技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物皂甙合成相关的限速酶基因领域，特别是涉及一种紫花苜蓿过表达鲨烯合酶基因的方法与应用。
背景技术
[0002] 苜蓿皂苷(Saponin)又名皂素、皂甙，由皂
苷元加1个或多个糖链构成，是普遍存在于自然界的一大类糖苷类化合物，包括三萜类化合物、甾醇、类固醇，在菌类、蕨类、植物、动物及海洋
生物中均有分布。尽管萜类化合物在植物中普遍存在，但人类目前为止还无法确定任何一个物种中萜类化合物合成的完整通路。
[0003] 鲨烯合酶(Squalene Synthases,SQS)是一种结合在内质网上的膜结合酶，催化双分子的法呢酯焦
磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)缩合生成鲨烯，是三萜和甾醇分支代谢流中的第一个关键酶，对植物甾醇和三萜生物合成均起着重要调控作用。高等植物中，SQS基因首次从
烟草中分离得到，目前已经从青蒿、甘草、拟南芥、人参等多种植物中克隆到相应的SQS基因将人参中克隆的鲨烯合酶基因在人参须根组织中过量表达后发现总三萜皂苷比未转化的对照组高出1.6～3倍；在刺五加中转化鲨烯合酶基因后鲨烯合成酶活性比对照增强3倍以上，总皂苷的
水平也提高了2～2.5倍。甘草转鲨烯合酶基因毛状根中最高
甘草酸含量约为野生型毛状根的3.6倍。上述研究表明，鲨烯合酶基因对三萜和甾醇的合成有一定的调控作用将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入睡茄中发现，转基因睡茄中萜类物质含量明显比非转基因睡茄的含量高。通过将青蒿反义鲨烯合酶基因导入烟草中，成功的降低了烟草中的甾醇含量。同时，过表达SQS基因还可使皂苷类化合物合成途径下游基因表达量上调，如：SE、β-AS、CYP450，最终提高人参中甾醇和人参皂苷含量。
[0004] 由此可见，SQS基因可能是皂甙合成的关键酶基因，对皂甙合成有重要的调控作用。有关紫花苜蓿中SQS基因的相关研究还未见报道。
[0005] 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)在世界范围内分布广泛，是世界公认的高产优质牧草，茎叶中含有丰富的
蛋白质，被誉为“牧草之王”。苜蓿不仅营养丰富，其次生代谢产物苜蓿皂甙(alfalfa saponins)近年来被认为是苜蓿的药用功能的主要来源。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种紫花苜蓿过表达鲨烯合酶基因的方法与应用。通过对紫花苜蓿皂甙合成途径中关键酶基因的克隆、表达模式及功能分析，表明鲨烯合酶基因在苜蓿皂甙合成途径中具有一定的调节作用。通过建立高效的遗传转化体系将鲨烯合酶基因转入紫花苜蓿中过表达，提高了转基因苜蓿体内的总皂甙的含量，为培育高皂甙含量的苜蓿品种提供育种材料。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 一种紫花苜蓿过表达鲨烯合酶基因的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)引物设计；
[0010] (2)克隆载体pEASY-T3质粒，质粒pGEX-4T-1V用于原核表达，大肠杆菌E.coli Trans5α和E.coli Transetta用于基因的克隆和表达；
[0011] (3)克隆紫花苜蓿鲨烯合酶基因MsSQS全长cDNA；
[0012] (4)MsSQS序列的生物信息学分析；
[0013] (5)鲨烯合酶基因MsSQS的表达分析；
[0014] (6)鲨烯合酶含量的测定；
[0015] (7)茉莉酸甲酯诱导下皂苷含量的测定；
[0017] (9)原核表达；
[0018] (10)MsSQS基因的超表达载体的构建及对紫花苜蓿的遗传转化。
[0019] 其中，所述步骤(1)具体为，根据NCBI中已知蒺藜苜蓿鲨烯合酶基因的cds序列，利用Primer 5.0设计引物MsSQS-f和MsSQS-r用于扩增MsSQS基因的cDNA序列。根据Genbank公布的紫花苜蓿肌动蛋白β-actin基因作为看家基因和已经克隆的MsSQS基因作为目标检测基因，各设计一对引物Actin-f和Actin-r，SQS-qPCR-f和SQS-qPCR-r。如SEQ ID NO:1-6所示，序列如下：
[0020] MsSQS-f：5’-GCTTATTCGTAGAAACAAAAGATGG-3’
[0021] MsSQS-r：5’-ATGCTACCACTGTTCTGTTGCTATC-3’
[0022] Actin-f:5’-CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT-3’
[0023] Actin-r:5’-CATGACACCAGTATGACGAGGTCG-3’
[0024] SQS-qPCR-f:5’-CTTCGGTCTTGTTATTCAGCAGC-3’
[0025] SQS-qPCR-r:5’-CTTGTATCATCCTCAACGGTGTC-3’。
[0026] 其中，所述步骤(3)具体为，采用Trizol法提取紫花苜蓿
叶片的总RNA，用分光光度计测定RNA的
质量；用1％的琼脂糖检测RNA的完整性；每个样品取1μg的RNA用于反转录，用Takara的Prime ScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit进行PCR扩增，反应体系为20μL；以MsSQS-f和MsSQS-r为引物，进行PCR扩增获得MsSQS全长cDNA，然后克隆到pEASY-T3载体中得到质粒pEASY-MsSQS，再转入大肠杆菌E.coli DH5α并在LB培养基37℃黑暗培养；然后质粒被测序组装，验证正确的MsSQS插入位点。
