一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用
阅读：1060发布：2020-05-13
专利汇可以提供一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一株高产γ-谷 氨 酰转肽酶的干 酪乳 杆菌Lactobacillus casei TH139，保藏于中国普通 微 生物 菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.18686；使用该菌株在37℃，pH7.0条件下 发酵 生产γ-谷氨酰转肽酶；离心收集菌 体细胞 后在40℃，pH9.0条件下生物转化L-谷氨酰胺和乙胺得到L-茶氨酸；反应液经膜分离、离子交换 树脂 分离和浓缩结晶后获得合格的L-茶氨酸成品。本发明开发的使用干酪乳杆菌生产L-茶氨酸的方法具有 食品安全 、绿色环保、操作简便以及成本低廉的优点，具有良好的工业应用价值。，下面是一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用专利的具体信息内容。
1.一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，分类命名为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2019年10月15日；保藏编号为CGMCC No.18686。
2.利用权利要求1所述的干酪乳杆菌生产L-茶氨酸的方法，其特征在于：采用如下步骤：
（1）细胞培养和收集：取300 μL干酪乳杆菌菌液接入30 mL LBS培养基中，pH7.0，37℃，
200 r/min条件下培养8-10 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，
200 r/min条件下培养14-16 h后，冷冻离心获得菌体细胞；
（2）生物转化制备L-茶氨酸：取40-60 g菌体细胞置于1 L含有50-65 g/L L-谷氨酰胺、
15-20 g/L乙胺、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃、100 r/min条件下反应8 12 h后，离心~
留上清液；
（3）L-茶氨酸的分离提取：将反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白；将膜滤过液流经阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，再使用1%的氨水进行洗脱；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上后，浓缩结晶获得L-茶氨酸成品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤一所述发酵培养基包含的成分及其含量分别为：葡萄糖18-20 g/L，蛋白胨8-10 g/L，酵母粉5-7 g/L，柠檬酸铵2-4 g/L，乙酸钠
1-2 g/L，磷酸氢二钾2-4 g/L，硫酸镁0.5-1 g/L，硫酸锰0.2-0.5 g/L。
4.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌在L-茶氨酸生产中的应用。
一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生
产中的应用
技术领域
背景技术
[0002] L-茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸，占其总游离氨基酸50%以上。L-茶氨酸有许多有益的生理效果，能够促进人脑放松，提高注意力和促进学习能力。在医疗保健方面，L-茶氨酸具有降低血压、预防血管疾病、缓解压力、保护神经、减肥降脂和提高免疫系统能力等功效。在食品方面，L-茶氨酸已被FDA列为安全的食品药品添加剂，用于改良食品品质、增强食品风味。
[0003] 现有L-茶氨酸的主要制备途径包括提取分离法、化学合成法和酶促合成法。提取法存在一定的缺点，从植物中提取茶氨酸步骤繁琐、周期长、成本昂贵、提取量少，不能满足大规模生产需求。化学合成法方法简单且成本低廉，是目前工业化生产的主要途径之一，但合成的茶氨酸易存在消旋体、提取困难、污染能耗大且难于在食品领域中应用。近来使用酶催化法生产L-茶氨酸引起了很多学者的关注，目前主要有4种不同的细菌来源的酶可作为理想的生物催化剂并显示出不同的潜力。这4种细菌来源的酶，包括L-谷氨酰胺合成酶，γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶，γ-谷氨酰转肽酶和L-谷氨酰胺酶。其中γ-谷氨酰转肽酶是一种能够催化多种γ-谷氨酰基供体合成L-茶氨酸的催化用酶，且无需消耗ATP。但现有技术用于γ-谷氨酰转肽酶的生产菌株主要为枯草芽孢杆菌和重组大肠杆菌（ZL200810021187.8、ZL200810021188.2、ZL201310302347.7、ZL200910027192.4），存在表达效率低、酶活力低的缺点，并且在食品中的应用受到限制。
[0004] 干酪乳杆菌是目前研究最为深入、应用最为广泛的益生菌之一，与嗜酸乳杆菌、双歧杆菌一同被认为是目前最为经典的三种益生菌。本发明以河南省各地区发酵乳制品中分离的200株干酪乳杆菌为研究对象，筛选出高产高活性γ-谷氨酰转肽酶的菌株，并将其用于食品级L-茶氨酸的生产中，满足产品在食品和医药领域的需求。
