首页 / 专利库 / 作物管理 / 环境胁迫 / 生物逆境 / 用于植物中转基因表达的方法和组合物

用于植物中转基因表达的方法和组合物

阅读：47发布：2020-11-04

专利汇可以提供用于植物中转基因表达的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了用于在包括玉米的单子叶 植物 中表达转基因的方法和组合物。在本 发明 中,利用薏苡属植物的单子叶植物部分同源序列进行转化来避免基因沉默。这些转基因序列包括薏苡启动子、增强子、编码序列和终止子。玉米衍生转基因的合适的代替物对于在玉米中表达是希望的,因为基于同源性的基因沉默能限制或有效消除转基因表达。，下面是用于植物中转基因表达的方法和组合物专利的具体信息内容。

1．一种制备表达所选基因的非薏苡的单子叶植物的方法，包括下列 步骤：
(a)提供一种选择的基因；
(b)制备含有与薏苡启动子有效连接的该基因的构建体；
(c)用该构建体转化非薏苡的单子叶植物的受体细胞；和
(d)由该受体细胞再生表达该基因的单子叶植物。
2．权利要求1的方法，其中所述单子叶植物是选自稻、小麦、燕麦、 大麦、黑麦、高粱和玉米的植物。
3．权利要求2的方法，其中单子叶植物是玉米。
4．权利要求1的方法，其中转化步骤包括微粒轰击、PEG介导的原 生质体转化、电穿孔、碳化硅纤维介导的转化或农杆菌介导的转化。
5．权利要求4的方法，其中微粒轰击包括用含有所述构建体的DNA 包被微粒，和使所述受体细胞接触微粒。
6．权利要求1的方法，其中所选的基因包括一种选自下列的基因： 昆虫抗性基因、真菌病害抗性基因、病毒病害抗性基因、细菌病害抗性 基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或质量的基因、营养利用基因、 真菌毒素减少基因、雄性不育基因、选择性标记基因、可筛选标记基因、 负选择标记基因、影响植物农学特性的基因和环境或逆境抗性基因。
7．权利要求1的方法，其中所述薏苡启动子是一种来源于薏苡基因 的启动子，该基因与选自下列的基因同源：γ玉米醇溶蛋白、油质蛋白 ole16、球蛋白1、肌动蛋白1、肌动蛋白c1、蔗糖合成酶、INOPS、EMB5、 球蛋白2、b-32、ADPG-焦磷酸化酶、Ltp1、Ltp2、油质蛋白ole17、油 质蛋白ole18、肌动蛋白2、花粉特异蛋白、花粉特异果胶酸裂合酶、花 药特异蛋白、花药特异基因RTS2、花粉特异基因、绒毡层特异基因、绒 毡层特异基因RAB24、邻氨基苯甲酸合酶α亚基、α玉米醇溶蛋白、邻氨 基苯甲酸合酶β亚基、二氢吡啶二羧酸合酶、Thi1、醇脱氢酶、cab结合 蛋白、H3C4、RUBISCO SS淀粉分支酶、ACC酶、肌动蛋白3、肌动 蛋白7、调节蛋白GF14-12、核糖体蛋白L9、纤维素生物合成酶、S-腺 苷-L-高半胱氨酸水解酶、超氧化物歧化酶、C-激酶受体、磷酸甘油酸变 位酶、根特异的RCc3 mRNA、葡萄糖-6磷酸异构酶、焦磷酸-果糖6-磷 酸1磷酸转移酶、遍在蛋白、β-酮脂酰-ACP合酶、33kDa光合系统Ⅱ、 释氧蛋白、69kDa液泡ATP酶亚基、金属硫蛋白样蛋白质、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样蛋白、苯丙氨酸氨裂合酶、腺苷三磷酸酶、 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、α-微管蛋白、cab、PEPC酶、R、凝集素、 集光复合体、热休克蛋白、查耳酮合酶、玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、ABA、 生长素结合蛋白、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因、MPI、肌动蛋白、 不透明2号、b70和油质蛋白。
8．权利要求1的方法，其中所述薏苡启动子是γ薏苡醇溶蛋白启动子。
9．一种产生后代的方法，其包括下列步骤：
(a)根据权利要求1的方法制备单子叶植物；和
(b)使该植物与第二种植物或与其本身杂交。
10．一种植物培育方法，其包括下列步骤：
(a)根据权利要求9的方法获得一种后代植物；和
(b)使该植物与其本身或与第二种植物杂交。
11．一种防止非薏苡的单子叶植物中基因沉默的方法，其包括下列步 骤：
(a)提供一种薏苡启动子；
(b)制备包含与所选基因有效连接的该薏苡启动子的构建体；
(c)用该构建体转化来自非薏苡的单子叶植物的受体细胞；
(d)由该受体细胞再生表达该基因的植物，由此该植物不显示基因 沉默。
12．权利要求11的方法，其中单子叶植物选自稻、小麦、大麦、黑 麦、燕麦、高粱和玉米。
13．权利要求12的方法，其中单子叶植物是玉米。
14．权利要求11的方法，其中转化步骤包括微粒轰击、PEG介导的 原生质体转化、电穿孔、碳化硅纤维介导的转化或农杆菌介导的转化。
15．权利要求14的方法，其中微粒轰击包括用含有所述构建体的DNA 包被微粒，和使所述受体细胞接触微粒。
16．权利要求11的方法，其中所选的基因是昆虫抗性基因、真菌病 害抗性基因、病毒病害抗性基因、细菌病害抗性基因、除草剂抗性基因、 影响谷粒组成或质量的基因、营养利用基因、真菌毒素减少基因、雄性 不育基因、选择性标记基因、可筛选标记基因、负选择标记基因、影响 植物农学特性的基因、或环境或逆境抗性基因。
17．权利要求11的方法，其中所述薏苡启动子是一种来源于薏苡基 因的启动子，该基因与选自下列的非薏苡单子叶植物的基因同源：γ玉米 醇溶蛋白、油质蛋白ole16、球蛋白1、肌动蛋白1、肌动蛋白c1、蔗糖 合成酶、INOPS、EMB5、球蛋白2、b-32、ADPG-焦磷酸化酶、Ltp1、 Ltp2、油质蛋白ole17、油质蛋白ole18、肌动蛋白2、花粉特异蛋白、花 粉特异果胶酸裂合酶、花药特异蛋白、花药特异基因RTS2、花粉特异基 因、绒毡层特异基因、绒毡层特异基因RAB24、邻氨基苯甲酸合酶α亚 基、α玉米醇溶蛋白、邻氨基苯甲酸合酶β亚基、二氢吡啶二羧酸合酶、 Thi1、醇脱氢酶、cab结合蛋白、H3C4、RUBISCO SS淀粉分支酶、ACC 酶、肌动蛋白3、肌动蛋白7、调节蛋白GF14-12、核糖体蛋白L9、纤 维素生物合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、超氧化物歧化酶、C-激 酶受体、磷酸甘油酸变位酶、根特异的RCc3 mRNA、葡萄糖-6磷酸异 构酶、焦磷酸-果糖6-磷酸1磷酸转移酶、遍在蛋白、β-酮脂酰-ACP合 酶、33kDa光合系统Ⅱ、释氧蛋白、69kDa液泡ATP酶亚基、金属硫蛋 白样蛋白质、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样蛋白、苯丙氨酸 氨裂合酶、腺苷三磷酸酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、α-微管蛋白、cab、 PEPC酶、R、凝集素、集光复合体、热休克蛋白、查耳酮合酶、玉米醇 溶蛋白、球蛋白-1、ABA、生长素结合蛋白、UDP葡萄糖类黄酮糖基转 移酶基因、MPI、肌动蛋白、不透明2号、b70和油质蛋白。
18．权利要求17的方法，其中产生步骤包括非薏苡的单子叶植物种 基因的DNA或其侧翼序列与来自薏苡的DNA杂交。
19．权利要求18的方法，其中非薏苡的单子叶植物种和非薏苡的单 子叶植物是相同种的成员。
20．权利要求18的方法，其中所述薏苡DNA包括基因组DNA克隆 的文库。
21．权利要求11的方法，其中产生薏苡启动子的步骤包括PCRTM。
22．一种产生后代的方法，其包括下列步骤：
(a)根据权利要求11的方法制备一种植物；和
(b)使该植物与第二种植物或与其本身杂交。
23．一种植物培育方法，其包括下列步骤：
(a)根据权利要求22的方法获得一种后代植物，其中该后代植物含 有该构建体；和
(b)使该植物与其本身或与第二种植物杂交。
24．一种制备单子叶植物表达载体的方法，其包括：
(a)鉴定来源于非薏苡单子叶植物、具有希望表达特征的第一种启 动子；
(b)分离与所述第一种启动子同源的薏苡启动子；和
(c)构建包含与所选基因有效连接的该薏苡启动子的表达载体。
25．权利要求24的方法，其中单子叶植物选自稻、小麦、大麦、黑 麦、高粱、燕麦和玉米。
26．权利要求25的方法，其中单子叶植物是玉米。
27．权利要求24的方法，其中所选的基因编码一种性状，其选自： 昆虫抗性基因、真菌病害抗性基因、病毒病害抗性基因、细菌病害抗性 基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或质量的基因、营养利用基因、 真菌毒素减少基因、雄性不育基因、选择性标记基因、可筛选标记基因、 负选择性标记、影响植物农学特性的基因和环境或逆境抗性基因。
28．权利要求24的方法，其中所述单子叶植物启动子来源于选自下 列的基因：γ玉米醇溶蛋白、油质蛋白ole16、球蛋白1、肌动蛋白1、肌 动蛋白c1、蔗糖合成酶、INOPS、EMB5、球蛋白2、b-32、ADPG-焦 磷酸化酶、Ltp1、Ltp2、油质蛋白ole17、油质蛋白ole18、肌动蛋白2、 花粉特异蛋白、花粉特异果胶酸裂合酶、花药特异蛋白、花药特异基因 RTS2、花粉特异基因、绒毡层特异基因、绒毡层特异基因RAB24、邻氨 基苯甲酸合酶α亚基、α玉米醇溶蛋白、邻氨基苯甲酸合酶β亚基、二氢吡 啶二羧酸合酶、Thi1、醇脱氢酶、cab结合蛋白、H3C4、RUBISCO SS 淀粉分支酶、ACC酶、肌动蛋白3、肌动蛋白7、调节蛋白GF14-12、 核糖体蛋白L9、纤维素生物合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、超氧 化物歧化酶、C-激酶受体、磷酸甘油酸变位酶、根特异的RCc3 mRNA、 葡萄糖-6磷酸异构酶、焦磷酸-果糖6-磷酸1磷酸转移酶、遍在蛋白、β- 酮脂酰-ACP合酶、33kDa光合系统Ⅱ、释氧蛋白、69kDa液泡ATP酶 亚基、金属硫蛋白样蛋白质、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样 蛋白、苯丙氨酸氨裂合酶、腺苷三磷酸酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、 α-微管蛋白、cab、PEPC酶、R、凝集素、集光复合体、热休克蛋白、 查耳酮合酶、玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、ABA、生长素结合蛋白、UDP 葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因、MPI、肌动蛋白、不透明2号、b70和油 质蛋白。
29．权利要求28的方法，其中鉴定步骤包括所述单子叶植物基因的 DNA或其侧翼序列与来自薏苡的DNA杂交。
30．权利要求29的方法，其中来自薏苡的DNA包含基因组DNA克 隆的文库。
31．权利要求28的方法，其中鉴定薏苡启动子的步骤包括PCRTM。
32．一种分离的γ薏苡醇溶蛋白启动子，其可分离自SEQ ID NO:8的 核酸序列。
33．一种分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:8的从约80到约894 的邻接核苷酸。
34．权利要求33的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:8的从约222 到约894的邻接核苷酸。
35．权利要求34的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:18的核酸 序列。
36．权利要求35的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:8的核酸序 列中从约412到约894的邻接核苷酸。
37．权利要求36的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:19的核酸 序列。
38．一种分离的γ薏苡醇溶蛋白终止子，其可从SEQ ID NO:11的核 酸序列分离。
39．一种核酸序列，其包含SEQ ID NO:11的核酸序列中从约80到 约412的邻接核苷酸。
40．权利要求39的核酸序列，其包含SEQ ID NO:11的核酸序列中 从约200到约412的邻接核苷酸。
41．权利要求40的核酸序列，其包含SEQ ID NO:11的核酸序列中 从约325到约412的邻接核苷酸。
42．权利要求41的核酸序列，其包含SEQ ID NO:11的核酸序列。
43．一种可从SEQ ID NO:17的核酸序列分离的薏苡油质蛋白3终止 子。
44．一种分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:17的核酸序列中从约 50到约377的邻接核苷酸。
45．权利要求44的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:17的核酸 序列中从约120到约377的邻接核苷酸。
46．权利要求45的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:17的核酸 序列中从约220到约377的邻接核苷酸。
47．权利要求46的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:17的核酸 序列中从约300到约377的邻接核苷酸。
48．权利要求47的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:17的核酸 序列。
49．一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所选的DNA含有γ薏 苡醇溶蛋白启动子。
50．权利要求49的植物，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列： 权利要求32的核酸序列、权利要求33的核酸序列、权利要求34的核酸 序列、权利要求35的核酸序列和权利要求36的核酸序列。
51．权利要求50的植物，其中所述启动子与选自下列的外源基因有 效连接：昆虫抗性基因、病害抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组 成或质量的基因、营养利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、 选择性标记基因、可筛选标记基因、负选择性标记、影响植物农学特性 的基因和环境或逆境抗性基因。
52．一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所选的DNA含有编 码γ薏苡醇溶蛋白的基因，该基因与对于该γ薏苡醇溶蛋白基因不是天然的 启动子有效连接。
53．权利要求52的能育的转基因植物，编码γ薏苡醇溶蛋白的所述基 因编码SEQ ID NO:16的核酸序列所编码的多肽。
54．一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所选的DNA含有γ薏 苡醇溶蛋白终止子。
55．权利要求54的能育的转基因植物，其中所述γ薏苡醇溶蛋白终止 子包含选自下列的核酸序列：权利要求39的核酸序列、权利要求40的 核酸序列、权利要求41的核酸序列和权利要求42的核酸序列。
56．一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所选的DNA含有薏 苡油质蛋白3终止子。
57．权利要求56的能育的转基因植物，其中所述薏苡油质蛋白3终 止子包含选自下列的核酸序列：权利要求44的核酸序列、权利要求45 的核酸序列、权利要求46的核酸序列、权利要求47的核酸序列和权利 要求48的核酸序列。
58．权利要求49、52、54或56的植物的任一代后代植物，其中该后 代植物含有所选的DNA。
59．权利要求49、52、54或56的能育的转基因植物，其中该植物是 选自稻、小麦、大麦、黑麦、高粱和玉米的单子叶植物。
60．权利要求59的能育的转基因植物，其中单子叶植物是玉米。
61．权利要求49、52、54或56的能育的转基因植物，其中该植物是 选自烟草、番茄、马铃薯、大豆和棉花的双子叶植物。
62．一种植物培育方法，包括使权利要求49、52、54或56的能育转 基因植物或其转基因后代与其本身或第二种植物杂交。
63．一种编码薏苡基因的分离的核酸序列，该基因选自：油质蛋白 ole16、球蛋白1、肌动蛋白1、肌动蛋白c1、蔗糖合成酶、INOPS、EMB5、 球蛋白2、b-32、ADPG-焦磷酸化酶、Ltp1、Ltp2、油质蛋白ole17、油 质蛋白ole18、肌动蛋白2、花粉特异蛋白、花粉特异果胶酸裂合酶、花 药特异蛋白、花药特异基因RTS2、花粉特异基因、绒毡层特异基因、绒 毡层特异基因RAB24、邻氨基苯甲酸合酶α亚基、α玉米醇溶蛋白、邻氨 基苯甲酸合酶β亚基、二氢吡啶二羧酸合酶、Thi1、醇脱氢酶、cab结合 蛋白、H3C4、RUBISCO SS淀粉分支酶、ACC酶、肌动蛋白3、肌动 蛋白7、调节蛋白GF14-12、核糖体蛋白L9、纤维素生物合成酶、S-腺 苷-L-高半胱氨酸水解酶、超氧化物歧化酶、C-激酶受体、磷酸甘油酸变 位酶、根特异的RCc3 mRNA、葡萄糖-6磷酸异构酶、焦磷酸-果糖6-磷 酸1磷酸转移酶、遍在蛋白、β-酮脂酰-ACP合酶、33kDa光合系统Ⅱ、 释氧蛋白、69kDa液泡ATP酶亚基、金属硫蛋白样蛋白质、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样蛋白、苯丙氨酸氨裂合酶、腺苷三磷酸酶、 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、α-微管蛋白、cab、PEPC酶、R、凝集素、 集光复合体、热休克蛋白、查耳酮合酶、玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、ABA、 生长素结合蛋白、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因、MPI、油质蛋白、 肌动蛋白、不透明2号和b70。

说明书全文

1．发明领域

本发明广泛地涉及转基因植物。更具体而言，它涉及在植物中表达转 基因的方法和组合物。

2．相关技术描述

分子生物学的最新进展大大提高了科学家们操作动物和植物种质的能 力。控制特殊表型如导致昆虫、抗生素和除草剂抗性的特定多肽的基因， 已被定位于特定的种质内，并已从中分离。更重要的是获得从一种生物 分离的基因和将其引入另一种生物的能力。这种转化甚至可在受体生物 与提供基因的生物为不同门、属或种时进行(异源转化)。

已经尝试通过用多种基因工程技术引入外源基因而将希望的性状遗传 构造入植物基因组中。已通过包括农杆菌(Agrobacterium)感染(Nester 等人，1984)、聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取(Lorz等人，1985)、 原生质体电穿孔(Fromm等人，1986)和微粒轰击(Klein等人，1987) 的方法实现了受体植物细胞对新DNA的摄取。

 上述一些技术使植物的转化几乎成为常规，但外源DNA的表达却更 加困难。所遇到的最严重的问题之一是被称为“共抑制”的现象。该术 语用来描述引入同源转基因后内源基因表达的抑制(Jorgensen,1990)， 第一次是用来描述矮牵牛属(Petunia)中的查耳酮合酶(CHS)基因(Napoli 等人，1990；Van der Krol等人，1990)。共抑制不是CHS独有的，反 而似乎是影响转基因植物的普遍现象。共抑制的程度随个体转化子而不 同，但在某些植物中，其可为对于有关基因座产生无表型的程度。

多种转基因植物系统显示依赖同源性的“基因沉默”的现象，这可能 涉及多拷贝的至少部分同源的转基因或一种转基因和同源内源序列 (Jorgensen,1995；Matzke和Matzke,1995；Meyer,1995)。区别沉 默的不同情况的最基本机理特征是，观察到的失活是发生在转录水平还 是发生在转录后水平，这又取决于相互作用序列之间的同源区。转录沉 默主要是由于启动子同源性而发生(Neuhuber等人，1994)。

依赖启动子同源性的基因沉默干扰转录，有时引起副突变，导致基因 表达的遗传性改变和/或在转基因分离后仍持续的DNA修饰(Lindbo等 人，1993；Jorgensen,1995；Matzke和Matzke,1995；Park等人，1996)。 对这些基因表达改变的原因仍缺乏了解，但已知沉默受同源性的长度和 相互作用序列位置的影响。

对于胭脂氨酸合酶启动子，发现一个300bp的同源区足以介导烟草中 的共抑制(Matzke等人，1993)。也已发现，被称为H2的内源序列，它 与胭脂氨酸合酶启动子同源，是胭脂氨酸合酶启动子引导的基因的强沉 默子(Matzke等人，1993；Matzke等人，1994)。据认为这包括胭脂氨 酸合酶启动子拷贝在沉默和靶基因座处的配对，随后使靶拷贝上的甲基 化达到类似于与沉默子自身获得的程度(Matzke等人，1994)。共抑制 的最有效的实例是一种烟草系，其带有含有两种分别由CaMV 19S和35S 启动子引导的基因的转基因插入片段。与两种启动子连接的基因都被抑 制，该基因座反式灭活具有至少90bp共同同源性的新引入的构建体 (Vaucheret,1993)。

转录沉默对于农业生物技术专家是特别麻烦的，因为许多最适用于特 定转基因表达的启动子对于宿主基因组是天然的。这对于最重要的农业 作物之一一玉米尤其如此。具有希望的表达特征的几种玉米启动子的实 例包括近组成型玉米启动子如Adh和蔗糖合酶基因的启动子(Walker等 人，1987；Yang和Russell,1990)、组织特异启动子如玉米醇溶蛋白和 集光复合体启动子(Conkling等人，1990；Simpson,1986)和诱导型 启动子如玉米热休克蛋白启动子(Odell等人，1985)。

因此，本领域中十分需要用于植物尤其是农业上重要的单子叶植物(如 玉米)中内源基因表达的改进方法。特别需要可使科学家探索单子叶植 物启动子的希望的特性而可避免与同源序列共抑制有关的问题的方法。 现有的技术在这方面受限于缺乏对于农业上重要的单子叶植物种天然启 动子的适当的启动子代替物。

发明概述

因此，本发明一方面提供一种在单子叶植物中表达基因的方法，其包 括下列步骤：(a)提供一种选择的基因；(b)制备含有与薏苡(Coix) 启动子有效连接的该基因的构建体；(c)用该构建体转化受体单子叶植 物细胞；和(d)再生表达该基因的单子叶植物。在本发明的具体实施方 案中，单子叶植物是选自稻、小麦、大麦、黑麦、高粱和玉米的植物。 转化步骤可包括能稳定转化植物的任何方法，例如，微粒轰击、PEG介 导的原生质体转化、电穿孔、碳化硅纤维介导的转化或农杆菌介导的转 化。在本发明的一个优选实施方案中，转化步骤包括微粒轰击，方法是 用含有构建体的DNA包被微粒，使受体细胞接触微粒。

基因可能是希望在转基因植物中表达的任何基因，包括昆虫抗性基 因、病害抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或质量的基因、营 养利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、选择性标记基因、可 筛选标记基因、负选择标记基因、影响植物农学特性的基因，和环境或 逆境抗性基因。在本发明的具体实施方案中，薏苡启动子是一种来源于 选自下列的基因的启动子：γ玉米醇溶蛋白、油质蛋白ole16、球蛋白1、 肌动蛋白1、肌动蛋白c1、蔗糖合成酶、INOPS、EMB5、球蛋白2、b- 32、ADPG-焦磷酸化酶、Ltp1、Ltp2、油质蛋白ole17、油质蛋白ole18、 肌动蛋白2、花粉特异蛋白、花粉特异果胶酸裂合酶、花药特异蛋白、花 药特异基因RTS2、花粉特异基因、绒毡层特异基因、绒毡层特异基因 RAB24、邻氨基苯甲酸合酶α亚基、α玉米醇溶蛋白、邻氨基苯甲酸合酶 β亚基、二氢吡啶二羧酸合酶、Thi1、醇脱氢酶、cab结合蛋白、H3C4、 RUBISCO SS淀粉分支酶、ACC酶、肌动蛋白3、肌动蛋白7、调节蛋 白GF14-12、核糖体蛋白L9、纤维素生物合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸 水解酶、超氧化物歧化酶、C-激酶受体、磷酸甘油酸变位酶、根特异的 RCc3 mRNA、葡萄糖-6磷酸异构酶、焦磷酸-果糖6-磷酸1磷酸转移酶、 遍在蛋白、β-酮脂酰-ACP合酶、33kDa光合系统Ⅱ、释氧蛋白(oxygen evolving protein)、69kDa液泡ATP酶亚基、金属硫蛋白样蛋白质、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样蛋白、苯丙氨酸氨裂合酶、腺苷 三磷酸酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、α-微管蛋白、cab、PEPC酶、 R、凝集素、集光复合体、热休克蛋白、查耳酮合酶、玉米醇溶蛋白、球 蛋白-1、生长素结合蛋白、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因、MPI、 油质蛋白、肌动蛋白、不透明2号和b70。在本发明的一个实施方案中， 薏苡启动子是γ薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子。

另一方面，本发明提供一种产生后代的方法，其包括下列步骤：(a) 按照上述方法制备单子叶植物；(b)使该植物与第二种植物或与其自身 杂交。

另一方面，本发明提供一种植物培育方法，其包括下列步骤：(a)获 得按照上述方法制备的单子叶植物的任一代后代植物，其中该后代植物 包含所述构建体；(b)使该植物与其自身或与第二种植物杂交。

另一方面，本发明提供一种防止单子叶植物中基因沉默的方法，其包 括下列步骤：(a)鉴定与该单子叶植物的启动子部分同源的薏苡启动子； (b)克隆该薏苡启动子；(c)制备包含与所选基因有效连接的该薏苡启 动子的构建体；(d)用该构建体转化该单子叶植物的受体细胞；(e)由 该受体细胞再生表达该基因的植物。单子叶植物可能是任何单子叶植物， 包括稻、小麦、大麦、黑麦、高粱和玉米。在本发明的一个实施方案中， 单子叶植物是玉米。

转化步骤可包括向植物基因组中引入DNA的任何适当方法，包括微 粒轰击、PEG介导的原生质体转化、电穿孔、碳化硅纤维介导的转化或 农杆菌介导的转化。在本发明的一个优选实施方案中，转化步骤包括微 粒轰击，实现方法是用含有所述构建体的DNA包被微粒并使受体细胞与 微粒接触。选择的基因可包括，例如，昆虫抗性基因、病害抗性基因(细 菌、病毒、真菌或线虫)、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或质量的基因、 营养利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、选择性标记基因、 可筛选标记基因、负选择性标记、影响植物农学特性的基因、或环境或 逆境抗性基因。在本发明的具体实施方案中，启动子来源于选自下列的 基因：γ玉米醇溶蛋白、油质蛋白ole16、球蛋白1、肌动蛋白1、蔗糖合 成酶、INOPS、EMB5、球蛋白2、b-32、ADPG-焦磷酸化酶、Ltp1、Ltp2、 油质蛋白ole17、油质蛋白ole18、肌动蛋白2、花粉特异蛋白、花粉特异 果胶酸裂合酶、花药特异蛋白、花药特异基因RTS2、花粉特异基因、绒 毡层特异基因、绒毡层特异基因RAB24、邻氨基苯甲酸合酶α亚基、α玉 米醇溶蛋白、邻氨基苯甲酸合酶β亚基、二氢吡啶二羧酸合酶、Thi1、醇 脱氢酶、cab结合蛋白、H3C4、RUBISCO SS淀粉分支酶、ACC酶、 肌动蛋白3、肌动蛋白7、调节蛋白GF14-12、核糖体蛋白L9、纤维素 生物合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、超氧化物歧化酶、C-激酶受 体、磷酸甘油酸变位酶、根特异的RCc3 mRNA、葡萄糖-6磷酸异构酶、 焦磷酸-果糖6-磷酸1磷酸转移酶、遍在蛋白、β-酮脂酰-ACP合酶、33kDa 光合系统Ⅱ、释氧蛋白、69kDa液泡ATP酶亚基、金属硫蛋白样蛋白质、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样蛋白、苯丙氨酸氨裂合酶、腺 苷三磷酸酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、α-微管蛋白、cab、PEPC酶、 R、凝集素、集光复合体、热休克蛋白、查耳酮合酶、玉米醇溶蛋白、球 蛋白-1、ABA、生长素结合蛋白、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因、 MPI、油质蛋白、肌动蛋白、不透明2号、b70和油质蛋白。

在本发明的具体实施方案中，鉴定步骤包括单子叶植物启动子的DNA 或其侧翼序列与薏苡的DNA杂交。薏苡的DNA可包含基因组DNA克 隆的文库。在本发明的其他实施方案中，鉴定薏苡启动子的步骤包括 PCRTM。

另一方面，本发明提供一种产生后代的方法，其包括下列步骤：(a) 按照上述方法制备单子叶植物；(b)使该植物与第二种植物或与其自身 杂交。

另一方面，本发明提供一种植物培育方法，其包括下列步骤：(a)获 得按照本发明的方法制备的单子叶植物的任一代后代植物，其中该后代 植物包含本发明的构建体；(b)使该植物与其自身或与第二种植物杂交。

另一方面，本发明提供一种制备玉米表达载体的方法，其包括下列步 骤：(a)鉴定具有希望的表达特征的单子叶植物启动子；(b)分离与该 玉米启动子部分同源的薏苡启动子；(c)构建包含与所选基因有效连接 的该薏苡启动子的构建体。在本发明的具体实施方案中，单子叶植物选 自稻、小麦、大麦、黑麦、高粱和玉米。在本发明的一个优选实施方案 中，单子叶植物是玉米。在本发明的另一个实施方案中，所选的基因编 码一种性状，其选自：昆虫抗性基因、病害抗性基因、除草剂抗性基因、 影响谷粒组成或质量的基因、营养利用基因、真菌毒素减少基因、雄性 不育基因、选择性标记基因、可筛选标记基因、负选择性标记、影响植 物农学特性的基因、和环境或逆境抗性基因。

在本发明的另一个实施方案中，单子叶植物启动子来源于选自下列的 基因：γ玉米醇溶蛋白、油质蛋白ole16、球蛋白1、肌动蛋白1、肌动蛋 白c1、蔗糖合成酶、INOPS、EMB5、球蛋白2、b-32、ADPG-焦磷酸 化酶、Ltp1、Ltp2、油质蛋白ole17、油质蛋白ole18、肌动蛋白2、花 粉特异蛋白、花粉特异果胶酸裂合酶、花药特异蛋白、花药特异基因 RTS2、花粉特异基因、绒毡层特异基因、绒毡层特异基因RAB24、邻氨 基苯甲酸合酶α亚基、α玉米醇溶蛋白、邻氨基苯甲酸合酶β亚基、二氢吡 啶二羧酸合酶、Thi1、醇脱氢酶、cab结合蛋白、H3C4、RUBISCO SS 淀粉分支酶、ACC酶、肌动蛋白3、肌动蛋白7、调节蛋白GF14-12、 核糖体蛋白L9、纤维素生物合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、超氧 化物歧化酶、C-激酶受体、磷酸甘油酸变位酶、根特异的RCc3 mRNA、 葡萄糖-6磷酸异构酶、焦磷酸-果糖6-磷酸1磷酸转移酶、遍在蛋白、β- 酮脂酰-ACP合酶、33kDa光合系统Ⅱ、释氧蛋白(oxygen evolving protein)、69kDa液泡ATP酶亚基、金属硫蛋白样蛋白质、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶、ABA-和成熟诱导样蛋白、苯丙氨酸氨裂合酶、腺苷三磷酸酶、 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、α-微管蛋白、cab、PEPC酶、R、凝集素、 集光复合体、热休克蛋白、查耳酮合酶、玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、ABA、 生长素结合蛋白、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因、MPI、油质蛋白、 肌动蛋白、不透明2号、b70和油质蛋白。

在本发明的一个实施方案中，鉴定步骤包括该单子叶植物基因的DNA 或其侧翼序列与薏苡的DNA杂交，从而薏苡的DNA可包含基因组DNA 克隆的文库。在本发明的另一个实施方案中，鉴定薏苡启动子的步骤包 括PCRTM。

本发明的另一方面提供分离的γ薏苡醇溶蛋白启动子，其可分离自SEQ ID NO:8的核酸序列。本发明还提供一种分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:8的从约80到约894的邻接核苷酸。在本发明的另一个实施方案中， 分离的核酸序列包含SEQ ID NO:8的从约222到约894的邻接核苷酸， 并可进一步包含SEQ ID NO:18的核酸序列。分离的核酸序列也可包含 SEQ ID NO:8的核酸序列中从约412到约894的邻接核苷酸，并可进一 步包含SEQ ID NO:19的核酸序列。

本发明的另一方面提供一种编码γ薏苡醇溶蛋白蛋白质或肽的分离的 DNA。在本发明的具体实施方案中，该DNA节段编码SEQ ID NO:16 所编码的多肽。该DNA节段也可包含SEQ ID NO:16的核酸序列中约100 到约603或约350到约603的邻接核苷酸，或可包含SEQ ID NO:16的 核酸序列。

本发明的另一方面提供一种分离的γ薏苡醇溶蛋白终止子，其可从SEQ ID NO:11的核酸序列分离。γ薏苡醇溶蛋白终止子也可包含SEQ ID NO:11 的核酸序列中从约80到约412的邻接核苷酸。在本发明的其他实施方案 中，该终止子可包含SEQ ID NO:11的核酸序列中从约200到约412或 从约325到约412的邻接核苷酸。该终止子也可包含SEQ ID NO:11的 核酸序列。

本发明的另一方面提供一种薏苡油质蛋白3终止子，其可从SEQ ID NO:17的核酸序列分离。本发明也提供一种分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO:17的核酸序列中从约50到约377、约120到约377、约220到约 377或约300到约377的邻接核苷酸。在本发明的一个实施方案中，该核 酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列。

本发明的另一方面提供一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所 选的DNA含有γ薏苡醇溶蛋白启动子。在本发明的具体实施方案中，γ薏 苡醇溶蛋白启动子可从SEQ ID NO:8的核酸序列分离。在本发明的其他 实施方案中，该启动子包含一种分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO:8 的约80到约894、约222到约894或约412到约894的邻接核苷酸。在 本发明的其他实施方案中，该启动子包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18 或SEQ ID NO:19的核酸序列。该启动子可与潜在的任何外源基因有效 连接，包括昆虫抗性基因、病害抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷粒 组成或质量的基因、营养利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、 选择性标记基因、可筛选标记基因、负选择性标记、影响植物农学特性 的基因、和环境或逆境抗性基因。

本发明的另一方面提供一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所 选的DNA含有编码γ薏苡醇溶蛋白的基因。在本发明的具体实施方案中， 编码γ薏苡醇溶蛋白的基因编码SEQ ID NO:16所编码的多肽。在本发明 的其他实施方案中，编码γ薏苡醇溶蛋白的基因包含SEQ ID NO:16的核 酸序列中从约100到约603或约350到约603的邻接核苷酸。在本发明 的其他实施方案中，编码γ薏苡醇溶蛋白的基因包含SEQ ID NO:16的核 酸序列。

本发明的另一方面提供一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所 选的DNA含有γ薏苡醇溶蛋白终止子。在本发明的具体实施方案中，γ薏 苡醇溶蛋白终止子可从SEQ ID NO:11的核酸序列中分离。在本发明的 其他实施方案中，γ薏苡醇溶蛋白终止子包含一种核酸序列，其含有SEQ ID NO:11的核酸序列中从约80到约412、约200到约412或约325到约 412的邻接核苷酸。在本发明的其他实施方案中，γ薏苡醇溶蛋白终止子 包含SEQ ID NO:11的核酸序列。

本发明的另一方面提供一种含有所选DNA的能育的转基因植物，所 选的DNA含有薏苡油质蛋白3终止子。在本发明的具体实施方案中，薏 苡油质蛋白3终止子可从SEQ ID NO:17的核酸序列中分离。在本发明 的另一个实施方案中，该终止子包含SEQ ID NO:17的核酸序列中从约 50到约377、约120到约377、约220到约377或约300到约377的邻 接核苷酸。在本发明的一个实施方案中，该终止子包含SEQ ID NO:17 的核酸序列。

本发明的另一方面提供上述任何植物的任一代后代植物，其中该植物 含有所选的DNA。在本发明的具体实施方案中，该植物是选自稻、小麦、 大麦、黑麦、高粱和玉米的单子叶植物。在本发明的一个实施方案中， 该单子叶植物是玉米。在本发明的另一个实施方案中，植物是选自烟草、 番茄、马铃薯、大豆和棉花的双子叶植物。

本发明的另一方面提供一种植物培育方法，包括使本发明的能育转基 因植物或遗传了本发明的外源DNA的转基因后代与其本身或与第二种植 物杂交。

附图简述

下列附图为本说明书的一部分，用来进一步证明本发明的某些方面。 参照一个或多个这些附图，结合此处具体实施方案的详细描述，可更好 地理解本发明。

图1：质粒pDPG844的图谱。该质粒含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 894bp启动子(SEQ ID NO:8)、GUS报道基因的编码序列和nos终止子 组成的表达盒。

图2：质粒pDPG845的图谱。该构建体含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 894bp启动子(SEQ ID NO:8)、稻肌动蛋白1内含子1、GUS报道基因 的编码序列和nos终止子组成的表达盒。

图3：质粒pDPG846的图谱。该质粒含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 412bp启动子(SEQ ID NO:19)、稻肌动蛋白1内含子1、GUS报道基 因的编码序列和nos终止子组成的表达盒。

图4：质粒pDPG847的图谱。该质粒含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 412bp启动子(SEQ ID NO:19)、GUS报道基因的编码序列(GUS)和 nos终止子组成的表达盒。

图5：质粒pDPG848的图谱。该质粒含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 222bp启动子(SEQ ID NO:18)、稻肌动蛋白1内含子、GUS报道基因 和nos终止子组成的表达盒。

图6：质粒pDPG849的图谱。该质粒含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 222bp启动子(SEQ ID NO:18)、报道基因的编码序列(GUS)和nos 终止子组成的表达盒。

图7：质粒pDPG869的图谱。该构建体含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 894bp启动子(SEQ ID NO:8)、稻肌动蛋白1内含子1、γ薏苡醇溶蛋白 基因的编码序列(SEQ ID NO:16)和γ薏苡醇溶蛋白终止子(SEQ ID NO:11)组成的表达盒。

图8：玉米、高粱与薏苡的γ谷醇溶蛋白编码基因启动子区的序列对 比。三种序列中相同的核苷酸以阴影标出。玉米、薏苡和高粱启动子序 列分别表示为γ玉米醇溶蛋白(SEQ ID NO:23)、γ薏苡醇溶蛋白(SEQ ID NO:8)和γ高粱醇溶蛋白(SEQ ID NO:22)。

图9：质粒pDPG851的图谱。该构建体含有由γ薏苡醇溶蛋白基因的 894bp启动子(SEQ ID NO:8)、稻肌动蛋白1内含子1、γ薏苡醇溶蛋白 基因的编码序列(SEQ ID NO:16)和nos终止子组成的表达盒。

图10：质粒pDPG862的图谱。该构建体含有由γ薏苡醇溶蛋白基因 的894bp启动子(SEQ ID NO:8)、稻肌动蛋白1内含子1、γ薏苡醇溶蛋 白基因的编码序列(SEQ ID NO:16)和nos终止子组成的表达盒。

图11：质粒pDV108的图谱。该构建体含有γ薏苡醇溶蛋白终止子(SEQ ID NO:11)。

发明详述

本发明通过提供可消除或降低基因沉默的转基因表达方法，克服了现 有技术的缺陷。本发明的意义在于它提供了用于在单子叶植物中表达外 源基因的启动子，其具有与宿主基因组相似的表达特征，但序列不相似 的程度足以限制基因沉默。在本发明的具体实施方案中，本发明提供的 启动子来源于薏苡属。来源于薏苡属的启动子特别适用于玉米，以及其 他单子叶植物，如小麦、稻、大麦、黑麦、高粱和甘蔗，以及双子叶植 物种。

基因沉默现象，也被称为共抑制、有义抑制和有义共抑制，是引入具 有天然同源拷贝的序列后基因表达的降低或消除(Napoli等人，1990；Van der Krol等人，1990)。基因沉默能在转基因的调节区和/或编码区起作用， 并且常常与沉默区的甲基化有关。在农业生物技术领域，调节区的沉默 特别成问题，因为许多内源启动子具有特别适用于转基因表达的特性。