[0027] 其中，所述步骤(4)具体为，利用DNAMAN程序和NCBI/BLAST分析目的基因MsSQS的开放阅读框序列，并进行多重序列比对和同源物种分析；利用SOPMA程序分析SQS蛋白质的分子量、
氨基酸组成和等电点；借助SignalP4.1Server
软件和SubLoc软件预测MsSQS编码蛋白质的
信号肽及亚细胞定位；采用TMHMM Server在线软件预测了蛋白质的跨膜区和疏水性；利用SWISSMODEL程序分析蛋白质的三维结构；利用Interpro
数据库分析蛋白结构域功能；在NCBI/GenBank中查找拟南芥、人参等植物的同源蛋白，并使用ClustalX2.0软件进行序列比对分析。
[0028] 其中，所述步骤(5)具体为，将紫花苜蓿中苜3号
种子置于浸湿的
滤纸上萌发，然后移植入Hoagland’s
营养液中，置于光照
培养箱，16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，
相对湿度40％，培育4周，每隔1周换一次营养液；4周后选取长势良好，大小一致的植株用于以下处理：①在距离植株20cm处，用15W紫外光照射30min后，分别在0、2、4、8、12、24、48h采集根、茎、叶组织样本；②避光处理0、4、8、12、24、48、96、144h分别采集根、茎、叶组织；③200μM MeJA处理0、4、8、12、24、48、96、144h分别采集根、茎、叶组织；④100μM ABA处理0、2、4、8、12、
24h分别采集根、茎、叶组织；⑤50μM GA3处理0、2、4、8、12、24h分别采集根、茎、叶组织；将收集的样本分别用于提取RNA。
[0029] 其中，所述步骤(6)具体为，应用酶联
免疫吸附试验测定MeJA诱导处理后苜蓿不同组织中鲨烯合酶蛋白的活性；取MeJA处理后各个时间点根、茎、叶组织各200mg置于2mL离心管内，加入10mM磷酸缓冲液PBS 900mL，PH＝7.2-7.4，用
研磨棒磨成浆，静置片刻后吸取上清，残渣再加入900mL匀
浆液再研磨一次，然后合并两次研磨液，在4℃条件下以6000rpm转速离心15min，取上清；样品提取后立刻测定酶活性；用分光光度计，读取吸光度，用标准曲线，计算样品的实际浓度。
[0030] 其中，所述步骤(7)具体为，选取在MeJA处理的苜蓿根、茎、叶样品置于低温
真空冻干机中-80℃冻干70小时，取出后过60目筛；准确称取30mg冻干样置于5mL离心管中，加1mL70％
乙醇用超声仪超声30min，4℃过夜，再次超声30min；然后以1000g离心30min，取上清液100μL注入已预处理的SPE柱，分别用5mL水和5mL30％甲醇冲洗，再以1mL甲醇洗脱4次；
合并洗脱液置于10mL的具塞试管中蒸干，冷却后加入0.2mL 5％的香草
醛-
冰醋酸溶液，待充分溶解后加入0.8mL高氯酸；置于70℃水浴锅中水浴15min后立即冰浴，冷却后加入5mL冰醋酸，静置20min；以空白平行样作对照，每个样品设3个生物学重复；用分光光度计测定在
545nm处样品的吸光度。
[0031] 其中，所述步骤(8)具体为，利用Primer 5.0软件设计含有上下游各含有Xho Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物，SQS-pA7-f:5’-CCCTCGAGATGGGAAGTATAAAAGCGATTTTGA-3’，CTCGAG为XhoⅠ酶切位点；SQS-pA7-r：5’-GCGTCGACGTTATTGTAACGGTTGGCAGAGAGA-3，GTCGAC为SalⅠ酶切位点；如SEQ ID NO:7-8所示；以pEasy-T3-MsSQS质粒为模板，分别以SQS-pA7-f和SQS-pA7-r为引物，进行目的
片段的扩增，再将目的片段连接到pEASY-T1载体，并命名重组子为pEASY-T1-MsSQS；将重组质粒pEASY-T1-MsSQS和瞬时表达质粒pA7-GFP，用XhoⅠ和SalⅠ快速酶切酶进行双酶切，酶切体系如下：质粒体积根据质粒浓度确定(<1μg)，Xho Ⅰ1μL，Sal Ⅰ1μL，10×Quick Cut Buffer 5μL，ddH2O Up to 50μL；轻轻混匀后，用PCR仪37℃反应5～10min；经琼脂糖凝胶
电泳后，回收目标片段；然后将目的基因片段在T4连接酶的作用下连接到载体pA7-GFP，16℃连接4～5h，构建质粒pA7-GFP-MsSQS；将MsSQS以正确的方向整合到瞬时表达载体pA7-GFP中，通过基因枪轰击的方法，将含有目的基因编码区序列的亚细胞瞬时表达载体pA7-GFP转入洋葱表皮，在35S强启动子驱动下，融合蛋白在洋葱表皮细胞中过量表达；绿色
荧光蛋白GFP在蓝色
波长光下显示绿色荧光，根据融合蛋白的荧
光信号确定SQS基因编码的蛋白在细胞内的定位；
[0032] 其中，所述步骤(9)具体为，设计两对引物分别为：①将MsSQS cDNA整个编码区序列插入原核表达载体，具体引物为SQS-PE-f:5’-ATGGGAAGTATAAAAGCGATTTTG-3’，SQS-PE-r:5’-ATTCCTCAAAA CGTAAGATTTCCTT-3’；②将MsSQS编码区序列C末端截掉30个氨基酸的序列插入原核表达载体，具体引物为SQS-PE-CTt-f:5’-ATTCCTCAAAACGTAAGATTTCCTT-3’，SQS-PE-r:5’-ATTCCTCAAAACGTAAGATTTCCTT-3’；如SEQ ID NO:9-11所示；将含有正确MsSQS序列的pEASY-T3-MsSQS质粒作为模板，分别以SQS-PE-f和SS-PE-r、SQS-PE-CTt-f和SQS-PE-r为扩增引物，进行目的片段的扩增，再将目的片段连接到pEASY-E2载体；PCR反应程序如下：94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃
