技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物领域，特别涉及一株防治柞栎象害虫的球孢白僵菌bh001及其应用。
背景技术
[0002] 蒙古栎林是我国重要的次生林资源，蒙古栎种实可提取
淀粉，如能充分利用其作为
饲料或替代玉米生产工业
乙醇，对国家的粮食安全和
能源安全具有重要意义。近年来蒙古栎种实受柞栎象危害超过60％，造成了巨大的经济损失。目前，对柞栎象危害缺乏有效、环境友好的控制手段。因此，基于病原
真菌的柞栎象防治技术是当前急需解决的重大技术问题。现在国际上有170余种昆虫病原微生物产品登记注册，但我国目前仅有球孢白僵菌、金龟子绿僵菌小孢变种和蝗变种等3种真菌的11种真菌
杀虫剂产品应用于农林害虫的防治。昆虫病原微生物相对的专化性使得寻找乡土的、针对特定森林害虫的优良菌株成为开发针对性的高效的真菌杀虫剂的重要环节。以长白山林区
土壤中对柞栎象高致病
力的病原真菌为
基础的生物制剂研制及相应的
化学防治技术的研究尚未见报导。
[0003]
生物防治是目前病害防控研究的热点之一。生物防治是利用生物活体或其代谢产物来控制
有害生物的发生和为害。由于其利用的是自然界中已经存在的生物或其代谢产物，环境友好，对人畜安全，有害生物不易产生抗性。生物防治与化学防治相比具有天然的优势。但是，由于生产成本高、
货架期短、使用技术难度大等原因，生产应用相对较少。近年来，通过筛选高效生防菌株、优化生产工艺等措施，有效促进了生物
农药的应用。
[0004] 应用球孢白僵菌防治林业害虫是目前生物防治研究的重点之一。但是利用球孢白僵菌防治柞栎象未见报导。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种防治柞栎象害虫的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001及其应用。
[0006] 第一方面，本发明要求保护球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001。
[0007] 本发明所要求保护的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001已于2019年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17975。
[0008] 第二方面，本发明要求保护一种菌剂。
[0009] 本发明所要求保护的菌剂的活性成分为前文所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001。
[0010] 在所述菌剂中，所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001的孢子量可为100(±10)亿/g所述菌剂。
[0011] 进一步地，所述菌剂可为粉剂(粒径小于35目)。
[0012] 更进一步地，所述菌剂是以麦麸、稻糠和玉米糁(3:1:1)(
质量比)的混合料为培养基质，接种所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001后，经培养、烘干、
粉碎制成的分生孢子粉剂。
[0013] 第三方面，本发明要求保护前文所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001或所述菌剂在如下任一中的应用：
[0014] (B1)防治柞栎象；
[0015] (B2)制备用于防治柞栎象的产品。
[0016] 第四方面，本发明要求保护一种防治柞栎象的方法。
[0017] 本发明所要求保护的防治柞栎象的方法，可包括如下步骤：每平方米待防治区域喷施2-3g前文所述的菌剂。
[0018] 第五方面，本发明要求保护前文所述的菌剂的林间应用方法。
[0019] 本发明所要求保护的前文所述的菌剂的林间应用方法，可包括如下步骤：每平方米待防治区域喷施2-3g所述菌剂。
[0020] 进一步地，在第四方面和第五方面中，所述菌剂在柞栎象幼虫入土越冬前施于所述待防治区域的地表
[0021] 在本发明的具体实施方式中，所述待防治区域具体为蒙古栎林。
[0022] 本发明从长白山林区采集柞栎象僵虫，分离获得昆虫病原真菌菌株，通过测定分离到的菌株致病力筛选出一株高效防治柞栎象的生防菌株，经过形态学和分子生物学分析，鉴定为球孢白僵菌；该菌株球孢白僵菌bh001对柞栎象幼虫有显著的防治效果，室内试验防治效果达到85.3％，林间试验防治效果达到70.1％。本发明提供的生防菌株能高效防治柞栎象，具有很好的生防潜力，为林业害虫柞栎象的生物防治提供了新的资源，同时为蒙古栎种实资源保护提供帮助。
[0023] 保藏说明
[0024] 菌株名称：球孢白僵菌
[0025] 拉丁名：Beauveria bassiana
[0027] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0028] 保藏机构简称：CGMCC
[0029] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0030] 保藏日期：2019年6月20日
[0031] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17975
具体实施方式
[0032] 下述
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 实施例1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001的获得及鉴定[0035] 1、昆虫病原真菌的收集
[0036] 在吉林长白山林区柞栎象越冬地土壤中搜集自然感染病原真菌的柞栎象僵虫。