发明者特别构思，本发明的应用除启动子外可扩展到包含薏苡元件的 表达载体的产生。特别构思，可通过在非薏苡的单子叶植物中表达的转 基因中使用薏苡序列，避免基因沉默以及与转基因元件和天然序列之间 的同源性有关的其他问题。例如，与玉米基因部分同源的编码区能在玉 米中有效表达，而天然玉米基因将沉默。也认为薏苡的增强子元件和终 止子是特别有用的。 Ⅰ．本发明使用的启动子

本发明包括薏苡属的启动子的使用，用于外源基因在单子叶植物如玉 米中的表达。这些启动子可从薏苡中从头分离，或者另外也可根据遗传 信息从已知的单子叶植物启动子中分离。发明者构思的特别有效的薏苡 启动子鉴定方法包括，使用由玉米基因或启动子衍生的引物或探针从薏 苡中分离部分同源序列。 (ⅰ)典型启动子

有用的启动子包括如述(Poszkowski等人，1989；Odell等人，1985) 的诱导型、病毒、合成、组成型启动子、时间调节、空间调节和时间空 间调节的启动子(Chau等人，1989)。对其向编码区引导转化植物细胞 或转基因植物的转录活性的能力选择启动子。被认为特别适用于分离薏 苡启动子的玉米序列的一些实例包括：Adh(Walker等人，1987；Paul 和Ferl,1991；Genbank保藏号S45022)、蔗糖合酶(Yang和Russell, 1990)、cab(Sullivan等人，1989,Genbank保藏号X14794)、PEPC 酶(Hudspeth和Grula,1989；Yanagisawa和Izui,1989,Genbank 保藏号X14579、X14581、X14580)和R基因复合体相关基因(Chandler 等人，1989；Consonni等人，1993,Genbank保藏号X67619；Radicella 等人，1991,Genbank保藏号X57276、S48027)。其他单子叶植物的序 列，例如稻肌动蛋白启动子(Genbank保藏号S44221)，也是有用的。

用于分离组织特异性启动子的典型基因是玉米蔗糖合成酶1(Yang 等人，1990)、玉米醇脱氢酶1(Vogel等人，1989；Dennis等人，1984, Genbank保藏号X04049、X00581)；玉米集光复合体(Simpson,1986； Bansal等人，1992,Genbank保藏号M87020)、玉米热休克蛋白(Odell 等人，1985；Rochester等人，1986,Genbank保藏号X03714)、玉米 醇溶蛋白(Reina等人，1990,Genbank保藏号X53514；Kriz等人，1987, Genbank保藏号X05911；Wandelt和Feix,1989；Genbank保藏号 X14334；Langridge和Feix,1983,Genbank保藏号K00543；Reina等 人，1990,Genbank保藏号X53515)、球蛋白-1(Belanger和Kriz等人， 1991；Genbank保藏号L22344、L22295)和查耳酮合酶基因(Franken 等人，1991；Genbank保藏号X60204)。

其他类似的已知玉米序列包括根细胞启动子(Conkling等人，1990) 和组织特异性增强子(Fromm等人，1989)。诱导型启动子的实例包括 ABA-和膨胀诱导型启动子和生长素结合蛋白基因的启动子(Scwob等人， 1993；Genbank保藏号L08425)。可用来分离异源启动子的其他已知的 玉米序列包括，UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因(Ralston等人，1988； Genbank保藏号X07940、Y00616)、MPI蛋白酶抑制剂基因(Cordero 等人，1994；Genbank保藏号X78988)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因 (Genbank保藏号U45859；Kohler等人，1995,Genbank保藏号L40803； Quigley等人，1989,Genbank保藏号X15408；Martinez等人，1989, Genbank保藏号X15596)，以及叶绿体基因(Genbank保藏号X86563)。

下面在表1中列出了发明者特别期望的、用于分离薏苡序列以在玉米 和其他单子叶植物中表达的典型遗传元件。如下所述，发明者已将许多 这类元件用于表达载体的制备。

表1：用于分离薏苡遗传元件的典型序列 基因 生物 Genbank保藏号 薏苡Genbank保藏号 γ玉米醇溶蛋白a,c,d 玉米 M16218  X59850 油质蛋白ole16a 玉米 U13701 球蛋白1a 玉米 X59083 肌动蛋白rac1a,b 稻 X15865 蔗糖合成酶b 玉米 X02382 INOPS 玉米 AF056326 EMB5 玉米 M90554 球蛋白2 玉米 X53715 ADPG-焦磷酸化酶 玉米 M81603 b-32a 玉米 X07987 Ltp1 大麦 X60292 Ltp2 大麦 X57270 油质蛋白ole17 玉米 U13702 油质蛋白ole18 玉米 J05212 肌动蛋白rac2 稻 X15864 花粉特异蛋白 玉米 S44171 花粉特异果胶酸裂合酶 玉米 L20140 花药特异蛋白 稻 D21159 花药特异基因RTS2 稻 U12171 花粉特异基因 稻 Z16402 花粉特异基因 稻 U31771 绒毡层特异基因 稻 D21159 绒毡层特异基因 稻 D21160 RAB24 稻 D63917 α玉米醇溶蛋白a 玉米 X05911  X63113 邻氨基苯甲酸合酶(α亚基)a 玉米 (PCT专利申请 WO97/26366) 邻氨基苯甲酸合酶(β亚基) 玉米 M95067  二氢吡啶二羧酸合酶 玉米 X52850  X61730 硫胺素生物合成酶(Thi1) 玉米  U17350  U17351 醇脱氢酶a,b 玉米 X04049 cab结合蛋白 玉米 X53398 组蛋白(H3C4)a 玉米 M13379 RUBISCO SS 玉米 Y09214 淀粉分支酶 玉米 U17897,U65948 ACC酶 玉米 A25272 肌动蛋白rac3 稻 X15862 肌动蛋白rac7 稻 X15863 纤维素生物合成酶 稻 AF030052 调节蛋白GF14-12 玉米 M96856 核糖体蛋白L9 稻 D83527 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶 小麦 L11872 超氧化物歧化酶 玉米 X17564 C-激酶受体 稻 D38231 磷酸甘油酸变位酶 玉米 Z33612 根特异的RCc3 mRNA 稻 L27208 葡萄糖-6磷酸异构酶 玉米 U17225 焦磷酸-果糖6-磷酸1磷酸转移酶 稻 D21294 遍在蛋白 玉米 U29162 β-酮脂酰-ACP合酶 大麦 Z34269 33kDa光合系统Ⅱ释氧蛋白 小麦 X57408 69kDa液泡ATP酶亚基 玉米 U36436 金属硫蛋白样蛋白质 玉米 I15488 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 玉米 M18976  ABA-和成熟诱导样蛋白 玉米 U09276 苯丙氨酸氨裂合酶 玉米 M95077 腺苷三磷酸酶 大麦 Z33632 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶 小麦 L11872 a，所指启动子已用于玉米的转化。 b，所指内含子增强子已用于玉米的转化。 c，薏苡启动子已被分离并用于玉米的转化。 d，薏苡蛋白编码序列(CDS)已被分离并用于玉米的转化。 (ⅱ)从薏苡中克隆部分同源序列

本发明的一部分包括利用由玉米基因或其侧翼序列衍生的探针或引物 从薏苡属中分离调节区。这些探针或引物可以直接由克隆的玉米DNA组 成，或者另外也可根据DNA序列数据合成制备。此外，也可以用来源于 非玉米的种但仍与玉米和薏苡密切相关的序列分离启动子。据认为特别 适用于鉴定薏苡中异源启动子的其他种包括单子叶植物如黑麦、小麦、 大麦、燕麦、高粱、稻和甘蔗。

此处定义的术语引物是指包括能以模板依赖的方式引发新生核酸合成 的任何核酸。通常，引物是10-20个碱基对长的寡核苷酸，但也能使用更 长的序列。引物可以是双链或单链形式，但单链形式是优选的。探针定 义不同，虽然它们也可用作引物。尽管探针也许能引发，但是用来结合 靶DNA或RNA，且不需要在扩增方法中使用。

在优选实施方案中，探针或引物用放射性物种(32P、14C、35S、3H或 其他标记)、用荧光团(罗丹明、荧光素)、抗原(生物素、链霉亲和素、 洋地黄毒苷)或化学发光剂(萤光素酶)标记，或直接与酶(碱性磷酸 酶)偶联。

制备探针或引物后，克隆异源启动子的第一步一般包括制备和筛选克 隆的适当文库，例如，在本发明中，薏苡的基因组DNA文库。筛选可基 于寡核苷酸探针杂交，这些探针是考虑到玉米启动子序列部分而设计的， 或来源于该基因或相关基因的DNA序列。这些筛选方法的操作为本领域 技术人员所周知，并在以下和在科学文献中详述，例如，Sambrook等人 (1989)，在此完整引用作为参考。 1．依赖模板的扩增

依赖模板的扩增方法，如PCR，代表一种从薏苡中分离玉米部分同 源或其他序列的有效方法。特别是，可根据部分同源序列的遗传信息设 计引物，其能用于含薏苡启动子的核酸之依赖模板的扩增。许多依赖模 板的方法可用于扩增给定模板样品中存在的序列。最著名的扩增方法之 一是聚合酶链反应(称为PCRTM)，在美国专利号4,683,195、美国专利 号4,683,202和美国专利号4,800,159中有详细描述，在此均完整引用作 为参考。

简言之，在PCRTM中，制备这样的两条引物序列，它们与标记序列 的相对互补链上的区域互补。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷 酸以及DNA聚合酶(如Taq聚合酶)。如果样品中有标记序列，引物将 与该标记结合，而聚合酶通过加入核苷酸使引物沿标记序列延伸。通过 升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将与标记分离，形成反应产 物，过量的引物将与标记和反应产物结合，该过程重复进行。

可进行反转录酶PCRTM扩增法，以定量出扩增的mRNA的量。将RNA 反转录为cDNA的方法众所周知，并在Sambrook等人(1989)中有述。 反转录的备择方法使用热稳定的、依赖RNA的DNA聚合酶。1990年12 月21日提交的PCT/WO90/07641中描述了这些方法。聚合酶链反应方 法在本领域中众所周知。

另一种扩增方法是在EP 0 320 308中公开的连接酶链反应(“LCR”)， 在此完全引用作为参考。在LCR中，制备两种互补探针对，在靶序列的 存在下，每一对将与靶标的相对互补链结合，使它们邻接。在连接酶的 存在下，两个探针对连接，形成一个单位。通过如PCRTM中的温度循环， 结合的连接单位与靶标分离，然后作为“靶序列”用于过量探针对的连 接。美国专利号4,883,750公开了一种类似于LCR的使探针对与靶序列 结合的方法。

PCT/US87/00880所述的Qbeta复制酶也可作为另一种扩增方法用于 本发明。在该方法中，在RNA聚合酶的存在下向样品中加入具有与靶标 互补的区域的RNA的复制型序列。聚合酶将拷贝该复制型序列，然后可 进行检测。

一种等温扩增方法，其中用限制性内切核酸酶和连接酶实现在限制位 点一条链中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸的靶分子的扩增，也可在本发 明中用于核酸的扩增(Walker等人，1992)。

链置换扩增(SDA)是进行核酸等温扩增的另一种方法，其包括多个 循环的链置换和合成(即切口平移)。一种类似的方法，称为修复链反应 (PCR)，包括在扩增目标区中使几种探针退火，随后是其中只存在四种 碱基中的两种的修复反应。另两种碱基可作为生物素化衍生物加入，以 易于检测。在SDA中可使用一种类似的方法。也能用循环探针反应(CPR) 检测靶特异序列。在CPR中，具有非特异性DNA的3’和5’序列和特异 性RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNAse H处理反应物，探针产物被确定为消化后释放的独特产物。原始模板与 另一种循环探针退火，反应重复进行。

可根据本发明使用GB 2 202 328和PCT/US89/01025中描述的另一 种扩增方法，两文均在此引用作为参考。在前一个申请中，在PCRTM样、 依赖模板和酶的合成中使用“修饰的”引物。可通过用捕获部分(例如 生物素)和/或检测部分(例如酶)标记修饰引物。在后一个申请中，向 样品中加入过量的标记探针。在靶序列的存在下，探针结合并被催化切 割。切割后，靶序列完整释放并与过量探针结合。标记探针的切割表明 靶序列的存在。

其他核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸 序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等人，1989；Gingeras等人； PCT/WO88/10315；在此引用作为参考)。在NASBA中，可通过标准酚/ 氯仿抽提、临床标本的热变性、裂解缓冲液处理和用于分离DNA和RNA 的minispin柱或RNA的盐酸胍抽提，来制备用于扩增的核酸。这些扩 增技术包括退火具有靶特异性序列的引物。聚合后，DNA/RNA杂合体用 RNAase H消化，而双链DNA分子再次热变性。在每种情况中，通过加 入第二条靶特异性引物随后聚合，使单链DNA成为完全双链的。然后用 RNA聚合酶如T7或SP6重复转录双链DNA分子。在等温循环反应中， RNA反转录为单链DNA，然后转化为双链DNA，然后再次用RNA聚 合酶(如T7或SP6)转录。所得截短或者完整的产物代表靶特异性序列。

EP 0 329 822(在此完整引用作为参考)公开了一种核酸扩增方法， 其包括循环合成的单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)， 可按照本发明使用。ssRNA是第一条引物寡核苷酸的模板，由反转录酶 (RNA依赖的DNA聚合酶)延伸。然后通过核糖核酸酶H(RNase H， 一种对含DNA或RNA的双链体中RNA特异的RNase)的作用从得到 的DNA:RNA双链体中切下RNA。得到的ssDNA是第二条引物的模板， 也包含5’与模板同源的RNA聚合酶启动子(例如T7 RNA聚合酶)的 序列。然后用DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow” 片段)延伸该引物，产生双链DNA(“dsDNA”)分子，其在引物之间含 有与原始RNA相同的序列，并在一端含有启动子序列。可用合适的RNA 聚合酶用该启动子序列制备DNA的多个RNA拷贝。然后这些拷贝可再 进入循环，导致极快速的扩增。适当地选择酶，该扩增能等温进行，而 不必在每一循环时加入酶。因为该方法的循环性质，可选择起始序列为 DNA或RNA形式。

PCT/WO89/06700(在此完整引用作为参考)公开了一种核酸序列扩 增方案，其基于启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)的杂交，随 后是该序列多个RNA拷贝的转录。该方案不是循环的，即，不能由得到 的RNA转录物产生新的模板。其他扩增方法包括“RACE”和“单向 PCRTM”(Frohman,1990；Ohara等人，1989；均在此引用作为参考)。

本发明的扩增步骤中也可使用基于两种(或多种)寡核苷酸在含终“二 寡核苷酸”序列的核酸存在下的连接，从而扩增该二寡核苷酸的方法(Wu 等人，1989，在此引用作为参考)。

扩增后，在某一阶段，使扩增产物与模板和用于确定是否发生特异性 扩增的过量引物分离通常是希望的。在一个实施方案中，用标准方法经 琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物(Sambrook 等人，1989)。

另外，也可用层析技术实现分离。有多种层析法可用于本发明：吸附、 分配、离子交换和分子筛，和使用它们的多种专用技术，包括柱、纸、 薄层和气相层析(Freifelder,1982)。

可显示产物，以证实标记序列的扩增。一种典型的显示方法包括用溴 化乙锭染色凝胶，并在紫外光下显示。此外，如果扩增产物用放射性或 荧光标记核苷酸整体标记，则能使扩增产物在分离后对X线胶片曝光或 在适当激发光谱下显示。

在一个实施方案中，间接实现显示。扩增产物分离后，使标记的核酸 探针与扩增的标记序列接触。探针优选地与生色团偶联，但也可被放射 性标记。在另一个实施方案中，探针与结合配偶体如抗体或生物素偶联， 结合对的另一成员带有可检测部分。

在另一个实施方案中，用标记探针检测。有关技术为本领域技术人员 所周知，并见于关于分子操作的许多标准图书(Sambrook等人，1989)。 例如，生色团或放射性标记探针或引物可在扩增之中或之后鉴定靶标。

美国专利号5,279,721中描述了前述的一个实例，其在此引用作为参 考，它公开了一种用于自动电泳和核酸转移的装置和方法。该装置可在 不对凝胶进行外部操作的情况下进行电泳和印迹，并且理想地适用于根 据本发明的方法。

另外，可用标准序列分析技术对上述扩增产物进行序列分析，以鉴定 变化的具体类型。在某些方法中，通过使用为最佳测序设计的引物组进 行序列分析来实现基因的彻底分析(Pignon等人，1994)。本发明提供了 可使用所有这些类型的分析的方法。 2．Southern/Northern印迹

印迹技术代表本领域技术人员众所周知的其他方法，且可用于根据本 发明的核酸鉴定。例如，能用Southern印迹分离在玉米基因表达中有用 的含候选薏苡启动子的DNA片段。特别是，通过玉米的cDNA探针与薏 苡植物的基因组DNA克隆杂交，能分离包含相应基因的启动子区的克 隆。此外，也能用启动子序列本身作为探针直接鉴定部分同源的薏苡启 动子。

Southern印迹包括DNA作为靶标的应用，而Northern印迹包括RNA 作为靶标的应用。各自提供不同类型的信息，虽然在许多方面cDNA印 迹类似于RNA种的印迹。简言之，用一种探针靶向已固定于适当基质通 常为硝酸纤维素滤膜上的DNA或RNA种。不同的种应当是空间分隔的， 以便于分析。这通常通过核酸种的凝胶电泳及随后向滤膜上的“印迹” 来完成。

之后，使吸印的靶与探针(通常是标记的)在促进变性和再杂交的条 件下温育。因为探针是为与靶标碱基配对而设计的，所以探针将在复性 条件下与靶序列的一部分结合。然后去除未结合的探针，如上所述完成 检测。 3．芯片技术

发明者特别期望的是基于芯片的DNA技术，如Hacia等人(1996) 和Shoemaker等人(1996)所述的技术。简言之，这些技术包括用来快 速且精确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因或使用 固定的探针阵列，能用芯片技术分离靶分子作为高密度阵列，并以杂交 为基础筛选这些分子(Pease等人，1994；Fodor等人，1991)。 (ⅲ)薏苡启动子的从头分离

本发明构思了不使用其他种启动子衍生的探针或引物而分离的薏苡启 动子的应用。启动子的克隆及其向适当转化载体中的构建和外源基因在 玉米中表达的方法在本领域中众所周知，例如，公开于Sambrook等人， 1989，在此特别引用作为参考。被认为特别适用于玉米中转基因表达的 薏苡启动子的种类是以组成型或非组成型方式高水平表达的启动子。希 望的非组成型启动子包括以组织和/或时间特异的方式表达的启动子，或 者是诱导型的。时间特异的是指在一个或多个特定发育阶段引导表达的 启动子。

启动子克隆的典型第一步包括鉴定以希望的方式即以组成型或组织/ 时间特异方式表达的靶基因的。一种有效方法包括从一种或多种确定的 靶组织中制备cDNA文库，和鉴定其中的高拷贝克隆。特别有利的是高 度表达而基因拷贝数较低的cDNA克隆。然后用本领域技术人员公知的 标准文库筛查技术，用该cDNA克隆分离包含编码序列侧翼5’区包括启 动子区的基因组DNA(见Sambrook等人，1989)。

一种优选的启动子克隆方法是如Siebert等人，1995所述的“抑制 PCR”技术的应用，其公开内容在此引用作为参考。该方法使得只要已 知基因特异的锚序列，就能PCR扩增未克隆的和未知的序列。利用该技 术，能用已知序列如同源或部分同源的cDNA序列克隆包括启动子、增 强子或终止子的侧翼调节元件。 1．用相对定量RT-PCRTM对基因表达的定量

能用RNA至cDNA的反转录(RT)及随后的相对定量PCRTM (RT-PCRTM)测定从植物中分离的特异mRNA种的相对浓度。通过测 定特异mRNA种浓度变化，表明编码特异mRNA种的基因差异地表达。 这样，能快速鉴定并从薏苡中筛选候选启动子，用于玉米转化所用表达 载体的构建。

在PCRTM中，随着反应的每一循环，扩增的靶DNA的分子数以近 似于2的倍数增加，直到某种试剂成为局限为止。之后，扩增速度逐渐 降低，直到在循环之间扩增的目标没有增加。如果以循环数为X轴，以 扩增的靶DNA的对数为Y轴作图，连接绘制的点形成特有形状的曲线。 从第一循环开始，线的斜率是正数且恒定。称其为该曲线的线性部分。 试剂变为有限的之后，线的斜率开始降低，最终成为零。在这点时，扩 增的靶DNA的浓度渐近于某一固定值。称其为该曲线的平台部分。

PCRTM扩增的线性部分中靶DNA的浓度与反应开始前靶标的起始浓 度成正比。在已完成相同数量的循环并处于线性范围内的PCRTM反应中， 通过测定靶DNA的扩增产物的浓度，能确定原始DNA混合物中特异靶 序列的相对浓度。如果DNA混合物是由从不同组织或细胞中分离的RNA 合成的cDNA，则能为各组织或细胞确定衍生出靶序列的特异mRNA的 相对丰度。PCRTM产物浓度与相对mRNA丰度之间的正比只在PCRTM 反应线性范围内是正确的。

曲线平台部分中靶DNA的终浓度取决于反应混合物中试剂的可用 性，并且不依赖于靶DNA的原始浓度。因此，在能用RT-PCRTM测定RNA 群中mRNA种的相对丰度之前必须满足的第一个条件是，当PCRTM反 应处于曲线线性部分时，必须对扩增的PCRTM产物浓度取样。

为成功确定特定mRNA种的相对丰度，RT-PCRTM研究必须满足的 第二个条件是，可扩增cDNA的相对浓度必须被标准化为某一独立的标 准。RT-PCRTM研究的目的在于测定特定mRNA种相对于样品中所有 mRNA种的平均丰度的丰度。

大多数竞争性PCRTM方案使用丰度与靶标近似的内部PCRTM标准。 如果在线性期对PCRTM扩增产物取样，则这些策略是有效的。如果在反 应接近平台期时对产物取样，则丰度较低的产物相对过量。对多种不同 RNA样品进行的相对丰度比较，例如当检测RNA样品的差别表达时的 情况，可能失真，这样使RNA相对丰度的差异比实际的要低。如果内部 标准比靶标丰度更高，那么这不是重要问题。如果内部标准比靶标丰度 更高，那么能在RNA样品之间进行直接线性比较。

上述内容叙述了植物组织RT-PCRTM测定的理论考虑。植物组织样 品中固有的问题是，它们的数量是可变的(使标准化成问题)，并且它们 的质量是可变的(需要优选地比靶标更大的可靠内部对照的共扩增)。如 果用内部标准以相对定量RT-PCRTM进行RT-PCRTM，其中内部标准是 大于靶cDNA片段的可扩增cDNA片段，并且编码该内部标准的mRNA 的丰度比编码靶标的mRNA大约高5-100倍，那么这两个问题都可以克 服。该测定法测定各mRNA种的相对丰度，而不是绝对丰度。

用外部标准方案以更常规的相对定量RT-PCRTM测定可进行其他研 究。这些测定法对其扩增曲线线性部分的PCRTM产物取样。对于每一靶 cDNA片段，必须以经验确定最适于取样的PCRTM循环数。另外，从不 同组织样品中分离的每一RNA群的反转录酶产物必须对等浓度的可扩增 cDNA仔细标准化。这一因素非常重要，因为该测定法测定绝对mRNA 丰度。只在标准化样品中绝对mRNA丰度能用作差异基因表达的量度。 扩增曲线线性范围的经验确定和cDNA制品的标准化是乏味且耗时的过 程，而RT-PCRTM测定可优于由应用内部标准的相对定量RT-PCRTM测 定衍生的方法。

该优点的一个原因是，不使用内部标准/竞争剂，所有试剂都能在扩 增曲线线性范围中转化为一种PCRTM产物，从而提高了该实验的敏感性。 另一个原因是，只用一种PCRTM产物，产物在电泳凝胶上或用另一种显 示方法的显示成为不甚复杂的，具有较低的背景，且易于说明。 2．非导向的启动子分离

通过首先鉴定具有希望的表达特征的基因以靶向、特异方式克隆启动 子，能用“鸟枪”筛选策略克隆薏苡启动子。例如，能产生大量包含与 薏苡DNA随机片段连接的选择性或可筛选标记基因的载体。这些载体 的制备包括，混合并连接限制性消化的标记基因DNA部分和薏苡总基因 组DNA，及将DNA克隆到适当载体中。此外，也能使用“无头骑师(headless horseman)”构建体，其中克隆位点直接位于标记基因之前，另外缺乏启 动子。在这种情况下，标记基因只有在启动子克隆到克隆位点中时才表 达。构建后，能用载体转化大量玉米细胞。通过筛选表达标记基因的转 化体，可鉴定能在玉米中引导表达的新薏苡启动子。 (ⅳ)启动子的测定

克隆后，能通过测序和/或表达测定证实启动子的同一性和/或效用。 对于植物，表达测定可包括使用胚发生或非胚发生细胞，或整个植物。 使用细胞测定的一个优点是，不需要大量植物的再生，然而，由于非再 生细胞中的启动子活性可能不与植物中的表达直接相关，系统受到限制。 另外，组织或发育特异性启动子的测定通常是不可行的。

待测定的生物样品可包括按照标准方法自任何植物材料细胞中分离的 核酸(Sambrook等人，1989)。核酸可以是基因组DNA或部分或全细 胞RNA。使用RNA时，将RNA转化为互补DNA是希望的。在一个实 施方案中，RNA是全细胞RNA；在另一个实施方案中，是poly-A RNA。 通常扩增该核酸。

根据方法类型，直接利用扩增或利用扩增后的第二种已知核酸鉴定样 品中的目的特异核酸。然后，检测鉴定的产物。在某些用途中，可用目 视法进行检测(例如，凝胶的溴化乙锭染色)。另外，检测可包括通过放 射性标记或荧光标记的化学发光、放射性闪烁乃至通过利用电或热脉冲 信号的系统间接鉴定产物(Affymax技术；Bellus,1994)。

检测后，可以将在给定植物中所见的结果与统计学显著的未转化对照 植物参照组比较。未转化的对照植物一般具有类似于转化的植物的遗传 背景。这样，有可能检测出在不同转化植物中检测的蛋白质的量或种类 上的差异。另外，也可将细胞的克隆培养物如愈伤组织或未成熟胚与其 他细胞样品相比较。

如上所述，在本发明的细胞或植物和相关启动子的筛选中构思了不同 类型的测定法。这些技术可用来检测特定基因的存在和表达，以及可在 基因构建体中发生的重排。这些技术包括但不限于：荧光原位杂交 (FISH)、直接DNA测序、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析、Southern 或Northern印迹、单链构象分析(SSCA)、RNA酶保护测定、等位基 因特异的寡核苷酸(ASO)、斑点印迹分析、变性梯度凝胶电泳、RFLP 和PCRTM-SSCP。

按照本发明分离含启动子的克隆时，希望限定克隆内的必需启动子 区。一种有效方法包括缺失分析。在缺失分析中，制备一系列构建体， 每一种均含有克隆(或亚克隆)的不同部分，然后就启动子活性筛选这 些构建体。一种活性筛选的合适方法是将缺失的启动子构建体与选择性 或可筛选标记连接，并只分离表达标记基因的细胞。这样，可鉴定许多 不同的仍保留启动子活性的缺失启动子构建体。由此通过比较筛选的构 建体鉴定启动子活性所需的最小片段。该片段然后可用于表达外源基因 的载体的构建。 Ⅱ．制备突变启动子的方法

发明者特别构思的是，能够诱变薏苡启动子，以有效改进启动子对于 玉米中转基因表达的应用。薏苡启动子的诱变可随机进行，并可根据在 尝试法中的应用筛选诱变的启动子。此外，也能鉴定使薏苡启动子具有 希望的表达特征的特定序列，并通过突变将这些或类似的序列引入玉米 启动子中。除了玉米之外，也能诱变来源于其他种的启动子，以使其具 有希望的薏苡启动子特征。例如，能诱变来源于稻、燕麦、高粱、大麦 或小麦的启动子，以使诱变启动子具有增强的在玉米转基因表达中的应 用性。

诱变编码本发明启动子的DNA片段的方法为本领域技术人员所周 知。可通过随机或位点特异性诱变法进行这些启动子区的修饰。通过添 加或缺失编码相应未修饰启动子区的序列的一种或多种核苷酸改变其结 构，可修饰启动子区。

可按照本领域所知的任何技术进行诱变，例如但不限于，合成在特定 启动子区序列内含有一个或多个突变的寡核苷酸。特别地，位点特异性 诱变是一种通过特定DNA的特异诱变制备启动子突变体中有用的技术。 该技术进而提供制备及检测序列变体的能力，例如，通过向DNA中引入 一个或多个核苷酸序列改变，合并前述一种或多种因素。位点特异性诱 变允许利用编码希望突变的DNA序列的特异寡核苷酸序列和足量的邻接 核苷酸产生突变体，以提供有足够大小和序列复杂性的引物序列，在跨 过的缺失连接两侧形成稳定的双链体。通常，约17个到约75个核苷酸 或更长的引物是优选的，在序列连接两侧的约10个到约25个或更多的 残基被改变。

总之，如多个申请所例举的，位点特异性诱变技术在本领域众所周知。 该技术一般使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。适用于定点诱变 的典型载体包括如M13噬菌体的载体。这些噬菌体易于商品获得，其应 用通常为本领域技术人员所周知。在去掉从质粒向噬菌体转移目的基因 的步骤的定点诱变中也常规使用双链质粒。

通常，进行定点诱变的方法包括，首先获得单链载体，或者使双链载 体的两条链解链，该载体在其序列中包含编码希望的启动子区或肽的DNA 序列。通常合成制备具有希望的突变序列的寡核苷酸引物。该引物然后 与单链载体退火，用DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶Ⅰ Klenow片段处理， 以完成含突变链的合成。从而形成一种一条链编码原始未突变序列而第 二条链具有希望的突变的异源双链体。然后用该异源双链载体转化或转 染适当的细胞，如玉米细胞，并筛选包含具有突变序列排列的重组载体 的细胞。Kunkel等人(1987)设计了一种遗传选择方案，用来富集掺入 诱变寡核苷酸的克隆。此外，可以用应用可商品获得的热稳定酶如Taq 聚合酶的PCRTM向扩增的DNA片段中掺入诱变寡核苷酸引物，然后能 将其克隆到适当的克隆或表达载体中。Tomic等人(1990)和Upender 等人(1995)的PCRTM介导的诱变法提供了该方法的两个实例。也可用 除热稳定聚合酶外还使用热稳定连接酶的PCRTM向扩增的DNA片段中 掺入磷酸化诱变寡核苷酸，然后可将其克隆到适当的克隆或表达载体中。 Michael(1994)所述的诱变法提供了这种方案的一个实例。

利用定点诱变制备编码所选启动子的DNA片段的序列变体是一种产 生潜在有用的种的方法，并且不是意在限制，因为有可获得DNA序列变 体的其他方法。例如，可用诱变剂(如羟胺)处理编码希望的启动子序 列的重组载体，而获得序列变体。

在此使用时，术语“寡核苷酸引导的诱变方法”是指依赖模板的过程 和载体介导的增殖，这导致特定核酸分子浓度相对于其初始浓度的提高， 或者导致可检测信号浓度的提高，如扩增。在此使用时，术语“寡核苷 酸引导的诱变方法”也是指包括引物分子的依赖模板的延伸的方法。术 语依赖模板的过程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中核酸新合成 链的序列受众所周知的互补碱基配对原则控制(见，例如，Watson和 Ramstad,1987)。载体介导的方法一般包括核酸片段向DNA或RNA载 体中的引入，载体的克隆扩增，和扩增的核酸片段的回收。美国专利号 4,237,224提供了这些方法的实例，在此引用作为参考。许多依赖模板的 方法适用于扩增样品中存在的目的靶序列，这些方法在本领域众所周知， 并在以下具体公开。 Ⅲ．转化

有许多方法可用于向细胞中转化DNA片段，但不是都适于向植物细 胞中输送DNA。本发明使用的合适的方法据认为实际上包括能向细胞中 引入DNA的任何方法，如DNA的直接输送，如PEG介导的原生质体 转化(Omirulleh等人，1993)，干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus 等人，1985)，电穿孔(美国专利号5,384,253，在此引用作为参考)，碳 化硅纤维搅拌(Kaepller等人，1990；美国专利号5,302,523，在此引用 作为参考；美国专利号5,464,765，在此引用作为参考)，农杆菌介导的转 化(美国专利号5,591,616和美国专利号5,563,055，均在此引用作为参 考)，和DNA包被颗粒的加速(美国专利号5,550,318；美国专利号 5,538,877；美国专利号5,538,880；均在此引用作为参考)，等等。通过应 用这些技术，可稳定地转化玉米细胞以及实际上任何其他植物种的细胞， 并且这些细胞发育为转基因植物。在某些实施方案中，加速法是优选的， 包括例如微粒轰击等。 (ⅰ)电穿孔

当希望利用电穿孔引入DNA时，预计Krzyzek等人(美国专利号 5,384,253，在此引用作为参考)的方法是特别有利的。在该方法中，用 某些细胞壁降解酶如果胶降解酶使靶受体细胞比未处理的细胞对电穿孔 转化更敏感。此外，也可通过机械创伤使受体细胞对转化更敏感。

为了实现电穿孔转化，可以使用易碎的组织，如细胞的悬浮培养液或 胚发生愈伤组织，或者另外可以直接转化未成熟的胚或其他有机组织。 在该技术中，可通过接触果胶降解酶(果胶酶)或以受控方式机械创伤， 部分降解所选细胞的细胞壁。已经通过完整细胞的电穿孔转化的某些种 的实例包括玉米(美国专利号5,384,253；D’Halluin等人，1992；Rhodes 等人，1995)、小麦(Zhou等人，1993)、番茄(Hou和Lin,1996)、 大豆(Christou等人，1987)和烟草(Lee等人，1989)。

也可使用原生质体用于植物的电穿孔转化(Bates,1994；Lazzeri, 1995)。例如，Dhir和Widholm在国际专利申请公开号WO9217598(在 此引用作为参考)中描述了通过子叶衍生的原生质体的电穿孔产生转基 因大豆。已经描述了原生质体转化的种的其他实例包括大麦(Lazerri, 1995)、高粱(Battraw等人，1991)、玉米(Bhattacharjee等人，1997)、 小麦(He等人，1994)、番茄(Tsukada,1989)和大豆(Dhir等人，1992)。 (ⅱ)微粒轰击

向根据本发明的植物细胞中输送转化的DNA片段的一种优选方法是 微粒轰击(美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号 5,610,042；和PCT申请WO94/09699；均在此引用作为参考)。在该方 法中，颗粒可以用核酸包被，并被推动力输送到细胞中。典型的颗粒包 括由钨、铂、优选地金组成的颗粒。可以预期，在某些情况中，金属颗 粒上DNA的沉淀不是利用微粒轰击向受体细胞输送DNA所必需的。然 而，构思了颗粒含有DNA而不是用DNA包被。因此，有人提出，DNA 包被的颗粒可提高经颗粒轰击的DNA输送水平，但其本身不是必需的。

通过加速向玉米细胞中输送DNA的方法的一个说明性实施方案是 Biolistics颗粒输送系统，它能用来推动DNA包被的颗粒或细胞通过筛， 如不锈钢或nytex筛，到达覆盖有悬液培养的单子叶植物细胞的滤膜表 面。筛可分散颗粒，使其不会以大的聚集体输送到受体细胞中。可以认 为，插在发射装置与待轰击细胞之间的筛减小了颗粒聚集体的大小，并 可通过减少颗粒对受体细胞的损伤而达到较高的转化率。

微粒轰击技术应用广泛，实际上可用来转化任何植物种。已通过微粒 轰击转化的种的实例包括，单子叶植物种，如玉米(PCT申请 WO95/06128)、大麦(Ritala等人，1994；Hensgens等人，1993)、小 麦(美国专利号5,563,055，在此引用作为参考)、稻(Hensgens等人， 1993)、燕麦(Torbet等人，1995；Torbet等人，1998)、黑麦(Hensgens 等人，1993)、甘蔗(Bower等人，1992)和高粱(Casa等人，1993；Hagio 等人，1991)；以及大量双子叶植物，包括烟草(Tomes等人，1990；Buising 和Benbow,1994)、大豆(美国专利号5,322,783，在此引用作为参考)、 向日葵(Knittel等人，1994)、花生(Singsit等人，1997)、棉花(McCabe 和Martinell,1993)、番茄(VanEck等人，1995)和普通的豆科植物(美 国专利号5,563,055，在此引用作为参考)。

对于轰击，将悬浮细胞浓缩于滤膜或固体培养基上。此外，也可在固 体培养基上排列未成熟胚或其他靶细胞。欲轰击的细胞被置于大颗粒截 止盘之下适当距离处。若希望，可在加速装置与待轰击的细胞之间放置 一个或多个筛。 (ⅲ)农杆菌介导的转化

农杆菌介导的转移是一种广泛适用于向植物细胞中引入基因的系统， 因为DNA能被引入整个植物组织中，从而不需要由原生质体再生为完整 植物。农杆菌介导的植物整合载体向植物细胞中引入DNA的应用在本领 域众所周知。见，例如，Fraley等人(1985)、Rogers等人(1987)和 美国专利号5,563,055所述的方法，在此引用作为参考。

农杆菌介导的转化在双子叶植物中最有效，是转化双子叶植物包括拟 南芥、烟草、番茄和马铃薯的优选方法。实际上，农杆菌介导的转化已 常规用于双子叶植物很多年，只是最近才应用于单子叶植物。农杆菌介 导的转化技术的进展现在已使该技术适用于几乎所有单子叶植物。例如， 农杆菌介导的转化技术现已应用于稻(Hiei等人，1997；Zhang等人， 1997；美国专利号5,591,616，在此引用作为参考)、小麦(McCormac 等人，1998)、大麦(Tingay等人，1997；McCormac等人，1998)和 玉米(Ishidia等人，1996)。

现代农杆菌转化载体能在大肠杆菌和农杆菌中复制，从而可如述(Klee 等人，1985)方便地操作。而且，农杆菌介导的基因转移所用载体方面 的最新技术进展改进了载体中的基因和限制位点的排列，利于能表达多 种多肽编码基因的载体的构建。所述(Rogers等人，1987)的载体含有 侧翼为启动子和聚腺苷酸化位点的多接头区，便于直接表达插入的多肽 编码基因，且适用于该目的。另外，含有武装(armed)和未武装Ti基 因的农杆菌也能用于转化。在农杆菌介导的转化有效的植物株中，这是 选择的方法，因为基因转移有容易和确定的性质。 (ⅳ)其他转化方法

用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理组合的方法能 实现植物原生质体的转化(见，例如，Potrykus等人，1985；Lorz等人， 1985；Omirulleh等人，1993；Fromm等人，1986；Uchimiya等人，1986； Callis等人，1987；Marcotte等人，1988)。

这些系统对不同植物株的应用取决于由原生质体再生特定植物株的能 力。已描述了由原生质体再生谷类的说明性方法(Fujimara等人，1985； Toriyama等人，1986；Yamada等人，1986；Abdullah等人，1986； Omirulleh等人，1993和美国专利号5,508,184；均在此引用作为参考)。 谷类原生质体直接摄取转化的实例包括稻(Ghosh-Biswas等人，1994)、 高粱(Battraw和Hall,1991)、大麦(Lazerri,1995)、燕麦(Zheng 和Edwards,1990)和玉米(Omirulleh等人，1993)的转化。