退火30s,72℃延伸1min72℃延伸5min,4℃保温；将上述的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和DNA片段回收后，将回收的目的片段与原核表达载体pEASY-E2连接，并转入Tran-T1感受态细胞中，载体的连接及转化；
[0033] 用PCR方法鉴定阳性单克隆，以对于每个单克隆进行菌体PCR鉴定，以菌液为模板，载体的正向引物M13-F，5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，如SEQ ID NO:12；和目的基因反向引物SQS-PE-r作为引物，鉴定阳性重组子，并将能扩增出目的基因片段的菌液送至测序公司测序；将重组子分别命名为pEASY-E2-MsSQS和pEASY-E2-CTtMsSQS；将两种原核表达重组子pEASY-E2-MsSQS和pEASY-E2-CTtMsSQS，以及空载体分别转入大肠杆菌Transetta；原核表达MsSQS蛋白和MsSQS-CTt蛋白SDS-PAGE电泳，取上述含有正确片段的大肠杆菌Transetta，37℃培养过夜至OD600为0.4～0.6；以含有空载体的大肠杆菌作为对照，加入IPTG使其在菌液中的终浓度为1mM，分别诱导表达0、30、1、2、3、4、5、6、8h；加入IPTG后，在上述每个时间点取2mL菌液，4℃10000rpm离心5min，弃上清，加入1mLPBS，10mM，PH＝7.2-7.4重悬菌体，用
超声波细胞
破碎仪超声100次，分别取收集沉淀和上清，沉淀用100μL PBS重悬，4℃暂存；取样完成后，分别取50μL上清和沉淀重悬液，加入等体积的2×SDS loading Buffer，100℃水浴3min后立即置于冰上冷却，然后用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定MsSQS的表达。
[0034] 其中，所述步骤(10)具体为，用MsSQS-f和MsSQS-r为扩增引物，扩增出含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点的MsSQS基因片段，回收纯化PCR产物，再将目的片段连接到pEASY-T3载体；测序并提取含有正确序列的重组质粒，用XbaⅠ和BamHⅠ快速限制性内切酶对pBI121和重组子pEASY-T3-pMsSQS进行双酶切，在T4连接酶的作用下将目的基因编码区序列插入到植物超表达载体pBI121中，构建目的基因超表达载体，并转化农杆菌EHA105；然后采用农杆菌介导法转化紫花苜蓿中苜3号。
[0035] 本发明任一所述的紫花苜蓿过表达鲨烯合酶基因的方法在培育高皂甙含量苜蓿品种中的应用。
[0036] 同
现有技术相比，本发明的突出效果在于：
[0037] 苜蓿皂甙(alfalfa saponins)被认为是苜蓿药用功能的主要来源，不仅具有良好的降胆固醇、降血脂的功效，而且还有抗炎、抗癌、抗菌、杀虫等药用及生物活性。为了更好的了解苜蓿皂甙生物合成路径中关键基因的调节机制及功能。本发明克隆了紫花苜蓿皂甙合成的关键酶基因，并进行功能分析，研究结果如下：通过同源克隆法首次获得紫花苜蓿鲨烯合酶(MsSQS)cDNA序列，该基因最大开放阅读框含有1242bp，可编码一个含413个氨基酸、分子量为47kDa的蛋白。序列比对结果表明，MsSQS基因与截形苜蓿SQS基因的同源性为97.91％，编码蛋白的相似度为93.53％。生物信息学分析该基因编码的氨基酸序列有6个保守区，其中3个高度保守，而且有2个跨膜螺旋区，其中C末端的疏水区域为膜结合区域。实时定量PCR分析了MsSQS在紫花苜蓿不同组织的表达模式，MsSQS在根、茎、叶中均可表达，但根中表达量最高，叶次之，茎中表达量最低。MsSQS基因也受MeJA、ABA、GA3、紫外伤害及黑暗诱导表达。在MeJa诱导下，MsSQS的表达量在根、茎、叶中均上升，而且鲨烯合酶含量与总皂苷含量均相应的上升。原核表达结果显示，MsSQS cDNA可在大肠杆菌中表达，分子量约为
45kDa。将MsSQS在苜蓿中过表达显示，转基因植株与对照比较MsSQS的表达量、转录水平和总皂苷量均高于野生型紫花苜蓿。上述研究表明，MsSQS对苜蓿皂甙的合成具有一定的调节作用。
[0038] 下面结合
附图说明和具体
实施例对本发明所述的紫花苜蓿鲨烯合酶MsSQS基因及其编码蛋白与应用作进一步说明。
附图说明
[0039] 图1为MsSQS的生物进化树分析。
[0040] 图2为紫花苜蓿其他物种鲨烯合酶蛋白序列的多重比较。
[0041] 图3为融合蛋白MsSQS-GFP在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析；其中，a-c：空载体pA7-GFP转化洋葱表皮细胞中的荧光信号分布情况；d-f：重组质粒pA7-GFP-MsSQS转化洋葱表皮细胞中荧光信号分布情况；g-i：转化了pA7-GFP-MsSQS的洋葱表皮细胞在细胞失水(0.3g/ml
蔗糖)条件下中荧光信号分布情况。a,d,g：蓝色波长与白光照射下拍摄；b,e,h：蓝色波长下拍摄；c,f,i：白光下拍摄；标尺＝100μm。
[0042] 图4为MsSQS蛋白的信号肽(A)和膜结构域预测(B)；其中，C-score(raw cleavage site score)：原始剪切位点的分值；S-score(signal peptide score)：信号肽的分值；Y-score(combined cleavage site score)：综合剪切位点的分值；mean S：信号肽分值的平均值；D-score(discrimination score)：mean S和max.Y的加权平均值。
