技术领域
[0001] 本
发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种脂肪干细胞提取方法。
背景技术
[0002] 干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源。其具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透，干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究己成为生命科学中的热点，其对于人类的
疾病的
治疗等具有非常重要意义。
[0003] 脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。脂肪干细胞是一种足量的、可用于实际的、有一定吸引
力的自
体细胞代替的供体资源，并能够广泛的用于组织修复、再生、发育的可塑性及细胞治疗等研究中。
[0004] 在现有的脂肪干细胞分离获取步骤中，通常可以包括：对脂肪组织的物理处理、消化以及传代培养扩增等几个步骤。
[0005] 在实现本发明的过程中，
申请人发现
现有技术中存在如下问题：在分离获取过程中，由于需要加入相应的消化酶进行消化，需要充分长的消化时间才能实现脂肪组织样本的完全消化。而在消化时间过长时，会导致细胞损伤较大的问题，影响细胞得率及后期培养。
发明内容
[0006] 鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种脂肪干细胞提取方法，旨在解决现有技术中脂肪组织消化时间过长，导致细胞损伤大，影响后期培养和细胞得率的问题。
[0007] 为了达到上述目的，本发明
实施例第一方面提供一种脂肪干细胞提取方法。所述方法包括如下步骤：
[0008] A、预处理脂肪组织；
[0009] B、向所述预处理后的脂肪组织加入I型胶原酶进行消化；
[0010] C、消化预定的时间后，收集位于下层的已消化的脂肪细胞；
[0011] D、吸取位于上层的未消化脂肪细胞以及I型胶原酶重新进行消化；
[0012] E、重复执行步骤C和步骤D，直至所述预处理后的脂肪细胞被消化完全；
[0013] F、培养若干代所述已消化的脂肪细胞，获得传代细胞；
[0014] G、收集所述传代细胞并进行若干项细胞检测；
[0015] H、在所述细胞检测项目合格后，将所述传代培养细胞转移至细胞
种子库中存储。
[0016] 可选地，所述步骤A具体包括：
[0017] A1、获取脂肪组织样本；
[0018] A2、使用生理盐
水清洗所述脂肪组织样本；
[0019] A3、将所述清洗后的脂肪组织样本分装至若干支离心管并剪碎。
[0020] 可选地，所述步骤A2具体包括：
[0021] A21、将脂肪组织样本分装至若干支离心管中；
[0022] A22、向离心管中加入生理盐水以补充至预定的体积；
[0023] A22、使用移液管反复吹打在所述离心管内的脂肪组织样本；
[0024] A23、将离心管放入离心机中离心10分钟，转速为1500rpm；
[0025] A24、弃去离心管内的中下层液体；
[0026] A25、重复执行步骤A22至A24，直至中下层液体清亮。
[0027] 可选地，所述I型胶原酶为使用DPBS配置的无菌I型胶原酶，浓度为[0028] 1mg/ml。
[0029] 可选地，所述预定时间为1小时。
[0030] 可选地，所述步骤B具体包括：B1、向装有所述剪碎后的脂肪组织样本的离心管中加入I型胶原酶并混合均匀；B2、将混合均匀的离心管放入37℃恒温摇床中进行消化，所述37℃恒温摇床的转速为250转/分钟。
[0031] 可选地，所述步骤C具体包括：消化1小时后，将所述离心管放入离心机中离心6分钟，转速为1200rpm。
[0032] 可选地，所述步骤D具体包括：
[0033] D1、收集位于下层的细胞沉淀并使用DPBS重悬；