发明内容
[0005] 为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌，目的二在于提供使用所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139生产L-茶氨酸的方法。利用所述高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌生产L-茶氨酸，具有产品收率高、纯度高、成本低廉等优点。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，分类命名为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2019年10月15日；保藏编号为CGMCC No.18686。
[0007] 利用上述干酪乳杆菌生产L-茶氨酸的方法，采用如下步骤：（1）细胞培养和收集：取300 μL干酪乳杆菌菌液接入30 mL LBS培养基中，pH7.0，37℃，
200 r/min条件下培养8-10 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，
200 r/min条件下培养14-16 h后，冷冻离心获得菌体细胞；
（2）生物转化制备L-茶氨酸：取40-60 g菌体细胞置于1 L含有50-65 g/L L-谷氨酰胺、
15-20 g/L乙胺、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃、100 r/min条件下反应8 12 h后，离心~
留上清液；
（3）L-茶氨酸的分离提取：将反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白；将膜滤过液流经阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，再使用1%的氨水进行洗脱；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上后，浓缩结晶获得L-茶氨酸成品。
200 r/min条件下培养8-10 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，
200 r/min条件下培养14-16 h后，冷冻离心获得菌体细胞；
（2）生物转化制备L-茶氨酸：取40-60 g菌体细胞置于1 L含有50-65 g/L L-谷氨酰胺、
15-20 g/L乙胺、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃、100 r/min条件下反应8 12 h后，离心~
留上清液；
（3）L-茶氨酸的分离提取：将反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白；将膜滤过液流经阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，再使用1%的氨水进行洗脱；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上后，浓缩结晶获得L-茶氨酸成品。
[0008] 作为对上述方案的进一步优化，步骤一所述发酵培养基包含的成分及其含量分别为：葡萄糖18-20 g/L，蛋白胨8-10 g/L，酵母粉5-7 g/L，柠檬酸铵2-4 g/L，乙酸钠1-2 g/L，磷酸氢二钾2-4 g/L，硫酸镁0.5-1 g/L，硫酸锰0.2-0.5 g/L。
[0010] 有益效果：本发明从发酵乳制品中分离筛选出一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，并将其应用于L-茶氨酸的生产。通过产酶菌株的培养及细胞收集，生物转化，分离提取等操作工序获得了合格的L-茶氨酸产品，与现有技术相比，本发明技术筛选得到的产酶微生物属于食品安全级菌株，且开发的L-茶氨酸生产工艺具有产品收率和纯度高，生产安全环保、原料成本低廉、操作简单易行的优点，具有很强的竞争力和工业应用潜质。
[0011] 生物材料的保藏干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，其分类命名为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），保藏日期为2019年10月15号，保藏单位及其简称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC No.18686。
附图说明
附图说明
[0012] 图1是L-茶氨酸标准品的高效液相色谱图；图2是制备的L-茶氨酸成品的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0013] 一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号CGMCC No.18686。
[0014] 其筛选方法采用如下步骤：（1）初筛方法：将从河南省各地区发酵乳制品中分离的200株干酪乳杆菌挑选单菌落接种于平板筛选培养基中，37℃静置培养1-2天，观察透明圈的大小。所述平板筛选培养基含有L-谷氨酰胺10-15 g/L，乙胺5-10 g/L，0.1%酚酞指示剂1-5 mL/L，琼脂1.5-2 g/L。