[0043] 图5为MsSQS在苜蓿不同组织的表达分析。
[0044] 图6为不同胁迫条件下MsSQS在不同组织的表达分析。
[0045] 图7为不同组织中MsSQS基因在MeJA诱导下的表达分析。
[0046] 图8为紫花苜蓿鲨烯合酶大肠杆菌表达载体示意图。
[0047] 图9为大肠杆菌表达紫花苜蓿鲨烯合酶SDS-PAGE分析；其中，A：蛋白分子质量标准；B：转化了pEASY-E2-Control的大肠杆菌总蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；C：转化了pEASY-E2-CTtMsSQS的大肠杆菌总蛋白(未经IPTG诱导表达)；D：转化了pEASY-E2-CTtMsSQS大肠杆菌上清蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；E：转化了pEASY-E2-CTtMsSQS大肠杆菌沉淀蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；F：转化了pEASY-E2-MsSQS的大肠杆菌总蛋白(未经IPTG诱导表达)；G：转化了pEASY-E2-MsSQS大肠杆菌上清蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；H：转化了pEASY-E2-CTtMsSQS大肠杆菌沉淀蛋白(经过IPTG诱导表达5h)。
[0048] 图10为目的基因超表达载体的图谱。
[0049] 图11为转基因紫花苜蓿株系中MsSQS表达量和皂苷含量的分析；其中，A：实时定量PCP分析MsSQS表达量；B：总皂苷含量测定；CK1：空载体PBI121转基因紫花苜蓿；CK2：野生型紫花苜蓿；Line1～9：MsSQS转基因紫花苜蓿。
具体实施方式
[0050] 1.材料与方法
[0051] 1.1植物材料培育
[0052] 紫花苜蓿中苜1号(Medicago sativa L.‘Zhongmu No.3’)是耐盐苜蓿品种由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成。挑选饱满的苜蓿种子培养皿中发芽，然后培育在hongland营养液中，置于
人工智能气候箱，
温度25±1℃，光照16h(昼)/8h(夜)，湿度65％，培育4周用于DNA和RNA的提取。
[0053] 1.2引物设计
[0054] 根据NCBI中已知蒺藜苜蓿鲨烯合酶基因的cds序列，利用Primer 5.0设计引物MsSQS-f和MsSQS-r用于扩增MsSQS基因的cDNA序列。根据Genbank公布的紫花苜蓿肌动蛋白β-actin基因作为看家基因和已经克隆的MsSQS基因作为目标检测基因，各设计一对引物Actin-f和Actin-r，SQS-qPCR-f和SQS-qPCR-r。如SEQ ID NO:1-6所示，序列如下：
[0055] MsSQS-f：5’-GCTTATTCGTAGAAACAAAAGATGG-3’
[0056] MsSQS-r：5’-ATGCTACCACTGTTCTGTTGCTATC-3’
[0057] Actin-f:5’-CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT-3’
[0058] Actin-r:5’-CATGACACCAGTATGACGAGGTCG-3’
[0059] SQS-qPCR-f:5’-CTTCGGTCTTGTTATTCAGCAGC-3’
[0060] SQS-qPCR-r:5’-CTTGTATCATCCTCAACGGTGTC-3’
[0061] 1.3菌株、质粒和培养基
[0062] 克隆载体pEASY-T3质粒，质粒pGEX-4T-1V用于原核表达，质粒pEASY-T3和pGEX-4T-1V的结构图谱可以在网上获得。大肠杆菌E.coli Trans5α和E.coli Transetta(DE3)用于基因的克隆和表达。
[0063] 1.4紫花苜蓿鲨烯合酶基因MsSQS全长cDNA的克隆
[0064] 采用Trizol法提取紫花苜蓿叶片的总RNA，用分光光度计测定RNA的质量。用1％的st琼脂糖检测RNA的完整性。每个样品取1μg的RNA用于反转录，用Takara的Prime ScriptTM1 strand cDNA synthesis kit进行PCR扩增，反应体系为20μL。以MsSQS-f和MsSQS-r为引物，进行PCR扩增获得MsSQS全长cDNA，然后克隆到pEASY-T3载体中得到质粒pEASY-MsSQS，再转入大肠杆菌E.coli DH5α并在LB培养基37℃黑暗培养。然后质粒被测序组装，验证正确的MsSQS插入位点。
[0065] 1.5MsSQS序列的生物信息学分析
[0066] 利用DNAMAN程序和NCBI/BLAST分析了目的基因MsSQS的开放阅读框序列，并进行多重序列比对和同源物种分析。利用SOPMA程序分析SQS蛋白质的分子量、氨基酸组成和等电点等理化性质。借助SignalP4.1Server软件和SubLoc软件预测了MsSQS编码蛋白质的信号肽及亚细胞定位。采用TMHMM Server在线软件预测了蛋白质的跨膜区和疏水性。利用SWISSMODEL程序分析了蛋白质的三维结构。利用Interpro数据库分析了蛋白结构域功能。在NCBI/GenBank中查找拟南芥、人参等植物的同源蛋白，并使用ClustalX2.0软件进行序列比对分析。
[0067] 1.6鲨烯合酶基因MsSQS的表达分析