为了转化不能由原生质体成功再生的植物株，可使用向完整细胞或组 织中引入DNA的其他方法。例如，如述(Vasil,1989)能实现由未成熟 胚或外植体再生为谷类。另外，也可在应用或不应用原生质体的情况下 使用碳化硅纤维介导的转化(Kaeppler,1990；Kaeppler等人，1992； 美国专利号5,563,055，在此引用作为参考)。利用该技术的转化是通过将 碳化硅纤维与细胞一起在DNA溶液中搅拌而实现的。细胞被穿破时DNA 被动进入。该技术已成功用于例如，单子叶谷类玉米(PCT申请 WO95/06128，在此引用作为参考；Tompson,1995)和稻(Nagatani, 1997)。 Ⅳ．微粒轰击的优化

对于根据本发明的微粒轰击转化，物理和生物学参数均可优化。物理 因素是涉及操作DNA/微粒沉淀的因素或影响大颗粒或微粒飞行和速度的 因素。生物学因素包括与轰击前或轰击后细胞操作有关的所有步骤，如 靶细胞的渗压调节，以助于缓解与轰击有关的损伤，未成熟胚或其他靶 组织相对于颗粒轨迹的方向，以及转化的DNA的性质，如线性化的DNA 或完整的超螺旋质粒。可以认为，轰击前操作对于未成熟胚的成功转化 是特别重要的。

因此，构思了在小规模研究中调节不同的轰击参数来充分优化条件。 特别希望调节物理参数如DNA浓度、间隙距离、飞行距离、组织距离和 氦压力。进一步构思了，氦的等级可影响转化效率。例如，轰击之间转 化效率的差异可用工业级(99.99％纯)或超纯氦(99.999％纯)来证明， 虽然目前仍不清楚哪一个在轰击中更有利。也可通过改变影响受体细胞 生理状态因而影响转化和整合效率的条件，来优化损伤减少因子(TRF)。 例如，为了最佳转化可调节受体细胞的渗透状态、组织水合和传代培养 阶段或细胞周期。

可以适当调整轰击的物理和生物学参数以进一步优化Ballistic转化。 物理因素是涉及操作DNA/微粒沉淀的因素或影响大颗粒或微粒飞行和速 度的因素。生物学因素包括与轰击前或轰击后细胞操作有关的所有步骤。 已调节轰击前培养条件如渗透环境、轰击参数和质粒结构，以产生最大 数量的稳定转化体。 (ⅰ)物理参数

1．间隙距离

能调节可变组件(大容器)以改变防爆片与大颗粒之间的距离，即间 隙距离。该距离可为0-2cm不等。预测的较短间隙的作用是提高大颗粒 和微粒的速度，增强冲击波(导致组织溅散和组织损伤加重)和微粒的 较深穿入。较长的间隙距离具有相反作用，但可增强生存力，因此可增 加回收的稳定转化体的总数。

2．飞行距离

通过放置垫圈来调节大颗粒经过的飞行路径，固定组件(包含于可变 组件之内)可以以预定的0.5cm增值在0.5-2.25cm间变化。短飞行路径 使飞行中的大颗粒更稳定，但减小了微粒的总速度。例如，飞行稳定性 的提高可增加中心GUS灶的数量。较大的飞行距离(可达某种程度)提 高了飞行速度但也提高了不稳定性。根据观察，建议一般以大约1.0cm- 1.5cm的飞行路径长度进行轰击。

3．组织距离

轰击室内的组织放置对微粒穿入具有明显影响。延长微粒的飞行路径 将降低速度和与冲击波有关的损伤。速度的降低也将导致微粒的较浅穿 入。

4．氦压力

通过防爆片类型和数量的操作，气体加速管内的压力可在400-2000psi 间不等。测定稳定转化的最适压力为1000-1200psi。

5．微粒的包被

对于微粒轰击，可将DNA与微粒结合(即“包被”)，使其以适于转 化的形式被输送到受体细胞中。在这方面，为了发生转化，至少某些转 化的DNA是靶细胞可利用的，而同时在输送中DNA必须与微粒结合。 因此，微粒中转化DNA的可用性包括在向靶细胞输送微粒后转化的DNA 与微粒间键的物理逆转。然而，不一定是这样，因为靶细胞的可用性可 能是由于与微粒物理连接的DNA或其他分子的未结合片段断裂而发生 的。可用性另外也可能是转化的DNA与直接或间接结合微粒的其他分子 间键断裂的结果。另外构思了利用转化的DNA与受体细胞基因组DNA 之间的直接重组发生靶细胞的转化。因此，在此使用时，“包被”的微粒 是能用来转化靶细胞的微粒，其中转化的DNA能被送递给靶细胞，而仍 可接近靶细胞，使得可发生转化。

可使用能向靶细胞输送转化的DNA的任何包被微粒技术。在此特别 公开了已证明可用于本发明的包被微粒的方法。然而，可以用备择技术 使DNA与微粒结合。例如，可用链霉亲和素包被颗粒，用长链巯基可切 割的生物素化核苷酸链标记DNA末端。由于链霉亲和素-生物素相互作 用，DNA附着于颗粒，但由于细胞中存在的还原剂对巯基的还原而在细 胞中释放。

另外，也可通过使氧化金颗粒表面功能化提供游离的胺基来制备颗 粒。带强负电荷的DNA可与功能化的颗粒结合。而且，带电荷的颗粒可 以以受控的排列沉积于PDS-1000 Biolistics装置所用聚脂薄膜飞盘表面， 从而利于向靶组织输送的颗粒的控制分布。

如上所公开的，进一步提出，用来包被微粒的DNA的浓度可影响含 有单拷贝转基因的转化体的回收。例如，较低浓度的DNA可能不会必然 改变转化率，但可增加单拷贝插入事件的比例。在这点上，每1.8mg初 始微粒上可使用大约1ng-2000ng转化的DNA。在本发明的其他实施方 案中，每1.8mg初始微粒上可使用大约2.5ng-1000ng、2.5ng-750ng、 2.5ng-500ng、2.5ng-250ng、2.5ng-100ng或2.5ng-50ng转化的DNA。

也可用多种其他方法提高转化率和/或增加低拷贝转化事件的相对比 例。例如，本发明者构思在转化前用碱性磷酸酶或可使DNA末端成为平 端的试剂末端修饰转化的DNA。另外，转化的DNA可包括惰性载体 DNA，从而在不降低所用DNA的总量的情况下降低有效转化的DNA浓 度。这些技术另外在1997年12月22日提交的美国专利申请系列号 08/995,451中有述，其公开内容在此引用作为参考。 (ⅱ)生物学参数

培养条件和其他因素能影响靶细胞的生理状态，并可对转化率和整合 率有极深影响。首先，轰击的作用能刺激乙烯的产生，这可导致组织的 衰老。抗乙烯化合物的加入能提高转化率。其次，有人提出细胞周期中 的某些时点可能更适于引入的DNA的整合。因此细胞培养的同步化可增 加转化体产生频率。例如，可以用冷处理、氨基酸饥饿或其他细胞周期 捕获剂实现同步化。第三，组织水合的程度也可影响与轰击有关的损伤 程度以及微粒穿入细胞壁的能力。

胚或其他靶组织相对于颗粒轨迹的位置和方向也可能是重要的。例 如，PDS-1000 biolistics装置不在靶培养皿表面产生一致的颗粒流。平板 中心的颗粒速度高于距培养皿中心较远的颗粒速度。因此，使靶组织处 于培养皿上以避开有时被称为“死亡区”的培养皿中心是有利的。而且， 靶组织对于目标轨迹的方向也可能是重要的。希望使可能再生为植物的 组织定向于颗粒流。例如，未成熟胚的盾片包含具有最大胚发生能力的 细胞，因此应定向于颗粒流。

也曾报道，轻微质壁分离的酵母细胞可提高转化率(Armaleo等人， 1990)。假设细胞的细胞渗透状态有助于减轻与微粒穿入有关的损伤。另 外，生长和细胞周期对于转化可能是重要的。

1．渗压调节

有人提出渗压预处理能有效减轻轰击相关的损伤，这是由于质壁分离 细胞的膨压降低。在以前的研究中，向新鲜培养基和渗压调节的培养基 中传代培养后，瞬时表达GUS的细胞数量增加(PCT申请WO95/06128， 在此引用作为参考)。90分钟的预处理时间比较短时间显示更高数量的 GUS表达灶。在500mOSM/kg培养基中温育90分钟的细胞在暂时GUS 灶方面比对照有大约3.5倍的增加。优选地，轰击前在含有12％蔗糖的 培养基上预培养未成熟的胚4-5小时。轰击后在12％蔗糖上进行第二次 培养16-24小时。此外，轰击前用0.2M甘露醇预处理Ⅱ型细胞3-4小时。 用其他渗透活性溶质预处理细胞1-6小时也是希望的。

2．质粒构造

在某些情况中，向玉米细胞中输送不含在细菌宿主(如大肠杆菌)中 保持质粒载体所需DNA序列的DNA是希望的，如抗生素抗性基因，包 括但不限于氨苄青霉素、卡那霉素和四环素抗性，和原核DNA复制起点。 在这种情况中，可在转化前纯化含有转化DNA的DNA片段。一种典型 的纯化方法是1.2％低熔点琼脂糖凝胶上的凝胶电泳，随后通过在6-10倍 过量的Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0,1mM EDTA,70℃-72 ℃)中熔化凝胶片从琼脂糖凝胶中回收；冻融(37℃)；离心沉淀琼脂糖。 然后可用Qiagen Q-100柱纯化DNA。为了DNA的有效回收，柱的流速 可调节为40ml/小时。

能用多种电洗脱技术、琼脂糖的酶消化或DNA与玻璃珠结合(例如 Gene Clean)从琼脂糖凝胶中回收分离的DNA片段。另外，也可用HPLC 和/或磁粉的应用分离DNA片段。作为DNA片段分离的备选，能用限制 酶消化质粒载体，并将该DNA输送到玉米细胞，而不必事先纯化表达盒 片段。 Ⅴ．用于转化的受体细胞

组织培养需要培养基和控制的环境。“培养基”是指用来在体外即完 整的活生物之外培养细胞的多种养分混合物。培养基通常是大多数细胞 型生长所需多种成分(盐、氨基酸、生物调节剂、糖、缓冲液)的悬液。 然而，每种特殊细胞型的生长需要特殊的成分比例范围，对于最适生长 甚至需要更特殊的配方范围。细胞生长速度也随允许细胞型生长的培养 基排列引发的培养而不同。

营养培养基制备为液体，但可通过向液体中加入能提供固体支持物的 物质而固化。对此而言琼脂是最常用的。细菌培养用琼脂(Bactoagar)、 Hazelton琼脂、乙酰吉兰糖胶(Gelrite)和Gelgro是适于组织培养中植 物细胞生长的固体支持物的特殊类型。

某些细胞型在悬液中或固体培养基上生长并分裂。如此处公开的，玉 米细胞可在悬液中或固体培养基上生长，但由悬浮培养物再生为植物需 要在发育的某一时间从液体向固体培养基转移。培养中细胞分化的类型 和程度将不仅受所用培养基种类和环境如pH的影响，而且受培养基是固 体还是液体的影响。表2说明了可用于产生受体细胞和植物再生的多种 培养基的组成。

受体细胞靶包括但不限于，分生细胞，包括苗端(美国专利 5,736,369)、Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型愈伤组织、未成熟的胚和配子细胞如小孢 子、花粉、精子和卵细胞。预期可再生为能育植物的任何细胞均可用作 受体细胞。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型愈伤组织可起始于组织来源，包括但不限 于未成熟胚、苗端分生组织、小孢子等。那些能增殖为愈伤组织的细胞 也是用于遗传转化的受体细胞。本发明提供转化未成熟胚及随后再生能 育转基因植物的技术。未成熟胚的转化不需要受体细胞培养物的长期发 育。花粉及其前体细胞小孢子能够作为遗传转化的受体细胞，或作为携 带外源DNA的载体用于受精期间的掺入。直接花粉转化不需要细胞培 养。分生细胞(即能连续细胞分裂的植物细胞，其特征在于未分化的细 胞学表现，通常在生长点或植物组织如根尖、茎顶、侧芽等中发现)可 能代表另一种受体植物细胞。由于其未分化的生长和器官分化的能力和 全能性，单个转化的分生细胞能再生为整个转化的植物。实际上，有人 提出胚发生悬浮培养物可以是体外分生细胞系统，其保留以未分化状态 连续细胞分裂的能力，受培养基环境的控制。

能作为受体细胞用于目的DNA片段转化的培养的植物细胞可以是任 何植物细胞，包括玉米细胞，尤其是玉蜀黍(zea mays L.)的细胞。体 细胞有多种类型。胚发生细胞是体细胞的一个实例，其可被诱导经胚形 成再生为植物。非胚发生细胞是一般不以这种形式应答的细胞。非胚发 生细胞的一个实例是某些黑墨西哥甜玉米(Black Mexican Sweet) (BMS)的玉米细胞。

美国专利号5,134,074和美国专利号5,489,520中描述了本发明申请中 可用的胚发生玉米愈伤组织和悬浮培养物如用于转化的受体细胞的发 育，均在此引用作为参考。

可使用某些富集细胞群体中受体细胞的技术。例如，Ⅱ型愈伤组织发 育，随后人工选择和培养易碎的胚发生组织，通常富集用于微粒转化的 受体细胞。特别是使用此处公开的培养基的悬浮培养可提高特定群体中 受体细胞与非受体细胞的比率。能用来选择受体细胞的人工选择技术包 括，例如，评价细胞形态学和分化，或者可使用多种物理或生物学方法。 冷藏也是一种可能的筛选受体细胞的方法。

受体细胞的人工选择，例如从Ⅱ型愈伤组织表面选择胚发生细胞， 是一种可用于在培养前富集受体细胞的方法(无论是在固体培养基上或 在悬液中培养)。优选的细胞可以是位于细胞簇表面的细胞，并可进一步 通过分化的缺乏、大小和稠密的细胞质来确认。优选的细胞通常是较少 分化的或仍未分化的细胞。因此，希望鉴定并筛选那些细胞质稠密、相 对没有液泡、具有较高核细胞质比(例如，经细胞学观察确定)、较小(例 如10-20μm)、并能够持续分裂和体细胞原胚形成的细胞。

也可使用其他方法鉴定这些细胞。例如，利用染料如伊文氏蓝，其被 具有相对不通透性膜的细胞如胚发生细胞排除，而被相对分化的细胞如 根样细胞和蛇形细胞(由于其类似于蛇的外形而如此称谓)吸收。

其他可能的鉴定受体细胞的方法包括利用胚发生细胞的同工酶标记， 如谷氨酸脱氢酶，其可通过细胞化学染色检测(Fransz等人，1989)。然 而，要小心同工酶标记包括谷氨酸脱氢酶的使用可导致非胚发生细胞如 根样细胞的一定程度的假阳性，这些细胞具有相对高的代谢活性。 (ⅰ)培养细胞成为转化受体

制备和冷藏玉米细胞培养物的能力对于本发明的某些方面是重要的， 因为它提供了一种可再生地且成功地制备转化用细胞的方法。以前已研 发了多种不同类型的培养基，其可用于实施本发明的多个方面。下表， 表2，列出了发明者为实施本发明的这些方面而优选的培养基的组成。 表2：用于Ⅱ型愈伤组织发育、悬浮培养物发育和植物细胞(特别是玉 米细胞)再生的组织培养基 培养基编号 基础培养基 蔗糖 pH     其他成分*     (量/L)     7     MS* 2％     6.0 .25mg硫胺素 .5mg BAP .5mg NAA  Bactoagar     10     MS  2％     6.0 .25mg硫胺素 1mg BAP 1mg 2,4-D 400mg L-脯氨酸 Bactoagar     19     MS  2％     6.0 .25mg硫胺素 .25mg BAR .25mg NAA  Bactoagar     20     MS  3％     6.0 .25mg硫胺素 1mg BAP 1mg NAA Bactoagar     52     MS  2％     6.0 .25mg硫胺素 1mg 2,4-D 10-7M ABA BACTOAGAR     101     MS  3％     6.0 MS维生素 100mg肌醇 Bactoagar     142     MS  6％     6.0 MS维生素 5mg BAP 0.186mg NAA 0.175mg IAA 0.403mg 2IP Bactoagar     157     MS  6％     6.0 MS维生素 100mg肌醇 Bactoagar 表2(续) 培养基编号 基础培养基 蔗糖 pH     其他成分*     (量/L)     163     MS  3％     6.0 MS维生素 3.3mg麦草畏 100mg肌醇 Bactoagar     171     MS  3％     6.0 MS维生素 .25mg 2,4-D 10mg BAP 100mg肌醇 Bactoagar     173     MS  6％     6.0 MS维生素 5mg BAP .186mg NAA .175mg IAA .403mg 2IP 10-7M ABA 200mg肌醇 Bactoagar     177     MS  3％     6.0 MS维生素 .25mg 2,4-D 10mg BAP 10-7M ABA 100mg肌醇 Bactoagar     185     MS   -     5.8 3mg BAP .04mg NAA RT维生素 1.65mg硫胺素 1.38g L-脯氨酸 20g山梨糖醇 Bactoagar     189     MS   -     5.8 3mg BAP .04mg NAA .5mg烟酸 800mg L-天冬氨酸 100mg酪蛋白氨基酸 20g山梨糖醇 1.4g L-脯氨酸 100mg肌醇 Gelgro 表2(续) 培养基编号 基础培养基 蔗糖      pH     其他成分*     (量/L)     201     N6  2％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 1mg 2,4-D 100mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 Gelgro     205     N6  2％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 .5mg 2,4-D 100mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 Gelgro     209     N6  6％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 100mg酪蛋白水解物 0.69g L-脯氨酸 Bactoagar     210     N6  3％     5.5 N6维生素 2mg 2,4-D 250mg泛酸钙 100mg肌醇 790mg L-天冬氨酸 100mg酪蛋白水解物 1.4g L-脯氨酸 Hazelton琼脂**** 2mg L-甘氨酸     212     N6  3％      5.5 N6维生素 2mg L-甘氨酸 2mg 2,4-D 250mg泛酸钙 100mg肌醇 100mg酪蛋白水解物 1.4g L-脯氨酸 Hazelton琼脂****     227     N6  2％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 13.2mg麦草畏 100mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 Gelgro 表2(续) 培养基编号 基础培养基 蔗糖     pH     其他成分*     (量/L) 273(也称为 201V、236S、 201D、2071、 2366、201SV、 2377和201BV)     N6  2％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 1mg 2,4-D 16.9mg AgNO3 100mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸     279     N6  2％     5.8 3.3mg麦草畏 1mg硫胺素 .5mg烟酸 800mg L-天冬氨酸 100mg酪蛋白水解物 100mg肌醇 1.4g L-脯氨酸 Gelgro****     288     N6  3％ 3.3mg麦草畏 1mg硫胺素 .5mg烟酸 .8g L-天冬氨酸 100mg肌醇 1.4g L-脯氨酸 100mg酪蛋白水解物 16.9mg AgNO3  Gelgro     401     MS  3％     6.0 3.73mgNa2EDTA .25mg硫胺素 1mg 2,4-D 2mg NAA 200mg酪蛋白水解物 500mg K2SO4 400mg KH2PO4 100mg肌醇     402     MS  3％     6.0 3.73mg Na2EDTA .25mg硫胺素 1mg 2,4-D 200mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 500mg K2SO4  400mg KH2PO4  100mg肌醇 表2(续) 培养基编号 基础培养基 蔗糖     pH     其他成分*     (量/L)     409     MS  3％     6.0 3.73mg Na2EDTA .25mg硫胺素 9.9mg麦草畏 200mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 500mg K2SO4 400mg KH2PO4 100mg肌醇     501  Clark′s培养     基 2％     5.7     607  1/2xMS  3％     5.8 1mg硫胺素 1mg烟酸 脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)     615     MS  3％     6.0 MS维生素 6mg BAP 100mg肌醇 Bactoagar     617  1/2xMS  1.5％     6.0 MS维生素 50mg肌醇 Bactoagar     708     N6  2％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 1.5mg 2,4-D 200mg酪蛋白水解物 0.69g L-脯氨酸 脱乙酰吉兰糖胶     721     N6  2％     5.8 3.3mg麦草畏 1mg硫胺素 .5mg烟酸 800mg L-天冬氨酸 100mg肌醇 100mg酪蛋白水解物 1.4g L-脯氨酸 54.65g甘露醇 Gelgro     726     N6  3％     5.8 3.3mg麦草畏 .5mg烟酸 1mg硫胺素 800mg L-天冬氨酸 100mg肌醇 100mg酪蛋白水解物 1.4g L-脯氨酸 表2(续) 培养基编号 基础培养基 蔗糖     pH     其他成分*     (量/L)     727     N6  3％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 9.9mg麦草畏 100mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 Gelgro     728     N6  3％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 9.9mg麦草畏 16.9mg AgNO3 100mg酪蛋白水解物 2.9g L-脯氨酸 Gelgro     734     N6  2％     5.8 N6维生素 2mg L-甘氨酸 1.5mg 2,4-D 14g维尔烯Fe(代替Fe-EDTA) 200mg酪蛋白水解物 0.69g L-脯氨酸 脱乙酰吉兰糖胶     735     N6  2％     5.8 1mg 2,4-D .5mg烟酸 .91g L-天冬氨酸 100mg肌醇 1mg硫胺素 .5g MES .75g MgCl2 100mg酪蛋白水解物 0.69g L-脯氨酸 Gelgro     2004     N6  3％     5.8 1mg硫胺素 0.5mg烟酸 3.3mg麦草畏 17mg AgNO3 1.4g L-脯氨酸 0.8g L-天冬氨酸 100mg酪蛋白水解物 100mg肌醇 脱乙酰吉兰糖胶     2008     N6  3％     5.8 1mg硫胺素 0.5mg烟酸 3.3mg麦草畏 1.4g L-脯氨酸 0.8g L-天冬氨酸脱乙酰吉兰糖胶

*Murashige和Skoog(1962)所述的基础MS培养基。一般通过使 NH4NO3从1.64g/l降低为1.55g/l并除去盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇和甘氨 酸来改进该培养基。

**NAA=萘酚(Napthol)醋酸

IAA=吲哚乙酸

2-IP=2，异戊基腺嘌呤

2,4-D=2,4-二氯苯氧乙酸

BAP=6-苄基氨基嘌呤

ABA=脱落酸

***Clark(1982)所述的基础培养基

****制备这些培养基可以加或不加固化剂。

已研发了多种可用于转化的典型玉米培养，并在PCT申请 WO95/06128中公开，在此引用作为参考。 (ⅱ)培养基

在本发明的某些实施方案中，可在培养生长后筛选受体细胞。使用时， 培养的细胞可在固体支持物上或以悬液的形式生长。在任一情况中，可 以以基质的形式对细胞提供养分，并控制环境条件。有多种类型的包含 多种氨基酸、盐、糖、生长调节剂和维生素的组织培养基。本发明实践 中使用的大多数培养基具有相似的成分(见表2)，但根据预计的特定用 途而可能在成分的组成和比例上不同。例如，许多细胞型通常在超过一 种类型的培养基中生长，但在不同生长培养基显示不同的生长速度和不 同的形态学。在某些培养基中，细胞存活但不分裂。

以前已描述了适于植物细胞培养的不同类型的培养基。这些培养基的 实例包括但不限于，Chu等人(1975)所述的N6培养基和MS培养基 (Murashige和Skoog,1962)。已发现具有高氨/硝酸盐比例的培养基如 MS对受体细胞的产生起反作用，因为它们促使形态发生能力的丧失。另 一方面，N6培养基具有略低的氨/硝酸盐比例，预计通过使细胞维持于能 持续分裂的原胚状态而促进受体细胞的产生。 (ⅲ)维持

维持细胞培养的方法有助于其作为转化的受体细胞来源的应用。向新 鲜培养基转移的细胞的人工选择、向新鲜培养基转移的频率、培养基的 组成和包括但不限于光量和光通量及温度的环境因素，都是维持可用作 受体细胞来源的愈伤组织和/或悬浮培养物中的重要因素。预期在不同培 养条件之间交换愈伤组织可有利于富集培养物中的受体细胞。例如，有 人提出细胞可以在悬浮培养中生长，但以固定的间隔转移到固体培养基 中。在固体培养基中生长一段时间后，可人工选择细胞，返回液体培养 基中。有人提出，通过重复向新鲜培养基中转移的程序，能富集受体细 胞。也可以预期，使细胞培养物通过1.9mm筛在维持愈伤组织或悬浮培 养物的脆性中是有用的，并有利于富集可转化的细胞。 (ⅳ)冷藏法

冷藏是重要的，因为它使人能维持并保藏已知的可转化细胞培养物用 于将来的应用，而消除了与延长的培养期有关的累积不利影响。

用以前报道(Finkle,1985；Withers和King,1979)的方法的改进 法冷藏细胞悬液和愈伤组织。冷藏方案包括在1-2小时内向预冷(0℃) 的细胞中逐步加入预冷(0℃)的浓缩的冷冻保护剂混合物。在整个过程 中混合物保持0℃。加入的冷冻保护剂的体积与细胞悬液的初始体积相等 (1∶1加入)，冷冻保护剂添加剂的终浓度为10％二甲基亚砜、10％聚乙 二醇(6000MW)、0.23M脯氨酸和0.23M葡萄糖。该混合物可在0℃下 平衡30分钟，其间将细胞悬液/冷冻保护剂混合物以1.5ml等份(0.5ml 收集细胞体积)分配入2ml聚乙烯冷冻管中。以0.5℃/分钟冷却该管至-8 ℃，并保持该温度进行冰核凝。

目测证实细胞外冰形成后，以0.5℃/分钟将该管从-8℃冷却到-35℃。 保持于该温度45分钟(确保在细胞集簇中一致的冷冻诱导的脱水)。在 这一点上，细胞已失去大部分渗透体积(即，在细胞中留有少量的自由 水)，并能安全地投入液氮中贮存。细胞中自由水的缺乏及从-35℃到-196 ℃的快速冷冻速度防止了在细胞中形成大的组织冰晶。细胞贮存于液氮 中，这有效地固定细胞，并使代谢过程减缓至长期贮存应当是无害的程 度。

细胞外溶液的融解方法是，从液氮中取出冷冻管，在42℃无菌水中 涡旋大约2分钟。在最后的冰晶融化后立即从热处取出该管以防止加热 组织。将细胞悬液(仍在冷冻保护剂混合物中)移至滤膜上，置于BMS 细胞层上(在回收过程中起辅助作用的滋养层)。移液去除冷冻保护剂溶 液。培养基包含渗透压提高的愈伤组织增殖培养基。当溶质通过滤膜扩 散开来，而养分向回收的细胞扩散时，缓慢发生冷冻保护剂的稀释。注 意到融解的细胞生长后，将生长组织转移到新鲜培养基中。如果希望开 始悬浮培养，则一旦收回足够的细胞团(通常1-2周)，即将细胞簇转移 回液体悬浮培养基中。此外，在固体愈伤组织增殖培养基上培养细胞。 在液体中重建培养物后(另外1-2周之内)，其可用于转化实验。希望时， 之前冷藏的培养物可再次冻存。 Ⅵ．稳定转化的玉米的产生和表征

完成向受体细胞输送外源DNA后，下一步通常涉及鉴定转化的细胞 用于进一步的培养和植物再生。如此处所述，为了提高鉴定转化体的能 力，除可表达的目的基因之外，希望使用选择性或可选择的标记基因。 在这种情况中，通常通过使细胞接触选择剂测定有效转化的细胞群，或 者可对希望的标记基因性状筛选细胞。

(ⅰ)筛选

可以认为在任一个实验中将DNA引入仅为小百分比的靶细胞中。为 了提供用于鉴定接受DNA并将其整合于基因组中的细胞的有效系统，可 使用筛选那些稳定转化的细胞的方法。这种方法的一个典型实施方案是 向宿主细胞中引入一种提供对某一正常抑制剂如抗生素或除草剂的抗性 的标记基因。可使用的抗生素的实例包括氨基糖苷类抗生素新霉素、卡 那霉素和巴龙霉素，或抗生素潮霉素。对氨基糖苷类抗生素的抗性由氨 基糖苷磷酸转移酶如新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)或NPTⅠ提供，而 对潮霉素的抗性由潮霉素磷酸转移酶提供。

然后使有效转化的细胞接触选择剂。存活的细胞群体中将是那些通常 已整合了提供抗性的基因，并以足以使细胞存活的水平表达这些基因的 细胞。可进一步检测细胞，以证实外源DNA的稳定整合。使用此处公开 的技术，超过40％的被轰击胚可产生转化体。

已建议作为希望的选择剂的一种除草剂是广谱除草剂双丙氨膦。双丙 氨膦是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的一种三肽抗生 素，包括膦丝菌素(PPT)、L-谷氨酸类似物和两种L-丙氨酸残基。用胞 内肽酶除去L-丙氨酸残基后，PPT释放出来，它是谷氨酸合成酶(GS) 的一种强抑制剂，GS是一种参与氨同化和氮代谢的关键酶(Ogawa等人， 1973)。合成的PPT，除草剂LibertyTM中的有效成分，作为选择剂也是 有效的。PPT对植物中GS的抑制导致氨的快速积累和植物细胞的死亡。

产生双丙氨膦的生物和链霉菌属(Streptomyces)的其他种也合成膦 丝菌素乙酰转移酶(PAT)，该酶在吸水链霉菌中由bar基因编码，在绿 色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)中由pat基因编码。 编码乙酰转移酶(PAT)的除草剂抗性基因的用途参见DE 3642 829 A， 其中该基因分离自绿色产色链霉菌。在细菌来源的生物中，该酶使PPT 的游离氨基乙酰化，从而防止了自体毒性(Thompson等人，1987)。bar 基因已经克隆(Murakami等人，1986；Thompson等人，1987)，并在 转基因烟草、番茄、马铃薯(De Block,1987)、芸苔属(Brassica)(De Block,1989)和玉米(美国专利号5,550,318)中表达。在以前的报道中， 表达该抗性基因的一些转基因植物在温室中对PPT和双丙氨膦的商品制 剂有完全抗性。

在本发明实施中可用于筛选转化细胞系的除草剂的另一个实例是广谱 除草剂草甘膦。草甘膦抑制在芳族氨基酸生物合成途径中有活性的酶 EPSPS的作用。该酶的抑制导致氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸及其 衍生的次级代谢物的饥饿。美国专利4,535,060描述了赋予鼠伤寒沙门菌 (Salmonella typhimurium)EPSPS基因aroA草甘膦抗性的EPSPS突 变的分离。从玉蜀黍中克隆EPSPS基因，并在体外引入类似于草甘膦抗 性aroA基因中发现的突变。例如，在国际专利WO97/4103中描述了编 码草甘膦抗性EPSPS酶的突变基因。最佳表征的提供草甘膦抗性的突变 EPSPS基因包含残基102和106处的氨基酸改变，虽然预计其他突变也 是有用的(PCT/WO97/4103)。

为了使用bar-双丙氨膦或EPSPS-草甘膦选择系统，被轰击的组织在 非选择性培养基上培养0-28天，然后转移到适当含有1-3mg/l双丙氨膦 或1-3mM草甘膦的培养基中。1-3mg/l双丙氨膦或1-3mM草甘膦的范围 一般是优选的，而0.1-50mg/l双丙氨膦或0.1-50mM草甘膦的范围在本 发明的实施中将得到应用。可将组织置于任何多孔、隋性、固体或半固 体支持物上进行轰击，包括但不限于滤膜和固体培养基。双丙氨膦和草 甘膦是适用于转化体筛选的试剂的实例，但本发明的技术不限于此。

进一步构思，除草剂茅草枯(DALAPON),2,2-二氯丙酸，可用于鉴 定转化的细胞。2,2-二氯丙酸脱卤素酶(deh)灭活2,2-二氯丙酸的除草 剂活性，因此赋予表达编码脱卤素酶的基因的细胞或植物除草剂抗性 (Buchanan-Wollaston等人，1992；PCT申请WO95/06128；美国专利 号5,508,468；美国专利号5,508,468)。

另外，编码邻氨基苯甲酸合酶的基因可用作选择性标记基因，其提供 对某些氨基酸类似物如5-甲基色氨酸或6-甲基邻氨基苯甲酸的抗性。邻 氨基苯甲酸合酶基因作为选择性标记的应用在美国专利号5,508,468和美 国专利申请08/604,789中有述。

可筛选标记性状的一个实例是在玉米中在R基因座控制下产生的红 色素。该色素可通过在固体支持物上培养细胞而检测，该支持物含有能 支持该阶段生长并能从显色的菌落(可见的细胞聚集)中筛选细胞的营 养培养基。这些细胞可进一步在悬液中或固体培养基上培养。R基因座 可用于从被轰击的未成熟胚中筛选转化体。C1和B基因的引入将以相似 的方式产生着色的细胞和/或组织。

萤光素酶在本发明中可用作可筛选标记。在底物萤光素的存在下，表 达萤光素酶的细胞发光，这可用增强夜视的装置或用高度光敏感摄影机 如光子计数摄影机，在发光计(或液体闪烁计数器)中用摄影胶片或x 线胶片检测。所有这些测定都是非破坏性的，并可在鉴定后进一步培养 转化的细胞。光子计数摄影机是特别有价值的，因为它使人们能鉴定表 达萤光素酶的特定细胞或细胞群，并实时操作。可使用的另一种可筛选 标记是编码绿色荧光蛋白的基因(Sheen等人，1995)。

进一步构思，可筛选标记与选择性标记的结合可用于转化细胞的鉴 定。在某些细胞或组织型中，选择剂如双丙氨膦或草甘膦可不提供足够 的杀伤活性以明确识别转化的细胞，或者可导致转化体或非转化体的非 选择性抑制，从而使筛选技术失效。有人提出，用生长抑制剂如浓度低 于可引起100％抑制的双丙氨膦或草甘膦筛选，随后针对可筛选标记基因 如萤光素酶的表达来筛选生长的组织，使人们能够只从未经受筛选的细 胞或组织型中回收转化体。有人提出，选择和筛选的结合使得人们能在 多种细胞和组织型中鉴定转化体。 (ⅱ)再生和种子产生

接触选择剂后存活的细胞，或在筛选试验中评分为阳性的细胞，可在 支持植物再生的培养基中培养。在一个典型实施方案中，可通过另外加 入如生长调节剂的物质而改进MS和N6培养基(见表2)。用于此目的 的一种优选生长调节剂是麦草畏或2,4-D。然而，也可使用其他生长调节 剂，包括NAA、NAA+2,4-D或甚至毒莠定。已发现这样或以类似方法的 培养基改进有利于特定发育阶段的细胞生长。组织可保持于含生长调节 剂的基础培养基中，直到可获得足够的组织来开始植物再生尝试，或者 进行重复的人工选择，直到组织的形态学适于再生，至少2周，然后转 移到有助于胚状体成熟的培养基中。每2周将培养物转移到该培养基上。 发芽代表向缺乏生长调节剂的培养基中转移的时间。

通过选择和筛选鉴定并在支持再生的适当培养基中培养的转化细胞， 可长成植物。发芽的小植物被转移到无土植物生长混合物中，例如使其 在约85％相对湿度、600ppm CO2和25-250微爱因斯坦m-2s-1光照的环 境控制室中茁壮生长。植物优选地在生长室或温室中成熟。鉴定的转化 体大约6周到10个月后再生为植物，这取决于最初的组织。再生过程中， 细胞在组织培养容器中的固体培养基上生长。这类容器的说明性实施方 案是培养皿和植物Cons。再生的植物优选地在约19-28℃下生长。再生 的植物达到发芽和生根阶段后，可将其转移到温室中进一步生长并检测。

然而，注意到转化植物的核有时由于核发育中止和植物的早衰而需要 胚的拯救。为了拯救发育的胚，在传粉10-20天后将其从表面消毒的核上 切下并培养。用于该阶段培养的培养基的一个实施方案包含MS盐、2％ 蔗糖和5.5g/l琼脂糖。在胚拯救中，较大的胚(确定为长度大于3mm) 直接在合适的培养基上萌发。较小的胚可在含有上述成分与10-5M脱落 酸的培养基上培养1周，然后转移到不含生长调节剂的培养基上萌发。

可从转化的植物中得到后代，并通过对植物部分如叶子局部施加适当 的底物检测可外源表达基因的表达。对于bar转化的植物，发现如果经 体外酶测定评估，在植物中有功能性PAT活性，则转化的亲本植物(R0) 及所检测的任一代后代，在对叶局部施用除草剂Basta后将不显示双丙氨 膦相关的坏死。所检测的所有PAT阳性后代都含有bar，证实该酶的存 在和双丙氨膦抗性与通过标记基因种系的传播有关。 (ⅲ)表征

为了证实再生的植物中外源DNA或“转基因”的存在，可进行多种 测定。例如，这些测定包括：“分子生物学”测定，如Southern和Northern 印迹和PCRTM；“生物化学”测定，例如通过免疫学方法(ELISA和 Western印迹)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如 叶或根测定；以及分析再生的整个植物的表型。

1．DNA整合、RNA表达和遗传

利用本领域技术人员周知的技术，可从愈伤组织细胞系或任何植物部 分中分离基因组DNA，来测定外源基因的存在。注意，不总是存在完整 序列，这可能是由于细胞中序列的重排或缺失。

利用聚合酶链反应(PCRTM)可测定用本发明的方法引入的DNA元 件的存在。利用该技术扩增DNA的不连续片段，并通过凝胶电泳检测。 这类分析使人们能确定一种基因是否存在于稳定的转化体中，但不能证 明向宿主细胞基因组中引入的基因的整合。然而，发明者的经验是，DNA 已整合到通过PCRTM分析证明存在基因的所有转化体的基因组中。另外， 不可能利用PCRTM技术确定转化体中是否含有引入基因组不同位点的外 源基因，即，转化体是否是独立来源的。构思了利用PCRTM技术能克隆 与引入基因相邻的宿主基因组DNA片段。

可用Southern杂交技术确定DNA向宿主基因组中整合的阳性证据 和转化体的独立同一性。利用该技术，能鉴定引入宿主基因组并且侧翼 为宿主DNA序列的特异序列。因此特定转化体的Southern杂交模式可 作为该转化体的鉴别特征。另外，通过Southern杂交能证明引入的基因 在高分子量DNA中的存在，即证实引入的基因已整合到宿主细胞基因组 中。Southern杂交技术提供用PCRTM获得的信息，例如基因的存在，但 也证明向基因组中的整合，并表征每一转化体。

可以预计，利用作为Southern杂交技术改进法的斑点印迹或狭线印 迹杂交技术，能获得由PCRTM产生的相同信息，例如基因的存在。

PCRTM和Southern杂交技术都能用来证明转基因向后代的传递。在 大多数情况中，特定转化体的特有Southern杂交模式将在后代中分离为 一种或多种孟德尔基因(Spencer等人，1992)，表明转基因的稳定遗传。