[0015] （2）复筛方法：选取透明圈较大的菌株，接种于LBS培养基中37℃，pH7.0条件下培养12 h后，离心收集菌体细胞测定γ-谷氨酰转肽酶的活力。选取酶活力最大的菌株进行甘油管冷冻保藏。
[0016] 一种使用干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139生产L-茶氨酸的方法，采用如下步骤：（1）细胞培养和收集：取300 μL干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139菌液接入30 mL LBS培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养8-10 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养14-16 h后，冷冻离心获得菌体细胞。
[0017] 所述发酵培养基成分为：葡萄糖18-20 g/L，蛋白胨8-10 g/L，酵母粉5-7 g/L，柠檬酸铵2-4 g/L，乙酸钠1-2 g/L，磷酸氢二钾2-4 g/L，硫酸镁0.5-1 g/L，硫酸锰0.2-0.5 g/L。
[0018] （2）生物转化制备L-茶氨酸：取40-60 g菌体细胞（湿重）置于1 L含有50-65 g/L L-谷氨酰胺，15-20 g/L乙胺，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃，100 r/min条件下反应8~12 h后，离心留上清液。
[0019] （3）L-茶氨酸的分离提取：将反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白；将膜滤过液流经001×7阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，再使用1%的氨水进行洗脱；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上后，浓缩结晶获得L-茶氨酸成品。
[0021] 本发明所用的干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139是由本发明人等发现的新菌株，是具有产生γ-谷氨酰转肽酶能力的天然发酵菌株。
[0022] 本发明采用的γ-谷氨酰转肽酶来源于干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139，该酶在碱性条件下，可以催化谷氨酰基转移反应，用于L-茶氨酸的生物合成。
[0023] 实施例1：高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌筛选（1）初筛方法：将从河南省各地区发酵乳制品中分离的200株干酪乳杆菌挑选单菌落接种于平板筛选培养基中，37℃静置培养1-2天，观察透明圈的大小。所述平板筛选培养基含有L-谷氨酰胺12 g/L，乙胺8 g/L，0.1%酚酞指示剂8 mL/L，琼脂1.8 g/L。
[0024] （2）复筛方法：选取透明圈较大的菌株，接种于LBS培养基中37℃，pH7.0条件下培养12 h后，离心收集菌体细胞测定γ-谷氨酰转肽酶的活力。将每分钟催化生成1 μmol L-茶氨酸的菌体细胞量（湿重）定义为一个酶活。选取酶活力最大的菌株进行甘油管冷冻保藏。
[0025] 实施例2：生物转化制备L-茶氨酸（1）细胞培养和收集：取300 μL干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139菌液接入30 mL LBS培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养8 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养14 h后，冷冻离心获得菌体细胞。
[0026] 所述发酵培养基成分为：葡萄糖18 g/L，蛋白胨8 g/L，酵母粉5 g/L，柠檬酸铵2 g/L，乙酸钠1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.2 g/L。
[0027] （2）生物转化制备L-茶氨酸：取40 g菌体细胞（湿重）置于1 L含有50 g/L L-谷氨酰胺，15 g/L乙胺，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃，100 r/min条件下反应8 h后，离心留上清液。上清液中L-茶氨酸的浓度为54.5 g/L，底物L-谷氨酰胺的摩尔转化率为91.5%。
[0028] （3）L-茶氨酸的分离提取：将1 L反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白，过滤温度常温，过滤压力0.2 MPa，过滤速度10 mL/min；将膜滤过液流经001×7阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，吸附温度常温，上样速率1 mL/min，再使用1%的氨水进行洗脱，洗脱温度常温，洗脱速率1.5 mL/min；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上，脱色温度60℃，活性炭用量5 g/L，脱色时间30 min；将脱色液浓缩结晶获得44.8 g L-茶氨酸成品。使用高效液相色谱检测成品纯度为98.5%。