[0068] 将紫花苜蓿中苜3号种子置于浸湿的滤纸上萌发，然后移植入Hoagland’s营养液中，置于光照培养箱(16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％)培育4周，每隔1周换一次营养液。4周后选取长势良好，大小一致的植株用于以下处理：①在距离植株20cm处，用15W紫外光照射30min后，分别在0、2、4、8、12、24、48h采集根、茎、叶组织样本；②避光处理0、
4、8、12、24、48、96、144h分别采集根、茎、叶组织；③200μM MeJA处理0、4、8、12、24、48、96、
144h分别采集根、茎、叶组织；④100μM ABA处理0、2、4、8、12、24h分别采集根、茎、叶组织；⑤
50μM GA3处理0、2、4、8、12、24h分别采集根、茎、叶组织。将收集的样本分别用于提取RNA。
[0069] 1.7鲨烯合酶含量的测定(酶联免疫吸附试验)
[0070] 应用酶联免疫吸附试验(ELISA：enzyme linked immunosorbant assay)测定MeJA诱导处理后苜蓿不同组织中鲨烯合酶蛋白的活性。取MeJA处理后各个时间点根、茎、叶组织各200mg置于2mL离心管内，加入10mM磷酸缓冲液PBS 900mL，(PH＝7.2-7.4)，用研磨棒磨成浆，静置片刻后吸取上清，残渣再加入900mL匀浆液再研磨一次，然后合并两次研磨液，在4℃条件下以6000rpm转速离心15min，取上清。样品提取后立刻测定酶活性。用分光光度计，读取吸光度(OD)，用标准曲线，计算样品的实际浓度。
[0071] 1.8茉莉酸甲酯诱导下皂苷含量的测定
[0072] 选取在MeJA处理的苜蓿根、茎、叶样品置于低温真空冻干机中-80℃冻干70小时，取出后过60目筛。准确称取30mg冻干样置于5mL离心管中，加1mL70％乙醇用超声仪超声30min，4℃过夜，再次超声30min。然后以1000g离心30min，取上清液100μL注入已预处理的SPE柱，分别用5mL水和5mL30％甲醇冲洗，再以1mL甲醇洗脱4次。合并洗脱液置于10mL的具塞试管中蒸干，冷却后加入0.2mL 5％的香草醛-冰醋
酸溶液，待充分溶解后加入0.8mL高氯酸。置于70℃水浴锅中水浴15min后立即冰浴，冷却后加入5mL冰醋酸，静置20min。以空白平行样作对照，每个样品设3个生物学重复。用分光光度计测定在545nm处样品的吸光度。
[0073] 1.9亚细胞定位分析
[0074] 利用Primer 5.0软件设计含有上下游各含有Xho Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物，SQS-pA7-f:5’-CCCTCGAGATGGGAAGTATAAAAGCGATTTTGA-3’(CTCGAG为XhoⅠ酶切位点),SQS-pA7-r：5’-GCGTCGACGTTATTGTAACGGTTGGCAGAGAGA-3’(GTCGAC为SalⅠ酶切位点)。如SEQ ID NO:7-8所示。以pEasy-T3-MsSQS质粒为模板，分别以SQS-pA7-f和SQS-pA7-r为引物，进行目的片段的扩增，再将目的片段连接到pEASY-T1载体，并命名重组子为pEASY-T1-MsSQS。将重组质粒pEASY-T1-MsSQS和瞬时表达质粒pA7-GFP，用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ快速酶切酶进行双酶切，酶切体系如下：质粒体积根据质粒浓度确定(<1μg)，Xho Ⅰ1μL，Sal Ⅰ1μL，10×Quick Cut Buffer 5μL，ddH2O Up to 50μL。轻轻混匀后，用PCR仪37℃反应5～10min。经琼脂糖凝胶电泳后，回收目标片段。然后将目的基因片段在T4连接酶的作用下连接到载体pA7-GFP(16℃连接4～5h)，构建质粒pA7-GFP-MsSQS。将MsSQS以正确的方向整合到瞬时表达载体pA7-GFP中，通过基因枪轰击的方法，将含有目的基因编码区序列的亚细胞瞬时表达载体pA7-GFP转入洋葱表皮，在35S强启动子驱动下，融合蛋白在洋葱表皮细胞中过量表达。绿色荧光蛋白GFP在蓝色波长光下显示绿色荧光，根据融合蛋白的荧光信号确定SQS基因编码的蛋白在细胞内的定位。(图3)
[0075] 1.10原核表达
[0076] MsSQS基因编码的蛋白N端并不存在信号肽，但由于其C端疏水区可能存在一个膜结合区域，因此可能影响其在大肠杆菌中的表达。故设计两对引物分别为：①将MsSQS cDNA整个 编 码区 序列 插入 原 核表 达载 体 ，具 体 引物为 S QS - PE -f :5’-ATGGGAAGTATAAAAGCGATTTTG-3’，SQS-PE-r:5’-ATTCCTCAAAACGTAAGATTTCCTT-3’；②将MsSQS编码区序列C末端截掉30个氨基酸的序列插入原核表达载体，具体引物为SQS-PE-CTt-f:5’-ATTCCTCAAAACGTAAG ATTTCCTT-3’，SQS-PE-r:5’-ATTCCTCAAAACGTAA GATTTCCTT-3’。如SEQ ID NO:9-11所示。将含有正确MsSQS序列的pEASY-T3-MsSQS质粒作为模板，分别以SQS-PE-f和SS-PE-r、SQS-PE-CTt-f和SQS-PE-r为扩增引物，进行目的片段的扩增，再将目的片段连接到pEASY-E2载体。PCR反应程序如下：94℃预变性5min,94℃变性
30s,55℃退火30s,72℃延伸1min72℃延伸5min,4℃保温。将上述的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和DNA片段回收后，将回收的目的片段与原核表达载体pEASY-E2连接，并转入Tran-T1感受态细胞中，载体的连接及转化。