可用自植物任一部分分离的DNA进行DNA分析技术，而RNA将只 在特定细胞或组织型中表达，因此必须从这些组织中制备RNA进行分 析。PCRTM技术也可用于由引入的基因产生的RNA的检测和定量。在 PCRTM的应用中，首先需要用如反转录酶将RNA反转录为DNA，然后 利用常规PCRTM技术扩增该DNA。在大多数情况中，PCRTM技术尽管 有用，但不能证明RNA产物的完整性。关于RNA产物性质的其他信息 可通过Northern印迹获得。该技术可证明RNA种的存在，并提供关于 RNA完整性的信息。RNA种的存在与否也能用斑点印迹或狭线印迹 Northern杂交确定。这些技术是Northern印迹的改进，并且只能证明RNA 种的存在与否。

2．基因表达

虽然Southern印迹和PCRTM可用来检测所述基因，但它们不能提供 关于基因是否表达的信息。可通过特异鉴定引入的基因的蛋白质产物， 或评价其表达引起的表型改变，来评价表达。

特定蛋白质的产生和鉴定的测定可利用蛋白质的物理化学、结构、功 能或其他性质。独有的物理化学或结构性质使得蛋白质能通过电泳法(如 天然或变性凝胶电泳)或等电聚焦或层析技术(如离子交换或凝胶排阻 层析)分离并鉴定。各种蛋白质的独有结构提供了利用特异抗体以如 ELISA测定的形式检测其存在的机会。可使用具有甚至更高特异性的方 法组合，如Western印迹，其中用抗体定位已用电泳技术分离的各基因 产物。也可用其他技术绝对证实目的产物的相同性，如纯化后通过氨基 酸测序估计。虽然这些是最常用的，但另外也可使用其他方法。

也可用测定法根据功能性特别是酶催化包括特异底物和产物的特异化 学反应的能力来鉴定蛋白质的表达。可通过物理或化学方法提供并定量 底物的丧失和反应产物的产生来进行这些反应。实例随待分析的酶而变 化，包括根据从膦丝菌素和14C-乙酰辅酶A产生放射性标记的乙酰化膦 丝菌素后测定PAT酶活性，或根据失去荧光素或邻氨基苯甲酸后测定邻 氨基苯甲酸合酶活性。

通常通过评价表达的表型结果测定基因产物的表达。这些测定也可采 取多种形式，包括但不限于分析化学组成的变化、形态学、或植物的生 理学性质。可通过表达编码改变了氨基酸组成的酶或贮藏蛋白的基因改 变化学组成，并可通过氨基酸分析或用改变淀粉量的酶检测，可通过近 红外反射光谱法分析。形态学改变可包括较大的体态或较粗的茎。植物 或植物部分对施加的处理反应引起的最常见的改变在称为生物测定的精 细控制的条件下评估。 Ⅶ．培育本发明的植物

除了用根据本发明的构建体直接转化特定基因型外，也可通过使含有 本发明的构建体的植物与缺少该构建体的第二种植物杂交产生本发明的 植物。因此，本发明不仅包括直接由根据本发明转化的细胞再生的植物， 而且包括该植物的后代。在此使用时，术语“后代”表示根据本发明制 备的亲本植物的任一代后代。在此公开时，“杂交”植物产生相对于初始 植物系含有一种或多种添加的转基因的植物系，其是指通过将初始系与 含有本发明的转基因的供体植物系杂交，而使本发明的转基因被引入植 物系中的技术。为实现这一点，通常进行下列步骤：

(a)种植第一种(初始系)和第二种(含有本发明的转基因的供体 植物系)亲本植物的种子；

(b)使第一种和第二种亲本植物的种子生长为带花的植物；

(c)用第二种亲本植物的花粉向第一种亲本植物的雌花传粉；和

(d)收获带雌花的亲本植物上产生的种子。

回交转化在此是指包括下列步骤的方法：

(a)使含有目的基因、DNA序列或元件的第一种基因型的植物与缺 乏该目的基因、DNA序列或元件的第二种基因型的植物杂交；

(b)筛选含有目的基因、DNA序列或元件的一个或多个后代植物；

(c)使该后代植物与第二种基因型的植物杂交；和

(d)重复步骤(b)和(c)，用于将目的基因、DNA序列或元件从 第一种基因型的植物转移到第二种基因型的植物。

DNA元件向植物基因型中的渐渗是指回交转化过程的结果。DNA序 列已渐渗的植物基因型可被称为回交转化的基因型、系、近交系或杂种。 类似地，缺乏所述目的DNA序列的植物基因型可被称为未转化的基因 型、系、近交系或杂种。 Ⅷ．植物转基因组合物

本发明的特别重要的进步在于提供了表达包括标记基因等转基因的改 进方法。这些转基因常常是引导特定蛋白质或多肽产物表达的基因，但 它们也可以是非可表达的DNA片段，如转座子，如不能引导其自身转座 的Ds。此处所用的“可表达基因”是能被转录为RNA(例如mRNA、 反义RNA等)或翻译为蛋白质、表达为目的性状等的任何基因，不限于 选择性、可筛选的或非选择性标记基因。本发明也构思了，当不必是标 记基因的可表达基因与标记基因联合使用时，人们可使用在相同或不同 DNA片段上的分离基因用于转化。在后一情况中，向受体细胞同时输送 不同的载体，以使共转化达到最大程度。

欲向受体细胞输送的特定DNA片段的选择通常取决于转化目的。作 物转化的一个主要目的是对植物添加某些商业需要的、农学重要的性状。 这些性状包括但不限于，除草剂抗性或耐受性；昆虫抗性或耐受性；病 害抗性或耐受性(病毒、细菌、真菌、线虫)；逆境耐受和/或抗性，典型 例子是对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐的抗性或耐受性；氧化应激； 提高的产量；食品含量与组成；物理外观；雄性不育；干燥；可堆积性 (standability)；多产；淀粉性质；油量和油质；等等。可希望掺入一种 或多种提供任何这类希望的性状的基因，如编码除草剂抗性的基因。

在某些实施方案中，本发明涉及用多于一种的有利转基因对受体细胞 的转化。使用不同的转基因编码载体，或者使用掺入了两种或多种基因 编码序列的一种载体，可在一个转化事件中提供两种或多种转基因。当 然，如希望也可使用所述任何两种或多种转基因，如提供除草剂、昆虫、 病害(病毒、细菌、真菌、线虫)抗性或抗旱性、雄性不育、干燥、可 堆积性、多产、淀粉性质、油量和油质、或提高产量或营养质量的转基 因。

本领域中众所周知，实际上可用任何特定转化技术引入任何DNA组 合物，最终产生能育的转基因植物。根据本公开内容(见，例如，Sambrook 等人，1989；Gelvin等人，1990)，本领域的技术人员公知可与本发明一 起使用的载体的构建。本发明的技术不限于任何特定的DNA序列。例如， 可使用载体或质粒形式的DNA片段，或线性DNA片段，在某些情况中 只含有将在植物中表达的DNA元件。

在某些实施方案中，可构思在单子叶植物转化中使用可复制型病毒载 体。这些载体包括，例如，小麦矮缩病毒(WDV)“穿梭”载体，如pW1-11 和PW1-GUS(Ugaki等人，1991)。这些载体能够在玉米细胞以及大肠 杆菌中自主复制，同样可提高检测向转基因细胞输送的DNA的敏感性。 复制载体也可用于输送侧翼为转座因子如Ac、Ds或Mu的DNA序列的 基因。有人提出(Laufs等人，1990)，玉米基因组内这些元件的转座需 要DNA复制。预计转座因子也可用于引入缺乏筛选和维持细菌中质粒载 体所需元件的DNA片段，例如，抗生素抗性基因和DNA复制起点。也 有人提出，转座因子如Ac、Ds或Mu的应用将大大促进目的DNA的整 合，从而提高稳定转化的细胞的频率。

另外预计，人们希望用两种或多种载体共转化植物或植物细胞。可用 含有标记和其他目的基因的载体实现共转化。此外，不同的载体如质粒， 可含有不同的目的基因，并可将质粒同时输送给受体细胞。利用该方法， 假定已经引入了标记的一定百分数的细胞也接受了其他目的基因。因此， 不是所有利用标记筛选的细胞都表达同时输送给细胞的其他目的基因。

用于转化植物细胞的载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、 BAC(细菌人工染色体)和其他DNA片段通常包括cDNA、希望引入细 胞中的基因。希望时这些DNA构建体可进一步包括如启动子、增强子、 多接头或调节基因的结构。为细胞引入选择的DNA片段或基因通常编码 将在重组细胞中表达的蛋白质，如将产生可筛选的或选择性性状，和/或 将赋予再生植物改进的表型。然而，不总是这样，本发明也包括掺入非 表达的转基因的转基因植物。本发明使用的载体中可能包含的优选成分 如下。

(ⅰ)调节元件

根据本发明制备的构建体通常包括限制玉米或其他单子叶植物中基因 沉默的启动子。这样，可从除希望转基因表达的单子叶植物之外的种中 分离该启动子。优选的构建体通常包含来源于薏苡属的启动子。这些启 动子可从薏苡中从头分离，或另外可根据已知基因或启动子的数据分离。 以上已特别公开了被认为特别适用于分离薏苡启动子的已知单子叶植物 基因和启动子的实例。

除了启动子之外，其他类型的元件也能调节基因表达。一种这样的基 因是位于转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列，被称为非翻译 前导序列。该前导序列能影响基因表达，前导序列的编译用来预测最佳 或次最佳的序列，并产生“共有”的和优选的前导序列(Joshi,1987)。 优选的前导序列包括预计引导结合基因最佳表达的序列，即，包括可增 强或保持mRNA稳定性并防止不恰当翻译起始的优选的共有前导序列。 根据本公开内容，本领域的技术人员公知这些序列的选择。来源于在植 物尤其在玉米中高表达的基因的序列是最优选的。

转录增强子或增强子的复制能用来增强表达。这些增强子常见于真核 细胞中起作用的启动子转录起点的5’，但通常能以正向或反向插入编码 序列的5’或3’。在某些情况中，这些5’增强元件是内含子。增强子的实 例包括来源于CaMV启动子，章鱼氨酸合酶基因(Ellis等人，1987)， 稻肌动蛋白1基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米缩小1基因和非植物真核 细胞(例如酵母；Ma等人，1988)的启动子的元件。

特别希望根据本发明使用的是包含ocs增强子元件的载体。该元件首 先被确定为农杆菌章鱼氨酸(ocs)基因的16bp回文增强子(Ellis等人， 1987)，并且存在于至少10种其他启动子中(Bouchez等人，1989)。有 人提出，当在单子叶植物转化中应用时，增强子元件如ocs元件特别是多 拷贝元件的应用，可用来提高从相邻启动子开始的转录水平。

包含多于一种基因的大DNA序列的引入可能是希望的。利用细菌或 酵母人工染色体(分别为BAC或YAC)或植物人工染色体可便于这些 序列的引入。例如，Hamilton等人(1996)公开了BAC用于农杆菌介 导的转化的应用。

最后，用于引入单子叶植物基因组的最希望的DNA片段可以是编码 希望性状(如提高每亩的产量)的同源基因或基因家族，其根据本发明 在新型启动子或增强子的控制下引入。组织特异的调节区尤其可用于此 方面。实际上，预计本发明的特殊用途可以是产生包含以组织特异方式 导向的转基因的转化体。例如，昆虫抗性基因可在轮和领/鞘组织中特异 表达，其分别导向第一和第二批欧洲玉米钻虫(ECB)。同样，编码对根 虫(rootworm)有特定活性的蛋白质的基因可被直接导向根组织。另外， 影响谷粒营养成分的某些基因的表达必须被导向种子，如胚乳或胚。

在转基因植物中组织特异性导向基因表达的载体一般包括组织特异性 启动子，并也可包括其他组织特异的控制元件如增强子序列。根据本公 开内容，本领域技术人员公知按照本发明在某些植物组织中引导特异或 增强的表达的启动子。

构思组织特异性表达也可通过引入组成型表达的基因(所有组织)及 只在基因产物是不希望的组织中表达的反义基因而功能性地实现。例如， 可引入编码苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)(Bt)的结晶毒素蛋白的 基因，使其可以用组成型启动子如薏苡的肌动蛋白启动子在所有组织中 表达。另外，预期来源于多于一种启动子的启动子结合元件也可能是有 用的。例如，美国专利号5,491,288公开了花椰菜花叶病毒启动子与组蛋 白启动子的结合。例如使用玉米醇溶蛋白启动子，Bt基因的反义转录物 在玉米粒中的表达可阻止种子中Bt蛋白的积累。因此引入的基因所编码 的蛋白质将存在于除粒之外的所有组织中。

此外，希望获得来源于薏苡的新型组织特异性启动子序列用于本发 明。为了实现这一点，可以首先从有关组织中分离cDNA克隆，并用例 如Northern印迹鉴定在组织中特异表达的克隆。理想地，人们希望鉴定 不以高拷贝数存在但其基因产物在特异组织中相对丰富的基因。然后可 用本领域技术人员公知的分子生物学技术定位相应基因组克隆的启动子 和控制元件。

另一种有用的鉴定组织特异性启动子的方法是差异显示(见，例如， 美国专利号5,599,672，其公开内容在此引用作为参考)。在差异显示中， 比较来源于不同组织型的mRNA。通过鉴定只在特定组织型或组织型组 中存在的mRNA，能够鉴定以组织特异方式表达的相应基因。RNA能被 反转录酶转录，产生cDNA,cDNA随后被用来分离含有全长基因的克隆。 如此处具体公开的，也能利用例如抑制PCR用cDNA从相应的基因中分 离部分同源或同源的启动子、增强子或终止子。

预期转基因植物中某些基因的表达只在特定条件下是希望的。例如， 有人提出提供对逆境因素抗性如抗旱性的某些基因的表达只在实际的逆 境条件下是希望的。进而预期这些基因在整个植物发育过程中的表达可 能具有有害作用。众所周知，存在大量对环境应答的基因。例如，当由 植物光敏素介导时，某些基因如编码核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的rbcS 的表达受光调节。其他基因由次级刺激物诱导。例如，脱落酸(ABA) 的合成由某些环境因素诱导，包括但不限于缺水。许多基因显示受ABA 的诱导(Skriver和Mundy,1990)。可以预料，提供对昆虫捕食抗性的 基因的表达只在实际昆虫侵袭的条件下是希望的。因此，对于某些希望 的性状，转基因植物中基因的诱导型表达是希望的。

有人提出，在本发明的某些实施方案中，转基因植物中的基因表达只 在植物发育的某一阶段是希望的。发育时间通常与组织特异的基因表达 有关。例如，玉米醇溶蛋白贮藏蛋白的表达在胚乳中开始于大约传粉后10 天。

可以预期，在细胞内导向DNA本身也是有用的。例如，向核导向引 入的DNA可能是有用的，因为这可提高转化率。在核内，导向一种基因 以实现位点特异整合是有用的。例如，使经转化引入的基因替换细胞中 已有的基因是有用的。

(ⅱ)终止子

构建体一般包含目的基因与用作终止转录信号并使产生的mRNA聚 腺苷酸化的3’末端DNA序列。最优选的3’元件预计是根瘤农杆菌胭脂氨 酸合酶基因的元件(nos3’末端)(Bevan等人，1983)，根瘤农杆菌章鱼 氨酸合酶基因的T7转录物终止子，和马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂Ⅰ或 Ⅱ基因的3’末端。希望时可进一步包括如Adh内含子1(Callis等人， 1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人，1989)或TMVΩ元件(Gallie等 人，1989)的调节元件。另外，也可如以上对于启动子序列所述，按照 本发明从薏苡中分离终止子。

特别优选的终止子是从薏苡中分离的终止子。例如，γ薏苡醇溶蛋白 终止子和薏苡油质蛋白3终止子。这些终止子的克隆在下面的实施例2 和实施例3中有述。γ薏苡醇溶蛋白和油质蛋白3终止子的核酸序列分别 在例如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17中列出。

(ⅲ)转运肽或信号肽

与抗性基因编码序列连接的序列，其在翻译后从初始翻译产物上去 除，并且有利于蛋白质穿过细胞内膜或细胞外膜或向其中转运，被称为 转运序列(通常进入液泡、小泡、质体和其他胞内细胞器)和信号序列 (通常进入内质网、高尔基体和细胞膜外)。通过利于蛋白质向细胞内和 细胞外区室的转运，这些序列可提高保护其免受蛋白降解的基因产物的 积累。这些序列也使高表达的基因的其他mRNA序列与基因的编码序列 连接。由于被核糖体翻译的mRNA比裸mRNA更稳定，所以该基因之 前可翻译mRNA转录物的存在可提高该基因mRNA转录物的总稳定性， 从而增强基因产物的合成。由于转运序列和信号序列通常在翻译后从初 始翻译产物上去除，所以这些序列的应用可添加不可能在最终多肽上出 现的另外的翻译序列。进一步预期，为了提高蛋白质的稳定性，某些蛋 白质的导向是希望的(美国专利号5,545,818，在此引用作为参考)。

另外，可构建载体，并用于转基因植物细胞内特定基因产物的胞内导 向，或者用于引导蛋白质进入胞外环境。这一般通过将编码转运肽或信 号肽序列的DNA序列与特定基因的编码序列相连接而实现。得到的转运 肽或信号肽可分别向特定细胞内或细胞外目标转运蛋白质，然后在翻译 后其被去除。

这种应用的一个具体实例涉及提供除草剂抗性的蛋白质(如突变 EPSPS蛋白)向特定细胞器(如叶绿体)而不是向细胞质中的引导。典 型例子是使用rbcS转运肽，美国专利号5,728,925所述的叶绿体转运肽， 或美国专利号5,510,471所述的优化的转运肽，其允许蛋白质的质体特异 的导向。另外，将负责雄性不育的特定基因导向线粒体，或将耐受植物 病原体生物的某些基因导向胞外间隙，或将蛋白质导向液泡可能是希望 的。另一种应用涉及参与氨基酸生物合成或油类合成的酶向质体的引导。 这些酶包括可提高饲料赖氨酸含量的二氢吡啶二羧酸合酶。

(ⅳ)标记基因

为了提高鉴定转化体的能力，除目的表达基因之外还可以使用选择性 或可筛选标记基因。“标记基因”是赋予表达标记基因的细胞不同表型从 而可使这些被转化的细胞与不含该标记的细胞区分开来的基因。这些基 因可编码选择性或可筛选标记，这取决于该标记是提供能通过化学方法 即利用选择剂(例如，除草剂、抗生素等)“选择”的性状，还是只是能 通过观察或检测即通过“筛选”鉴定的性状(例如，绿色荧光蛋白)。当 然，合适的标记基因的许多实例为本领域所知，并且能用于本发明的实 施。

术语选择性或可筛选标记基因也包括编码“分泌型标记”的基因，其 分泌的检测能作为鉴定或选择被转化的细胞的方法。实例包括编码能通 过抗体相互作用鉴定的分泌型抗原或能根据其催化活性检测的分泌型酶 的标记。分泌型蛋白质分属许多类别，包括例如可通过ELISA检测的扩 散性小蛋白；可在胞外溶液中检测的小活性酶(例如，α-淀粉酶、β-内酰 胺酶、膦丝菌素乙酰转移酶)；插入或被捕获至细胞壁内的蛋白质(例如， 包含前导序列的蛋白质，如在伸展蛋白或烟草PR-S的表达单位中所见的 蛋白质)。

对于选择性分泌标记，使用编码在细胞壁中被隔开的蛋白质的基因是 特别有利的，该蛋白质包含独特的表位。这种分泌型抗原标记理想地使 用一种能在植物组织中提供低背景的表位序列，一种提供有效表达和引 导穿过质膜的启动子-前导序列，并产生在细胞壁中结合且仍可接近抗体 的蛋白质。修饰后包含独特表位的正常分泌型胞壁蛋白可满足所有这些 要求。

适于以该方法修饰的蛋白质的一个实例是伸展蛋白或富含羟脯氨酸的 糖蛋白(HPRG)。玉米HPRG的应用(Steifel等人，1990)是优选的， 因为该分子已在分子生物学、表达和蛋白质结构等方面充分表征。然而， 任一种伸展蛋白和/或富含甘氨酸的胞壁蛋白(Keller等人，1989)都可 通过加入抗原位点修饰，产生可筛选的标记。

分泌型可筛选标记的一个典型实施方案涉及编码胞壁蛋白HPRG的 玉米序列的应用，其被修饰后包含来源于鼠白细胞介素-1-β(IL-1-β)的 原区(proregion)的15个残基的表位。然而，实际上在这些实施方案中 可使用任何可检测的表位，因为根据极广泛的抗原：抗体组合的选择为本 领域的技术人员所周知。然后能用抗体标记结合显色或荧光添加物直接 检测来源于IL-1-β或任何其他蛋白质或表位物质的独特胞外表位。 1．选择性标记

在本发明中可使用多种选择性标记基因，包括但不限于neo基因 (Potrykus等人，1985)，其编码卡那霉素抗性且能用卡那霉素、G418、 巴龙霉素等选择；提供双丙氨膦抗性的bar基因；提供草甘膦抗性的突 变EPSP合酶蛋白(Hinchee等人，1988)；提供溴苯腈抗性的腈水解酶 基因如臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的bxn(Stalker等人，1988)； 提供对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制化学品抗性的突变乙酰乳酸合 酶基因(ALS)(欧洲专利申请154,204,1985)；氨甲蝶呤抗性DHFR 基因(Thillet等人，1988)，一种提供除草剂茅草枯抗性的茅草枯脱卤素 酶基因；或提供5-甲基色氨酸抗性的突变邻氨基苯甲酸合酶基因。当使 用突变EPSP合酶基因时，引入合适的叶绿体转运肽CTP(美国专利号 5,188,642)或OTP(美国专利号5,633,448)并使用修饰的玉米EPSPS 基因(PCT申请WO97/04103)可有另外的益处。

能在系统中用来选择转化体的选择性标记基因的一个说明性实施方案 是编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因，如吸水链霉菌的bar基因或绿色产 色链霉菌的pat基因。膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)可灭活除草剂双丙氨 膦、膦丝菌素(PPT)中的有效成分。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami 等人，1986；Twell等人，1989)，导致氨的快速积累和细胞死亡。

希望在本发明的实施中使用双丙氨膦抗性基因时，发明者发现在此方 面特别有用的基因是可从链霉菌属的种中获得的bar或pat基因(例如， ATCC号21,705)。bar基因的克隆已有描述(Murakami等人，1986； Thompson等人，1987)，并在植物中得到应用(De Block等人，1987； De Block等人，1989；美国专利号5,550,318)。 2．可筛选的标记

可使用的可筛选标记包括编码已知其多种显色底物的酶的β-葡糖醛酸 糖苷酶或uidA基因(GUS)；R-基因座基因，其编码一种调节植物组织 中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，1988)；β-内酰 胺酶基因(Sutcliffe,1978)，其编码已知其多种显色底物的酶(例如， PADAC，一种显色头孢菌素)；编码能转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧 酶的xylE基因(Zukowsky等人，1983)；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，1990)； 酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码一种能使酪氨酸氧化为DOPA 和多巴醌，随后缩合形成易于检测的化合物黑色素的酶；编码具有显色 底物的酶的β-半乳糖苷酶；允许生物发光检测的萤光素酶(lux)基因(Ow 等人，1986)；可用于钙敏感生物发光检测的水母蛋白基因(Prasher等 人，1985)；或编码绿色荧光蛋白的基因(Sheen等人，1995；Haseloff 等人，1997；Reichel等人，1996；Tian等人，1997；WO97/41228)。

预计玉米R基因复合体的基因尤其可用作可筛选的标记。玉米中的 R基因复合体编码可用来调节大多数种子和植物组织中花色素苷色素产 生的蛋白质。玉米株可具有一个或者多至四个R等位基因，它们结合起 来以发育和组织特异的方式调节色素产生。因此，引入这些细胞中的R 基因可导致红色素的表达，如果稳定引入，能目测到红色区。如果玉米 系带有编码花色素苷生物合成途径中酶中间产物的基因(C2、A1、A2、 Bz1和Bz2)的显性等位基因，但在R基因座处有隐性等位基因，则用 R对该系任何细胞的转化可引起红色素形成。典型的系包括Wisconsin 22，其含有rg-Stadler等位基因和TR112，一种为r-g、b、P1的K55衍 生物。此外，如果同时引入C1和R等位基因，则能使用玉米的任何基 因型。

有人进一步提出，可在嵌合构建体中使用R基因调节区，以提供控 制嵌合基因表达的机制。已知R基因座处表型表达的多样性多于其他任 何基因座(Coe等人，1988)。预计从结构R基因5’区获得的调节区在引 导如昆虫抗性、除草剂耐受性或其他蛋白质编码区的基因表达中是有价 值的。对于本发明，可以认为，可成功地使用任何不同的R基因家族成 员(例如，P、S、Lc等)。然而，最优选的通常是Sn(特别是Sn:bol3)。 Sn是R基因复合体的主要成员，在功能上类似于R和B基因座，因为Sn 控制某些幼苗和植物细胞中花色素苷色素的组织特异性沉积，因此其表 型类似于R。

可用于本发明的另一种可筛选标记是lux基因编码的萤火虫萤光素 酶。例如，可用X线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、弱光摄影机、 光子计数照相机或多孔光度计检测被转化的细胞中lux基因的存在。可以 想象，也可研发该系统用于如组织培养板上生物发光的群体筛选，或甚 至用于整个植物的筛选。编码绿色荧光蛋白的基因可作为特别有用的报 道基因(Sheen等人，1995；Haseloff等人，1997；Reichel等人，1996； Tian等人，1997；WO97/41228)。绿色荧光蛋白的表达可在特定光波长 照明下在细胞或植物中以荧光显示。 (ⅴ)用于单子叶植物修饰的转基因

本发明一个特别重要的进步在于它提供了用于在植物细胞中有效表达 除标记基因外的基因的方法和组合物。这些转基因通常是引导特定蛋白 质或多肽产物表达的基因，但也可以是非可表达的DNA片段，例如转座 子，如不引导其自身转座的Ds。在此使用时，“可表达基因”是能被转录 为RNA(例如mRNA、反义RNA等)或翻译为蛋白质、表达为目的性 状等的任何基因，不限于选择性、可筛选的或非选择性标记基因。本发 明也涉及，当不必是标记基因的可表达基因与标记基因联合使用时，可 使用在相同或不同DNA片段上的分离基因进行转化。在后一情况中，向 受体细胞同时输送不同的载体，以使共转化达到最大程度。

向受体细胞输送的特定DNA片段的选择通常取决于转化目的。作物 转化的一个主要目的是对植物增加某些商业需要的、农学重要的性状。 这些性状包括但不限于：除草剂抗性或耐受性；昆虫抗性或耐受性；病 害抗性或耐受性(病毒、细菌、真菌、线虫)；逆境耐受和/或抗性，典型 例子包括对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐逆境的抗性或耐受性；氧 化应激；提高的产量；食品含量与组成；物理外形；雄性不育；干燥； 可堆积性；多产；淀粉质量与数量；油量和油质；蛋白质质量和数量； 氨基酸组成；等等。可希望掺入一种或多种提供任何这类希望的性状的 基因，如编码除草剂抗性的基因。

在某些实施方案中，本发明涉及用多于一种的外源基因对受体细胞的 转化。在此使用的“外源基因”是在相同范围内在宿主基因组中通常不 能见到的基因。因此，这意味着基因可以从与宿主基因组不同的种中分 离，或者另外可从宿主基因组中分离，但其与不同于未改变的天然基因 中所见的一种或多种调节区有效连接。使用不同的转基因编码载体，或 者使用掺入了两种或多种基因编码序列的一种载体，可在一个转化事件 中提供两种或多种外源基因。例如，以趋同、趋异或同线方向含有bar 和aroA表达单位的质粒被认为是特别有用的。进一步优选的组合是昆虫 抗性基因如Bt基因与蛋白酶抑制剂基因如pinⅡ的组合，或bar与上述 任一种基因的组合应用。当然，希望时也可使用所述的任何两种或多种 转基因，如提供除草剂、昆虫、病害(病毒、细菌、真菌、线虫)抗性 或抗旱性、雄性不育、干燥、可堆积性、多产、淀粉性质、油量和油质、 或提高产量或营养质量的转基因。 1．除草剂抗性

编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因(bar和pat)、草甘膦耐受EPSP合 酶基因、草甘膦降解酶基因、编码草甘膦氧化还原酶的gox、deh(编码 可灭活茅草枯的脱卤素酶)、除草剂抗性(例如磺酰脲和咪唑啉酮)乙酰 乳酸合酶和bxn基因(编码可降解溴苯腈的腈水解酶)是用于转化的除 草剂抗性基因的较好实例。bar和pat基因编码膦丝菌素乙酰转移酶 (PAT)，该酶可灭活除草剂膦丝菌素，并防止该化合物抑制谷氨酰胺合 成酶。5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(EPSP合酶)一般被除草剂N- (磷酰基甲基)甘氨酸(草甘膦)抑制。然而，已知编码草甘膦抗性EPSP 合酶的基因。这些基因尤其可用于单子叶植物转化。deh基因编码茅草枯 脱卤素酶，并提供对除草剂茅草枯的抗性。bxn基因编码使溴苯腈转化为 非除草剂降解产物的特异性腈水解酶。 2．昆虫抗性

能被引入的潜在的昆虫抗性基因包括苏云金芽胞杆菌结晶毒素基因或 Bt基因(Watrud等人，1985)。Bt基因可提供对鳞翅目或鞘翅目昆虫如 欧洲玉米螟(ECB)的抗性。这些实施方案中使用的优选Bt毒素基因包 括CryⅠA(b)和CryⅠA(c)基因。在此方面也可使用影响昆虫生长或发育的 来源于苏云金芽胞杆菌其他种的内毒素基因。

可以预计，此处公开的转化方法所用的优选Bt基因是编码序列已被 修饰以提高在植物中尤其在玉米中表达的基因。制备合成基因的方法在 本领域众所周知，并且公开于例如美国专利号5,500,365和美国专利号 5,689,052，其公开内容均在此引用作为参考。这些修饰的Bt毒素基因的 实例包括合成Bt CryⅠA(b)基因(Perlak等人，1991)，和被称为1800b 的合成CryⅠA(c)基因(PCT申请WO95/06128)。下面的表3中列出了 本领域技术人员公知的其他Bt毒素基因的某些实例。 表3：苏云金芽胞杆菌δ-内毒素基因a 新的命名            旧的命名          GenBank保藏号# Cry1Aa              CryⅠA(a)           M11250 Cry1Ab              CryⅠA(b)           M13898 Cry1Ac              CryⅠA(c)           M11068 Cry1Ad              CryⅠA(d)           M73250 Cry1Ae              CryⅠA(e)           M65252 Cry1Ba              CryⅠB              X06711 Cry1Bb              ET5                 L32020 Cry1Bc              PEG5                Z46442 Cry1Bd              CryE1               U70726 Cry1Ca              CryⅠC              X07518 Cry1Cb              CryⅠC(b)           M97880 Cry1Da              CryⅠD              X54160 Cry1Db              PrtB                Z22511 Cry1Ea              CryⅠE              X53985                                 表3(续) Cry1Eb              CryⅠE(b)         M73253 Cry1Fa              CryⅠF            M63897 Cry1Fb              PrtD              Z22512 Cry1Ga              PrtA              Z22510 Cry1Gb              CryH2             U70725 Cry1Ha              PrtC              Z22513 Cry1Hb                                U35780 Cry1Ⅰa             CryⅤ             X62821 Cry1Ⅰb             CryⅤ             U07642 Cry1Ja              ET4               L32019 Cry1Jb              ET1               U31527 Cry1K                                 U28801 Cry2Aa              CryⅡA            M31738 Cry2Ab              CryⅡB            M23724 Cry2Ac              CryⅡC            X57252 Cry3A               CryⅢA            M22472 Cry3Ba              CryⅢB            X17123 Cry3Bb              CryⅢB2           M89794 Cry3C               CryⅢD            X59797 Cry4A               CryⅣA            Y00423 Cry4B               CryⅣB            X07423 Cry5Aa              CryⅤA(a)         L07025 Cry5Ab              CryⅤA(b)         L07026 Cry6A               CryⅥA            L07022 Cry6B               CryⅥB            L07024 Cry7Aa              CryⅢC            M64478 Cry7Ab              CryⅢCb           U04367 Cry8A               CryⅢE            U04364                                表3(续) Cry8B                     CryⅢG                 U04365 Cry8C                     CryⅢF                 U04366 Cry9A                     CryⅠG                 X58120 Cry9B                     CryⅨ                  X75019 Cry9C                     CryⅠH                 Z37527 Cry10A                    CryⅣC                 M12662 Cry11A                    CryⅣD                 M31737 Cry11B                    Jeg80                  X86902 Cry12A                    CryⅤB                 L07027 Cry13A                    CryⅤC                 L07023 Cry14A                    CryⅤD                 U13955 Cry15A                    34kDa                  M76442 Cry16A                    cbm71                  X94146 Cry17A                    Cbm71                  X99478 Cry18A                    CryBP1                 X99049 Cry19A                    Jeg65                  Y08920 Cyt1Aa                    CytA                   X03182 Cyt1Ab                    CytM                   X98793 Cyt2A                     CytB                   Z14147 Cyt2B                     CytB                   U52043 a获自http:∥epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html

蛋白酶抑制剂也可提供昆虫抗性(Johnson等人，1989)，因此可用 于植物转化。预计番茄或马铃薯的蛋白酶抑制剂Ⅱ基因pinⅡ的应用是 特别有用的。更有利的是pinⅡ基因与Bt毒素基因的组合应用，已发现 其联合作用产生协同的杀昆虫活性。编码昆虫消化系统抑制剂的其他基 因，或编码利于抑制剂产生的酶或辅因子的基因，也可能是有用的。这 类的典型例子是例如来源于小麦和大麦的oryzacystatin和淀粉酶抑制 剂。

另外，编码凝集素的基因也可提供另外的杀昆虫性质。凝集素(最初 被称为植物凝集素)是多价的碳水化合物结合蛋白，具有凝集许多物种 的红细胞的能力。凝集素最近被鉴定为具有抗象鼻虫、ECB和根虫活性 的杀昆虫剂(Murdock等人，1990；Czapla和Lang,1990)。预计有用 的凝集素基因包括，例如大麦和小麦胚凝集素(WGA)和稻凝集素 (Gatehouse等人，1984),WGA是优选的。

当被引入昆虫时控制对昆虫有活性的大或小多肽产生的基因，如裂解 肽、肽激素和毒素和毒液，构成了本发明的另一方面。例如，可以预计， 针对特定害虫的保幼激素酯酶的表达也可产生杀昆虫活性，或者也许导 致变态的停止(Hammock等人，1990)。

表达编码影响昆虫外皮完整性的酶的基因的转基因玉米构成了本发明 的另一方面。这些基因包括编码例如几丁质酶、蛋白酶、脂酶的基因， 和产生尼可霉素-一种抑制几丁质合成的化合物-的基因，其任一种的 引入预计都可产生昆虫抗性玉米植物。编码影响昆虫蜕皮活性的基因， 如影响蜕皮甾类UDP-葡糖基转移酶产生的基因，也属于可用于本发明的 转基因的范围之内。

本发明也包括这类基因，其编码利于产生可降低宿主植物对害虫营养 质量的化合物的酶。例如，通过改变其固醇组成赋予植物杀昆虫活性是 可能的。固醇由昆虫从其食物中获得，并用于激素合成和膜稳定性。因 此通过表达新型基因，如直接促进产生不希望的固醇的基因，或使希望 的固醇转化为不希望形式的基因，改变植物的固醇组成，能对昆虫生长 和/或发育有不利影响，因此赋予植物杀昆虫活性。脂氧化酶是天然存在 的植物酶，其对昆虫显示抗营养作用，且降低食物的营养价值。因此， 本发明的另外的实施方案涉及具有增强的脂氧化酶活性、可耐受昆虫摄 食的转基因植物。

鸭茅状磨擦禾(Tripsacum dactyloides)是对某些昆虫包括玉米根虫 有抗性的一种草。预计编码对昆虫有毒或参与对昆虫有毒的化合物生物 合成的蛋白质的基因，可从磨擦禾(Tripsacum)中分离，这些新型基因 可用于提供对昆虫的抗性。众所周知，磨擦禾中昆虫抗性的基础是遗传 学的，因为这种抗性已通过有性杂交转移给玉蜀黍(Branson和Guss, 1972)。进一步预期，其他谷类、单子叶植物或双子叶植物种也可含有编 码对昆虫有毒的蛋白质的基因，其可用于产生昆虫抗性的玉米植物。

编码特征为具有强杀虫活性的蛋白质的其他基因也可据此用作转基 因。这些基因包括，例如：可用作根虫拒食剂的豇豆胰蛋白酶抑制剂 (GpTI；Hilder等人，1987)；编码除虫菌素的基因(除虫菌素和阿维 菌素，Campbell,W.C.编，1989；Ikeda等人，1987)，其证明特别可用 作玉米根虫拒食剂；核糖体失活蛋白基因；甚至调节植物结构的基因。 也涉及转基因玉米，其包含抗昆虫抗体基因和编码能将施用于植物外部 的无毒杀虫剂(前杀虫剂)在植物内转化为杀昆虫剂的酶的基因。 3．环境或逆境抗性

玉米耐受不同逆境例如但不限于干旱、过湿、寒冷、冷冻、高温、盐 和氧化应激的能力的提高，也可通过新型基因的表达实现。有人提出， 通过引入如Winter Flounder(Cutler等人，1989)的“抗冻蛋白”或其 合成基因衍生物可实现在提高抗冻性方面的优点。通过增加叶绿体中甘 油-3-磷酸乙酰转移酶的表达也可增强耐寒性(Wolter等人，1992)。对 氧化应激的抗性(通常由于如寒冷温度结合强光强度的条件而加剧)可 通过表达超氧化物歧化酶实现(Gupta等人，1993)，并可由谷胱甘肽还 原酶增强(Bowler等人，1992)。这些策略可导致在新场所中的耐冻性， 并将晚熟、高产品种扩展到相对早熟地区。

可以预期，有利地影响植物水含量、总水势、渗透压和膨压的新型基 因的表达将提高植物耐旱的能力。在此使用时，术语“抗旱性”和“耐 旱性”是指植物对因与正常环境相比水可得性降低诱导的逆境的抗性或 耐受性提高，和该植物在缺水环境中行使功能和存活的能力。对于本发 明的这一方面，例如，有人提出编码渗透活性溶质如多元醇化合物生物 合成的基因的表达可提供对干旱的保护。这类中包括编码甘露醇-L-磷酸 脱氢酶(Lee和Saier,1982)和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen等人，1992) 的基因。通过随后细胞中天然磷酸酶的作用，或通过特异磷酸酶的引入 和共表达，这些引入的基因将分别引起甘露醇或海藻糖的积累。这两者 都被证明为能减轻逆境影响的保护性化合物。已经证实了转基因烟草中 的甘露醇积累，初步结果表明表达高水平的这种代谢物的植物能耐受施 加的渗透压(Tarczynski等人，1992,1993)。