[0034] D2、对所述细胞沉淀重悬进行细胞计数并进行离心，所述离心的时间为6min，转速为1200rpm；
[0035] D3、弃去离心后的上清。
[0036] 可选地，所述步骤
[0037] 所述步骤F具体包括：F1、使用脂肪间充质干细胞完全培养基，将所述已消化的脂肪细胞重悬并调整细胞
密度至2×104/cm2，接种在培养瓶中；F2、在将所述接种有所述已消化的脂肪细胞的培养瓶放置于二
氧化
碳培养箱中静置培养；F3、当细胞融合度达70～80％时，倾出培养瓶内的培养基并加入20ml生理盐水洗涤；F4、向所述培养瓶内加入胰蛋白酶消化液，静置消化3分钟后，加入生理盐水终止消化；F5、从所述培养瓶中收集细胞悬液并离心去上清，获得脂肪间充质干细胞，记为细胞代次PO；F6、将细胞代次为P0的脂肪间充质干细胞按2×104/cm2的密度，接种在培养瓶中；F7、重复执行步骤F2、F3和F4；F8、从所述培养瓶中收集细胞悬液并离心去上清，获得脂肪间充质干细胞，记为细胞代次P1。
[0038] 可选地，在所述步骤G之前，所述方法还包括：
[0039] G01、将细胞代次为P1的脂肪间充质干细胞按照1×107/ml/支的容量，分装至若干支冻存管内；
[0040] G02、向所述冻存管加入冻存液；
[0041] G03、依照预定的降温程序，降低所述冻存管至目标
温度后，将所述冻存管放置到暂存罐内。
[0042] 本发明实施例提供的脂肪干细胞提取方法，可以有效的降低消化时间对于脂肪干细胞活性的影响，提高脂肪干细胞的细胞得率或者含量。该提取方法的工艺简单，操作简便，实现成本低，可广泛推广。
[0043] 通过该方法提取获得的脂肪干细胞传代速度快，细胞存活率高，能够很好的临床应用于
皮肤美容、免疫力提升、性器官衰老对抗等方面。该脂肪干细胞还可以作为研究的
基础，在克服和治疗冠心病、糖尿病、脑血管病、老年痴呆症等危害人类生命与健康的重大疾病
进程中发挥重大作用，具有良好的应用前景。
附图说明
[0044] 一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制
[0045] 图1为本发明具体实施例的脂肪干细胞提取方法的方法
流程图；
[0046] 图2为本发明具体实施例的步骤110的具体方法流程图。
具体实施方式
[0047] 为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048] 本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。
[0049] 本发明实施例中表述的术语“脂肪”、“脂肪组织”、“脂肪组织样本”是指包含具有特定活性代谢特征、可无限传代生长、具备繁殖潜力的脂肪干细胞的
生物活性组织。该生物活性组织可以经由一种或者多种，任意合适的处理方法进行处理，以便于分离获得其中的脂肪干细胞。
[0050] 如何通过合适的方式稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞，是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。为了满足脂肪干细胞的应用需求，在本实施例中，可以应用本发明提供的脂肪干细胞提取方法，高效率的获得脂肪干细胞用以研究或者其他相关的临床应用。
[0051] 图1为本发明实施例提供的脂肪干细胞提取方法。如图1所示，所述方法包括如下步骤：
[0052] 110、预处理脂肪组织。
[0053] 在本实施例中，所述脂肪组织可以来源于人体脂肪细胞较多的臀部、腹部或大腿。这些脂肪组织包含的脂肪干细胞数量充足，便于后续能够分离获取到更多的的脂肪干细胞。
[0054] 所述预处理具体可以是根据脂肪组织的取材来源或者途径，使用的任何合适的，用以取出脂肪组织上的杂质或者其他附着物的处理方法(如某些清洁步骤)。通过预处理的过程，可以首先去除脂肪组织中的其他杂质，确保最终分离获得的脂肪干细胞的纯度。