[0077] 用PCR方法鉴定阳性单克隆，以对于每个单克隆进行菌体PCR鉴定，以菌液为模板，载体的正向引物M13-F，5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，如SEQ ID NO:12；和目的基因反向引物SQS-PE-r作为引物，鉴定阳性重组子，并将能扩增出目的基因片段的菌液送至测序公司测序。将重组子分别命名为pEASY-E2-MsSQS和pEASY-E2-CTtMsSQS。将两种原核表达重组子pEASY-E2-MsSQS和pEASY-E2-CTtMsSQS，以及空载体分别转入大肠杆菌Transetta(DE3)。原核表达MsSQS蛋白和MsSQS-CTt蛋白SDS-PAGE电泳，取上述含有正确片段的大肠杆菌Transetta(DE3)，37℃培养过夜至OD600为0.4～0.6。以含有空载体的大肠杆菌作为对照，加入IPTG使其在菌液中的终浓度为1mM，分别诱导表达0、30、1、2、3、4、5、6、8h。加入IPTG后，在上述每个时间点取2mL菌液，4℃10000rpm离心5min，弃上清，加入1mLPBS(10mM，PH＝7.2-7.4)重悬菌体，用
超声波细胞破碎仪超声100次，分别取收集沉淀和上清，沉淀用100μL PBS重悬，4℃暂存。取样完成后，分别取50μL上清和沉淀重悬液，加入等体积的2×SDS loading Buffer，100℃水浴3min后立即置于冰上冷却，然后用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定MsSQS的表达。
[0078] 1.11MsSQS基因的超表达载体的构建及对紫花苜蓿的遗传转化
[0079] 用MsSQS-f和MsSQS-r为扩增引物，扩增出含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点的MsSQS基因片段，回收纯化PCR产物，再将目的片段连接到pEASY-T3载体。测序并提取含有正确序列的重组质粒，用XbaⅠ和BamHⅠ快速限制性内切酶对pBI121和重组子pEASY-T3-pMsSQS进行双酶切，在T4连接酶的作用下将目的基因编码区序列插入到植物超表达载体pBI121中，构建目的基因超表达载体(图10)，并转化农杆菌EHA105。然后采用农杆菌介导法转化紫花苜蓿中苜3号。
[0080] 1.12转基因苜蓿的鉴定
[0081] 以紫花苜蓿卡那霉素抗性植株基因组DNA为模板，以空载体PBI121转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿DNA作为阴性对照和PBI121-SQS质粒作为阳性对照，以pBI121上的35S启动子的上游引物35S-f和SQS基因的下游引物SQS-r作为引物进行PCR扩增，以检测转基因苜蓿。
[0082] 1.13转基因苜蓿中MsSQS表达分析与皂甙含量的测定
[0083] 提取转基因紫花苜蓿地上部分总RNA并进行反转录，分别以SQS-qPCR-f和SQS-qPCR-r和Actin-f和Actin-r为引物，检测目的基因MsSE1和看家基因β-actin的转录水平，以转空载体和野生型紫花苜蓿作为对照，检测MsSQS的转录水平变化。取转MsSQS的阳性转基因紫花苜蓿和转空载体PBI121的转基因紫花苜蓿以及野生型紫花苜蓿地上部分
粉碎脱脂，-80℃冻干70小时，过60目筛，经过固相萃取纯化后，利用比色法测定皂苷含量。
[0084] 2结果与分析
[0085] 2.1紫花苜蓿鲨烯合酶基因MsSQS的序列分析
[0086] 根据已知蒺藜苜蓿的鲨烯合酶核酸序列，从紫花苜蓿中苜1号中同源克隆出紫花苜蓿鲨烯合酶基因的全长cDNA序列。序列分析MsSQS cDNA包含一个1242bp的开放读码框，编码413个氨基酸。DNAMAN软件序列比对结果显示：其与蒺藜苜蓿SQS基因的同源性为97.91％，同时编码的蛋白也高度相似，为93.53％。
[0087] 同源性分析发现，推衍的MsSQS氨基酸序列与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆、大豆、甘草、百脉根、人参的SQS氨基酸序列一致性分别为98％、95％、94％、93％、92％、92％。同时选取12种不同植物物种的SQS氨基酸序列一起进行多重序列比较，结果表明各物种中的SQS蛋白序列同源性较高，总体同源性高达80％，这说明植物SQS蛋白在进化过程中比较保守，不同物种的SQS蛋白应属于同一个家族。(图1)
[0088] 通过MsSQS cDNA推衍的紫花苜蓿SQS氨基酸序列与人类、鼠、
酵母、拟南芥、裂殖酵母等不同物种的SS氨基酸序列作比较，发现SQS氨基酸序列有6个区域比较保守，每个保守区域的氨基酸残基一般为14～23个(图2)。其中有3个区域(Ⅲ区、Ⅳ区和Ⅴ区)是高度保守的，在动物、植物和
真菌中几乎是一样的，这三个区域被认为与酶活性中心有关；Ⅱ区和Ⅳ2+
区中各含有1个富天冬氨酸保守区域(DXXXD)，被认为是Mg 结合位点的活性中心，其为萜类合酶典型的结构；区域Ⅵ虽然保守性相对较低，但均含有1段高度疏水序列，这与所有其它物种的鲨烯合酶相似的，也与氨基酸序列疏水区域预测结果一致
[0089] 2.2二级结构预测及理化性质分析
[0090] 用SOPMA在线软件预测二级结构，表明紫花苜蓿SS二级结构以α-螺旋与无规则卷曲为主，其中无规则卷曲为20.19％，α-螺旋为64.48％，β-转
角为6.57％，延伸链为8.76％。通过对MsSQS的亲疏水性分析，总平均亲水性为-0.134(负值越大表示亲水性越好，正值越大表示疏水性越强)。通过ProtParam程序对MsSQS蛋白质序列进行理化性质分析(表1)。
[0091] 表1MsSQS蛋白的理化特性
[0092]
[0093] 2.3亚细胞定位及信号肽预测