类似地，已经证明了其他代谢物在保护酶功能(例如alanopine或丙 酸)或膜完整性(例如alanopine)中的能力，因此编码这些化合物生物 合成的基因的表达可以以类似于或赋予甘露醇的方式引起抗旱性。具渗 透活性和/或在干旱和/或干燥过程中提供一定直接保护作用的天然存在代 谢物的其他实例包括果糖、赤藓糖醇(Coxson等人，1992)、山梨糖醇、 卫矛醇(Karsten等人，1992)、葡糖基甘油(Reed等人，1984；ErdMann 等人，1992)、蔗糖、水苏糖(Koster和Leopold,1988；Blackman等 人，1992)、棉子糖(Bernal-Lugo和Leopold,1992)、脯氨酸(Rensburg 等人，1993)、甘氨酸、甜菜碱、ononitol和松醇(Vernon和Bohnert, 1992)。通过引入和表达如那些控制上述渗透活性化合物和其他这类化合 物的基因，可增强逆境过程中连续的株冠生长和提高的繁殖适度。目前 优选的可促进渗透活性多元醇化合物合成的基因是编码甘露醇-1-磷酸脱 氢酶、海藻糖-6磷酸合酶和肌醇0-甲基转移酶的基因。

可以预期，特定蛋白质的表达也可提高抗旱性。根据结构类似性将三 类晚期胚发生蛋白质分类(见Dure等人，1989)。所有这三类LEA都已 在成熟(即干燥的)种子中得到证明。在这3类LEA蛋白质中，Ⅱ型 (dehydrin型)一般与植物部分中的干旱和/或干燥耐受性有关(即， Mundy和Chua,1988；Piatkowski等人，1990；Yamaguchi-Shinozaki 等人，1992)。最近，发现烟草中Ⅲ型LEA(HVA-1)的表达影响植物 高度、成熟和耐旱性(Fitzpatrick,1993)。在稻中，HVA-1基因的表达 影响对缺水和盐度的耐受性(Xu等人，1996)。因此所有这三类LEA类 别的结构基因的表达可提供耐旱性。在缺水时诱导的其他类型的蛋白质 包括硫醇蛋白酶、醛缩酶和跨膜转运蛋白(Guerrero等人，1990)，其可 在干旱应激情况下提供不同的保护性和/或修复型功能。也可以预期，实 现脂类生物合成因而膜组成的基因也可用来赋予植物抗旱性。

用于提高抗旱性的多种这类基因具有互补的作用模式。因此，可以想 象，这些基因的组合在提高玉米抗旱性中可具有加成的和/或协同的作用。 多种这类基因也可提高耐冻性(或抗冻性)；冷冻和干旱过程中发生的物 理应激在性质上相似，并可以相似的方式减轻。这些基因的组成型表达 可具有优点，但表达这些新型基因的优选方法可以是利用膨胀诱导型启 动子(如Guerrero等人，1990和Shagan等人，1993所述膨胀诱导基因 的启动子，在此引用作为参考)。这些基因的空间和时间表达模式可使玉 米能更好地耐受逆境。

有人提出，与增强从干土中汲取水的特异形态学性状有关的基因的表 达是有利的。例如，改变根特性的基因的引入和表达可增强水的摄取。 预计提高逆境期间繁殖适度的基因的表达也将具有重要价值。例如，提 高花粉脱落与雌花部分即丝接受的同步性的基因的表达将是有利的。另 外，有人提出，逆境期间使谷粒败育减至最小程度的基因的表达将提高 收获的谷物的量，因此是有价值的。

假定水在决定产量中有全面的作用，预计通过引入和表达新型基因使 玉米能更有效地利用水，甚至在土壤中水可得性不受限制时仍将提高总 的表现。通过引入可提高玉米在与水利用性有关的逆境时最大程度利用 水的能力的基因，可了解产量稳定性或产量表现的一致性。 4．抗病性

有人提出，通过向单子叶植物如玉米中引入基因可实现增强的抗病 性。产生对病毒、细菌、真菌和线虫引起的病害的抗性是可能的。预计 也可通过被引入的基因的表达实现产真菌毒素的生物的防治。

病毒抗性可通过新型基因的表达产生。例如，已经证明，病毒外壳蛋 白在转基因植物中的表达能赋予植物对病毒和其他密切相关病毒感染的 抗性(Cuozzo等人，1988,Hemenway等人，1988,Abel等人，1986)。 预计针对关键病毒功能的反义基因的表达可提供对这些病毒的抗性。例 如，针对负责病毒核酸复制的基因的反义基因可抑制复制，并产生病毒 抗性。相信利用反义基因对其他病毒功能的干扰也可提高病毒抗性。另 外有人提出，通过其他方法包括但不限于利用卫星病毒实现病毒抗性也 是可能的。下面在表4中列出了病毒和病毒样病害的实例，人们可根据 本发明向转基因植物中引入对其的抗性。 表4：植物病毒和病毒样病害

             病害                             病原体 美洲小麦条点病(小麦条点花叶病)    美洲小麦条点花叶病毒(AWSMV) 大麦条纹花叶病                    大麦条纹花叶病毒(BSMV) 大麦黄矮病                        大麦黄矮病毒(BYDV) 雀麦花叶病                        雀麦花叶病毒(BMV) 谷类褪绿斑驳病*                  谷类褪绿斑驳病毒(CCMV) 玉米褪绿脉结病(巴西玉米花叶病)1  玉米褪绿脉结病毒(CCVBV) 玉米致死性坏死                    病毒复合体(玉米褪绿斑驳病毒[MCMV]和

                              玉米矮缩花叶病毒[MDMV]A或B或小麦

                              线条花叶病毒[WSMV]) 黄瓜花叶病                        黄瓜花叶病毒(CMV) Cynodon褪绿线条病*,1             Cynodon褪绿线条病毒(CCSV) 约翰逊草花叶病                    约翰逊草花叶病毒(JGMV) 玉米丛缩病                        支原体样生物(MLO)相关的 玉米褪绿矮缩病                    玉米褪绿矮缩病毒(MCDV) 玉米褪绿斑驳病                    玉米褪绿斑驳病毒(MCMV) 玉米矮缩花叶病                    玉米矮缩花叶病毒(MDMV)A、D、E和

                                F株 玉米枯斑病                          玉米枯斑病毒(MLFV) 玉米线条病*                        玉米线条病毒(MLV) 玉米花叶病(玉米叶条斑病，enanismo    玉米花叶病毒(MMV) rayado) 玉米斑驳和褪绿矮化病1               玉米斑驳和褪绿矮化病毒* 玉米明环斑病*                       玉米明环斑病毒(MPRV) 玉米raya gruesa*,1                 玉米raya gruesa病毒(MRGV) 玉米雷亚多非纳病*(细条纹病)        玉米雷亚多非纳病毒(MRFV) 玉米红叶和红条病*                  柔膜体？ 玉米红条病*                        玉米红条病毒(MRSV) 玉米环斑驳病*                      玉米环斑驳病毒(MRMV) 玉米rioⅣ*                         玉米rio cuarto病毒(MRCV) 玉米粗缩病*(nanismo ruvido)        玉米粗缩病毒(MRDV)(=谷类分蘖病毒) 玉米不育矮化病*                    玉米不育矮化病毒(大麦黄条点病毒株) 玉米条斑病*                        玉米条斑病毒(MSV) 玉米条纹病(玉米褪绿条纹病，玉米hoja  玉米条纹病毒 blanca) 玉米矮化病*,1                      玉米矮化病毒 玉米缨脱落病*                      玉米缨脱落病毒(MTAV) 玉米脉突病*                        玉米脉突病毒(MVEV) 玉米鼠耳病*                        玉米鼠耳病毒(MWEV) 玉米白叶病*                        玉米白叶病毒 玉米白纹花叶病                      玉米白纹花叶病毒(MWLMV) 粟红叶病*                          粟红叶病毒(MRLV) 北方禾谷花叶病*                     北方禾谷花叶病毒(NCMV) 燕麦伪丛簇病*(zakuklivanie)        燕麦伪丛簇病毒 燕麦不育矮缩病*                    燕麦不育矮缩病毒(OSDV) 稻黑条矮缩病*                      稻黑条矮缩病毒(RBSDV) 稻条纹叶枯病*            稻条纹叶枯病毒(RSV) 高粱花叶病                高粱花叶病毒(SrMV)，以前称为甘蔗花

                      叶病毒(SCMV)H、I和M株 甘蔗菲济岛病*            甘蔗菲济岛病毒(FDV) 甘蔗花叶病                甘蔗花叶病毒(SCMV)A、B、D、E、SC、

                      BC、Sabi和MB株(以前称MDMV-B) 脉突病*,1                病毒？ 小麦斑点花叶病1           小麦斑点花叶病毒(WSMV)

*在美国不知其在玉米中自然存在。1次要病毒病害。

有人提出，通过引入新型基因可实现对细胞和真菌引起的病害的抗性 提高。可以预期，编码所谓“肽抗生素”、病理相关(PR)蛋白、毒素抗 性和影响宿主病原体相互作用如形态学特征的蛋白质的基因将是有用 的。肽抗生素是可抑制细菌和其他微生物生长的多肽序列。例如，被称 为杀菌肽和爪蟾抗菌肽的肽类抑制许多种细菌和真菌的生长。有人提出， PR蛋白在单子叶植物(如玉米)中的表达可用来提供对细菌病害的抗性。 在病原体攻击后在宿主植物中诱导这些基因，并可分类为至少5类蛋白 质(Bol,Linthorst和Cornelissen,1990)。PR蛋白包括β-1,3-葡聚糖酶、 几丁质酶和渗透蛋白和被认为在植物对病害生物的抗性中起作用的其他 蛋白质。已经鉴定了具有抗真菌性质的其他基因，如UDA(小荨麻凝集 素)和hevein(Broakaert等人，1989；Barkai-Golan等人，1978)。众 所周知，某些植物病害是由于植物毒素的产生引起的。有人提出，对这 些病害的抗性可通过表达编码能降解或另外灭活植物毒素的酶的新型基 因而实现。可以预期，改变宿主植物与病原体间相互作用的新型基因的 表达也可用于降低病害生物侵袭宿主植物组织的能力，例如，叶表皮蜡 质或其他形态学特征的提高。下面表5、6、7中列出了细菌和真菌病害 的实例，包括霜霉病，人们可根据本发明向转基因植物中引入对其的抗 性。 表5：植物细菌病害

           病害                                病原体 细菌性叶枯病和茎腐病             燕麦假单胞菌燕麦亚种(Pseudomonas avenae

                             subsp.avenae) 细菌性叶斑病                     野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种

                             (Xanthomonas campestris pv.holcicola) 细菌性茎腐病                     溶解肠杆菌(Enterobacter dissolvens)=溶解欧

                             文氏菌(Erwinia dissolvens) 细菌茎腐和顶腐病                 胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia

                             carotovora subsp.carotovora)、菊欧文氏菌玉米

                             致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae) 细菌性条纹病                     高粱叶斑病假单胞菌(Pseudomonas

                             andropogonis) 斑点病                           丁香假单胞菌晕斑变种(Pseudomonas syringae

                             pv.coronafaciens) Goss′s细菌性枯萎病(叶斑枯病)    密执安棒状杆菌内布拉斯加亚种(Clavibacter

                             michiganensis subsp.nebraskensis)=密执安棒杆

                             菌尼布拉斯加致病变种(Corynebacterium

                             michiganense pv.nebraskense) 紫斑病                           丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas

                             syringae pv.syringae) 紫叶鞘病                         兼性寄生菌+(见真菌) 种子腐烂病-籽枯萎病              枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) Stewart′s病(细菌性萎蔫病)       斯氏泛菌(Pantoea stewartii)=斯氏欧文氏菌

                             (Erwinia stewartii) 玉米矮化病(achapparramiento，玉孔氏螺原体(Spiroplasma kunkelii) 米矮化病，Mesa Central或Rio Grande玉米矮化病) 表6：植物真菌病害

   病害                              病原体 炭疽叶枯病和炭疽茎腐病    禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)(有性

                      型：Glomerella graminicola Politis)、Glomerella

                      tucumanensis(无性型：Glomerella falcatum Went) 曲霉穗腐和赤霉病          黄曲霉(Aspergillus flavus)Link:Fr. 带状叶斑病和鞘斑病*      茄病丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)=小菌核

                      丝核菌(Rhizoctonia microsclerotia J.Matz)(有性

                      型：瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)) 黑斑病                    直立顶孢霉(Acremonium strictum W.Gams)=顶

                      头孢(Cephalosporium acremonium Auct.non Corda) 黑赤霉病*                柯柯豆毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)=可

                      可球色单隔孢(Botryodiplodia theobromae) Borde blanco*            微皮伞属(Marasmiellus)的种 褐斑病(黑斑病、茎腐病)    玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis) 头孢赤霉病                直立顶孢霉=顶头孢 炭腐病                    菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina) 白菜穗腐病*              瓜亡革菌=世木伏革菌(Corticium sasakii) 苦乌叶斑病                棒形弯孢(Curvularia clavata)、C.eragrostidis=斑

                      点弯孢(C.maculans)(有性型：Cochliobolus

                      eragrostidis)、不等弯孢(Curvularia inaequalis)、

                      中间弯孢(C.intermedia)(有性型：中间旋孢腔菌

                      (Cochliobolus intermedius))、新月弯孢(Curvularia

                      lunata)(有性型：Cochliobolus lunatus)、苍白弯

                      孢(Curvularia pallescens).(有性型：苍白旋孢

                      腔菌(Cochliobolus pallescens))、远志弯孢

                      (Curvularia senegalensis)、C.tuberculata(有性

                      型：Cochliobolus tuberculatus) Didymella叶斑病*         Didymella exitalis 色二孢穗腐和茎腐病           干腐壳色单隔孢(Diplodia frumenti)(有性型：

                         Botryosphaeriafestucae) 色二孢穗腐病、茎腐病、种子腐马伊德壳色单隔孢(Diplodia maydis)=Stenocarpella 烂病和籽枯萎病               maydis 色二孢叶斑病或叶线条病       Stenocarpella macrospora=大孢壳色单隔孢(Diplodia

                         macrospora) *在美国不知其在玉米中自然存在。 表7：植物霜霉病

        病害                        病原体 褐条病霜霉病*                Sclerophthora rayssiae var.zeae Crazy top霜霉病              大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)=大

                         孢指梗霉(Sclerospora macrospora) 绿穗霜霉病(graminicola霜霉病)禾生指梗霉(Sclerospora graminicola) 爪哇霜霉病*                 Peronosclerospora maydis=玉蜀黍指梗霉

                         (Sclerospora maydis) 菲律宾霜霉病*               Peronosclerospora philippinensis=菲律宾指梗霉

                         (Sclerospora philippinensis) 高粱霜霉病                   Peronosclerospora sorghi=高粱指梗霉

                         (Sclerospora sorghi) Spontaneum霜霉病*           Peronosclerospora spontanea=Sclerospora

                         spontanea 甘蔗霜霉病*                 Peronosclerospora sacchari=甘蔗指梗霉

                         (Sclerospora sacchari) 干穗腐病(穗轴、核和茎腐病)   稻黑孢(Nigrospora oryzae)(有性型：Khuskia

                         oryzae) 穗腐病，次要                 链格孢(Alternaria alternata)=细链格孢(A.

                         tenuis).灰绿曲霉(Aspergilhiis glaucus)、黑曲

                         霉(A.niger)、曲霉属(Aspergillus)的种、灰

                              葡萄孢(Botrytis cinerea)(有性型：Botryotinia

                              fuckeliana)、小克银汉霉属(Cunninghamella)

                              的种、苍白弯孢、Doratomyces stemonitis=

                              Cephalotrichum stemonitis、黄色镰孢(Fusarium

                              culmorum)、Gonatobotrys simplex、Pithomyces

                              maydicus、小孢根霉(Rhizopus microsporus

                              Tiegh.)、匍枝根霉(R.stolonifer)=黑根霉(R.

                              nigricans)、布朗氏帚霉(Scopulariopsis

                              brumptii). 麦角病*(马齿病、diente de        巨大麦角(Claviceps gigantea)(无性型： caballo)                          Sphacelia sp.) 轮斑病                            玉蜀黍短梗霉(Aureobasidium zeae)=玉蜀黍

                              球梗孢(Kabatiella zeae) 镰孢穗腐和茎腐病                  Fusarium subglutinans=亚粘团串球镰孢(F.

                              moniliforme var.subglutinans) 镰孢核、根和茎腐病、种子腐烂病和  小孢串珠镰孢(Fusarium moniliforme)(无性 籽枯萎病                          型：Gibberella fujikuroi 镰孢茎腐病、籽根腐病              蚕豆镰孢(Fusarium avenaceum)(有性型：蚕

                              豆赤霉(Gibberella avenacea)) 赤霉穗腐和茎腐病                  玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(无性型：禾谷

                              镰孢(Fusarium graminearum)) 灰穗腐病                          玉蜀黍葡萄座腔菌(Botryosphaeria zeae)=

                              Physalospora zeae(无性型：玉蜀黍大茎点菌

                              (Macrophoma zeae)) 灰色叶斑病(尾孢叶斑病)            高粱尾孢(Cercospora sorghi)=C.sorghi var.

                              maydis、C.zeae-maydis 长蠕孢根腐病                      Exserohilum pedicellatum=Helminthosporium

                              pedicellatum(有性型：Setosphaeria pedicellata) 单孢枝霉穗腐病(枝孢腐烂病)        枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)=芽

                              孢状单孢枝霉(Hormodendrum

                              cladosporioides.)、草本枝孢(C.herbarum)(有

                              性型：塔森球腔菌(Mycosphaerella tassiand)) 透斑菌叶斑病*                    马伊德透斑菌(Hyalothyridium maydis) Late wilt*                       马伊德头孢(Cephalosporium maydis) 叶斑病，次要                      链格孢、马伊德壳二胞菌(Ascochyta maydis)、

                              A.tritici、A.zeicola、Bipolaris victoriae=

                              Helminthosporium victoriae(有性型：

                              Cochliobolus victoriae)、禾旋孢腔菌(C.sativus)

                              (无性型：Bipolaris sorokiniana=H.

                              sorokinianum=麦根腐长蠕孢(H.sativum))、黑

                              附球菌(Epicoccum nigrum)、Exserohilum

                              prolatum=Drechslera prolata(有性型：

                              Setosphaeria prolata)、Graphium penicillioides、

                              马伊德小球腔菌(Leptosphaeria maydis)、玉蜀

                              黍小球腔菌(Leptothyrium zea)e、Ophiosphaerella

                              herpotricha(无性型：线形孢属

                              (Scolecosporiella)的种)、Paraphaeosphaeria

                              michotii、茎点霉属(Phoma)的种、玉蜀黍壳

                              针孢(Septoria zeae)、玉蜀黍生壳针孢(S.

                              zeicola)、玉蜀黍壳针孢(S.zeina) 北方玉米叶枯病(white blast、冠茎  Setosphaeria turcica(无性型：大斑病明脐菌 腐病、条纹病)                     (Exserohilum turcicum)=大斑病长蠕孢

                              (Helminthosporiurn turcicum)) 北方玉米叶斑病、长蠕孢穗腐病(品   Cochliobolus carbonum(无性型：Bipolaris 种1)                              zdicola=炭色长蠕孢(Helminthosporium

                              carbonum)) 青霉穗腐病(blue eye、青霉病)      青霉属(Penicillium)的种、产黄青霉(P.

                              chrysogenum)、扩展青霉(P.expansum)、草

                           酸青霉(P.oxalicum) Phaeocytostroma茎腐病和根腐病  Phaeocytostroma ambiguum、=Phaeocytosporella

                           zeae 小暗球壳叶斑病*               马伊德小暗球壳(Phaeosphaeria maydis)=马

                           伊德亚球壳(Sphaerulina maydis) Physalospora    穗   腐   病   Botryosphaeria festucae=Physalospora zeicola (Botryosphaeria穗腐病)         (无性型：干腐壳色单隔孢(Diplodia frumenti)) 紫叶鞘病                       兼性寄生菌和真菌 棘壳孢茎腐病和根腐病           土壤茎点霉(Phoma terrestris)=土壤棘壳孢

                           (Pyrenochaeta terrestris) 腐霉根腐病                     腐霉属(Pythium)的种、P.arrhenomanes禾生

                           腐霉(P.graminicola.) 腐霉茎腐病                     瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)=巴特勒

                           腐霉(Pbutleri L.) Red kernel病(穗霉病、叶和种腐  黑附球菌 病) 丝核菌穗腐病(sclerotial rot)   玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)(有性型：

                           Waitea circinatd) 丝核菌根腐病和茎腐病           立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉蜀黍丝核菌 根腐病，次要                   链格孢、高粱尾孢、Dictochaeta fertilis、尖圭镰

                           孢(Fusarium acuminatum)(有性型：

                           Gibberella acuminata )、泡状木贼镰孢(F.

                           equiseti)(有性型：G.intricans)、尖镰孢(F.

                           oxysporum)、F.pallidoroseum、早熟禾镰孢(F.

                           poae)、土粉红镰孢(F.roseum)、G.cyanogena(无

                           性型：F.sulphureum)、Microdochium bolleyi、

                           毛霉属(Mucor)的种、Periconia circinata、恶

                           疫霉(Phytophthora cactorum)、德雷疫霉(P.

                           drechsleri)、寄生疫霉(P.nicotianae var.

                           parasitica)、少根根霉(Rhizopus arrhizus) 喙状叶斑病(长蠕孢叶斑病、穗和  长喙球隔孢(Setosphaeria rostrat)(无性型：喙 茎腐病)                        状明脐菌(Exserohilum rostratum)=嘴突长蠕

                           孢(Helminthosporium rostratum)) 锈病，普通玉米                 玉米柄锈菌(Puccinia sorghi) 锈病，南方玉米                 多堆柄锈菌(Puccinia polysora) 锈病，热带玉米                 苍白壳锈菌(Physopella pallescens)、玉蜀黍壳

                           锈菌(P.zeae)=Angiopsora zeae 小核菌穗腐病*(白绢病)         齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)(有性型：

                           Athelia rolfsii) 种子腐烂病-籽枯萎病            Bipolaris sorokiniana、B.zeicolci=炭色长蠕孢

                           (Helminthosporium carbonum )、马伊德壳色

                           单隔孢，Exserohilum Pedicillatum、大斑病明

                           脐菌=大斑病长蠕孢、燕麦镰孢(Fusarium

                           avenaceum)、黄色镰孢、小孢串球镰孢(F.

                           moniliforme)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(无

                           性型：禾谷镰孢(F.graminearum))、菜豆壳球

                           孢(Macrophomina phaseolina)、青霉属的种、

                           茎点霉属(Phomopsis)的种、腐霉属(Pythium)

                           的种、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉蜀黍

                           丝核菌(R.zeae)、Sclerotium rolfsii.穗霉属

                           (Spicaria)的种 壳月孢叶斑病*                 壳月孢属(Selenophoma)的种 鞘腐病                         禾顶囊孢(Gaeumannomyces graminis) 壳腐病                         禾漆斑菌(Myrothecium gramineum) Silage mold                    紫红曲(Monascus purpureus)、红色红曲(M.

                           ruber) 黑粉病，普通                   玉蜀黍黑粉菌(Ustilago zeae)=马伊德黑粉菌(U.

                           maydis)) 黑粉病，false                  稻绿核菌(Ustilaginoidea virens) 黑粉病，头状花序               丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana)=

                           Sporisorium holci-sorghi 胡麻叶枯病和茎腐病             异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)(无

                           性型：Bipolaris maydis=玉蜀黍长蠕孢

                           (Helminthosporium maydis)) 南方叶斑病                     Stenocarpella macrospora=大孢色二孢(Diplodia

                           macrospora) 茎腐病，次要                   高粱尾孢、Fusarium episphaeria、节状镰孢(F.

                           Merismoides)、尖镰孢(F.oxysporum

                           Schlechtend)、早熟禾谷镰孢、粉红镰孢、腐皮

                           镰孢(F.solani)(有性型：Nectria

                           haematococca)、三隔镰孢(F.tricinctum)、

                           Mariannaea elegans、毛霉属的种、玉蜀黍褐

                           孢座壳(Rhopographus zeae)、穗霉属(Spicaria)

                           的种 毛霉病                         曲霉属的种、青霉属的种和其他真菌 黑痣病*                       马伊德黑痣菌(Phyllachora maydis) 木霉穗腐病和根腐病             绿色木霉(Trichoderma viride)=木素木霉(T.

                           lignorum)有性型：肉座菌属(Hypocrea)的

                           种 白穗腐病、根和茎腐病           Stenocarpella maydis=玉蜀黍壳色单隔孢

                           (Diplodia zeae) 黄叶枯病                       Ascochyta ischaemi、马伊德叶点霉(Phyllosticta

                           maydis)(有性型：Mycosphaerella zeae-

                           maydis) 环纹叶斑病                     高粱胶尾(Gloeocercospora sorghi)

*在美国不知其在玉米中自然存在。

植物寄生线虫是许多植物包括玉米的病因。有人提出，通过新基因的 表达能使玉米对这些生物有抗性。可以预期，通过改变线虫识别或结合 宿主植物的能力和/或使植物能产生杀线虫剂包括但不限于蛋白质来实现 对线虫感染的防治。下面表8中列出了线虫相关植物病害的实例，人们 可根据本发明向转基因植物中引入对其的抗性。 表8：寄生线虫

病害                          病原体 Awl                  锥线虫属(Dolichodorus)的种、异头锥线虫(D.

                 heterocephalus) 鳞茎和茎(欧洲)       起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci) Burrowing            相似穿孔线虫(Radopholus similis) 胞囊                 燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、玉米异皮线虫(H.

                 zeae)、查尔科斑皮线虫(Punctodera chalcoensis) Dagger               剑线虫属(Xiphinema)的种、美洲剑线虫(X.

                 americanum)、地中海剑线虫(X.mediterraneum) 假根结               背侧珍珠线虫(Nacobbus dorsalis) Lance,Columbia       哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus) Lance                纽带线虫属(Hoplolaimus)的种、帽状纽带线虫(H.

                 galeatus) 损伤                 短体线虫属(Pratylenchus)的种、最短尾短体线虫(P.

                 brachyurus)、刻痕短体线虫(P.crenatus)、六纹短体线

                 虫(P.hexincisus)、落选短体线虫(P.neglectus)、穿

                 刺短体线虫(P.penetrans)、斯氏短体线虫(P.

                 scribneri)、索氏短体线虫(P.thornei)、玉米短体线虫

                 (P.zeae) 针                   长针线虫属(Longidorus)的种、短环长针线虫(L.

                 breviannulatus) 环                   小环线虫属(Criconemella)的种、装饰小环线虫(C.

                 ornata) 根结                  根结线虫属(Meloidogyne)的种，奇氏奶结线虫(M.

                  chitwoodi)、南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结

                  线虫(M.javanica) 螺旋                  螺旋线虫属(Helicotylenchus)的种 刺                    刺线虫属(Belonolaimus)的种、长地刺线虫(B.

                  longicaudatus) 粗短根                异毛刺线虫属(Paratrichodorus)的种、克氏异毛刺线

                  虫(P.christiei)、较小异毛刺线虫(P.minor)、锐利异

                  毛刺线虫(Quinisulcius acutus)、毛刺线虫属

                  (Trichodorus)的种 矮化                  不定矮化线虫(Tylenchorhynchus dubius) 5．真菌毒素减少/消除

与单子叶植物(如玉米)相关的真菌产生包括黄曲霉毒素和串珠镰孢 菌素的真菌毒素是使谷粒无用的重要因素。这些真菌生物不能引起病症， 和/或影响植物的生长，但它们产生对动物有毒的化学品(真菌毒素)。可 以预计，这些真菌的生长抑制将降低这些有毒物质的合成，由此减少由 于真菌毒素污染引起的谷粒损失。也有人提出，向单子叶植物如玉米中 引入可抑制真菌毒素合成而不干扰真菌生长的新基因是可能的。另外， 表达编码能使真菌毒素无毒的酶的新基因对于实现谷粒真菌毒素污染降 低是有用的。上述任一机制的结果是谷粒中真菌毒素的存在减少。 6．谷粒组成或质量

可向单子叶植物特别是商业重要谷类如玉米中引入基因，以改进谷类 主要生长的谷粒。可根据谷粒的最终特定用途设想这样产生的多种新型 转基因植物。

玉米粒的最大用途是用于饲料或食物。能改变谷粒组成的基因的引入 可大大提高饲料或食物的价值。玉米粒的主要成分是淀粉、蛋白质和油。 可通过改变其水平或组成来改善玉米粒的这些主要成分。可提及几个实 例用于说明，但决不是提供所有可能性的完全清单。

包括玉米的谷物蛋白质较适于饲料和食物用途，特别是当供给猪、家 禽和人时。该蛋白质缺乏这些物种的饮食中必需的几种氨基酸，需要向 谷粒中加入添加物。限制性的必需氨基酸包括赖氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸和组氨酸。一些氨基酸只有在玉米中补充 了用于饲料配制的其他补料后才成为限制性的。例如，当玉米中补充了 大豆粉来满足赖氨酸需要时，甲硫氨酸成为限制性的。可用以下机理评 价种子和谷粒中这些必需氨基酸的水平，包括但不限于，引入基因提高 氨基酸的生物合成、降低氨基酸的降解、提高蛋白质中氨基酸的贮存、 或增强氨基酸向种子或谷粒的转运。

提高氨基酸生物合成的一个机理是引入解除氨基酸生物合成途径控制 的基因，使植物不再能充分控制产生的水平。实现方法是解除或绕过氨 基酸生物合成途径中通常由该途径的氨基酸终产物水平调节的步骤。实 例包括，为了提高赖氨酸和苏氨酸产量，引入编码解控形式的天冬氨酸 激酶或二氢吡啶二羧酸(DHDP)合酶的基因，和为了提高色氨酸产量引 入编码邻氨基苯甲酸合酶的基因。氨基酸分解代谢的降低可通过引入DNA 序列而实现，这些序列可降低或消除编码催化分解代谢途径中步骤的酶 如赖氨酸-酮戊二酸还原酶的基因的表达。可以预计，将与氨基酸生物合 成有关的基因表达导向于种子的胚乳和胚是希望的。更优选地，该基因 可导向于胚。对于编码参与氨基酸生物合成的蛋白质的基因，用质体转 运肽序列将该蛋白质导向质体也是优选的。

可改变谷粒的蛋白质组成，以多种方法改进氨基酸平衡，方法包括提 高天然蛋白质的表达、降低组成不良的蛋白质的表达、改变天然蛋白质 的组成、或引入编码具有较佳组成的全新蛋白质的基因。实例可包括降 低贮藏蛋白的玉米醇溶蛋白家族成员表达的DNA的引入。该DNA可编 码减弱玉米醇溶蛋白表达或玉米表达调节剂(如不透明2号)基因产物 表达的核酶或反义序列。也有人提出，可通过共抑制现象，即，通过表 达经转化引入的相同结构基因或基因片段抑制内源基因的表达，来改变 谷粒的蛋白质组成(Goring等人，1991)。另外，引入的DNA可编码降 解玉米溶醇蛋白的酶。获得玉米醇溶蛋白表达的降低可通过增加具有更 希望的氨基酸组成的蛋白质或增加其他主要种子成分(如淀粉)来实现。 另外，可引入一种嵌合基因，其含有适当氨基酸组成的天然蛋白质如玉 米球蛋白或10kDδ玉米醇溶蛋白、20kDδ玉米醇溶蛋白或27kDγ玉米醇 溶蛋白之一的编码序列，和用来提高该蛋白质表达的启动子或其他调节 序列。该基因的编码序列可包括必需氨基酸的附加的或置换的密码子。 另外，也可使用从其他物种获得的编码序列，或用来提高种子氨基酸组 成、编码完整的独特的肽序列的部分或完全合成序列。可以预期，将编 码具有较佳组成的蛋白质的这些转基因的表达导向种子胚乳是优选的。

改变谷粒含油量的基因的引入是有价值的。含油量的提高可导致用于 饲料和食物的种子中可代谢能含量和密度的增加。引入的基因可编码能 除去或减少脂肪酸或脂类生物合成中限速步骤或调节步骤的酶。这些基 因包括但不限于编码乙酰辅酶A羧化酶、ACP-酰基转移酶、β-酮酰基-ACP 合酶，加其他众所周知的脂肪酸生物合成活性的基因。其他的可能性是 编码不具有酶活性的蛋白质如酰基载体蛋白的基因。可引入可改变油中 存在的脂肪酸平衡的基因，以提供更有益健康或更有营养的饲料。引入 的DNA也可编码阻止参与脂肪酸生物合成的酶表达的序列，改变如下所 述的谷粒中存在的脂肪酸的比例。发明者特别关注的基因的其他一些实 例，用于产生油组成性状已改变的转基因植物，包括2-乙酰转移酶、油 质蛋白、丙酮酸脱氢酶复合体、乙酰辅酶A合成酶、ATP柠檬酸裂合酶、 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，和肉碱辅酶A-乙酰辅酶A穿梭的基因。可以 预期，用质体转运肽序列，可将与油生物合成有关的基因的表达导向质 体，优选地在种子胚中表达。

可引入例如通过增加分支程度提高谷粒淀粉成分营养价值的基因，通 过延迟其代谢导致母牛对淀粉的利用提高。可以预期，与淀粉生物合成 有关的基因的表达优选地被导向于种子的胚乳。

除影响谷粒的主要成分外，当用于饲料或食物时，可引入影响谷粒的 其他营养、加工或其他性质方面的基因。例如，可提高或降低谷粒的色 素形成。在某些动物饲料中黄色素形成的增强和稳定性是希望的，实现 方法可以是引入通过去除其产生过程中的限速步骤而提高叶黄素和胡萝 卜素产量的基因。这些基因可编码改变形式的八氢番茄红素合酶、八氢 番茄红素去饱和酶或番茄红素合酶。此外，对于许多食用产品的产生未 着色的白玉米是希望的，并可通过引入可阻断或去除色素产生途径中步 骤的DNA而产生。

谷粒中的大多数磷内含物是肌醇六磷酸的形式，一种不被单胃动物代 谢的磷酸贮存形式。因此可以预期，为了提高种子磷酸的可利用性，希 望降低种子中肌醇六磷酸的量，并提高游离磷的量。此外，也可在玉米 种子中表达一种基因，该基因可在单胃动物的消化系统中例如被pH激 活，而从肌醇六磷酸释放磷酸，例如肌醇六磷酸酶。

主要含有玉米或其他谷物粒的饲料或食物具有数量不足的维生素，必 须补充才具有足够的营养价值。可设想引入能增强种子中维生素生物合 成的基因，包括例如，维生素A、E、B12、胆碱等。对于最佳营养价值 而言，玉米粒也没有足够的矿物质含量。尤其影响含磷、硫、钙、镁、 锌和铁的化合物积累或可用性的基因是有价值的。一个实例是引入可降 低肌醇六磷酸产生或编码可增强肌醇六磷酸分解的肌醇六磷酸酶的基 因。这些基因可提高饮食中可利用的磷酸的水平，减少对补充矿物磷酸 盐的需要。

也描述了改进用于饲料和食物的玉米或其他谷物的大量其他实例。这 些改进也许甚至不必涉及谷粒，但可以如改进玉米用作青贮饲料的价值。 为实现这一点的DNA引入可包括改变木质素产生的序列，如产生与优良 的畜用饲料价值相关的“褐色中脉”表型的序列。

除了饲料或食物价值的直接改进之外，也可引入改善玉米加工和提高 处理产生的产物价值的基因。加工玉米的主要方法是通过湿磨。通过表 达可提高加工效率且降低处理成本的新基因，如通过缩短浸泡时间，可 改进玉米。

提高湿磨产物价值可包括改变淀粉、油、玉米面筋粉或玉米面筋饲料 成分的数量或性质。通过鉴定和取消淀粉生物合成中的限速步骤，或通 过降低谷粒其他成分的水平，使淀粉比例升高，可实现淀粉的增多。前 者的一个实例是编码调节活性改变的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶或以较高水 平表达的基因的引入。后者的实例可包括例如核发育后期表达的蛋白质 或油生物合成的选择性抑制剂。

通过改变直链淀粉与支链淀粉的比例、淀粉分子的大小或其分支模 型，可有利地改淀粉的性质。通过这些改变，可改进许多性质，包括但 不限于，胶凝温度的改变、胶凝的加热、胶片和糊的透明度、流变学特 性等。为了实现这些性质的改变，可单独或联合引入编码颗粒结合的或 可溶性的淀粉合酶活性或分支酶活性的基因。也可用DNA如反义构建体 降低这些酶的内源活性的水平。引入的基因或构建体可具有调节序列， 控制其在淀粉生物合成和淀粉颗粒发育中在特定间隔表达。此外，引入 并表达导致淀粉分子葡萄糖部分体内衍生或其他修饰的基因也是有价值 的。可以设想任何分子的共价连接，其只受限于可催化淀粉颗粒中适当 底物衍生和可利用性的酶的存在。重要衍生的实例可包括官能团的加入， 如胺基、羧基或磷酸基，它们为随后的体外衍生提供位点，或通过引入 离子电荷影响淀粉性质。其他修饰的实例可包括葡萄糖单位的直接改变， 如羟基的丢失或其氧化为醛基或羧基。

油是玉米湿磨的另一种产物，其价值可通过基因的引入和表达来提 高。通过以上对饲料和食物所述的方法，可提高能用湿磨提取的油量。 也可改变油的特性，以改善其在烹饪油、面点酥松油脂、滑润剂或其他 油衍生产物的产生和应用中的表现，或在用于食品相关用途时，改善其 健康属性。也可合成新型脂肪酸，其在提取后能用作化学合成的原材料。 通过改变油中存在的脂肪酸的种类、水平或脂排列，可实现油质的改变。 这随后可通过下列方法完成：加入编码能催化新型脂肪酸和含有它们的 脂类合成的酶的基因，或者提高天然脂肪酸的水平而尽可能地降低前体 的水平。此外，也可引入能减缓或阻断脂肪酸生物合成中步骤的DNA序 列，从而引起前体脂肪酸中间物的增加。可加入的基因包括去饱和酶、 环氧酶、水合酶、脱水酶和能催化涉及脂肪酸中间物的反应的其他酶。 可被阻断的催化步骤的代表性实例包括，从硬脂酸去饱和为油酸，及从 油酸去饱和为亚麻酸，导致硬脂酸和油酸的分别累积。另一个实例是延 伸步骤的阻断，导致C8-C12饱和脂肪酸的积累。

通过引入基因获得新的玉米植物也可实现其他主要玉米湿磨产物玉米 面筋粉和玉米面筋饲料的改进。典型的可能性包括但不限于以上对于食 物和饲料价值的改善所述的。

另外，进一步认为，玉米植物可用于产生或制备有用的生物化合物， 这些化合物以前在玉米植物中根本不能产生或者不能以相同水平产生。 通过玉米转化法引入并表达基因，可使产生这些化合物的新型玉米植物 成为可能。可能性包括但不限于，目前由任何生物产生的任何生物化合 物，如蛋白质、核酸、初级和中间代谢物、糖聚合物等。这些化合物可 由植物产生，收获和/或处理后提取，并用于目前公认的任何有用的用途， 如制药、香料和工业用酶。

例举转基因植物中被引入基因潜在编码的谷粒性状或特性范围的其他 可能性包括，通过引入可增强γ玉米醇溶蛋白合成而具有较低分解敏感性 用于出口目的，或当干磨加工时有较大磨粒尺寸的谷粒，通过可提高果 皮厚度的基因而具有改进的爆裂特性和膨胀体积的爆米花，通过引入可 有效阻断参与色素产生途径的酶表达的基因而具有较白的谷粒用于食用 的玉米，和通过引入影响味道的基因如甜玉米的shrunken 1基因(编码 蔗糖合酶)或shrunken 2基因(编码ADPG焦磷酸化酶)而改进的酒精 饮料或甜玉米质量。 7．植物农学特征