[0055] 在一些实施例中，如图2所示，所述预处理步骤110具体可以包括：
[0056] 111、获取脂肪组织样本。
[0057] 具体的，所述脂肪组织样本可以是专业的医院或者美容院等医疗美容机构，通过肿胀法吸脂手术获得的废弃物。这些废弃物可以在无菌条件下，以4℃存储，并在48小时内进行相应的干细胞分离获取操作，以确保脂肪组织中干细胞的生理活性。
[0058] 112、使用生理盐水清洗所述脂肪组织样本。
[0059] 使用生理盐水清洗的步骤，其目标在于去除脂肪组织样本中的红细胞以及其他杂质。由于脂肪组织样本来源于活体，其通常包含了许多影响后续实验操作的杂质，例如红细胞等。在实际操作过程中，需要进行清洗。
[0060] 具体的，所述步骤112具体可以采用如下的方式：
[0061] 首先，将脂肪组织样本分装至若干支离心管中，并且向离心管中加入生理盐水以补充至预定的体积。然后，使用移液管反复吹打在所述离心管内的脂肪组织样本。吹打后，将离心管放入离心机中离心10分钟，转速为1500rpm。离心后，弃去离心管内的中下层液体。
[0062] 最后，重复执行以上步骤，直至离心后，离心管内的中下层液体清亮，不存在红细胞为止。
[0063] 在本实施例中，该清洗操作在离心管中进行，方便后续的离心和弃去中下层液体的操作。所述离心管具体可以采用任何合适的规格，例如，常用的50ml离心管。
[0064] 具体的，在使用50ml离心管时，可以在每支离心管内分装20ml脂肪，并且加入生理盐水定容至45ml进行清洗。
[0065] 113、将所述清洗后的脂肪组织样本分装至若干支离心管并剪碎。
[0066] 在清洗干净后，可以将脂肪组织样本从离心管中吸出并且分装到新的50ml离心管内(同样的，每支50ml离心管分装20ml脂肪)。然后，使用
剪刀等工具对脂肪组织样本进行物理上的分离
破碎，剪碎脂肪组织成糊状。
[0067] 120、向所述预处理后的脂肪组织加入I型胶原酶进行消化。
[0068] 所述I型胶原酶是一种常用的消化酶，应用于细胞消化。脂肪组织需要经过完全消化后才能进行后续扩大和传代培养，以分离出脂肪干细胞。
[0069] 在本实施例中，使用的是使用DPBS(杜氏
磷酸缓冲液)配置的无菌I型胶原酶，浓度为1mg/ml。该I型胶原酶的无菌可以通过0.22μm
过滤器过滤的方式来实现。
[0070] 130、消化预定的时间后，收集位于下层的已消化的脂肪细胞。
[0071] 在消化预定的时间后(步骤120)，可以通过离心的方式，通过两者之间的密度差异，将已消化的脂肪细胞和未消化的脂肪组织分离，使其位于不同的层中。其中，已消化的脂肪细胞会位于离心管的下层，未消化的脂肪细胞和I型胶原酶则位于上层。在本实施例中，离心时间为6分钟，转速为1200rpm。
[0072] 140、吸取位于上层的未消化脂肪细胞以及I型胶原酶重新进行消化。该重新消化的过程可以在另一个新的离心管中进行。
[0073] 150、重复执行步骤130和步骤140，直至所述预处理后的脂肪细胞被消化完全。
[0074] 在本实施例中，将脂肪组织的消化划分为多个阶段，每次只消化一段较短的时间，然后收集已经消化完毕的脂肪细胞，避免已消化的脂肪细胞受到I型胶原酶的损害。
[0075] 通过这样分步消化的方式，能够很好的避免消化时间过长造成的问题，确保脂肪组织细胞能够得到充分消化的同时又不会过度消化，导致细胞的损伤。
[0076] 具体的，所述消化过程具体可以为：将脂肪组织和I型胶原酶混合均匀后的离心管放入37℃恒温摇床中进行消化，所述37℃恒温摇床的转速为250转/分钟。
[0077] 160、培养若干代所述已消化的脂肪细胞，获得传代细胞。
[0078] 由于脂肪干细胞具有繁殖潜力，可进行传代培养。因此，可以通过连续培养多代的方式完成脂肪干细胞的分离，从脂肪组织中获得一定量的脂肪干细胞。