[0094] 利用TargetP 1.1和PSORT prediction分析紫花苜蓿鲨烯合酶的细胞定位。结果表明(表2)：MsSQS蛋白在分泌途径、叶绿体、线粒体中很少，应属于非分泌性蛋白。主要分布在
细胞质膜、叶绿体类囊体膜、微体，少数分布在内质网膜上。
[0095] 借助生物学软件SignalP4.1Server软件分析MsSQS编码的蛋白质序列，检测它是否具有N端信号肽(图4)。结果显示：MsSQS蛋白序列第51位苯丙氨酸残基具有最高的原始剪切位点分值0.113和第1位甲硫氨酸残基具有最高的信号肽分值0.167，第11位脯氨酸残基具有最高综合剪切位点的分值0.121。由于最后算得的氨基酸残基的加权平均值较小0.122(＜0.5)，由此，推测MsSQS基因所编码的蛋白序列N端不存在信号肽，为非分泌性蛋白。结果与亚细胞定位结论相一致，说明紫花苜蓿SQS在细胞质合成后，不能进行蛋白转运。
[0096] 表2MsSQS的亚细胞定位预测
[0097]
[0098]
[0099] 通过TMHMM Server在线软件分析：MsSQS编码蛋白有两个可能跨膜螺旋区(TM helix)：一个是从第288个氨基酸残基到第310个氨基酸残基，方向是由外向内。第二个是从第385个氨基酸残基到第407个氨基酸残基，方向是由内向外。跨膜区域预测结果表明，MsSQS的氨基酸序列从288到310氨基酸残基之间和C末端各存在1个长约22个
碱基的疏水区域，结合其中C末端疏水区域可能是MsSQS蛋白与膜锚定结合的区域。
[0100] 2.4鲨烯合酶基因MsSQS的表达分析
[0101] 2.4.1不同组织中的表达分析
[0102] 以叶、茎、根各组织样品的反转录cDNA为模板，以SQS-qPCR-f和SQS-qPCR-r为引物，检测MsSQS的在紫花苜蓿各组织中转录水平的变化。结果(图5)显示：MsSQS在根中表达量最高，其次是叶，茎中表达量最低。其中根部比茎部的表达量高3倍以上。
[0103] 3.4.2不同诱导条件对MsSQS基因转录水平的影响
[0104] 为了研究不同诱导条件紫外照射、黑暗、100μM ABA和50μM GA3诱导下MsSQS的表达模式，我们测定了不同组织根、茎、叶中MsSQS的表达水平。在15w紫外灯照射30min，叶中MsSQS的转录水平显著升高，24小时处达到最高，而根中的转录水平呈下降趋势，32小时处最低(图6A)。黑暗条件处理，叶中MsSQS的转录水平略有下降，茎中的基本不变，而在根中的转录水平呈显著的上升趋势(图6B)。用100μM ABA处理，根中MsSQS的转录水平没有明显变化，而在茎叶中4-12小时间表达量显著升高。用50μM GA3处理，叶中MsSQS的转录水平明显升高，结果与ABA处理的相似。处理8小时时转录水平与对照相比提高15倍以上。
[0105] 3.5MeJA诱导对MsSQS基因的表达，酶含量及皂甙含量的影响
[0106] 为了解MsSQS表达对皂苷与甾醇类物质合成的调节作用。我们研究了茉莉酸甲酯诱导下，MsSQS的表达水平与鲨烯合酶含量以及总皂甙含量的变化之间的关系。以200μM MeJA处理紫花苜蓿，按处理后时间梯度取叶、茎、根组织提取总RNA。以反转录cDNA为模板，以SQS-qPCR-f和SQS-qPCR-r为引物，检测MsSQS在紫花苜蓿不同组织中转录水平(图7A)。在MeJA处理的144h内，MsSQS在叶、茎、根中的表达量均升高，表明MeJA可诱导MsSQS表达。根部MsSQS的表达量呈现先升高后降低的趋势，在24h时表达量最高，随后逐步下降，但总体趋势都高于对照；叶中MsSQS转录水平不同于根表现出两个峰值，第一个峰值在8小时处转录水平是对照的15倍，第二次升高值在144小时处是对照的24倍。茎中MsSQS的转录水平虽然有所升高，但变化幅度不大。
[0107] 在MeJA诱导下，苜蓿各组织中的鲨烯合酶含量总体升高，但随着胁迫时间的长短呈现一定的
波动性，根中鲨烯合酶含量在胁迫24小时时含量最高，是对照的2.26倍；叶和茎中MsSQS的转录水平和鲨烯合酶含量的变化趋势是一致，即随着MsSQS基因转录水平的提高，鲨烯合酶的含量也升高(图7B)。
[0108] 在MeJA诱导下，苜蓿不同组织中的总皂苷含量变化如图7C，随着MeJA胁迫时间的延长，根中总皂苷含量呈上升趋势，在24小时处含量达到最大，是对照的1.2倍。叶中总皂苷含量的变化较大，总体趋势是皂苷含量不断上升，144小时处皂苷含量达到最大值，是对照的1.78倍。茎中总皂苷含量变化不显著。
[0109] 2.6原核表达结果
[0110] 实验成功构建了MsSQS基因全长编码区cDNA和C末端截短(carboxy-terminal truncated)90个碱基的MsSQS原核表达重组子，并将其重组子分别命名为pEASY-E2-MsSQS和pEASY-E2-CTtMsSQS(图8)。同时构建了在pEASY-E2表达载体内插入了一段对照基因序列，作为空白对照，命名为pEASY-E2-Control。并将上述重组子转入大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中，在T7启动子的作用下，用1mM IPTG诱导重组蛋白在大肠肝菌中大量表达。
[0111] SDS-PAGE电泳结果显示：与诱导前相比，诱导2h后转化了pEASY-E2-MsSQS的大肠杆菌样品在45～50kDa左右出现明显蛋白条带，重组蛋白相对分子质量与预测的MsSQS-HIS蛋白分子量理论值(49kDa)相近，且在5h后表达量达到最大值；同时，转化了pEASY-E2-CTtMsSQS的大肠杆菌样品在40～45kDa左右出现明显蛋白条带，IPTG诱导表达5h后重组蛋白表达量达到最高，表达的重组蛋白分子量大小与期望的CTtMsSQS-HIS重组蛋白理论值(46kDa)一致。