决定玉米能在何处生长的两个因素是生长季节中的日平均温度和霜期 之间的时间长度。在可能生长玉米的地区，有对使其生长至成熟并可收 获的最长时间的不同限制。针对具有最大可能产量所需的时间内成熟并 干燥至可收获的湿含量的能力，筛选将在特定地区生长的玉米。因此， 对于不同的生长地点培育不同成熟度的玉米。除需要充分干燥而可收获 外，希望在使收获后干燥所需能量降至最小的范围内发生最大的干燥。 另外，谷粒越易于干燥，生长和颗粒饱满所需的时间越长。据认为，能 鉴定影响成熟和/或干燥的基因，并可使用转化技术将其引入玉米系中， 产生适于不同生长地点或生长地点相同但在收获时产量湿度比提高的新 玉米品种。参与植物发育调节的基因的表达可能是特别有用的，例如， 已在玉米中鉴定的无舌片和粗鞘基因。

预期可向单子叶植物中引入将提高堆积性和其他植物生长特性的基 因。提供较硬茎、改进根系统或者防止或减缓穗脱落的新基因的表达对 于农民有极大价值。有人提出，例如通过提高光分布和/或阻挡，引入和 表达可增加可利用的光同化总量的基因是有利的。另外，可提高光合作 用效率和/或叶冠的基因的表达将进一步提高产量。预期玉米中植物光敏 素基因的表达是有利的。这种基因的表达可降低顶端优势，使植物半矮 生，并提高耐荫性(美国专利号5,268,526)。这些方法可增加田地中的植 物群体。

晚季植物老化的延迟可增加同化产物向谷粒中的移动，从而提高产 量。有人提出，与“保持绿色”相关的玉米基因的过量表达或延迟老化 的任何基因的表达将是有利的。例如，已经在羊茅(Festuca pratensis) 中鉴定了一种不泛黄的突变体(Davies等人，1990)。该基因及其他基因 的表达可阻止叶绿素的过早分解，从而保持株冠的功能。 8．营养利用

利用可获得的养分的能力可能是单子叶植物如玉米生长的限制性因 素。有人提出，通过引入新的基因能改变养分的吸收、耐受极端pH、通 过植物转移、贮存库和代谢活性的可用性。这些修饰将使植物如玉米更 有效地利用可用的养分。预期植物中正常存在的和参与营养利用的酶活 性的提高将提高养分的可利用性。这种酶的一个实例是肌醇六磷酸酶。 进一步预期，玉米植物的氮利用提高是希望的。玉米中谷氨酸脱氢酶基 因如大肠杆菌gdhA基因的表达可导致有机化合物中的固氮作用增强。另 外，玉米中gdhA的表达可通过将过量的氨掺入谷氨酸中从而对氨解毒， 提高对除草剂草铵膦(glufosinate)的抗性。预计新基因的表达也可使以 前不可获得的营养源成为可利用的，例如，从更复杂的分子也许是大分 子释放有营养价值的成分的酶。 9．雄性不育

雄性不育在杂种种子的产生中是有用的。有人提出，雄性不育可通过 新基因的表达产生。例如，已经显示，编码可干扰雄花序和/或配子体发 育的蛋白质之基因的表达可导致雄性不育。已经证明在转基因烟草和油 菜籽花药中表达的嵌合核糖核酸酶基因可导致雄性不育(Mariani等人， 1990)。

发现许多突变在玉米中可引起细胞质雄性不育。特别是一种被称为T 细胞质的突变，也与对南方玉米叶枯病的敏感性有关。已确定一种被称 为TURF-13(Levings,1990)的DNA序列与T细胞质有关。有人提出， 经转化引入TURF-13能使雄性不育与病害易感性分开。由于为了培育和 谷粒产生目的，恢复雄性不育是必要的，因此有人提出也可引入编码恢 复雄性不育的基因。 10．负选择性标记

引入编码能被选择的性状的基因对于去除不希望的连锁基因是有用 的。预期当通过共转化同时引入两种或多种基因时，这些基因将在宿主 染色体上连锁在一起。例如，可向植物中引入编码赋予植物昆虫抗性的Bt 基因的基因，同时引入可用作选择性标记并赋予植物除草剂Liberty抗 性的bar基因。然而，使昆虫抗性植物对除草剂Liberty也有抗性可能 是不希望的。有人提出，当不希望在如整个植物部分中表达bar基因时， 也能引入可在这些植物中表达的反义bar基因。因此，尽管bar基因表 达并可用作选择性标记，但其不可用来赋予整个植物除草剂抗性。bar反 义基因是负选择性标记。

也可以预期，为对通过基因导向产生的较少同源重组子筛查转化子群 体，负选择是必要的。例如，可通过灭活以前在该细胞中表达的基因鉴 定同源重组子。已经对烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的负选择性标记研究了新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)的反 义基因(Xiang和Guerra,1993)。在该实施例中，通过转化向植物中引 入有义和反义NPTⅡ基因，得到的植物对抗生素卡那霉素敏感。一种被 引入的基因，其整合于宿主细胞染色体的反义NPTⅡ基因位点，并使该 反义基因失活，这可使植物对卡那霉素和其他氨基糖苷类抗生素有抗性。 因此，可通过筛选抗生素抗性鉴定较少的位点特异性重组子。类似地， 对于植物天然的或经转化引入的任何基因，当其失活时提供对化合物的 抗性，其可用作负选择性标记。

预期负选择性标记在其他方面也可能是有用的。一个应用是构建转基 因系，其中人们能筛选对非连锁位点的转座。在标记过程中，对于转座 因子最常用的是转移到同一染色体上的遗传连锁位点。用于恢复已对非 连锁基因座发生转座的稀有植物的选择性标记是有用的。例如，胞嘧啶 脱酰胺酶可用于此目的(Stouggard,1993)。在该酶的存在下，化合物5- 氟胞嘧啶被转化为对植物和动物细胞有毒的5-氟尿嘧啶。如果转座因子 与胞嘧啶脱酰胺酶的基因连锁，人们可通过选择转座事件选择向非连锁 位点的转座，其中得到的植物对5-氟胞嘧啶有抗性。亲本植物和含有连 锁位点转座的植物仍对5-氟胞嘧啶敏感。对5-氟胞嘧啶的抗性是由于转 座因子和胞嘧啶脱酰胺酶基因的基因分离引起胞嘧啶脱酰胺酶基因丢 失。在本说明书中，编码使植物对某种化合物敏感的蛋白质的其他基因 也可是有用的。例如，根瘤农杆菌的T-DNA基因2编码一种可催化α-萘 乙酰胺(NAM)转化为α-萘乙酸(NAA)的蛋白质，使植物细胞对高浓 度的NAM敏感(Depicker等人，1988)。

预期负选择性标记也可用于转座子标记系的构建。例如，通过用选择 性标记来标记自主转座因子如Ac、Master Mu或En/Spn，人们能选择 自主因子未稳定整合到基因组中的转化子。例如，有人提出，当自主因 子的瞬时表达反式激活缺陷转座因子如Ds的转座，但不希望自主因子的 稳定整合时，这是希望的。为了稳定缺陷因子，即，防止其进一步转座， 自主因子的存在可能不是希望的。然而，有人提出，如果植物中自主转 座因子的稳定整合是希望的，负选择性标记的存在可使得在培育过程中 去除自主因子成为可能。 (ⅵ)非蛋白质表达序列

1．RNA表达

可向玉米和其他单子叶植物中引入DNA，用于表达可影响植物表型 而不能翻译为蛋白质的RNA转录物。两个实例是反义RNA和具有核酶 活性的RNA。这两者都可在降低或消除天然或被引入的植物基因的表达 方面起可能的作用。

可构建或分离基因，当其转录时，产生互补于所有或部分导向信使 RNA的反义RNA。该反义RNA降低信使RNA多肽产物的产量。多肽 产物可以是植物基因组编码的任何蛋白质。上述基因被称为反义基因。 因此可用转化法向植物中引入反义基因，产生目的所选蛋白质表达降低 的新转基因植物。例如，该蛋白质可以是催化植物中反应的酶。酶活性 的降低可减少或消除反应产物，包括在植物中酶促合成的任何化合物， 如脂肪酸、氨基酸、碳水化合物、核酸等。另外，该蛋白质也可以是贮 藏蛋白，如玉米醇溶蛋白，或结构蛋白，其表达的降低可分别导致种子 氨基酸组成的改变或植物形态学改变。上述可能性只是实施例的形式， 并不代表申请的全部范围。

也可构建或分离基因，当其转录时产生RNA酶或核酶，这些酶能用 作内切核糖核酸酶，并能催化具有所选序列的RNA分子的切割。所选信 使RNA的切割能导致其编码的多肽产物的产量降低。这些基因可用于制 备含有它们的新转基因植物。这些转基因植物可含有降低水平的多肽， 包括但不限于上述可被反义RNA影响的多肽。

也能利用共抑制机理引入基因，产生天然基因产物表达降低的新转基 因植物。已经在烟草、番茄和矮牵牛中证明(Goring等人，1991；Smith 等人，1990；Napoli等人，1990；van der Krol等人，1990)，天然基因 的有义转录物的表达可以以类似于反义基因的方式降低或消除基因的表 达。被引入的基因可编码所有或部分导向天然蛋白质，但其翻译可能不 是天然蛋白质水平降低所必需的。

2．非RNA表达

包括转座因子如Ds、Ac或Mu的DNA元件可插入基因中引起突变。 可插入这些DNA元件，以便灭活(或激活)基因，从而“标记”特定性 状。在此情况中，转座因子不能引起标记突变的不稳定性，因为该因子 的应用不依赖于其在基因组中转移的能力。被希望的性状标记后，例如， 可用引入的DNA序列克隆相应的基因，如引入的DNA序列作为PCR 引物，并用PCR基因克隆技术(Shapiro,1983；Dellaoporta等人，1988)。 鉴定后，可如希望的分离、克隆并操作特定性状的完整基因，希望时包 括控制或调节区。为了基因标记而引入生物中的DNA元件的应用不依赖 于DNA序列，并且不依赖于DNA序列的任何生物活性，即，转录为RNA 或翻译为蛋白质。该DNA元件的唯一功能在于破坏基因的DNA序列。

可以预期，能向细胞中引入非表达的DNA序列，包括新合成的序列， 作为那些细胞和植物及其种子的特有“标记”。对于标记DNA元件，不 必破坏对于宿主生物而言为内源的基因的功能，因为该DNA的唯一功能 是鉴定生物的来源。例如，人们能向植物中引入唯一的DNA序列，该DNA 元件可鉴定由标记来源产生的所有细胞、植物和这些细胞的后代。有人 提出，标记DNA的内含使得人们能将特有种质或由其衍生的种质与未标 记的种质区分开来。

可引入的另一种可能的元件是基质附着区元件(MAR)，如鸡溶菌酶 A元件(Stief,1989)，它能在掺入植物基因组后位于目的可表达基因周 围，以实现该基因总表达的提高，并减少位置依赖的作用(Stief等人， 1989；Phi-Van等人，1990)。 Ⅸ．转基因的位点特异性整合或切除

发明者特别希望，能使用用于根据本发明制备的转基因的位点特异性 整合或切除技术。位点特异性整合或切除的一个优点是，它能用来解决 与常规转化技术有关的问题，其中转基因一般随机且多拷贝地整合于宿 主基因组中。如果外源DNA插入必需基因中，则被引入的DNA向宿主 细胞基因组中的随机插入可能是致死的。另外，周围基因组DNA引起的 “位置效应”可影响转基因的表达。此外，由于与多转基因拷贝转化有 关的困难，包括基因沉默、重组和不可预测的遗传，一般希望控制插入 DNA的拷贝数，通常只希望插入单拷贝的DNA序列。

在植物中能通过同源重组(见，例如，美国专利号5,527,695，在此 引用作为参考)实现转基因或转基因部分的位点特异性整合或切除。同 源重组是具有相似核苷酸序列的任何DNA序列对之间的反应，这两个序 列相互作用(重组)形成一种新的重组DNA种。当共有的核苷酸DNA 序列长度增加时，同源重组频率提高，且用线性质粒分子的高于用环形 质粒分子的。同源重组能在不相同的两个DNA序列之间发生，但当两个 序列之间差异增加时，重组频率下降。

通过将目的DNA分子和与宿主细胞内源序列同源的序列连接，能经 同源重组导向引入的DNA序列。DNA进入细胞后，两个同源序列即能 相互作用，在同源基因组DNA序列所处的位点插入该引入的DNA。因 此，被引入的DNA上所含同源序列的选择将决定经同源重组整合引入的 DNA的位点。例如，如果目的DNA序列和与宿主植物细胞单拷贝基因 同源的DNA序列连锁，目的DNA序列将通过同源重组只在一个特异位 点处插入。然而，如果目的DNA序列和与宿主真核细胞的多拷贝基因同 源的DNA序列连锁，那么目的DNA序列能通过同源重组在基因拷贝所 处的每一个特异位点处插入。

能通过同源重组反应向宿主基因组中插入DNA，包括一次相互重组 (导致全长引入DNA的插入)或两次相互重组(只导致位于两个重组事 件之间的DNA的插入)。例如，如果人们希望向选择基因所处的基因组 位点插入外源基因，则引入的DNA应含有与所选基因同源的序列。单同 源重组事件然后使完整引入的DNA序列插入所选的基因中。此外，可通 过使目的DNA序列的每一端(准备插入基因组中的序列)侧翼为与所选 基因同源的DNA序列来完成双重重组事件。包括每一同源侧翼区的同源 重组事件可导致外源DNA的插入。因此，只有那些位于基因组同源的两 个区之间的DNA序列才整合到基因组中。

尽管被引入的序列能通过同源重组插入特异基因组位点，但在高等真 核生物中，同源重组与随机插入事件相比是相对罕见的事件。在植物细 胞中，外源DNA分子在细胞基因组中具有同源序列，并以大约0.5-4.2×10-4 的频率重组。因此，含有经同源重组整合的引入DNA序列的任何转化细 胞也都可能含有多拷贝的随机整合的引入DNA序列。因此，为了保持对 拷贝数和插入DNA位置的控制，可以去除这些随机插入的DNA序列。 去除这些随机插入的一个方法是利用位点特异性重组酶系统。通常，一 种位点特异性重组酶系统由三种成分组成：两对DNA序列(位点特异性 重组序列)和特异性酶(位点特异性重组酶)。位点特异性重组酶将只催 化两个位点特异性重组序列之间的重组反应。

根据本发明能使用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于 噬菌体P1的Cre/lox系统(美国专利号5,658,772，在此引用作为参考)、 酵母的FLP/FRT系统(Golic和Lindquist,1989)、噬菌体μ的Gin重 组酶(Maeser等人，1991)、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983) 和pSR1质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。噬菌体P1 Cre/lox和 酵母FLP/FRT系统组成了两种特别适用于转基因位点特异性整合或切割 的系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)可与其各自的位点特异 性重组序列(分别为lox或FRT)特异相互作用，翻转或切下间插序列。 用于这两种系统中每一种的序列相对较短(lox为34bp,FRT为47bp)， 因此便于转化载体使用。

已经证明FLP/FRT重组酶系统在植物细胞中有效地作用。关于 FLP/FRT系统在玉米和稻原生质体中表现的实验表明，FRT位点结构和 存在的FLP蛋白的量影响切割活性。通常，短的不完全FRT位点比完整 的全长FRT位点可引起更高的切割产物积累。这些系统能催化玉米原生 质体中的分子内和分子间反应，表明其可用于DNA切割以及整合反应。 该重组反应是可逆的，这种可逆性能在每个方向降低反应效率。改变位 点特异性重组序列的结构是解决这种状况的一种方法。能这样突变位点 特异性重组序列，使得重组反应产物不再作为逆反应的底物被识别，从 而稳定切割事件或整合。

在噬菌体P1中发现的Cre-lox系统中，loxP位点之间的重组在Cre 重组酶的存在下发生(见，例如，美国专利号5,658,772，在此引用作为 参考)。该系统已被用来切割已被引入酵母基因组中、位于两个lox位点 之间的基因(Sauer,1987)。Cre从诱导型GAL1启动子开始表达，该 Cre基因位于自主复制酵母载体中。

由于lox位点是一种不对称的核苷酸序列，相同DNA分子上的lox 位点可能具有彼此相同或相反的方向。相同方向lox位点之间的重组引起 位于两个lox位点之间的DNA片段的缺失，以及原始DNA分子产生的 末端之间的连接。缺失的DNA片段形成环形DNA分子。原始DNA分 子和产生的环形分子均含有一个单一lox位点。在同一DNA分子上的相 反方向的lox位点之间的重组引起位于两个lox位点之间的DNA片段核 苷酸序列的翻转。另外，也可能发生与位于两个不同DNA分子上的lox 位点邻近的DNA片段的相互交换。所有这些重组事件都可被Cre编码区 产物催化。 Ⅹ．蛋白质的纯化

在本发明的具体实施方案中，纯化本发明的转基因编码的蛋白质是希 望的。此外，可从植物中分离天然蛋白质，作为克隆编码分离蛋白质的 基因或引导基因表达的启动子的尝试的一部分。得到蛋白质后，能对该 蛋白质测序，并推断该基因的编码序列。能根据推断的DNA序列产生探 针或引物，由此能有效克隆相应基因。

蛋白质纯化技术为本领域技术人员所周知。这些技术在一个水平上包 括将细胞环境粗提为多肽和非多肽级分。将多肽与其他蛋白质分离后， 可以用层析和电泳技术进一步纯化目的多肽，以实现部分或完全纯化(或 纯化为同质)。特别适于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、排阻层析、 聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。一种特别有效的纯化肽的方法是快速 蛋白质液相层析或HPLC。

适用于蛋白质纯化的多种技术为本领域的技术人员所周知。例如，包 括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性沉淀，随后离心；层析步骤， 如离子交换、凝胶过滤、反相、羟磷灰石和亲和层析；等电聚焦；凝胶 电泳；和这些及其他技术的组合。如本领域所公知，可改变进行不同纯 化步骤的顺序，或者可省略某些步骤，而仍可产生适用于制备基本纯化 的蛋白质或肽的方法。

一般不需要蛋白质或肽总是为最纯化的状态。实际上，预期不纯的产 物在某些实施方案中也得到应用。部分纯化可通过组合应用较少纯化步 骤或利用不同形式的相同普通纯化方案来实现。例如，可以理解，利用 HPLC装置进行的阳离子交换柱层析通常比使用低压层析系统的相同技 术导致更多“倍”的纯化。显示较低相对纯化程度的方法可在蛋白质产 物的总回收率或在保持表达蛋白质的活性方面有优势。

已知多肽的迁移可随不同SDS/PAGE条件而变化，有时是显著的 (Capaldi等人，1977)。因此可以理解，在不同的电泳条件下，纯化或 部分纯化的表达产物的表观分子量可能不同。

高效液相层析(HPLC)的特征在于极快速的分离和超常的峰分辨率。 利用极细颗粒和高压保持足够的流速可实现这一点。分离能够在几分钟 或最多一小时内完成。而且，只需要极小体积的样品，因为颗粒非常小 且紧密堆积，使得外水体积是柱床体积的极小一部分。另外，样品浓度 不需要很大，因为带非常窄，使得样品有非常小的稀释度。

凝胶层析或分子筛层析是基于分子大小的特殊类型的分配层析。凝胶 层析的原理是，用有小孔的惰性物质的细颗粒制备的柱，在分子穿过小 孔或在孔周通过时，能根据其大小将较大分子与较小分子分开。只要组 成颗粒的物质不吸附这些分子，决定流速的唯一因素即是其大小。因此， 只要形状是相对固定的，就能以逐渐降低的大小从柱上洗脱下分子。对 于分离不同大小的分子而言，凝胶层析是最好的，因为分离不依赖于所 有其他因素如pH、离子强度、温度等。实际上也没有吸附，较低的区带 扩散和洗脱体积以一种简单的方式与分子量相关。

亲和层析是一种依赖于欲分离的物质和能与之特异结合的分子之间特 异亲和力的层析方法。这是一种受体-配体型相互作用。柱材料通过将结 合配偶体之一与不可溶基质共价偶联而合成。因此柱材料能从溶液中特 异吸附该物质。通过将条件改变为不发生结合的条件(改变pH、离子强 度、温度等)进行洗脱。

适用于含糖化合物纯化的一种特殊类型的亲和层析是凝集素亲和层 析。凝集素是一类能结合多种多糖和糖蛋白的物质。通常用溴化氰使凝 集素与琼脂糖偶联。与Sepharose偶联的伴刀豆蛋白A是可用的这一种 类的首选材料，并已广泛用于多糖和糖蛋白的分离。其他凝集素包括扁 豆凝集素、已用于N-乙酰葡糖胺基残基纯化的麦胚凝集素和Helix pomatia凝集素。凝集素本身用使用糖配体的亲和层析纯化。乳糖已用于 从蓖麻子和花生中纯化凝集素；麦芽糖已用于从扁豆和刀豆中提取凝集 素；N-乙酰-D半乳糖胺可用于从大豆中纯化凝集素；N-乙酰葡糖胺可结 合麦胚中的凝集素；D-半乳糖胺已用于从蛤中获得凝集素，L-岩藻糖将 结合莲的凝集素。

基质应是本身不能明显地吸附分子且具有广泛化学、物理和热稳定性 的物质。配体应以不影响其结合特性的方式偶联。配体应当也提供相对 紧密的结合。并且应能在不破坏样品或配体的情况下洗脱该物质。最常 用的亲和层析形式之一是免疫亲和层析。下面叙述了适用于本发明的抗 体的产生。 Ⅺ．定义

外源基因：一种通常不存在于特定宿主基因组中的基因，其为外源基 因的存在形式。在此方面，基因本身对于宿主基因组可能是天然的，然 而，外源基因可含有通过加入或缺失一种或多种不同的调节元件而改变 的天然基因。发明者希望的一种尤其可用于本发明的外源基因类型包括 与薏苡属启动子有效连接的玉米基因。

表达：细胞内加工的组合，包括编码DNA分子如结构基因经历的转 录和翻译，产生多肽。

后代：任何后代，包括其种子和植物，其来源于特定的亲本植物或亲 本植物组。

启动子：DNA序列或DNA序列组上的一种识别位点，其为结构基因 提供表达控制元件，RNA A聚合酶与其特异结合，并起始该基因的RNA 合成(转录)。

再生：由一种植物细胞(例如植物原生质体或外植体)生长为植物的 过程。

所选DNA：已引入宿主基因组中的DNA片段。优选的所选DNA包 括一种或多种外源基因和用于在宿主细胞中表达外源基因的元件，例如， 启动子和终止子。所选DNA中包含一种或多种增强子元件可更有优势。

转化：一种向细胞或原生质体中引入外源DNA序列或构建体(例如， 载体或表达盒)的方法，其中外源DNA掺入染色体中，或者能自主复制。

被转化的细胞：一种细胞，其DNA已通过向该细胞中引入外源DNA 分子而改变。

转基因：一种被引入宿主基因组中的DNA区段。典型的转基因可使 宿主细胞或由其再生的植物具有一种相对于相应的未转化细胞或植物而 言新的表型。转基因可编码蛋白质、RNA自身或不被转录或翻译。个体 植物可直接通过转化或通过从亲本植物遗传而含有转基因。

转基因细胞：由被转化的细胞衍生或再生的任何细胞。典型的转基因 细胞包括由被转化的植物细胞衍生的植物愈伤组织，和从转基因植物获 得的特定细胞如叶、根、茎细胞，如体细胞，或生殖(germ)细胞。

转基因植物：被转化的植物细胞或原生质体产生的一种植物或其任一 代后代，其中植物DNA含有一种引入的外源DNA分子，该分子最初不 存在于相同株的天然非转基因植物中。转基因植物另外可含有对被转化 的植物而言天然的序列，但其中为了改变基因表达的水平或模式已通过 基因技术改变了“外源”基因。

转运肽：一种能将多肽导向特定细胞器或细胞内其他位置的多肽序 列。

载体：一种DNA分子，其能在宿主细胞中复制，和/或能与另一种DNA 段区有效连接以引起该连接区段的复制。质粒是一种用于向细胞中携带 新基因的典型载体或DNA分子。质粒是一种独立、稳定、自我复制的DNA 片段的典型载体。

Ⅻ．实施例

下列实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应 当理解，下列实施例中公开的技术代表发明者发现的在本发明实施中有 效的技术，因此可认为其组成了优选的实施模式。然而，根据本公开内 容，本领域的技术人员应当理解，可在不违反本发明的概念、精神和范 围的情况下，在公开的具体实施方案中进行多种改变，而仍可获得相同 或相似的结果。更具体而言，显然可用化学和生理学相关的某些试剂代 替此处所述的试剂，而可获得相同或相似的结果。本领域技术人员了解 的所有这些相似的替换和修改被认为属于附加权利要求所限定的本发明 的精神、范围和概念之内。

实施例1

薏苡的部分同源序列的克隆

薏苡(Coix lacryma-jobi)种子(PI 320865)从USDA/ARS植物引 种站，Ames,IA获得。种子在温室中发芽并生长数周。按照下列方法从 2-3周龄的叶物质中制备基因组DNA。在液氮中用玻璃棒将冷冻的叶组 织(2克鲜重)研磨为细粉。粉末组织与8ml提取缓冲液(100mM Tris, pH8.0；50mM EDTA；1％v/v SDS；500mM NaCl)完全混合，预温到60 ℃，随后在60℃下温育45分钟。然后将样品与2.5ml冰预冷的5M乙酸 钾混合，然后在冰上温育20分钟。以3750转每分离心20分钟除去蛋白 质凝聚体，使上清液通过微孔布层(Miracloth)，随后与5ml异丙醇混 合，沉淀DNA。以3750转每分离心15分钟收集沉淀的DNA。从沉淀 的DNA中弃除上清液，并将管倒置5分钟，以除去沉淀中的残余上清液。 用300μl含50mM Tris,pH8.0、10mM EDTA和3μl RNA酶(10mg/ml 原液)的水重悬浮DNA。通过与50μl 4.4M乙酸铵,pH5.2和350μl异丙 醇混合，随后用微量离心机以14000转每分离心10分钟，再次沉淀DNA。 用750μl 80％v/v乙醇洗涤DNA沉淀，然后倒置10分钟使之变干。DNA 重悬浮于200μl含10mM Tris,pH8.0和1mM EDTA的水中。用基因组 步移PCR试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)，按照使用说明书制备基因 组DNA文库，用作PCR模板。

然后如下PCR扩增位于γ-薏苡醇溶蛋白的蛋白编码序列5’的DNA区 段。制备嵌套寡核苷酸引物，称为gCoix5’nest2(SEQ ID NO:1)和gCoix5’ nest3(SEQ ID NO:2)，其分别对应于公开的γ-薏苡醇溶蛋白序列 (Genbank保藏号X59850)的位点267-288和26-53。也使用被称为AP1 (SEQ ID NO:3)和AP2(SEQ ID NO:4)的引物，以“基因组步移” 试剂盒(Clontech)的形式提供。引物的序列如下： gCoix5’nest2=    CTGGAACTGGAACGGGCTTGGA gCoix5’nest3=    GCGAGGGCAACGAGCAGCACCTTCATGG AP1=              GTAATACGACTCACTATAGGGC AP2=              ACTATAGGGCACGCGTGGT

如下进行PCR：首先，除下列所述之外，按照使用说明书使用长模 板PCR系统(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，每一反应包含： 350μM dNTP’s、500nM每种引物、50mM Tris-HCl,pH9.2；14mM (NH4)2SO4、3.0mM MgCl2和2μl(＜25ng)来源于基因组步移文库的模 板DNA。首先使用的引物是gCoix5’nest2和衔接引物AP1。用带加热 罩的MJ Research PTC-100热循环仪进行下列循环条件：

95°-1分钟1个循环

94°-30秒

72°-3分钟7个循环

94°-30秒

67°-3分钟32个循环

67°-4分钟1个循环

4°-保持

然后用水将该反应产物1∶25稀释，取2μl作为模板用于第二轮扩增。 引物换为嵌套gCoix5’nest3和衔接引物AP2。其他改变只是循环本身， 其如下：

95°-1分钟1个循环

94°-30秒

72°-3分钟5个循环

94°-30秒

67°-3分钟20个循环

67°-4分钟1个循环

4°-保持

按照使用说明书(Invitrogen,Carlsbad,CA)，通过凝胶电泳和条带 切除分离适当大小的带(500bp或更大)，并将其克隆到质粒载体pCR2.1 中。用定制的寡核苷酸或载体定位引物和ABI染料-脱氧测序试剂盒 (Perkin-Elmer,Applied Biosystems,Norwalk,CT)，按照使用说明书进 行DNA测序。用ABI Prism 373 DNA测序仪(Perkin-Elmer,Applied Biosystems)分析测序反应。获得PCR产物3’和5’端的序列后，设计引 物使之含有方便的限制酶位点尾，以备直接从基因组DNA扩增随后克隆 γ-薏苡醇溶蛋白启动子。合成引物gcx-1000seq5’xho(SEQ ID NO:5)、 gcx-1pcr3’xba(SEQ ID NO:6)和gcx-1pcr3’nco(SEQ ID NO:7)。引 物序列如下： gcx-1000seq5’xho=GGCTCGAGGGACCGGTTACAGCACACCACTG gcx-1pcr3’xba=GGTCTAGAGGTGTCGATCTTCTGTGCTCT gcx-1pcr3’nco=GCCATGGGGTGTCGATCTTCTGTGCTCT

使用高保真PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)，用gcx-1pcr3’nco 和gcx-1000seq5’xho引物进行γ-薏苡醇溶蛋白启动子的扩增。该反应混 合物含有200ng薏苡基因组DNA模板、200μM dNTP、500nM每种引 物和5μl 10×缓冲液#2。用带加热罩的MJ Research PTC-100热循环仪进 行的循环条件如下：

95°-2分钟1个循环

94°-1分钟

56°-1分钟

72°-1分钟32个循环

72°-4分钟

4°-保持

扩增后，用NcoⅠ和XhoⅠ消化扩增子，以向GUS表达载体pDPG827 (mcs/GUS/nos,pSP72骨架；Promega公司；Madison,WI)中定向克 隆。将完整启动子插入片段以及插入接头测序，并将该载体命名为 pDPG844(图1)。然后用定制的寡核苷酸或载体定位引物和ABI染料- 脱氧测序试剂盒(Perkin-Elmer,Applied Biosystems,Norwalk,CT)，按 照使用说明书进行DNA测序。用ABI Prism 373 DNA测序仪(Perkin- Elmer,Applied Biosystems)分析测序反应。启动子插入片段的序列示于 SEQ ID NO:8中。

用gcx-1pcr3’xba和gcx-1000seq5’xho引物进行γ薏苡醇溶蛋白启动 子片段的平行扩增。扩增产物用XbaⅠ和XhoⅠ消化，并连接于GUS表 达载体pDPG828(mcs/稻肌动蛋白内含子I/GUS/nos,pSP72骨架中) 中。对插入接头以及完整插入片段测序，将该载体命名为pDPG845(图 2)。

对于质粒pDPG846(图3)和pDPG847(图4)的构建，用高保真 PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)和gcx-1pcr3’xba(SEQ ID NO:6) 和gcx-(400)pcr5’xho(SEQ ID NO:24)引物进行γ薏苡醇溶蛋白启动子 的扩增。扩增产物用XbaⅠ和XhoⅠ消化，并连接于GUS表达载体pDPG827 (mcs/GUS/nos,pSP72骨架)和pDPG828(mcs/稻肌动蛋白内含子 I/GUS/nos,pSP72骨架)中，分别产生载体pDPG847和pDPG846。对 插入接头以及完整启动子插入片段测序，证实载体的适当构建。启动子 插入片段的序列列于SEQ ID NO:19中。

与pDPG846和pDPG847构建平行地构建质粒pDPG848(图5)和 pDPG849(图6)。用高保真PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)和 引物gcx-1pcr3’xba(SEQ ID NO:6)和gcx-(220)pcr5’xho(SEQ ID NO:25)PCR扩增γ薏苡醇溶蛋白启动子片段。扩增产物用XbaⅠ和XhoⅠ 消化，并连接于GUS表达载体pDPG827(mcs/GUS/nos,pSP72骨架) 和pDPG828(mcs/稻肌动蛋白1内含子1/GUS/nos,pSP72骨架)中， 分别产生载体pDPG849和pDPG848。对插入接头和完整启动子插入片 段测序，证实载体的适当构建。启动子插入片段的序列列于SEQ ID NO:18 中。gcx-(400)pcr5’xho和gcx-(220)pcr5’xho的序列在以下及SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中列出。

gcx-(400)pcr5’xho GGCTCGAGTAAGTATGCAGGA

gcx-(220)pcr5’xho GGCTCGAGCACTCGGCTTGCT

实施例2

γ薏苡醇溶蛋白终止子和编码序列的分离及pDPG869的构建

用来分离γ薏苡醇溶蛋白启动子的基因组步移试剂盒和基因组DNA文 库另外也可用于γ薏苡醇溶蛋白终止子序列的分离。对于所有轮次，所有 PCR浓度和循环条件都与用于启动子分离(实施例1)的情况相同。仅 有的改变只在于所用的薏苡醇溶蛋白特异性引物。第一轮PCR用引物 gcx-5’pcr2(SEQ ID NO:9)和AP1进行，第二轮用引物gCoix3’nest2 (SEQ ID NO:10)和AP2进行。引物序列如下：

gcx5′pcr2=(CTCAGCCCCAGCAGCCACATCCA)

gCoix3′nest2=(GTGCGGCAGCCAATGACAAGTC)

根据使用说明书，扩增产物通过凝胶电泳分离，随后切下适当大小的 带，洗脱该条带并将DNA克隆到载体pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad, CA)中，并测序。该克隆，含有γ薏苡醇溶蛋白终止子，被命名为DV108 (图11)。该终止子序列列于SEQ ID NO:11中。

为了获得γ薏苡醇溶蛋白蛋白编码序列，用PCR扩增分离含有γ薏苡 醇溶蛋白基因编码序列和启动子的扩增产物。用下面列出的引物gcx- 1000seq5’xho(SEQ ID NO:12)和gCoix3’pcr(SEQ ID NO:13)进行 扩增。 gcx-1000seq5’xho=GGCTCGAGGGACCGGTTACAGCACACCACTG gCoix3′pcr=      TCAGTACTGGGCACCGCCGGC

用“Master Amp”试剂盒(Epicentre Technologies,Madison,WI) 优化扩增。使用缓冲液D和下列在Robocycler(Stratagene)中的程序 获得启动子/编码扩增产物的序列：

94°-2分钟1个循环

94°-1分钟

73°-1分钟

72°-1分钟32个循环

72°-4分钟1个循环

4°-保持

然后将该扩增子克隆到pCR2.1中。用该质粒构建体作为模板，设计 下一轮PCR策略，获得编码序列和启动子作为分开的反应产物。下列引 物gCoix 5′pcr+4(SEQ ID NO:14)和gCoix3′pcr+sac(SEQ ID NO:15) 用于单独编码序列的扩增：

gCoix 5′pcr+4=AAGGTGCTGCTCGTTGCCCTC gCoix 3′per+sac=GGGAGCTCTCAGTACTGGGCACCGCCGGC

这些引物分别对应于上述Genbank序列的碱基31-51和607-627。引 物gCoix 5′pcr+4的使用产生缺少γ薏苡醇溶蛋白起始密码子的扩增产物。 使用Boehringer Mannheim的高保真PCR试剂盒，及100pg质粒模板、 500nM每种引物、1×缓冲液1和200μM dNTP、3mM终浓度的MgCl2的反应混合物。使用带加热罩的MJ Research PTC-100热循环仪的循环 条件如下：

95°-2分钟1个循环

94°-1分钟

62°-1分钟

72°-1分钟32个循环

72°-4分钟1个循环

4°-保持

该反应产物然后通过凝胶电泳和条带切割纯化，用SacⅠ消化克隆到 pDPG845中。质粒pDPG845的制备方法包括，用NcoⅠ消化，随后通过 加入2单位Klenow酶和dNTP至各为0.2mM的终浓度，用Klenow补 平5’突出端。这使得ATG起始密码子与γ薏苡醇溶蛋白蛋白编码序列5’ 端的直接连接，从而恢复γ薏苡醇溶蛋白的完整开放阅读框。然后用SacⅠ 消化该载体，切下GUS编码序列，保留与γ薏苡醇溶蛋白编码序列3’端 相容的位点。然后将制备的pDPG845载体和γ薏苡醇溶蛋白编码序列连 接在一起，形成一种新载体，被命名为pDPG851(图9)。

为便于用γ薏苡醇溶蛋白终止子替换pDPG851中的nos终止子，将表 达盒转移到更合适的载体，如pBK-CMV(Stratagene,La Jolla,CA)。 实现方法包括用ScaⅠ消化pBK-CMV(平端)，用XhoⅠ和ClaⅠ消化 pDPG851，及随后5’突出端的Klenow补平(2单位Klenow和0.2mM 每种dNTP)。凝胶纯化pDPG851盒和pBK-CMV骨架。然后连接两种 质粒，产生pDPG862(图10)。

将γ薏苡醇溶蛋白终止子克隆到pDPG862中γ薏苡醇溶蛋白编码序列 的3’末端。实现方法包括，首先除去nos终止子，然后通过进行如下所 述的步骤在此位置克隆纯化的薏苡醇溶蛋白终止子。γ薏苡醇溶蛋白编码 序列在报道的Genbank序列的位点620-625处有一个ScaⅠ位点。用ScaⅠ 及NotⅠ酶切该限制位点，由于通过基因组步移法获得的编码序列部分， 该位点存在于pDPG862和DV108中。然后凝胶纯化γ薏苡醇溶蛋白终止 子序列及pDPG862骨架。连接这两个片段，产生pDPG869(图7)。γ薏 苡醇溶蛋白编码序列的序列列于SEQ ID NO:16中。通过颗粒轰击将这 些基因构建体的每一个引入如以下实施例5和6中所述的可再生的玉米 细胞中。

实施例3

薏苡油质蛋白3终止子的分离

在实施例1和2中用来分离启动子和终止子序列的基因组步移试剂盒 和基因组DNA文库也可用于薏苡油质蛋白3终止子的分离。对于所有PCR 轮次，所有PCR浓度和循环条件都与这些实施例中所用的相同。仪有的 改变只在于所用的薏苡特异性引物。第一轮PCR用引物cx-L3 3’nest1 (SEQ ID NO:26)和AP1(SEQ ID NO:3)进行，第二轮用引物cx-L3 3’nest2(SEQ ID NO:27)、cx-L3 3′nest3(SEQ ID NO:28)和AP2(SEQ ID NO:4)进行。引物序列如下：

cx-L3 3′nest1 CGGGCTGATCCTGGCCGGCACCGT

cx-L3 3′nest2 GTGTTCTCCTGGATGTACAAGTAC

cx-L3 3′nest3 TCCAAGGCCCGCGACGTCAAGGA

扩增产物通过凝胶电泳分离，随后根据使用说明书切下适当大小的带 (＞500bp)，洗脱该条带并将DNA克隆到载体pCR2.1(Invitrogen)中， 并如上所述对克隆的DNA测序。该克隆，含有薏苡油质蛋白终止子，被 命名为DV112。油质蛋白终止子序列示于SEQ ID NO:17中。