[0029] 实施例3：生物转化制备L-茶氨酸（1）细胞培养和收集：取300 μL干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139菌液接入30 mL LBS培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养9 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养15 h后，冷冻离心获得菌体细胞。
[0030] 所述发酵培养基成分为：葡萄糖19 g/L，蛋白胨9 g/L，酵母粉6 g/L，柠檬酸铵3 g/L，乙酸钠1.5 g/L，磷酸氢二钾2.5 g/L，硫酸镁0.8 g/L，硫酸锰0.3 g/L。
[0031] （2）生物转化制备L-茶氨酸：取50 g菌体细胞（湿重）置于1 L含有60 g/L L-谷氨酰胺，18 g/L乙胺，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃，100 r/min条件下反应10 h后，离心留上清液。上清液中L-茶氨酸的浓度为64.8 g/L，底物L-谷氨酰胺的摩尔转化率为90.7%。
[0032] （3）L-茶氨酸的分离提取：将1 L反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白，过滤温度常温，过滤压力0.2 MPa，过滤速度10 mL/min；将膜滤过液流经001×7阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，吸附温度常温，上样速率1 mL/min，再使用1%的氨水进行洗脱，洗脱温度常温，洗脱速率1.5 mL/min；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上，脱色温度60℃，活性炭用量6 g/L，脱色时间30 min；将脱色液浓缩结晶获得54.2 g L-茶氨酸成品。使用高效液相色谱检测成品纯度为98.8%。
[0033] 实施例4：生物转化制备L-茶氨酸（1）细胞培养和收集：取300 μL干酪乳杆菌Lactobacillus casei TH139菌液接入30 mL LBS培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养10 h后，再取30 mL种子液接种于3 L发酵培养基中，pH7.0，37℃，200 r/min条件下培养16 h后，冷冻离心获得菌体细胞。
[0034] 所述发酵培养基成分为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉7 g/L，柠檬酸铵4 g/L，乙酸钠2 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，硫酸镁1 g/L，硫酸锰0.5 g/L。
[0035] （2）生物转化制备L-茶氨酸：取60 g菌体细胞（湿重）置于1 L含有65 g/L L-谷氨酰胺，20 g/L乙胺，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃，100 r/min条件下反应12 h后，离心留上清液。上清液中L-茶氨酸的浓度为69.3 g/L，底物L-谷氨酰胺的摩尔转化率为89.5%。
[0036] （3）L-茶氨酸的分离提取：将1 L反应上清液流经截留分子量为300 Da的纳滤膜截留其中的可溶性蛋白，过滤温度常温，过滤压力0.2 MPa，过滤速度10 mL/min；将膜滤过液流经001×7阳离子交换树脂吸附其中的L-茶氨酸，吸附温度常温，上样速率1 mL/min，再使用1%的氨水进行洗脱，洗脱温度常温，洗脱速率1.5 mL/min；将洗脱液用药用活性炭脱色至透光率90%以上，脱色温度60℃，活性炭用量6 g/L，脱色时间30 min；将脱色液浓缩结晶获得57.4 g L-茶氨酸成品。使用高效液相色谱检测成品纯度为98.7%。
[0037] 实施例5：L-茶氨酸的高效液相检测方法（1）衍生处理：取200 μL衍生缓冲液（50 mmol/L NaHCO3溶液）加入到1 mL L-茶氨酸成品或标准品溶液中。取上述上清液10 μL，再加入300 μL衍生剂溶液（1%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液），充分混匀后，将反应液置于65°C水浴锅中避光反应1 h，取出加入定容缓冲液（50 mmol/L KH2PO3溶液）定容至1.2 mL，充分摇匀后过0.2 μm膜后进行色谱分析。
[0038] （2）色谱检测：使用高效液相色谱，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm，5-Micron)，流动相A为50%乙腈溶液，流动相B为50 mmol/L乙酸钠缓冲液，柱温33℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm，采用二元梯度分析，进样量10 μL。L-茶氨酸标品（图
1）和成品（图2）的高效液相色谱图见附图所示，其中11.5 min为L-茶氨酸的特征峰。
1）和成品（图2）的高效液相色谱图见附图所示，其中11.5 min为L-茶氨酸的特征峰。
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