[0037] 2、昆虫病原真菌的分离和提纯
[0038] 把搜集到的感染病原真菌的柞栎象僵虫用95％乙醇进行表面消毒，用刀切成0.2mm大小组织
块，放在PDA平板培养基上，25℃恒温培养，对生长出的病原真菌进行纯化，获得纯菌种。
[0040] (1)收集野生柞栎象幼虫，挑取健康活泼的个体进行试验。
[0041] (2)在50ml三
角瓶中分别加入20ml浓度为0.05％(体积百分含量)TW-80溶液，然后把培养好的菌株孢子粉用药匙刮入到各三角瓶中，用涡旋
振荡器振荡10min，用血球计数板在
显微镜下测定出各菌株孢子悬浮液的初始浓度，利用梯度稀释的方法最终将溶液浓度配置成为1×108孢子·ml-1。
[0042] (3)采用浸虫法，将柞栎象幼虫浸入孢子悬浮液中15S后取出，并以0.05％(体积百分含量)TW-80为空白对照。记录死虫数及僵虫数，并对感染的虫尸进行检测，确定致病菌株与出发菌株是否一致，校正死亡率，并测出其LT50。
[0043] 结果显示：经步骤2纯化分离的多株昆虫病原真菌对柞栎象幼虫有致病力，其中一株编号为bh001的菌株对柞栎象幼虫的毒力最高，其LT50为5d。相比之下，其余菌株的LT50均大于6d。
[0044] 4、菌株鉴定
[0045] (1)菌体、菌落形态观察
[0046] 将筛选出的高毒力菌株(编号为bh001)接种在PDA平板培养基上，25℃恒温培养7d，观察菌落特征并挑取菌丝在显微镜下观察菌丝及孢子形态特征，结果表明：菌落白色，基质
颜色呈浅黄色，菌落呈粉状，质地疏松，菌落较薄，边缘放射状。菌丝细长，分生孢子梗单生，呈瓶状，孢子梗的瓶体形状从基部显著膨大到细长瓶形不等。分生孢子生在“之”字形小梗上，多数为圆球形，少数卵圆形，无色，单胞。
[0047] (2)分子生物学鉴定
[0048] 提取菌株bh001的DNA，借助引物ITS1F和ITS4R扩增ITS区段，测序后进行BLAST比较，得到扩增产物中含有SEQ ID No.1所示序列。
[0049] ITS1F：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；
[0050] ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0051] 通过序列比对结果，并结合上述形态学鉴定结果，确定该菌株为球孢白僵菌Beauveria bassiana。
[0052] 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001已于2019年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17975。
[0053] 5、高毒力菌株生长特性测定
[0054] 针对室内毒力测定筛选出的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001，进行基本生物学特性测定，菌株在PDA培养基上培养，观察并记录相应数据及信息。
[0055] (1)菌株产孢量测定
[0056] 用移液枪移取500μl浓度为1×104孢子·ml-1的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001的孢子悬浮液，接种于90mm培养皿平板上，匀速转动培养皿，使液体均匀分布培养基表面，放入25℃恒温
培养箱中培养，5次重复。培养15d后，向培养皿中加入10ml浓度为0.05％(体积百分含量)TW-80溶液，刮下整板菌落，并用移液器反复吹打，将菌液移入50ml锥形瓶中，反复操作定容至20ml。将锥形瓶放在振荡器中充分振荡，配成孢子悬浮液。
用血球计数板测定孢子含量。
[0057] 结果显示：含孢量为9.2×109孢子/皿。
[0058] (2)菌株孢子萌发率
[0059] 配取1×106孢子·ml-1的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001的孢悬液，接种到含有20ml PDA液体培养基的三角瓶中，25℃150r/min下振荡培养12h后，在显微镜下观察孢子萌发情况。芽管长度大于或等于孢子半径的孢子视为萌发。
[0060] 结果显示：孢子萌发率为90.8％。
[0061] 实施例2、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001对柞栎象的防治试验[0062] 1、室内防治柞栎象试验
[0063] (1)生防菌制备
[0064] 以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)bh001为生产菌株，以麦麸、米糠、玉米糁(3:1:1)(质量比)混合料为培养基质，经过接种、培养、干燥、粉碎等加工制成粉剂，含孢量为
100(±10)亿/g，细度为全部通过35目筛。
[0065] (2)柞栎象幼虫准备
[0066] 柞栎象幼虫来自野外收集的蒙古栎果实中，并准备1m×1m×0.5m木箱，内装土壤。30个重复。
[0067] (3)喷粉试验
[0068] 喷施步骤(1)每平方米喷施球孢白僵菌粉剂2-3g，然后土壤表层按1m2放置100头柞栎象幼虫，对照喷施不接种球孢白僵菌的培养料粉。
[0069] (4)结果调查
[0070] 30d后调查僵虫数。
[0071]
[0072] 结果表明：白僵菌bh001防治柞栎象效果达到85.3％。
[0073] 2、林间防治柞栎象试验
[0074] 在蒙古栎林中，视林中具体林相情况打出2m×2m样地30个，每个样地用架网罩住，防止虫体爬出，对照、菌剂用量及放虫数同室内防治试验。9月中旬开始试验，第二年4月上旬统计僵虫数。防治效果计算公式同室内防治试验计算公式。
[0075] 结果表明：白僵菌bh001防治柞栎象效果达到70.1％。