实施例4 γ薏苡醇溶蛋白启动子与来源于玉米和高粱的部分同源启动子的序列对比

γ谷醇溶蛋白是一类在薏苡、高粱和玉米胚乳中存在的种子贮藏蛋白。 分析测定如实施例1所述发明者克隆的薏苡γ谷醇溶蛋白启动子(γ薏苡醇 溶蛋白，SEQ ID NO:8)与高粱(γ高粱醇溶蛋白，SEQ ID NO:22,Genbank 保藏号X62480)和玉米(γ玉米醇溶蛋白，SEQ ID NO:23,Genbank保 藏号X56117)相应序列的γ谷醇溶蛋白启动子区之间的序列相似性。用 GeneWorks DNA分析软件(Intelligenetics,Inc.,Mountainview,CA)在 翻译起始密码子894核苷酸上游进行对比。引入缺口以利于对比。每一 序列的3’端对应于ATG起始密码子。图8和表9中列出了对比结果。分 析表明，在γ薏苡醇溶蛋白和γ高粱醇溶蛋白之间有65％的序列同一性， 在γ薏苡醇溶蛋白和γ玉米醇溶蛋白之间有63％的序列同一性。结果表明， 三个物种的启动子区之间有显著性差异。 表9：薏苡、玉米和高粱中γ谷醇溶蛋白上游区之间的核苷酸序列同一性 γ高粱醇溶蛋白-1-894  γ玉米醇溶蛋-1-894 γ薏苡醇溶蛋白-1-894  65％ 63％ γ玉米醇溶蛋白-1-894  56％

实施例5

微粒的制备

如下制备微粒：通过向1000μl纯乙醇中加入60mg 0.6μm金颗粒 (BioRad，目录号165-2262)并在室温下温育至少3个小时，制备金颗 粒，随后贮存于-20℃。在微量离心机中离心20-35μl无菌金颗粒，更优 选地30-35μl金颗粒(30μl含1.8mg颗粒)1分钟。弃上清液，向管中加 入1ml无菌水，随后以1800-2000转每分离心2-5分钟。将微粒重悬浮于 20-35μl含大约250ng载体DNA的DNA溶液中。

然后向含颗粒的溶液中加入220μl无菌水、250μl 2.5M CaCl2和50μl 亚精胺原液(14μl亚精胺溶于986μl水)。然后充分混合该溶液，并置于 冰上，随后在4℃下振荡10分钟，以500转每分离心5分钟。弃上清液， 沉淀重悬浮于600μl纯乙醇中。500转每分离心5分钟后，用36-38μl纯 乙醇重悬浮沉淀，振荡约20秒，超声处理20-30秒。在此阶段，颗粒一 般处理2-5分钟，之后取出5-10μl上清液，分配到飞盘表面，使乙醇完 全干燥。此外，也可在用36μl-38μl乙醇重悬浮并振荡20-30秒钟后直接 取出颗粒，置于飞盘上，如常规处理一样使之干燥。在轰击前将轰击容 器抽真空至大约28英寸汞柱(in.Hg)。然后使用DuPont Biolistics PDS1000He颗粒轰击装置将这些颗粒用于大约1100psi的氦流轰击。

实施例6

Hi-Ⅱ未成熟胚的轰击

传粉后10-12天，从表面灭菌的、温室生长的Hi-Ⅱ穗上切下玉米Hi-Ⅱ 基因型的未成熟胚(1.2-3.0mm长)。Hi-Ⅱ基因型由A188×B73杂交产生 (Armstrong等人，1991)。每个培养皿大约30个胚轴侧向下平板接种 于用2g/l Gelgro固化、含1mg/l 2,4-D、100mg/l酪蛋白水解物、6mM L- 脯氨酸、0.5g/l 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、0.75g/l MgCl2和2％蔗糖的改 良N6培养基pH5.8(#735培养基)中。这些胚在暗处24℃培养2-4天。

轰击前大约3-4小时，将胚转移到蔗糖浓度由3％提高到12％的上述 培养基中。当胚被转移到高渗培养基时，将其以同心圆排列于平板上， 距平皿中心1cm，这种位置使其胚根鞘端朝向平皿中心。通常每板25-35 个胚形成两个同心圆。

将含有胚的平板置于从下起第三层架上，在终止筛下5cm。用1100psi 破裂片进行轰击。每个板的胚用DuPont Biolistics PDS1000He粒子枪轰 击一次。轰击后，使胚在高渗培养基(735,12％蔗糖)上恢复过夜(16- 24小时)，然后转移到含1mg/l双丙氨膦的选择培养基(#739,735加1mg/l 双丙氨膦或#750,735加0.2M甘露醇和1mg/l双丙氨膦)上。使胚在暗 处保持于24℃。在起始选择平板上3-4周后，大约90％的胚一般形成Ⅱ 型愈伤组织，将其转移到含有3mg/l双丙氨膦的选择培养基(#758)上。 然后可用Southern分析法分析转化子，并可进行基因表达的测定。下面 表10中列出了用于转化的构建体和转化子的数量。

表10：用含薏苡DNA序列的构建体轰击玉米胚获得的转化子 质粒描述 pDPG 独立转化子 数 由转化子衍生的植 物数 GcxPro(900)IrActinllγ薏苡醇溶蛋白NOS  862  81  327 GcxPro(900)IGUS/NOS  844  17  65 GcxPro(900)IrActinllGUSINOS  845  14  60 GcxPro(400)IGUSINOS  847  9  34  GcxPro(400)IrActinllGUS/NOS  846  15  60  GcxPro(220)IGUS/NOS  849  11  37  GcxPro(220)IrActinllGUS/NOS  848  11  38

实施例7

推断的启动子调节元件的测定

通过对比已知将以类似的组织特异或发育唯一方式表达的启动子序 列，开始对每一启动子序列内推断的调节元件的鉴定。在具有相似表达 模式的启动子之间共有的序列可能是转录因子结合的候选者，因此可能 是提供表达模式的元件。通过对每个启动子的缺失分析，随后经过测定 与每一构建体功能上有关的报道基因对每一缺失构建体进行功能分析， 来证实这些推断的调节元件。

对克隆的γ薏苡醇溶蛋白启动子进行这种分析。如实施例4所述进行 薏苡γ薏苡醇溶蛋白启动子与玉米γ玉米溶醇蛋白和高粱γ高粱醇溶蛋白基 因启动子的DNA序列对比，显示有几个代表潜在转录因子结合位点的短 同源区。这些位点中的几个以前被确定为高粱贮藏蛋白启动子的推断的 调节区(Ottoboni等人，1993；de Freitas等人，1994)。已鉴定了四个 推断的调节区。预测有两个区提供普通的启动子活性，潜在地响应氮状 态，这些区被称为GCN4样区。预测另外两个区提供组织特异性表达， 被称为谷醇溶蛋白盒结合区。这些元件排列于从翻译起始位点起的180- 700碱基对之间，GCN4盒最接近起始甲硫氨酸密码子(-190bp)，随后 是谷醇溶蛋白盒(-395bp)、第二个GCN4盒(-525bp)，最后是第二个 谷醇溶蛋白盒(-650bp)。

通过产生412bp(SEQ ID NO:19)和222bp(SEQ ID NO:18)(距 翻译起始位点的距离)的启动子片段，用截短的启动子序列特异性去除 推断的组织特异性调节元件。412bp启动子片段只包含近端的GCN4和 谷醇溶蛋白盒基序，而222bp片段只包含近端GCN4基序，两个谷醇溶 蛋白盒区都被去除。除全长γ薏苡醇溶蛋白启动子之外，将这些启动子片 段克隆到含GUS报道基因的载体中(该载体含或不含稻肌动蛋白1内含 子1)，以增强表达。这些载体已被命名为pDPG844、845、846、847、848 和849，其构建如上所述。将每一构建体轰击到未成熟的玉米胚中(如实 施例6所述)，产生含有每种启动子：GUS构建体作为转基因的植物。

可分析含有这些转基因的植物，分析在不同发育阶段时GUS报道基 因在所有植物组织中的表达。预测最短的启动子构建体(221bp,pDPG848 和pDPG849)将不显示组织特异的表达模式，因为该启动子缺乏谷醇溶 蛋白盒调节区。进一步预测，412bp启动子构建体pDPG846和pDPG847 将保留组织特异性，但与全长启动子构建体(pDPG844和pDPG845) 相比只引导较低水平的表达。

实施例8 转基因玉米中α玉米醇溶蛋白基因的有义抑制和利用薏苡启动子对抑制的

消除

如果玉米醇溶蛋白基因被玉米启动子控制，则玉米中有义玉米醇溶蛋 白表达盒的表达显示可诱导内源玉米醇溶蛋白表达的抑制。为了证明若 使用薏苡启动子则不引起抑制，可进行转化研究，并在玉米或薏苡启动 子表达的构建体之间进行对比。这些研究如下进行。

用质粒载体pDPG531转化玉米细胞，如1996年12月9日提交的美 国专利系列号08/763,704所述，该载体含有与玉米Z4有义编码序列和胭 脂氨酸合酶3’区有效连接的玉米Z27启动子，该专利的公开内容在此引 用作为参考。pDPG531的制备方法是从载体SPZ4Ent上切下大约960 个碱基对的片段，并补平末端(美国专利系列号08/763,704,1996年12 月9日提交)。完整的Z4转录单位基本包含于SPZ4Ent中，其具有960 核苷酸的总插入片段大小。由两个Z4亚克隆-pSPZ4R3’和pSPZ45’重 构Z4基因。亲代载体是pSPZ4R3’，其含有713个核苷酸的中度重复3’ 核苷酸序列，即Z4序列的核苷酸630到核苷酸1341。通过SacⅠ(切割 插入基因之外的多接头序列)和BamHⅠ消化释放Z4序列的5’端，经SacⅠ (也切割多接头序列)和BamHⅠ消化获得含有pSPZ45’的5’序列的插入 片段，将其与线性化的pSPZ4R3’载体连接，导致完整Z4转录单元的重 构。得到的载体在pBSK(-)中含有Z27启动子：Nos 3’区构建体，在启动 子和终止子之间含有唯一的NcoⅠ位点。使载体和插入片段都成为平端， 并将其连接。鉴定含有有义方向的Z4 DNA序列的克隆(pDPG531)。 pDPG531能被转录并翻译为22kD玉米醇溶蛋白(α-玉米醇溶蛋白)。如 下通过共轰击将质粒pDPG531和pDPG165引入玉米细胞中。

如PCT公开文本WO95/06128和1996年12月9日的美国专利系列 号08/763,704所述再生转化子；两者的公开内容均在此引用作为参考。 方法如下：基因型A188×B73的玉米植物与Hi-Ⅱ玉米植物杂交 (Armstrong等人，1991)。传粉11-12天后，从表面灭菌、温室生长的 Hi-Ⅱ稳上切下未成熟胚(1.2-2.0mm长)。由A188×B73杂交产生Hi-Ⅱ 基因型，用于从未成熟胚高频发育Ⅱ型愈伤组织(Armstrong等人， 1991)。每个培养皿大约30个胚轴侧向下平板接种于用2g/l Gelgro固化 的含1mg/l 2,4-D、100mg/l酪蛋白水解物、6mM L-脯氨酸、0.5g/l 2-(N- 吗啉)乙磺酸(MES)、0.75g/l MgCl2和2％蔗糖的改良N6培养基pH5.8 (#735培养基)中。这些胚在暗处24℃培养2-4天。

轰击前大约4小时，将胚转移到蔗糖浓度由3％提高到12％的上述培 养基中。当胚被转移到高渗培养基时，将其以同心圆排列于平板上，距 平皿中心2cm，这种位置使其胚根鞘端朝向平皿中心。通常每板25-35个 胚形成两个同心圆。将含有胚的平板置于从下起的第三层架上，在轰击 容器中终止筛下5cm。使用1100psi破裂片。每个板的胚轰击一次。在 开始选择前，使胚在高渗透强度培养基上恢复过夜。

在高渗培养基(735,12％蔗糖)上恢复过夜(16-24小时)后，将 胚转移到含1mg/l双丙氨膦的选择培养基(#739,735加1mg/l双丙氨膦 或#750,735加0.2M甘露醇和1mg/l双丙氨膦)上。这些胚在暗处保持 于24℃。在起始选择平板上3-4周后，大约90％的胚形成Ⅱ型愈伤组织， 将其转移到含有3mg/l双丙氨膦的选择培养基(#758)上。双丙氨膦抗 性组织大约每两周被传代培养到新鲜的选择培养基(#758)上。将转化 的胚发生愈伤组织转移到再生培养基(MS培养基(Murashige和Skoog, 1962)，含有0.91mg/L L-天冬氨酸、1.4g/L L-脯氨酸、20g/L D-山梨糖 醇、0.04mg/L萘乙酸(NAA)和3mg/L 6-苄氨基嘌呤)。细胞在该培养 基上生长大约4周，在大约第2周时转移到新鲜培养基上。随后将转化 子转移到MS0培养基(未加植物激素的MS培养基)。将再生植物转移 到土壤中。这些植物与被命名为AW、CV和DJ的玉米近交系杂交。含 Z27有义表达盒的种子表型不透明，类似于不透明2号突变谷粒的谷粒。 由三种Z27-Z4有义表达盒再生植物，并与被命名为AW、CV和CN的 近交系杂交。

如下所述在考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上比较未转化的玉米植物 与Z27-Z4有义转化子中存在的α-玉米醇溶蛋白的量。50mg磨碎的谷粒 悬浮于0.5ml 70％乙醇、1％ β-巯基乙醇中，并在室温下抽提30分钟至 过夜。振荡样品，以12000转每分离心5分钟。取出50μl含玉米醇溶蛋 白的上清液并干燥。将玉米醇溶蛋白重悬浮于含1％ β-巯基乙醇的50∶1 SDS聚丙烯酰胺凝胶加样缓冲液中。用SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质 并用考马斯蓝染色。

结果证明，Z27-Z4有义转化子中存在的α-玉米醇溶蛋白水平大大降 低。这种降低与在反义转化子中观察到的相当。除了有义转化子中玉米 醇溶蛋白浓度的意外降低之外，玉米醇溶蛋白含量降低的种子通常也显 示不透明的表型，和Z27玉米醇溶蛋白水平的降低。

也分析了由各谷粒衍生的种子中赖氨酸和亮氨酸的浓度。如下所述从 三个独立转化系产生的成熟从谷粒中提取氨基酸。50mg磨碎的玉米粉在 110℃下在氩气中用1ml 6N HCl水解24小时。样品稀释为50ml，并通 过0.45微米滤膜过滤。在HPLC分析前向每一样品中加入正缬氨酸作为 内部标准。用Supelcosil LC-8 HPLC柱分离氨基酸(Jarrett等人，1986； Jones等人，1983；AACC,1995)。单个谷粒的分析结果表明，在转化 的和未转化的谷粒之间有显著性差异，显著性水平p＜0.05。在一个被命 名为KQ018的转化子中，在等基因的转化和未转化种子中赖氨酸和亮氨 酸水平在统计学上相同。然而，在被命名为KQ012的转化子中，转化子 中赖氨酸水平在统计学上升高，而转化子中亮氨酸水平在统计学上显著 降低。因此表明，Z27启动子-Z4有义转化子产生类似于反义转化子的种 子形态学、蛋白质和氨基酸组成表型。据认为这是同源性依赖的基因沉 默的结果。

为了证明在玉米Z27启动子被替换为同源薏苡基因的薏苡启动子时 不发生基于同源性的基因沉默，构建一种质粒载体，其含有从与Z27基 因同源的薏苡基因中分离的启动子，该启动子与玉蜀黍Z4编码序列有效 连接。用实施例1所述的策略分离该启动子序列。然后如上所述用薏苡 启动子-Z4编码序列载体转化入玉米。如上所述再生含该载体的转基因植 物，并与未转化的近交系杂交。然后测定α-玉米醇溶蛋白的量，以证明 在含薏苡衍生启动子-Z4结构基因表达盒的转化子中转基因表达不降低。 而且，含薏苡衍生启动子-Z4结构基因表达盒的植物中不透明表型的缺 乏，证明了与含天然启动子的转化子相比，薏苡衍生启动子-Z4结构基因 表达盒的表达增强。也进行薏苡衍生启动子-Z4结构基因表达盒转化子中 赖氨酸和亮氨酸浓度的分析，以证明赖氨酸水平不升高，亮氨酸水平不 降低，从而表明在含有来源于薏苡的启动子的玉米转化子中未观察到有 义共抑制，而用玉米Z27启动子可观察到。

实施例9

H99未成熟胚或愈伤组织的转化和用巴龙霉素的筛选

从温室生长的自花传粉或近缘传粉的H99植物中分离玉米未成熟胚 (1.2-3.0mm，传粉后10-14天)。在大约27℃下，在735培养基上暗处 培养未成熟胚。未成熟胚或者在分离1-6天后轰击，或者经培养产生用于 轰击的胚发生愈伤组织。通过以2-3周间隔向新鲜735培养基传代培养， 扩展并保持胚发生愈伤组织。轰击前，将培养的胚或胚发生愈伤组织(再 分为大约2-4mm块)转移到含12％蔗糖的735培养基中3-6小时。在如 实施例6所述进行轰击后，将组织培养物温育过夜，并转移到含500mg/L 巴龙霉素的735培养基中。2-3周后，愈伤组织被再分为小片(大约2-4mm 直径)，转移到新鲜选择培养基中。该传代培养步骤以2-3周间隔重复可 至轰击后约15周，再分并目测筛选健康、生长的愈伤组织。

将耐受巴龙霉素的愈伤组织转移到不含2,4-D但含有3.52mg/L BAP 的735培养基中，于暗处在约27℃下3-9天，随后转移到含100mg/L巴 龙霉素Phytatrays(Sigma)溶液的110培养基(1/2×MS盐、0.5mg/L 硫胺素、0.5mg/L烟酸、3％蔗糖、3.6g/L Gelgro,pH5.8)中，并于光下 约27℃培养。3-6周后小植物在Phytatrays中发育，然后转移到土壤中。 使小植物适应生长容器，并在温室中生长成熟。

实施例10

GUS报道基因在γ薏苡醇溶蛋白启动子控制下的表达

标准组织化学GUS活性染色

1)合并贮存液用作GUS测定缓冲液，新鲜制备：

铁氰化钾     50mM原液          1mL

亚铁氰化钾   50mM原液          1mL

磷酸钠缓冲液 200mM原液，pH7.0  5mL

EDTA钠       10mM原液，pH8.0   1mL

Triton X-100 10％v/v原液       1mL

2)通过0.2微米滤膜过滤除菌测定缓冲液混合物。

3)显色底物是以25mg/mL的浓度溶解于N,N-二甲基甲酰胺中的X- gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸糖苷酶)。

4)通过合并下列试剂制备GUS测定使用液：

磷酸钠缓冲液     200mM,pH7.0    26mL

GUS测定缓冲液(来自于以上步骤1)  9mL

X-gluc底物       25mg/ml原液    1.2mL

5)在GUS测定缓冲液中37℃温育组织。含活性GUS酶的组织显蓝 色。必要时可在室温下温育组织过夜或更长时间。

测定实施例7所述转基因植物的谷粒的GUS基因表达。从传粉后 (DAP)9天到27天获得各R0转基因植物的谷粒。用刀片纵向切开谷 粒。将谷粒切片置于24孔微量培养板的孔中，并用Jefferson(Jefferson, R.A.,1987)所述的方法在室温下在GUS测定溶液中温育。用0-4的标 度(0，无蓝色染色；4，强蓝色染色)记录表示GUS活性的蓝色。

在R0期测定谷粒中GUS表达的植物中，含GcxPro(900)/GUS/NOS 构建体的9个植物中的5个，含GcxPro(900)/rActinl/GUS/NOS构建体 的9个植物中的4个，含GcxPro(400)/rActinl/GUS/NOS构建体的12个 植物中的3个，含GcxPro(220)/rActinl/GUS/NOS构建体的6个植物中 的2个，观察到蓝色染色(表11)。含GcxPro(400)/GUS/NOS或 GcxPro(220)/GUS/NOS构建体的植物中没有一个在谷粒中显示任何蓝色 染色。

也根据谷粒不同部分的蓝色染色观察了空间染色模式。GcxPro(900)/ GUS/NOS植物的谷粒只在胚乳中显示表达模式，在某些谷粒中在含淀粉 胚乳中有最强染色，在糊粉中有有限的染色；GcxPro(900)/rActinl/ GUS/NOS植物的谷粒主要在淀粉胚乳中显示染色模式，在某些谷粒中在 胚芽中有较浅的有限的染色；GcxPro(400)/rActinl/GUS/NOS或GcxPro (220)/rActinl/GUS/NOS植物的谷粒在胚乳中和胚芽中都显示染色，表明 胚乳特异的表达模式的缺乏。在GcxPro(400)/GUS/NOS或GcxPro (220)/GUS/NOS植物的谷粒中未检测到蓝色染色。表达GcxPro(900)/ GUS/NOS或GcxPro(900)/rActinl/GUS/NOS转基因的植物也显示时间 调节的染色模式，较老的种子比较嫩的种子显示更高程度的蓝色染色(表 12)。 表11：在谷粒组织中显示GUS活性的转基因γ薏苡醇溶蛋白/GUS植物的 频率     所测转化子数 表达GUS活性的转化子数  GcxPro(900)/GUS/NOS  GcxPro(900)/rActinl/GUS,NOS  GcxPro(400)/GUS/NOS  GcxPro(400)/rActin/GUS/NOS  GcxPro(220)/GUS/NOS  GcxPro(220)/rActinl/GUS/NOS     9     9     8     12     9     6     5     4     0     3     0     2 表12：含γ薏苡醇溶蛋白/GUS构建体的R0转基因植物的发育种子中GUS 活性的表达     质粒描述                 转化子   植物数  DAP    GUS得分 GcxPro(900)/GUS/NOS          92RR204     4     10       1                                                12       0                                                20       3                                                24       4                              92RR201     3     10       0                                                20       3                              92RR101     2     10       0                                                20       1                                                24       1                              92RR205     1     11       2                                                25       3                              92RR207     2     10       0                                                20       3                                                24       4 GcxPro(900)/rActinl/GUS/NOS  93RS302     4     10       2                                                20       3                                                24       3                              93RS306     1     24       2                                          2     24       2  GcxPro(400)/rActinl/GUS/NOS 94RT503     3     22       3                                          2     29       3                              94RT507     1     16       3                                          2     27       3                                          3     27       3  GcxPro(220)/rActinl/GUS/NOS 99RX303     1     9        1                                                23       1                              99RX305     3     11       2                                                27       2

实施例11

普通微粒轰击方法

微粒轰击技术中的许多改变在本领域众所周知，因此认为其可用于本 发明。例如，PCT申请WO95/06128中叙述了典型的轰击方法，其在此 引用作为参考。本发明可用的靶组织的实例包括未成熟胚、Ⅰ型愈伤组织、 Ⅱ型愈伤组织、Ⅲ型愈伤组织、悬浮培养物和分生组织(PCT申请WO 96/04392)。以上以及在如PCT申请WO95/06128中具体公开了尤其可 用于玉米转化的某些基因型。优选的基因型是易于转化且也可再生产生 能育转基因植物的基因型。

用于微粒加速的任何方法都可潜在地用于转化本发明的植物细胞。一 种优选方法是气动粒子枪如DuPont Biolistics PDS1000He粒子轰击装 置。用于轰击的典型颗粒包括由钨、金、铂等组成的颗粒。金颗粒被认 为在本发明中特别有用，0.6μm或0.7μm的金颗粒是优选的，0.6μm颗 粒是最优选的。最优选的颗粒是DNA包被且平均大小为0.6μm-1.0μm 的颗粒。

如此处所公开的，任何DNA序列都可潜在地用于转化。用于转化的 DNA片段优选地包含一种或多种选择性、分泌型或可筛选的标记。它们 的许多实例在本领域众所周知，并在此特别公开。对于选择性标记，可 在固体或液体培养基中选择。使用的DNA片段优选地也包含单独或与其 他序列结合赋予被转化植物希望的表型的一种或多种基因。此处公开了 用于转化的典型基因和这些序列可赋予转化的植物的相应表型。

实施例12

转基因向原种近交种和杂种中的渐渗

能用回交改进原来的植物。回交将希望的特殊性状从一个来源转移到 缺乏该性状的近交种或其他植物中。实现方法是，例如，首先使优良近 交种(A)(回归亲本)与供体近交种(非回归亲本)杂交，该供体近交 种带有所述性状的适当基因，例如，根据本发明制备的构建体。首先在 产生的后代中对从非回归亲本转移的希望性状筛选杂交后代，然后使选 择的后代与优良回归亲本(A)回交。在对希望的性状筛选4个或更多回 交代后，对于控制被转移的特征的基因座而言，该后代是半合子的，但 其大多数或几乎所有其他基因都类似于优良亲本。最后的回交代至少自 交一次，产生对于被转移的基因即一种或多种转化事件而言是纯种的后 代。

因此，通过一系列培育操作，所选的转基因可从一个系转移到一个完 全不同的系中，而不需要进一步的重组操作。转基因是有价值的，因为 它们一般在遗传学上表现为其他任何基因，且能以与其他任何玉米基因 相同的方式通过繁育技术操作。因此，可以产生对于一种或多种转基因 来说是真正繁殖的近交植物。通过杂交不同的近交植物，可以产生大量 含有不同转基因组合的不同杂种。这样，可产生具有通常与杂种相关的 希望的农学特性(“杂种优势”)以及具有由一种或多种转基因赋予的希 望的特性的植物。

实施例13

标记辅助的选择

遗传标记可用来辅助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景向另 一个遗传背景的渐渗。标记辅助的选择与常规培育相比具有优点，因为 它能避免表型变异引起的错误。另外，遗传标记也可提供有关特定杂交 个体后代中原种种质相对程度的数据。例如，当具有希望的性状且另外 具有农业不希望的遗传背景的植物与原种亲本杂交时，可用遗传标记筛 选不仅具有目的性状而且含有相对高比例的希望种质的后代。这样，使 一种或多种性状向特定遗传背景渐渗所需的代数降至最少。

在标记辅助的培育过程中，用DNA序列在植物培育过程中跟随希望 的农学性状(Tanksley等人，1989)。标记辅助的培育可如下进行。将具 有希望的性状的植物种子种植于温室或田地中的土壤中。在任意生长点 收集植物的叶组织用于制备DNA，此时可从植物上取下约1g叶组织， 而不损害植物的生存力。用Shure等人(1983)改良的方法分离基因组 DNA。将约1g来源于籽苗的叶组织在15ml聚丙烯管中冻干过夜。用玻 璃棒在管中将冻干的组织研磨成粉末。粉状组织与3ml提取缓冲液(7.0 尿素、0.35M NaCl、0.05M Tris-HCl pH8.0、0.01M EDTA、1％肌氨酸) 充分混合。组织/缓冲液匀浆用3ml酚/氯仿抽提。离心分离水相，用1/10 体积的4.4M乙酸铵pH5.2和等体积的异丙醇沉淀两次。用75％乙醇洗 涤沉淀，将其重悬浮于100-500μl TE(0.01M Tris-HCl、0.001M EDTA, pH8.0)中。

然后用3倍过量的限制酶消化基因组DNA，经0.8％琼脂糖(FMC) 电泳，并用10×SCP(20 SCP∶2M NaCl、0.6M磷酸二钠、0.02M EDTA 二钠)转移(Southern,1975)到Nytran(Schleicher和Schuell)。滤 膜在6×SCP、10％硫酸葡聚糖、2％肌氨酸和500μg/ml变性鲑精DNA 和随机引物产生的32P-标记探针(Feinberg和Vogelstein,1983)中预杂 交。杂交的滤膜用2×SCP、1％SDS在65℃下洗涤30分钟，并用Kodak XAR5胶片经放射自显影显示。由此用与目的性状遗传连锁的遗传多态 性预测目的的性状的存在与否。

本领域的技术人员应当认识到，有多种不同方法从植物组织中分离 DNA，并且有多种不同的Southern杂交方案可产生相同的结果。本领域 的技术人员应当认识到，Southern印迹可摆脱放射自显影使用的放射性 探针，并可用不同探针再次探针杂交。这样人们可以鉴定植物中存在的 每种不同的转基因。另外，本领域的技术人员应当认识到，在目的区域 为多态性的任何类型的遗传标记都可用于鉴定性状的相对存在或不存 在，这种信息也可用于标记辅助的培育。

Southern印迹的每一泳道代表从一种植物中分离的DNA。在同一基 因组DNA印迹上利用多个基因整合事件作为探针，可以确定每种植物的 整合事件组成。可在特定整合事件的作用与植物的表型之间建立相关性。 只让那些含有希望的整合事件组合的植物发育成熟，并用于传粉。在植 物培育过程中，对应于特定转基因整合事件的DNA探针是有用的标记， 用来在不生长植物的情况下鉴定并组合特定的整合事件，并测定植物的 农学表现。

预期可以单个或组合地使用一种或多种限制酶消化基因组DNA。本 领域的技术人员应当认识到，许多不同的限制酶是有用的，限制酶的选 择将取决于用作探针的转基因整合事件的DNA序列和转基因周围的基因 组DNA序列。对于探针，人们希望使用可与用于转化的DNA杂交的DNA 或RNA序列。可选择一种杂交后产生可被确定为转基因整合事件的DNA 片段的限制酶。因此，特别有用的限制酶是显示与特定转基因或目的性 状遗传连锁的多态性的限制酶。

实施例14

测定的一般方法

如下对转化的植物进行DNA分析。用Shure等人(1983)改进的方 法分离基因组DNA。用研钵和研杵在液氮中将叶组织的约1mg愈伤组织 或叶组织研磨成细粉。粉状组织与4ml提取缓冲液(7.0尿素、0.35M NaCl、0.05M Tris-HCl pH8.0、0.01M EDTA、1％肌氨酸)充分混合。 组织/缓冲液匀浆用4ml酚/氯仿抽提。离心分离水相，通过微孔布，并用 1/10体积的4.4M乙酸铵pH5.2和等体积的异丙醇沉淀两次。用70％乙 醇洗涤沉淀，将其重悬浮于200-500ml TE(0.01M Tris-HCl、0.001M EDTA, pH8.0)中。

可利用聚合酶链反应(PCR)检测被转化细胞中DNA序列的存在。 利用该技术，能扩增特异DNA片段，并用琼脂糖凝胶电泳检测。例如， 向含10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.1mg/ml明 胶、200μM每种dATP、dCTP、dGTP、dTFP、0.5μM每种正向和反 向DNA引物、20％甘油和2.5单位Taq DNA聚合酶的反应混合物中加 入200-1000ng基因组DNA。在热循环仪中如下进行反应：94℃ 3分钟， 然后是94℃ 1分钟、50℃ 1分钟、72℃ 30秒的39个循环，随后72℃ 5 分钟。20μl每种反应混合物在TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐、2mM EDTA)中在3.5％ NuSieve凝胶上50V电泳2-4小时。例如，利用该方 法，用正向引物CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC(SEQ ID NO:20)和反向引物AAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGA(SEQ ID NO:21)，可以检测bar基因的存在。

如PCT申请WO95/06128(在此引用作为参考)所述，一种检测膦 丝菌素乙酰转移酶(PAT)存在的方法包括体外酶反应，和随后的薄层层 析。该方法包括，从被转化的细胞的匀浆中和既未被转化也未进行双丙 氨膦选择的对照细胞中制备不同蛋白质提取物，然后通过与PPT和14C- 乙酰辅酶A温育随后薄层层析测定。该测定的结果证实了编码PAT的bar 基因的表达。

对于Southern印迹分析，用3倍过量的限制酶消化基因组DNA，经 0.8％琼脂糖(FMC)电泳，并用10×SCP(20×SCP:2M NaCl、0.6M 磷酸二钠、0.02M EDTA二钠)将其转移(Southern,1975)到Nytran (Schleicher和Schuell)。用随机引物法(Boehringer Mannheim)用32P 标记探针，并用Quik-Sep自旋柱(Isolab Inc.,Akron,OH)纯化。滤 膜在6×SCP、10％硫酸葡聚糖、2％肌氨酸和500μg/ml肝素(Chomet 等人，1987)中65℃预杂交15分钟。然后滤膜在含100μg/ml变性鲑精 DNA和32P-标记探针的6×SCP中65℃杂交过夜。在65℃下用2×SCP、 1％SDS洗涤滤膜30分钟，用Kodak XAR5胶片经放射自显影显示。为 了再次杂交，滤膜在蒸馏水中煮沸10分钟，以去除第一种探针，然后如 上所述预杂交。

实施例15

转基因作物的用途

植物转化的最终目的在于产生对人类有用的植物。就此而言，根据本 发明产生的转基因植物实际上可用于被认为对种植者或对消费者有价值 的任何用途。例如，可希望从转基因植物中收集种子。该种子随后可用 于多种目的。该种子可出售给农民在田地中种植，或者可直接用作动物 或人类的食物。此外，也可由种子本身制造产品。可由种子制造的产品 的实例包括油、淀粉、动物或人类食品、药品和多种工业产品。除了玉 米粒的人类消费外，玉米的食用用途还包括干磨和湿磨工业的产品。玉 米干磨的主要产物是粗粒、粗粉和面粉。玉米湿磨工业能提供玉米淀粉、 玉米浆和食用葡萄糖。玉米油从玉米胚芽中回收，它是干磨和湿磨工业 的副产品。

玉米，包括植物的谷粒和非谷粒部分，也可广泛用作牲畜饲料，主要 用于菜牛、乳牛、肉猪和家禽。玉米的工业用途包括乙醇的生产、湿磨 工业中的玉米淀粉和干磨工业中的玉米粉。玉米淀粉和面粉的工业用途 基于功能特性，如粘度、薄膜形成、粘着性和悬浮颗粒的能力。玉米淀 粉和面粉可用于造纸和纺织工业。其他工业用途包括在粘合材料、建筑 材料、铸造粘合剂、洗衣粉、炸药、油井污泥中的应用和其他矿业用途。 除玉米粒之外的植物部分也可在工业中应用，例如，茎和壳可制成纸和 壁板，穗轴可用作燃料和制成木炭。利用植物的其他方法，如本发明的 方法，随着农业逐渐被了解而众所周知，并且根据本公开内容为本领域 技术人员所公知。例如，在Spragne和Dudley(1988)和Watson和Ramstad (1987)中可发现作物利用的具体方法。

根据本公开内容，可以在不进行过多实验的情况下制备和实行此处公 开和要求保护的所有组合物和方法。本发明的组合物和方法已在优选实 施方案中描述，本领域的技术人员应当理解，在不背离本发明的概念、 精神和范围的情况下，可对组合物和方法和此处所述方法的步骤或步骤 顺序进行改变。更具体而言，应当理解，可以用化学和生理学相关的某 些试剂代替此处所述的试剂，而可获得相同或相似的结果。