[0079] 170、收集所述传代细胞并进行若干项细胞检测。
[0080] 在培养完成后，可以对脂肪干细胞进行多项细胞检测，判断脂肪干细胞的生理特性或者生物学特性是否符合要求，是否具有足够的生物活性或者繁殖潜力，是否存在
生物污染等。该细胞检测可以包括
蛋白质电泳、基因测序、支原体检测、内毒素检测等相关的生物检测项目。
[0081] 180、在所述细胞检测项目合格后，将所述传代培养细胞转移至细胞种子库中存储。
[0082] 各个细胞检测项目具可以具有对应的判定指标，其既可以是定量的，也可以是定性的判定指标。经过细胞检测后，合格的脂肪干细胞可以认为具有较好的生物活性或者特征，能够应用于各种临床和研究应用。
[0083] 细胞种子库是将干细胞放置在低温状态下长期保存的细胞仓库。该细胞仓库通过低温冻存的方式，实现脂肪干细胞的长时间存储。构建完备的细胞种子库可以为临床细胞治疗或者相应的研究应用提供良好和充足的细胞来源。
[0084] 在一些实施例中，可以应用本发明实施提供的脂肪干细胞提取方法，为用户个人构建相应的自体细胞库。通过从用户个体中取出相应的脂肪组织样本，并提取脂肪干细胞进行低温存储，构建自体库。
[0085] 以下详细描述在消化完成后，对于已消化脂肪细胞的连续传代培养过程(步骤160)：
[0086] 1)调节细胞密度：将采集获得已消化脂肪细胞使用DPBS混匀后后离心弃上清。并使用脂肪间充质干细胞完全培养基重悬所述已消化脂肪细胞，经过40μm细胞过滤器过滤后，细胞计数以调整细胞密度至2×104/cm2。
[0087] 2)原代接种培养：将已接种后的培养瓶(规格为75cm2)放置在37℃，5％二氧化碳以及饱和湿度的培养箱中静置培养。
[0088] 在培养2－3天，细胞融合度达到70－80％时，倾倒培养瓶内的培养基，并向培养瓶加入20mL生理盐水洗涤2－3次。在洗涤后，向培养瓶加入3mL胰蛋白酶消化液，消化静置3分钟后，加入生理盐水终止消化。最后，收集细胞悬液并转入50ml离心管中。放入离心机中离心，弃上清后得到脂肪间充质干细胞，记为细胞代次P0。
[0089] 3)传代培养：将P0代细胞按照2×104/cm2接种在培养瓶(规格为75cm2)，放置于37℃，5％二氧化碳以及饱和湿度的培养箱中静置培养。
[0090] 弃去培养瓶中的培养基并加入生理盐水润洗两遍。然后，向每个培养瓶中加入3ml胰蛋白酶消化，使瓶底细胞都浸没在消化液中。
[0091] 消化2－3min，在倒置
显微镜下观察，待原贴壁细胞逐渐趋于圆形脱落后，向每个瓶中加入15ml生理盐水终止消化。
[0092] 最后，将细胞培养瓶用10ml生理盐水润洗2遍，一并将细胞悬液于1200rpm，离心5min，收集细胞并记为细胞代次P1。
[0093] 在一些实施例中，由于本发明实施例提供的脂肪干细胞提取方法最终应用于细胞种子库的构建。因此，在进行细胞检测时，所述方法还包括如下步骤：
[0094] 首先，将P1代细胞按照细胞密度为1×107/ml，每支1ml的容量，分装至若干至冻存管内。然后，向所述冻存管加入冻存液。最后，依照预定的降温程序，降低所述冻存管至目标温度后，将所述冻存管放置到暂存罐内。该暂存罐可以是液氮罐或者其他合适的暂时性低温冻存设备。
[0095] 通过设置该步骤，在脂肪干细胞进行传代培养后，可以取样部分P1代进行相应的细胞检测(包括无菌检验、支原体检验以及内毒素检验等)的同时将细胞进行细胞冻存。当细胞检测及格以后，便可以将相应批次的细胞的冻存管移入正式的，可长期保存的细胞种子库内，实现脂肪干细胞的长期保存。
[0096] 通过额外设置的检测和低温冻存步骤，可以保证移入细胞种子库内的脂肪干细胞具有足够的安全性，确保脂肪干细胞在临床使用过程中的安全。
[0097] 可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的
权利要求的保护范围。