[0112] 以转化了pEASY-E2-Control的大肠杆菌作为空白对照，IPTG诱导表达5h后，分别提取转化了pEASY-E2-MsSQS和pEASY-E2-CTtMsSQS的大肠杆菌细胞破碎液，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示(图9)：经过IPTG诱导后，转化了pEASY-E2-CTtMsSQS大肠杆菌的上清液总蛋白和沉淀物总蛋白中均可在40～45kDa左右检测到目标重组蛋白条带，而转化了pEASY-E2-MsSQS大肠杆菌的只能在其沉淀物总蛋白中检测到目标重组蛋白条带。因此，MsSQS蛋白可在大肠杆菌中大量表达，但均为包涵体蛋白，未检测到可溶性蛋白。而C末端截短30个氨基酸后，MsSQS蛋白依然可在大肠杆菌中表达，且可表达出可溶性蛋白。
[0113] 2.7转MsSQS基因苜蓿总皂甙含量的变化
[0114] 根据
齐墩果酸标准曲线求得不同株系的地上部分的总皂苷的浓度，以空载体PBI121转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿为对照，检测MsSQS转基因紫花苜蓿地上部分皂甙含量表明，转基因紫花苜蓿中总皂苷含量明显高于对照，比转空载体的植株高1.5～2倍，比野生型高1～1.6倍(图11)。说明，MsSQS在紫花苜蓿中过表达，可以提高紫花苜蓿中皂甙的含量。由此可见MsSQS基因在苜蓿皂苷合成途径中起到关键作用。
[0115] 本发明通过对不同物种SQS基因编码的氨基酸序列比对发现，紫花苜蓿SQS基因编码的蛋白质与其他物种中的SQS蛋白序列同源性高达80％，说明植物SQS蛋白在进化过程中比较保守，不同物种的SQS蛋白应属于同一个家族。而且不同物种SQS的编码蛋白结构相一致，均有6个保守区域：其中3个高度保守区域(Ⅲ区、Ⅳ区和Ⅴ区)与酶活性中心有关；另外2个保守区域(Ⅱ区和Ⅳ区)被认为是Mg2+结合位点的活性中心，是富含天冬氨酸(DXXXD)的萜类合酶典型的结构；区域Ⅵ虽然保守性较低，但与其他物种中的序列一样均含有1段高度疏水序列，预测可能是细胞膜锚定区域(Robinson et al.,1993)。亚细胞定位显示其编码的蛋白可能主要分布在细胞质膜、叶绿体类囊体膜、微体，少数分布在内质网膜上。同时跨膜结构域分析得出MsSQS蛋白有2个可能的跨膜螺旋区，其中C末端疏水区域可能为膜结合区域。采用SWISSMODEL对MsSQS蛋白进行同源模建，结果表明该蛋白与禽类法尼酯焦磷酸合酶、人鲨烯合酶活性中心结构十分相似，在中央形成一个疏水空间容纳反应底物，表明本研究克隆的MsSQS序列编码的蛋白具有相同的鲨烯合酶催化活性。
[0116] 利用实时荧光定量PCR检测MsSQS在苜蓿不同组织的表达差异，结果显示MsSQS在根中的表达量最高，其次是叶，茎中表达量最低。通过对不同组织中鲨烯合酶活性和皂苷含量的分析，MsSQS基因在不同组织的表达量与鲨烯合酶活性和皂苷含量具有相同的变化趋势，即MsSQS基因与鲨烯合酶含量及皂苷含量呈正相关，说明鲨烯合酶基因可能是调控皂苷合成的关键酶基因。
[0117] 本发明中经过紫外处理后，鲨烯合酶基因转录的mRNA水平在地上部分均上升，根部的转录水平略有下降。可能是由于紫外照射对茎叶造成直接伤害，通过增加地上部分鲨烯合酶基因的表达来调节皂苷的合成，从而减少紫外线
辐射造成的损伤，由此说明皂苷参与了植物的自身防御系统。目前对于紫花苜蓿皂苷的抗
氧化的研究已有文献报道，但是关于其是否具有一定的抗
紫外辐射作用还尚未见到相关报道。
[0118] 本发明在避光处理后，根部MsSQS表达量明显上升，但地上部分的表达量却略有下降。可能是不同植物的不同组织中次生代谢产物合成对光照需求有一定的差异，是植物通过次生代谢对不良环境(遮阴)的一种适应性反应。研究表明，光照强度、时间、光质等条件的改变均可影响植物体内次生代谢产物的合成。
[0119] 本发明在紫花苜蓿培养液中分别添加ABA和GA3，在处理后24h内，MsSQS在叶片中的表达量显著上调，而根部表达量在各个时间段差异不显著。赤霉素和脱落酸均能在叶片中诱导MsSQS表达量上调，可能是因为当植物体内外源性赤霉素或者脱落酸增加时，从甲羟戊酸(mevalonate，MVA)开始流向赤霉素或脱落酸合成的
碳流减少了，而相应流向甾体合成的碳流却增加，从而正向调控鲨烯合酶基因的表达。此外，植物
激素和三萜类化合物合成具有共同中间体，植物体内激素含量的变化可能会影响三萜类化合物的合成，进而影响鲨烯合酶表达量的改变。
[0120] 本发明分析了在200mM MeJA诱导下，MsSQS基因的转录水平、编码蛋白的表达水平及最终产物-皂苷含量的变化，不同组织中的MsSQS的表达量均有上升，同时苜蓿中鲨烯合酶含量及活性也相应的呈现波动状态；通过固相萃取-紫外分光光度计法测定各组织中总皂苷的含量也相应升高，总皂甙含量的变化趋势与MsSQS表达水平的变化趋势一致。研究表明，在MeJa诱导下，苜蓿叶片中MsSQS基因表达量和皂苷含量上升幅度最大，说明MeJA对叶中的MsSQS诱导最为显著。实验初步证明，茉莉酸甲酯可以通过诱导紫花苜蓿MsSQS基因的转录，从而影响鲨烯合酶的活性和皂苷类活性物质的合成。
[0121] 通过对转MsSQS的苜蓿转基因阳性苗进行转录水平和总皂苷含量的检测，结果表明转基因植株中MsSQS表达量和总皂苷量均高于野生型紫花苜蓿和转空载体紫花苜蓿。进一步验证，MsSQS基因在苜蓿总皂苷合成途径中具有一定的的调节作用。本发明不仅建立了苜蓿转MsSQS基因的高效转化体系，而且对MsSQS的表达模式及功能有了初步的了解；获得的转基因紫花苜蓿株系可作为培育高皂甙含量紫花苜蓿新品种的种质材料，为苜蓿的遗传改良具有一定的意义和应用价值。
[0122] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种
变形和改进，均应落入本发明
权利要求书确定的保护范围内。
