
[0096] 2、翻译水平分析（蛋白表达量）
[0097] （1）拟南芥总蛋白提取
[0099] 2)按2mL/g加入拟南芥总蛋白提取缓冲液，混匀后在冰上放置1h，期间颠倒混匀3～4次；
[0100] 3)4℃下12,000rpm离心2次，每次15min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。
[0101] （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE
[0102] 1)样品准备：蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水煮5～10min，12000rpm离心5min；
[0103] 2)玻璃板洗净装好，配制适当浓度的分离胶与浓缩胶溶液，注入胶板制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。分离胶与浓缩胶配方如下所示：
[0104] 分离胶配方
[0105]
[0106] 浓缩胶配方
[0107]
[0108] 3)把胶板按Bio-Rad Mini III的要求装好后，加入400mL1×电泳缓冲液，上样，80V恒压电泳20～30min后，换150V恒压电泳约1h，至溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳。
[0109] （3）蛋白质免疫印迹Western blot
[0111] 2)把膜放入封闭液中，在脱色摇床上室温慢摇3h；
[0112] 3)封闭结束后，把膜放入一抗（CPN20蛋白抗体，兔源多克隆抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇2h；
[0113] 4)用TBST1洗膜3次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
[0114] 5)把膜放入二抗（Cell Signaling Technology公司产品，其产品目录号为Anti-rabbit IgG,AP-linked Antibody#7054，为羊抗兔抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇1h；
[0115] 6)用TBST2洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
[0116] 7)用TBS洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
[0117] 8)把膜放入显色液中进行显色，显色完成后将膜放入ddH2O中，终止反应。
[0118] 同时以Actin作为内参。
[0119] 各遗传材料中CPN20基因表达量的分析结果如图2所示。具体的，CPN20相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2中(a)所示，CPN20基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）CPN20基因的表达为100。CPN20相关遗传材料免疫印迹检测结果如图2中(b)所示，CPN20蛋白的表达均为相对值。从图2中可以看出，相比拟南芥野生型（Col-0），步骤三获得的转基因拟南芥OE2、OE3、OE4、OE5和OE7纯合系中CPN20基因的表达量显著提高，T-DNA插入突变体cpn20-1、cpn20-2中CPN20基因的表达在转录水平和翻译水平上相对于拟南芥野生型（Col-0）均明显调低。
[0120] 实施例2、CPN20转基因植物对ABA耐受性分析试验
[0121] 一、ABA对CPN20各遗传材料种子萌发的影响
[0122] 以拟南芥野生型（Col-0生态型）、CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2、实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上（0μM，0.5μM，1μM和3μM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中。记录种子在层积后的24h到72h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计。实验重复5次，结果取平均值。
[0123] 结果如图3所示，在含有0μM ABA的培养基上，各种实验材料种子的萌发情况基本一致。在含有不同浓度ABA的培养基上，cpn20-1和cpn20-2相对于拟南芥野生型（Col-0生态型）都明显的表现出对ABA超敏的表型（对ABA的耐受性降低），即在相同检测时间内cpn20-1和cpn20-2的种子萌发数低于拟南芥野生型（Col-0生态型）；而实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7都明显的表现出ABA脱敏的表型（对ABA的耐受性提高），即在相同检测时间内OE2、OE3、OE4、OE5和OE7的种子萌发数高于拟南芥野生型（Col-0生态型）。同时，从图中可以看出，在培养基中ABA浓度为1μM以下时，OE2、OE3、OE4、OE5和OE7的种子萌发情况并没有因为培养基中是否含有ABA而发生变化。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。综合以上结果可见，实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7对ABA表现出较高的耐受性。
[0124] 二、ABA对CPN20各遗传材料幼苗生长的影响
[0125] 1、在含ABA培养基上直接播种并观察生长表型
[0126] 以拟南芥野生型（Col-0生态型）、CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2、实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有0.5μM ABA的MS培养基上（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，12d后观察各拟南芥幼苗生长的情况。实验重复3次。
[0127] 结果如图4所示，在含0.5μM ABA的MS培养基上，cpn20-1和cpn20-2相对于拟南芥野生型（Col-0），对ABA表现出明显超敏的表型（对ABA的耐受性降低）。而CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7的幼苗生长则基本不受ABA的影响。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，其幼苗生长及根长统计情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。综合以上实验结果可见，实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7对ABA表现出较高的耐受性。
[0128] 2、将正常萌发后的幼苗移到含ABA培养基上并观察生长表型
[0129] 以拟南芥野生型（Col-0生态型）、T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2，实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株的种子为实验材料。将各实验材料的分别播种在正常MS培养基上，4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中生长48h后，再将刚萌发的幼苗分别移入含有不同浓度ABA的培养基上（0μM和5μM），生长10d后观察幼苗生长的情况，并对各幼苗根长进行统计分析。实验重复3次，结果取平均值。
[0130] 结果如图5所示，在含0μM ABA的MS培养基上，各遗传材料的幼苗都能够正常生长，各遗传材料的主根长度基本一致。在含5μM ABA的MS培养基上，拟南芥野生型（Col-0生态型），特别是T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2被ABA抑制无法正常萌发和生长，同时主根生长明显受阻；而CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7幼苗几乎没有受到ABA的抑制，同时主根生长受阻程度较弱。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μMABA的培养基上，还是在含有5μM ABA的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。综合以上实验结果可见，实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7对ABA表现出较高的耐受性。
[0131] 3、ABA促进气孔关闭和ABA抑制气孔开放实验
[0132] （1）ABA促进气孔关闭实验
[0133] 以拟南芥野生型（Col-0生态型）、CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2、实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在MS培养基上（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，土壤中生长3周后，选取成熟莲座叶，将离体叶片浸于表皮条缓冲液（配方：50mM KCl、10mM MES-KOH、pH6.15）中，置于冷光源下光照3h，再将叶片浸于含有不同浓度（0μM、5μM和20μM）ABA的表皮条缓冲液中，置于与前相同的冷光源下光照2.5h，统计并记录气孔开度（每个样本记录60个气孔孔径）。实验重复5次，结果取平均值。
[0134] 结果如图6中（a）所示，从图中可以看出，与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2对ABA诱导气孔关闭更加敏感（ABA耐受性相对较弱）；而实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7对ABA诱导气孔关闭更加迟钝（ABA耐受性相对较强）。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其气孔开度均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。
[0135] （2）ABA抑制气孔开放实验
[0136] 以拟南芥野生型（Col-0生态型）、CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2、实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在MS培养基上（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，土壤中生长3周后，选取成熟莲座叶，将叶片浸于表皮条缓冲液（配方：50mM KCl、10mM MES-KOH、pH6.15）中，黑暗放置3h，再将叶片浸入含有不同浓度（0μM、5μM和20μM）ABA的表皮条缓冲液中，置于冷光源下光照2.5h，统计并记录气孔开度。实验重复5次，结果取平均值。
[0137] 结果如图6中（b）所示，从图中可以看出，与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，CPN20基因表达降低的两个T-DNA插入突变体cpn20-1和cpn20-2对ABA诱导气孔关闭更加敏感（ABA耐受性相对较弱）；而实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7对ABA诱导气孔关闭更加迟钝（ABA耐受性相对较强）。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度（0μM、5μM和20μM）ABA的培养基上，其气孔开度均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。
[0138] 综合以上ABA促进气孔关闭和ABA抑制气孔开放实验的结果，可见，实施例1得到的T3代纯合体CPN20转基因株系OE2、OE3、OE4、OE5和OE7对ABA表现出较高的耐受性。
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