发明背景

参考文献
以下所列参考文献在此引用作为参考，以便补充、解释、提供背景， 或讲述此处使用的方法、技术和/或组合物。 Abel等人，科学(Science),232:738-743,1986。 Araki等人，“酵母质粒pSRI编码的位点特异性重组酶R”分子生物学
杂志(J.Mol.Biol.)225(1):25-37,1992。 Armstrong等人，玉米遗传学通讯(Maize Genetics Coop Newsletter)
65:92-93,1991。 Assad,Tucker,Signer,“拟南芥中后生重复片段诱导的基因沉默 (RIGGS)”植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)22:1067-85,1993。 Bansal,Viret,Haley,Khan,Schantz,Bogorad，“玉米叶的叶肉和维管束 鞘细胞中，从cab-ml和rbcS-m3启动子序列开始的瞬时表达不同”美国 国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:3654-3658,1992。 Barkai-Golan等人，微生物学文献(Arch.Microbiol.)116:119-124.1978。 Barton等人，植物生理学(Plant Physiol.)85:1103-1109,1987。 Bates，“植物通过原生质体电穿孔的基因转化”分子生物技术(Mol
Biotechnol.)2(2):135-145,1994。 Battraw和Hall，“用嵌合新霉素磷酸转移酶Ⅱ和β葡糖苷酶基因对双色高 粱原生质体的稳定转化”理论与应用遗传学(Theor.App.Genet.)82(2):
161-168,1991。 Belanger和Kriz，“玉米球蛋白-1基因的等位基因多态性的分子基础”遗
传学(Genet.)129:863-872,1991。 Bellus，大分子科学纯化应用化学(Macromol.Sci.Pure Appl.Chem.)
A31(1):1355-1376,1994。 Bernl-Lugo和Leopold，植物生理学(Plant Physiol.),98:1207-1210,1992。 Bevan等人，“T-DNA胭脂氨酸合酶基因区的结构与转录”核酸研究
(Nucleic Acids Research)11(2):369-385,1983. Bhattacharjee；An；Gupta，“玉米遍在蛋白启动子-bar嵌合基因在原生质
体中表达产生的能育转基因indica稻”植物生物化学与生物技术杂志
(K.Plant Bioch.and Biotech.)6,(2):69-73.1997。 Blackman等人，植物生理学(Plant Physiol.)100:225-230,1992。 Bol等人，植物病理学年述(Annu.Rev.Phytopath.)28:113-138,1990。 Bouchez等人，EMBO Journal,8(13):4197-4204,1989。 Bower等人，“经微粒轰击产生的转基因甘蔗”植物杂志(The Plant
Journal)2:409-416.1992。 Bowler等人，植物生理学年述(Ann Rev.Plant Physiol.)43:83-116,1992。 Branson和Guss，美国北方中心昆虫学会学报(Proceedings North Central
Branch Entomological Society of America)27:91-95,1972。 Broakaert等人，科学245:1100-1102,1989。 Buising和Benbow，“微粒轰击产生的转基因植物的分子分析：矮牵牛属
转化强化序列的作用”分子与普通遗传学(Mol Gen Genet),
243(1):71-81.1994。 Callis等人，“内含子增强了培养的玉米细胞中的基因表达”基因与发育 (Genes and Development)1:1183-1200,1987。 Campbell(编)，《除虫菌素与阿维菌素》(Avermectin and Abamectin)
1989。 Capaldi等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.
Comm.)76:425,1977。 Casas,Kononowicz,Zehr,Tomes,Axtell,Butler,Bressan,Hasegawa，“经
微粒轰击产生的转基因高粱”美国国家科学院院报90(23):11212-
11216,1993。 Chandler等人，“玉米花色素苷途径的两种调节基因是同源的：利用R基
因组序列对B的分离”植物细胞(The Plant Cell)1:1175-1183,1989。 Chau等人，科学244:174-181,1989。 Chomet等人，EMBO J.,6:295-302,1987。 Christou；Murphy；Swain，“通过电穿孔对大豆的稳定转化与由转化的
愈伤组织的根形成”美国国家科学院院报84(12):3962-3966,1987。 Chu等人，Scientia Sinica,18:659-668,1975。 Coe等人，《玉米与玉米改良》(Corn and Corn Improvement)81-258,
1988。 Conkling等人，植物生理学(Plant Physiol.)93:1203-1211,1990。 Consonni，Geuna,Gavazzi,Tonelli，“玉米R基因家族成员之间的分子同
源性”植物杂志(Plant J.)3(2):335-346,1993。 Cordero,Raventos,San Segundo，“玉米蛋白酶抑制剂基因的表达受创
伤和真菌感染诱导：单子叶植物基因的系统性创伤应答”植物杂志
6(2)141-150,1994。 Coxson等人，Biotropica,24:121-133,1992。 Cristou等人，植物生理学，87:671-674,1988。 Cuozzo等人，生物/技术(Bio/Technology)6:549-553,1988。 Cutler等人，植物生理学杂志，135:351-354,1989。 Czapla和Lang，经济昆虫学杂志(J.Econ.Entomol.),83:2480-2485,
1990。 Davies等人，植物生理学，93:588-595,1990。 De Block,Botterman,Vandewiele,Dockx,Thoen,Gossele,Movva,
Thompson,Van Mantagu,Leemans，“通过表达解毒酶改造植物的除
草剂抗性”The EMBO Journal,6(9):2513-2518,1987。 De Block,De Brouwer,Tenning，“利用根瘤农杆菌对芸苔(Brassica
napus)和甘蓝(Brassica oleracea)的转化及转基因植物中bar和neo
基因的表达”植物生理学，91:694-701,1989。 Dehio和Schell，“参与减数分裂可逆基因沉默的转录后机制的植物基因座
的鉴定”美国国家科学院院报91:5538-5542,1994。 Dellaporta等人，“植物DNA的小量制备：方法Ⅱ”植物分子生物学报
道(Plant Mol.Biol.Rep.)1:19-21,1983。 Dellaporta等人，《染色体结构与功能：新概念的影响》(Chromosome
Structure and function:Impact of New Concepts)第18届Stadler遗传
学研讨会(18th Stadler Genetics Symposium),11:263-282,1988。 Dennis,Gerlach,Pryor,Bennetzen,Inglis,Llewellyn,Sachs,Fer1,
Peacock，“玉米醇脱氢酶(Adhl)基因的分子分析”核酸研究，
12(9):3983-4000,1984。 Depicker等人，植物细胞报道(Plant Cell Reports),7:63-66,1988。 D′Halluin,K.,Bonne,E.,Bossut,M.De Beuckeleer,M.,和Leemans,J.
植物细胞4:1495-1505.1992 Dhir；Dhir；Savka；Belanger；Kriz；Farrand；Widholm，“由电穿孔的原
生质体再生转基因大豆甘氨酸-max植物”植物生理学，99(1):81-88,
1992。 Dunn等人，加拿大植物科学杂志(Can.J.Plant Sci.),61:583,1981。 Dure等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology),12:475-486,1989。 Ellis等人，EMBO Journal,6(11):3203-3208,1987。 Enomoto M，等人，“编码导致大肠杆菌K-12中鞭毛相变化的位点特异性
重组酶的pin基因座的作图”细菌学杂志(J Bacterial.)6(2):663-668.
1983。 Erdmann等人，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiology),138:363-368,
1992。 Feinberg和Vogelstein，分析生物化学(Anal.Biochem.),132:6-13,1983。 Finkle等人，植物科学(Plant Sci.),42:133-140,1985。 Fitzpatrick，“大麦植物中发现的多效基因”基因工程新闻(Genetic
Engineering News),13(5):1,22,1993。 Fitzpatrick，基因工程新闻，22:7,1993。 Fodor等人，“光引导的空间定位的平行化学合成”科学，251:767-773,
1991。 Franken,Niesbach-Klosgen,Weydemann,Marechal-Drouard,Saedler,
Wienand，“玉蜀黍的复制查耳酮合酶基因C2和Whp(白花粉)是独
立调节的：花色素苷基因对Whp表达的翻译控制的证据”EMBO J.,
10(9):2605-2612,1991。 Fransz,de Ruijter, Schel，“玉米(玉蜀黍)胚发生愈伤组织中作为生物化
学与细胞化学标记的同工酶”植物细胞报道，8:67-70,1989。 Freifelder,《生物化学和分子生物学的物理生物化学应用》(Physical
Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology)
第二版，1982。 Frohman,《PCRTM方法：方法与应用指南》(PCRTM Protocols:A Guide
to Methods and Applications)，1990。 Fromm等人，植物细胞(The Plant Cell)，1:977-984,1989。 Gallie等人，植物细胞，1:301-311,1989。 Gatehouse等人，食品与农业科学杂志(J.Sci.Food.Agric.),35:373-380,
1984。 Gelvin等人，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology
Manual),1990。 Ghosh-Biswas,Iglesias,Datta,Potrykus，“通过向原生质体直接基因转
移获得的转基因Indica稻(Oryza sativa L.)”生物技术杂志(J.
Biotechnol.),32(1):1-10,1994。 Golic和Lindquist，细胞(Cell),59:3,499-509,1989。 Goring等人，美国国家科学院院报，88:1770-1774,1991。 Grosset,Alary,Gautier,Menossi,Martinez-Izquierdo,Joudrier，“编码α-
淀粉酶抑制剂亚基(CMd蛋白)的大麦基因的表征及在经微粒轰击产生
的转基因烟草和玉米粒中对其启动子的分析”植物分子生物学，
34(2):331-338,1997。 Guerrero等人，植物分子生物学，15:11-26,1990。 Gupta等人，美国国家科学院院报，90:1629-1633,1993。 Hacia等人，“用高密度寡核苷酸阵列和双色荧光分析对BRCA1中杂合突
变的检测”自然遗传学(Nature Genetics),14:441-447,1996。 Hagio,Blowers,Earle，“用DNA包被的微粒轰击后高粱细胞培养物的稳 定转化”植物细胞报道(Plant Cell Rep.),10(5):260-264,1991。 Hamilton等人，美国国家科学院院报，93(18):9975-9979,1996。 Hammock等人，自然，344:458-461,1990。 Haseloff,Siemering,Prasher,Hodge，“隐蔽内含子的去除和绿色荧光蛋
白的亚细胞定位是明亮标记转基因拟南芥植物所需的”美国国家科学
院院报，94:2122-2127,1997。 He；Mouradov；Yang；Mouradova；Scott，“小麦{Triticum aestivum L.)
通过原生质体电穿孔的转化”植物细胞报道，14(2-3):192-196,1994。 Hemenway等人，The EMBO J.,7:1273-1280,1988。 Hensgens,de Bakker,van Os-Ruygrok,Rueb,van de Mark,van der
Maas,van der Veen,Kooman-Gersmann,Schilperoort，“含稻基因的
gusA融合体在稻、大麦和黑麦草中的瞬时和稳定表达”植物分子生
物学，22(6):1101-1127,1993。 Hilder等人，自然，330:160-163,1987。 Hinchee等人，生物/技术，6:915-922,1988。 Hou和Lin，“用于大豆和Hudspeth和Grula的电穿孔条件的快速优化”植
物分子生物学，12:579-589,1989。 Hou和Lin，植物生理学，111:166,1996 Ikeda等人，细菌学杂志，169:5615-5621,1987。 Ikuta等人，生物/技术，8:241-242,1990。 Ingelbrecht,Van Houdt,Van Montagu,Depicker，“烟草中与DNA甲基化
有关的报道转基因的转录后沉默”美国国家科学院院报，91:10502-
10506,1994。 Jefferson，“测定植物中的嵌合基因：GUS fusio系统”植物分子生物学
报道(Plant Molecular Biology Reporter)5:387-405,1987。 Johnson等人，美国国家科学院院报，86:9871-9875,1989。 Jorgensen，“植物中由于同源基因间反式相互作用而改变的基因表达”生
物技术趋势(Trends Biotechnol.),8:340-44,1990。 Jorgensen，“共抑制、花色模式和亚稳的基因表达状态”科学，268:686-
691,1995。 Joshi，核酸研究，15:6643-6653,1987。 Kaasen等人，细菌学杂志，174:889-898,1992。 Kaeppler等人，植物细胞报道，9:415-418.1990。 Kaeppler,Somers,Rines,Cockburn，“碳化硅纤维介导的植物细胞的稳
定转化”理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.),84(5-6):560-566,
1992。 Karsten等人，Botanica Marina,35:11-19,1992。 Katz等人，普通微生物学杂志，129:2703-2714,1983。 Keller等人，EMBO J.,8(5):1309-1314,1989。 Klein,Kornstein,Sanford,Fromm，“通过颗粒轰击对玉米细胞的基因转
化”植物生理学，91:440-444,1989。 Knittel,Gruber；Hahne；Lenee,“向日葵(Helianthus annuus L.)的转化：
一种可靠的方法”植物细胞报道，14(2-3):81-86,1984。 Kohler,Liaud,Mendel,Cerff,Hehl，“玉米GapC4启动子使厌氧报道基
因表达并显示与玉米花色素苷调节基因座Cl的同源性”植物分子生物
学，29(6):1293-1298,1995。 Koster和Leopold，植物生理学，88:829-832,1988。 Kriz,Boston,Larkins，“编码19kD玉米醇溶蛋白的DNA序列侧翼基因的
结构与转录分析”分子与普通遗传学，207(1):90-98,1987。 Kunkel,T.A.等人，“不经表型筛选的快速且有效的位点特异性诱变”酶
学方法(Methods Enzymol),154:367-382,1987。 Kwoh等人，美国国家科学院院报，86:1173,1989。 Langridge和Feix，“从两个分开很远的启动子区转录玉米醇溶蛋白基因”
细胞，34:1015-1022,1983。 Laufs等人，美国国家科学院院报，7752-7756,1990。 Lazzeri，“通过直接DNA摄取的大麦稳定转化。电穿孔和PEG介导的原
生质体转化”分子生物学方法(Methods Mol.Biol.),49:95-106,1995。 Lee和Saier，细菌学杂志，153-685,1983。 Lee；Suh；Lee，“经电穿孔向完整烟草细胞中的基因转移”韩国遗传学
杂志(Korean J Genet),11(2):65-72,1989。 Levings，科学，250:942-947,1990。 Lindbo,Silva-Rosales,Proebsting,Dougherty，“转基因植物中高度特异
抗病毒状态的诱导:基因调节和病毒抗性的含义”植物细胞，5:1749-
1759,1993。 Lindstrom等人，发育遗传学(Developmental Genetics),11:160,1990。 Loomis等人，实验动物学杂志(J.Expt.Zoology),252:9-15,1989。 Ma等人，自然，334:631-633,1988。 Maas,Reichel,Schell,Steinbiss，“单子叶植物原生质体的制备和转化”细
胞生物学方法，50:383-399,1995。
Maeser等人，“Mu噬菌体的Gin重组酶能在植物原生质体中催化位点特异
性重组”分子与普通遗传学，230(1-2):170-176,1991。 Mariani等人，自然，347:737-741,1990。 Martinez,Martin,Cerff“编码玉米胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核基因
的结构、进化与厌氧调节”分子生物学杂志，208(4):551-565,1989。 Matzke和Matzke，“植物如何和为何灭活同源(反式)基因？”植物生
理学，107:679-685,1995。 Matzke,Neuhuber,Matzke，“有性杂交产生的部分同源转基因座之间能
发生多种上位相互作用”分子与普通遗传学，236:379-86,1993。 Matzke,Neuhuber,Park,Ambros,Matzke，“转基因植物中同源性依赖
的基因沉默：上位沉默基因座含有多拷贝的甲基化转基因”分子与普
通遗传学，244:219-229,1994。 Matzke,Priming,Trnovsky,Matzke，“顺序转化的烟草植物中标记基因
的可逆甲基化和失活”EMBO J.,8:643-49,1989。 Meyer，“了解的和控制的转基因表达”生物技术趋势，13:332-337,1995。 Meyer,Heidmann,Niedenhof,“DNA甲基化的差异与转基因矮牵牛花中
的副突变现象有关”植物杂志，4:86-100,1993。 Mittlesten,Scheid,Paszkowski,Potrykus，“拟南芥中转基因的可逆失活”
分子与普通遗传学，228:104-12,1991。 Mueller,Gilbert,Davenport,Birgnefic,Baulcombe，“植物中同源性依赖
的抗性和转基因病毒抗性与同源性依赖的基因沉默有关”植物杂志，
7:1001-1013,1995。 Mundy和Chua,The EMBO J.,7:2279-2286,1988。 Murakami,Anzai,Imai,Satoh,Nagaoka,Thompson，“吸湿链霉菌的双
丙氨膦生物合成基因L：基因簇的分子克隆和表征”分子与普通遗传
学，205:42-50,1986。 Murashige和Skoog，植物生理学(Physiol.Plant.),15:473-497,1962。 Murdock等人，植物化学(Phytochemistry),29:85-89,1990。 Murray等人，核酸研究，17:477-498,1989。 Nagatani,Honda,Shimada,Kobayashi,“DNA向稻细胞中的输送和应用
碳化硅丝的转化”生物技术(Biotech.Tech.),11(7):471-473,1997。 Napoli,Lemieux,Jorgensen，“嵌合查耳酮合酶基因向矮牵牛花中的引入
导致可逆的反式同源基因共抑制”植物细胞，2:279-289,1990。 Neuhuber,Park,Matzke,Matzke，“转基因基因座对依赖同源性的基因沉
默的易感性”分子与普通遗传学，244:230-241,1994。 Newton,Winberg,Yamato,Lupold,Stem，“多年生野生玉蜀黍
(teosintes)的cox2基因之前新线粒体的证据” EMBO J.,
14(3):585-593,1995。 Niebel,Frendo,Van Montagu,Comelissen,“β-1,3-葡聚糖酶基因的转录 后共抑制不影响转基因核mRNA的积累”植物细胞，7:347-358,1995。 Odell等人，“花椰菜花叶病毒35S启动子活性所需DNA序列的鉴定”自
然，313:810-812,1985。 Ogawa等人，科学报道(Sci.Rep.),13:42-48,1973。 Ohara等人，美国国家科学院院报，86:5673-5677,1989。 Omirulleh等人，“含双CaMV 35S增强子元件的嵌合启动子在原生质衍生
细胞和玉米转基因植物中的活性”植物分子生物学，21:415-428,1993。 Omirulleh,Abraham,Golovkin,Stefanov,Karabaev,Mustardy,Morocz,
Dudits，“含双CaMV 35S增强子元件的嵌合启动子在原生质衍生细胞
和玉米转基因植物中的活性”植物分子生物学，21(3):415-428,1993。 Ow等人，科学，234:856-859,1986。 Park,Papp,Moscone,Iglesias,Vaucheret,Matzke,Matzke，“启动子同
源性介导的沉默在转录水平上发生，并导致甲基化和基因活性的减数
分裂可遗传改变”植物，9:183-194,1996。 Paul和Ferl，“体内足迹法显示玉米Adh1和Adh2中唯一的顺式元件和不
同的低氧诱导模式”植物细胞，3(2):159-168,1991。 Pease等人，“用于快速DNA序列分析的光产生的寡核苷酸阵列”美国国
家科学院院报，91:5022-5026,1994。 Perlak等人，美国国家科学院院报，88:3324-3328,1991。 Phi-Van等人，分子细胞生物学，10:2302-2307.1990。 Piatkowski等人，植物生理学，94:1682-1688,1990。 Pignon等人，人类突变(Hum.Mutat.),3:126-132,1994。 Poszkowski等人，EMBO J.,3:2719,1989。 Potrykus等人，分子与普通遗传学，199:183-188,1985。 Prasher等人，生物化学与生物物理学研究通讯，126(3):1259-1268,1985。 Prols和Meyer，“在矮牵牛(Petunia hybrida)中染色体整合区的甲基化
模型影响转移的DNA的基因活性”植物杂志，2:465-75,1992。 Quigley,Brinkman,Martin,Cerff,“编码叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶亚
基GAPA的光调节玉米基因中的强功能GC压力：GAPA假基因进化的
意义”分子发育杂志(J.Mol.Evol.),29(5):412-421,1989。 Radicella,Turks,Chandler,“编码B-Peru-玉米花色素苷途径中的一种
调节蛋白-的cDNA的克隆和核苷酸序列”植物分子生物学(Plant Mol.
Biol.),17(1):127-130,1991。 Ralston,English,Dooner，“玉米的三种bronze等位基因的序列及与基因
精细结构的关系”遗传学，119(1):185-197,1988。 Reed等人，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiology),130:1-4,1984。 Reichel,Mathur,Eckes,Langenkemper,Koncz,Schell,Reiss,Maas，“单
子叶和双子叶植物细胞中表达Aequorea victoria绿色荧光蛋白突变体
增强的绿色荧光”美国国家科学院院报，93:5888-5893,1996。 Reina,Ponte,Guillen,Boronat,Palau，“编码玉蜀黍W64 A的Zc2蛋白的
基因组克隆的序列分析”核酸研究，18(21):6426,1990。 Rensburg等人，植物生理学杂志，141:188-194,1993。 Rhodes；Marrs；Murry,“通过胚电穿孔对玉米的转化”分子生物学方
法(Methods Mol.Biol.),55:121-131.1995 Ritala,Aspergren,Kurten,Salmenkallio-Marttila,Mannonen,Hannus,
Kauppinen,Teeri,Enari，“经颗粒轰击未成熟胚产生的能育转基因大
麦”植物分子生物学，24(2):317-325,1994。 Rochester,Winer,Shah，“编码主要热休克蛋白的玉米基因hsp70的结构
与表达”EMBO J.,5:451-458,1986。 Sabl和Laird，“后成的转化：人类基因作图的含义的建议”美国人类遗
传学杂志(Am.J.Hum.Genet.),50:1171-1177,1992。 Sambrook,Fritsch和Maniatis，《分子克隆：实验室手册》(Molecular
Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，
纽约，1989。 Sauer，分子与细胞生物学(Mol.and Cell.Biol.),7:2087-2096.1987。 Schwarz-Sommer,Shepherd,Tacke,Gierl,Rohde,Leclercq,Mattes,
Berndtgen,Peterson,Saedler，“转座因子对玉蜀黍A1基因结构与功能
的影响”EMBO J.,6:287-294,1987 Schwob,Choi,Simmons,Migliaccio,Ilag,Hesse,Palme,Soll，“三种玉米
22kDa生长素结合蛋白基因-瞬时启动子表达和调节区的分子分析”植
物杂志，4:423-432,1993。 Shagan和Bar-Zvi，植物生理学，101:1397-1398,1993。 Shapiro，《可动遗传因子》(Mobile Genetic Elements),1983。 Sheehy,Kramer,Hiatt，“反义RNA使番茄果实中多聚半乳糖醛酸酶活性
降低”美国国家科学院院报，85:8805-8809,1988。 Sheen等人，植物杂志，8(5):777-784,1995。 Shoemaker等人，“利用高度平行的分子bar编码策略对酵母缺失突变体的
定量表型分析”自然遗传学(Nature Genetics),14:450-456,1996。 Shure等人，细胞，35:225-233,1983。 Siebert等人，“一种在非克隆基因组DNA中步移的改良PCR法”核酸研
究，23:1087-1088,1995。 Simpson，科学，233:34,1986。 Singsit,Adang,Lynch,Anderson,Wang,Cardineau,Ozias-Akins，“苏
云金芽胞杆菌cryIA(c)基因在转基因花生中的表达及其对较少玉米杆
蛀虫的作用”转基因研究(Transgenic Res.),6(2):169-176,1997。 Skriver和Mundy,植物细胞，2:503-512,1990。 Smith,Swaney,Parks,Wernsman,Dougherty,“非翻译有义RNA介导的
转基因植物病毒抗性：非必需RNA的表达、调节和命运”植物细胞，
6:1441-1453,1994。 Smith,Watson,Bird,Ray,Schuch,Grierson，“截短的番茄多聚半乳糖醛
酸酶基因的表达抑制转基因中内源基因的表达”分子与普通遗传学，
224:447-481,1990。 Southern，“凝胶电泳分离的DAN片段间特异序列的检测”分子生物学
杂志，98:503-517,1975。 Spencer等人，“玉米中转基因的分离”植物分子生物学，18:201-210,1992。 Sprague和Dudley编，《玉米与改良》第三版，1988。 Stalker等人，生物学与化学杂志(J.Biol.Chem.),263:6310-6314,1988。 Stalker等人，科学，242:419-422,1988。 Stiefel等人，自然，341:343,1989。 Stiefel等人，植物细胞，2:785-793,1990。 Stougaard，植物杂志，3:755-761,1993。 Sullivan等人，分子与普通遗传学，215:431-440,1989。 Sullivan,Christensen,Quail，“在暗处产生高水平mRNA的玉米叶绿素a/b
结合蛋白基因的分离与表征”分子与普通遗传学，215(3):431-440,  
1989。 Sutcliffe，“大肠杆菌质粒pBR322的氨苄青霉素抗性基因的核苷酸序列”
美国国家科学院院报，75:3737-3741,1978。 Tanksley等人，生物/技术，7:257-264,1989。 Tarczynski等人，“细菌mtID基因在转基因烟草中的表达导致甘露醇的产
生和积累”美国国家科学院院报，89:1-5,1992。 Tarczynski等人，“Osmolyte甘露醇的产生对转基因烟草的压力保护”科
学，259:508-510,1993。 Tarczynski等人，美国国家科学院院报，89:2600,1992。 Thillet等人，生物化学杂志，263:12500-12508,1988。 Thompson等人，“吸湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)除草剂抗
性基因bar的表征”The EMBO Journal,6(9):2519-2523,1987。 Thompson,Drayton,Frame,Wang,Dunwell，“利用碳化硅丝的玉米转
化：综述”Euphytica,85(1-3):75-80,1995。 Tian,Sequin,Charest，“针叶树组织中绿色荧光蛋白基因的表达”植物
细胞报道，16:267-271,1997 Tomes等人，“烟草叶的微粒轰击产生的转基因烟草及其后代”植物分子
生物学，14(2):261-268,1990。 Tomic等人，核酸研究，12:1656,1990。 Torbet,Rines,Somers，“用成熟胚产生的组织培养物对燕麦的转化”作
物科学(Crop Science)，38(1):226-231,1998。 Torbet,Rines,Somers，“巴龙霉素作为选择剂在燕麦转化中的应用”植
物细胞报道，14(10):635-640,1995。 Tsukada；Kusano；Kitagawa，“通过电穿孔向番茄原生质体中引入外源
基因”植物细胞生理学，30(4)599-604,1989。 Twell等人，“经微粒轰击向花粉中输送的嵌合基因的瞬时表达”植物生
理学，91:1270-1274,1989。 Ugaki等人，核酸研究，19:371-377,1991。 Upender等人，生物技术(Biotechniques),18:29-31,1995。 Vaeck.等人，自然，328卷，33页.1987。 Van Blokland,Van der Geest,Mol,Kooter，“矮牵牛中转基因介导的查耳
酮合酶表达抑制是因为RNA转化的增加”植物杂志，6:861-877,1994。 Van der Krol,Mur,Beld,Mol,Stuitje，“矮牵牛花中的类黄酮基因：有限
数量拷贝的添加可导致基因表达的抑制”植物细胞，2:291-99,1990。 Van Eck；Blowers；Earle，“用质粒和YAC DNA的轰击后番茄细胞培养
物的稳定转化”植物细胞报道，14(5):299-304,1995。 Vasil等人，植物生理学，91:1575-1579,1989。 Vaucheret，“转基因烟草植物中19S和35S启动子的普通沉默子的鉴定：
启动子序列中90bp的同源性对于反式灭活是足够的”C.R.Acad.Sci.
Ⅲ,316:1471-83,1993。 Vernon和Bohnert,The EMBO J.,11:2077-2085,1992。 Vodkin等人，细胞，34:1023,1983。 Vogel等人，细胞生物化学(Cell Biochem.),13D(增):312,1989。 Walker等人，美国国家科学院院报，84:6624-6628,1987。 Walker等人，美国国家科学院院报，89:392-396,1992。 Wandelt和Feix，“含有框内终止密码子的玉米的21kd玉米醇溶蛋白基
因的序列”核酸研究，17(6):2354,1989。 Wang等人，“调节从组成型活性稻肌动蛋白基因启动子开始转录的顺式作
用元件的表征”分子与细胞生物学(Molecular and Cellular
Biology),12(8):3399-3406,1992。 Watrud等人，《工程生物与环境》(Engineered Organisms and the
Environment),1985。 Watson和Ramstad，编，《玉米：化学与技术》(Corn:Chemistry and
Technology),1987。 Withers和King，植物生理学，64:675-678,1979。 Wolter等人，The EMBO J.,4685-4692,1992。 Wu等人，基因组学(Genomics),4:560,1989。 Wyn-Jones和Storey,1982。 Xiang和Guerra，植物生理学，102:287-293,1993。 Xu等人，植物生理学，110:249-257,1996。 Yamaguchi-Shinozaki等人，植物细胞生理学，33:217-224,1992。 Yanagisawa和Izui，“参与C4光合作用的玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶：基
因5′侧翼区的核苷酸序列分析”生物化学杂志，106(6):982-987,1989。 Yang和Russell，美国国家科学院院报，87:4144-4148,1990。 Zheng和Edwards，“大麦和燕麦原生质体中大麦条纹花叶病毒抗性的表
达”普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.),71:1865-1868,1990。 Zhou；Stiff；Konzak,“经电穿孔诱导的直接基因转移稳定转化的小麦愈
伤组织”植物细胞报道，12(11).612-616,1993。 Zukowsky等人，美国国家科学院院报，80:1101-1105,                                   序列表 <110>KRIS,ALAN L.
LUETHY,MICHAEL H.
VOYLES,DAIE A. <120>植物中转基因表达的方法及组合物 <130>DEKM:158P <140>在此提交 <141>1999-05-11 <150>09/078,972 <151>1998-05-14 <160>28 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>1 ctggaactgg aacgggcttg ga                                          22 <210>2 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>2 gcgagggcaa cgagcagcac cttcatgg                                   28 <210>3 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>3 gtaatacgac tcactatagg gc                                        22 <210>4 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>4 actatagggc acgcgtggt                                            19 <210>5 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>5 ggctcgaggg accggttaca gcacaccact g                                 31 <210>6 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>6 ggtctagagg tgtcgatctt ctgtgctct                                    29 <210>7 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>7 ggccatgggg tgtcgatctt ctgtgctct                                    29 <210>8 <211>894 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400> 8 ggaccggtta cagcacacca ctgtgggtgg tctcaaggca gtaccaaact atagcatcca 60 tatagcagca gaatcacctg tcttgtctac aagacagaac caatgcatca acttcaaggg 120 agtaccagcg tcttcttgac tgtctttcag aattgtggca ttcttgttgg aagcatagca 180 gtgtaggttg ctcattcacg gataatctcg acacgtaaag tgatgaggaa tacggaacga 240 ccattggcat gtagagctgt atgaattggt gttatccata caacaactcg cagaacatca 300 caaaattgca cgtcaatgga ttgggtcaga aacaaatcgt ctccttgtag cttgtacaat 360 gaagtgatgg tgagtcatga gtcacactga tccgatctga tatatatgcc aaatagctca 420 cacgacaaca ttacaaacaa ccccatacta tacatcacaa agtttgtttc atgaaaaaac 480 aaataagtat gcaggagggg acaataatcc ttgcttgacg cgtaaagtga atttacaaag 540 ccatatatca acctatatct aattaataag ttcgttatat atacgcacga tgatcatcaa 600 caaccgtacc tgtgaaaggc aacaaaatga gccacgcaaa aatgcagaat gaatccatat 660 gatgacgaac gtacactcgg cttgctacat aaagtgaatg atgagtcata aatatttggc 720 aagaaaccgt gaaagctaca cagccgtcgt cagtagcaca ggaacacaag aaactgtgct 780 aatcgaagct ataaataacc ctagtatgcc tatgcacttc tccatcacca ctacccatat 840 cttcagtcta tttaccttct ctatctactc cagagagcac agaagatcga cacc       894 <210>9 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>9 ctcagcccca gcagccacat cca                                        23 <210>10 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>10 gtgcggcagc caatgacaag tc                                        22 <210>11 <211>412 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400> 11 actgaagaaa ctatatccta ctgtaataat aatgatgtaa tatagccgct ggcgagctaa 60 gctagtttag tcatttagcg cggcgatggg taataaaagt gtcatccatc accatgggtg 120 acaatatatg cgaacaaatg acctgaagat gaacaattga aatgaaaagg aaaatatatt 180 acaattcaac gagatatcct ctcgatcgta tcacgtgtcc acaggggtgg atccatgccc 240 cgggctgccc gggctgcagc ccggggcgta gaccaaaaat ccctttagcg attctttttt 300 tcagttcaat tttgccaata aaaactacat ttagccctac ctgatgcggt ctaaaatttt 360 tttacactag tttagcccct cctgtaatgt gtttctagat caggcaatgt at         412 <210>12 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>12 ggctcgaggg accggttaca gcacaccact g                                31 <210>13 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>13 tcagtactgg gcaccgccgg c                                         21 <210>14 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>14 aaggtgctgc tcgttgccct c                                           21 <210>15 <211>29     <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>15 gggagctctc agtactgggc accgccggc                                 29 <210>16 <211>603 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>16 atgaaggtgc tgctcgttgc cctcgctctc ctggctctca ctgcgagcgc cacctccacg 60 caaataggcg gcacgtgcgg ctgccaacca ccgcatctgc caccgccgcc ggttcatctg 120 ccgcctccgg ttcacccgcc cccgccggtt catctgccgc cgccacaatg ccactaccct 180 actcaaccgc cccggcctca gccccagcag ccacatccat gcccatacca accgcagcat 240 ccaagcccgt tccagttcca gcagccggga acctgcgttg gccaaggcac ccagatcctg 300 ggccagtgca ttgagttcct gaggcatcag tgcagcccgg cggcgacgcc ctactgctcg 360 ccacaatgcc aggcgttgcg gcagcagtgt tgccaccagc tcaggcaggt ggagccgctg 420 caccggcaac aggcgatctt cggcgtggtc ctgcagtcca tccagcagca gccgataggc 480 cagccgctcg cggcgctgat ggcggcgcaa atagcgcagc aactgacgga gatgtgcggt 540 gtgcggcagc caatgacaag tccctgccct tgcagcgctg ctgccggcgg tgcccagtac 600 tga                                                               603 <210>17 <211>377 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>17 agaagaagca cgtacgcggg cggaacgcgt gtcctgcctg gataccgcgc gcgagatgac 60 gtgcggcggc ggcgcgcgac taccgccggc gcggcatggc cctactacgg cggctgctgc 120 tgctgctacg tacgctgccg taaagtctcg gtcgccgtgc tagctctagc tagtcgttat 180 gtgtgttgtg ctttgtatgt gcgcgtgtct tgttgggaca tgcagtgtag tgctgctgta 240 tgcgtgtgtc ctttcttgat cggagtcgga gtggctgatg cacagcatgc tggatgtcaa 300 gtttatgatg aggaataaaa tgcaatgttc agggcgagat actacggttt tccttgacta 360 ccatgggatt tgtagaa                                                377 <210>18 <211>222 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>18 gcactcggct tgctacataa agtgaatgat gagtcataaa tatttggcaa gaaaccgtga 60 aagctacaca gccgtcgtca gtagcacagg aacacaagaa actgtgctaa tcgaagctat 120 aaataaccct agtatgccta tgcacttctc catcaccact acccatatct tcagtctatt 180 taccttctct atctactcca gagagcacag aagatcgaca cc                    222 <210>19 <211>412 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>19 gtaagtatgc aggaggggac aataatcctt gcttgacgcg taaagtgaat ttacaaagcc 60 atatatcaac ctatatctaa ttaataagtt cgttatatat acgcacgatg atcatcaaca 120 accgtacctg tgaaaggcaa caaaatgagc cacgcaaaaa tgcagaatga atccatatga 180 tgacgaacgt acactcggct tgctacataa agtgaatgat gagtcataaa tatttggcaa 240 gaaaccgtga aagctacaca gccgtcgtca gtagcacagg aacacaagaa actgtgctaa 300 tcgaagctat aaataaccct agtatgccta tgcacttctc catcaccact acccatatct 360 tcagtctatt taccttctct atctactcca gagagcacag aagatcgaca cc         412 <210>20 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>20 catcgagaca agcacggtca acttc                                        25 <210>21 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>21 aagtccctgg aggcacaggg cttcaaga                                    28 <210>22 <211>2647 <212>DNA <213>人工序列     <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400> 22 tatgaattat tatgtattta ttaattttca gtcgatttaa aaaataaaag aaaagtaaat 60 tggagatttt acattgggaa cctagaaaat tttttatttt ttttctctct tccatcgtaa 120 cgattctggg ctgattgggc ctacagagag gagagcgaaa gcgaagtaat atgagatttt 180 acattaggaa ccctagaata ttttttattt tgtttttccc cttctagaaa agttggatgg 240 aggaggccat cggtaaaccg aacacggaca agatcagggg caaaagaaaa tatttggcaa 300 actaaaattt tggctcttta tagataggta tagatttggg ttaagaacag tagtcggaca 360 ttccacgctt tgttaagttc tttttttaca taacaagaat agaatcacgc tctgtaggct 420 cgtcagaccg tacctttcta aggaagtcgc tttgggtagt tcagttggcg agaaaagcct 480 tcctaccttt gcaggtccat cgggccgact acaacccgtg gctcaatccc ggttcttgcg 540 gtgtcttggc aacattcttg ttggaagata ccagaaggtt gctccacggg taatcttgac 600 acgtatgtaa agtgatgagg aacattgaac gaacattggc atgtaagctc tataattggt 660 gttatccata acaacgtcgc agaacatcac aaattgcacg tcaagggatt gggtcagaaa 720 caaatcgtct ccgtgtacaa cgaagtggtg agtcatgagc catgttgatc tgatatatac 780 atagcacaca cgacatcaca aacaagtcat actacattac agagttagtt tcacctttca 840 agtaaaaaca aagtaggccg gagagaggac aataatcctt gacgtgtaaa gtgaatttac 900 aaagccatat atcaatttat atctaattcg tttcatgtag atatcaacaa cctgtaaaag 960 gcaacaaatt gagccacgca aaattacaag tgagtccaaa taaaccctca catgctacat 1020 aaaagtgaat gatgagtcat gtatatctgg caagaaactg tagaagctac agtcatcggt 1080 agcaaagaaa cacaagaaaa tgtgctaata aaagctataa ataaccctcg tacgcctatg 1140 cacatctcca tcaccaccac tggtcttcat tcagcctatt aacttatatc tatctactcc 1200 agagcagaca agaactcgac accatgaagg tgttgctcgt tgccctcgct ctcctggctc 1260 tcgcgagcgc cgcctccacg cttacaaccg gcggctgcgg ctgccagaca cctcatctac 1320 caccaccgcc ggttcatctg ccgccgccgg tgcatctgcc accgccggtg cacctgccgc 1380 cgccggttca cgtgccaccg ccgccaccac aatgccaccc acaccctact ctaccgcccc 1440 acccacatcc atgcgctaca tacccaccgc atccaagccc gtgccaccca gggcatcccg 1500 gatcctgcgg tgttggcggc ggccccgtca ccccgccgat cctgggccag tgcatcgagt 1560 tcctgaggca tcagtgcagc ccggcggcga cgccctactg ctcgccacag tgccaggcgt 1620 tgcggcagca gtgctgtcag cagctcaggc aggtggagcc gctgcaccgg taccaggcga 1680 tcttcggcgt ggtcctgcag tccatccagc agcagcagcc gcaaggccag tcgtcaccgc 1740 tcccggcgct gatggcggcg caaatagcac agcaactgac ggcgatgtgc ggtctaggag 1800 tggggcagcc aagtccctgc gcttcttgca gcccttttgc cggtggtgtc cactattaaa 1860 gaaactatct atactgtaat aatgttgtat agccgccgga tagctagcta gttagtcatt 1920 cagcggcgat gggtaataat aaagtgtcat ccatccatca ccatgggtgg caacgtgagc 1980 aatgacctga ttgaacaaat tgaaatgaaa agaagaaata tgttatatgt caacgagatt 2040 tcctcataat gccactgaca acgtgtgtcc aagaaatgta tcagtgatac gtatattcac 2100 aattttttta tgacttatac tcacaatttg tttttttact acttatactc gaacaatttg 2160 ttgtgggtac cataacaatt tcgatcgaat atatatcaga aagttgacga aagtaagctc 2220 actcaaaaag ttaaatgggc tgcggaagct gcgtcaggcc caagttttgg ctattctatc 2280 cggtatccac gattttgatg gctgagggac atatgttcgg cttaagctgc agctttgtag 2340 ttagttttgt ttttgattat atttaatact ctatgcatgt gcaccaagat ttttctggtg 2400 aattaaacaa ggcctaataa cgtgagtagc gtatctaact gtgacctata aagtagagca 2460 cctttttaga gtaggggctc ctttttttag aactctattt attgcaccca acttcaataa 2520 gggtcttttc atccaaaatt aagagtcctt acattacatc taatcgtcta ttcattgtct 2580 atattttaat ataaatctta ctgtatatct tgtagcacac tagtatgcct caaagccgac 2640 aataaat 2647 <210>23 <211>3704 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>23 gtggcgcctg taccgcgtgt ggggacgatg agcgctccct gaacgctgtc ttgggagagc 60 tgcaagatga gacactccat cccgcgcagc ctgtcgtggc gtcctcctgg atggacacct 120 gcatcgctgt cgccctccac caactcacct gaacgaagaa tagaataaaa aatggaggga 180 gctgaggggg cagtggttgc gctgtaggga ggagagagac cgcgtcatta taagactatc 240 tgcaaccgtt acctctaaat ttttccctct atatcatttt ttccccatat tttcccccct 300 attttttcat ctcccgcaac ggtttctcct aaatactccc cctatatctc actaccacta 360 taaaatatta ttttttatac caactatcaa ttttttatct actaacaatt actcgtggac 420 ccacagcaca gtgtttagga gatgaacagt gacacgctat atctgggggg agagagaaag 480 aggcgcgcgt agggggcgcg cggtaggggc actgctgcgg ctgtagagta ccccctacac 540 gccggcatgc aagggaaggg ggcaatgttg cgcatagcct aaagagcgga tgaagcggct 600 tgcaatttgc acgctggatt cataaatagt gcatattact aaaaaaaggg tggggacgta 660 ggtatagaga gtctattaga gttgatctaa gacccggttt atttcagatt ataatctgtc 720 cggattatat aatccagcgc aaataataca gtaggtaaac aaacaactag attatgggtt 780 cagattatat aatctaaacc ccagattatg ataatctcat aatctcctca agagtagctt 840 attggagatt attttggcaa aagacccact acccatggtt atgtaaatag aaattataat 900 atatatcatc ttttttctca ccttaaataa acaaataagg gtattgttgt ctttatgaat 960 aatctacatt tgtataatct aaactaccaa acaactacat ctagattata atctggatta 1020 tataatttaa attataatct agattatata atttataagc tgaaacaacc cggccctaaa 1080 gcactatcgt atcacctatc tgatagtcac gggtttcgaa cgtccacttg cgtcgcacgg 1140 aattgcatgt ttcttgttgg aagcatattc acgcaatctc cacacataaa ggtttatgta 1200 taaacttaca tttagcccag tttaattaca gtcttatttg gatgcatatg tatggttctc 1260 aatccatata agttagagta aaaaataagt ttaaatttta tcttaattca ctccaacata 1320 tacggattga gtacaacact catgtgcatc caaacaaact acttatattg aggtgaattt 1380 ggatagaaat taaactaact tacacactaa gccaatcttt actatattaa agcaccagtt 1440 tcaacgatcg tcccgcgtca atattattaaaaaactccta catttcttta taatcaaccc 1500 gcactcttat aatctcttct ctactactat aataagagag tttatgtaca aaataaggtg 1560 aaattatgta taagtgttct ggatattggt tgttaactcc atattcacac aacctaatca 1620 atagaaaaca tatgttttat taaaacaaaa tttatcatat atcatatata tatatataca 1680 tatatatata tatatatata taaaccgtag caatgcacgg gcatataact agtgcaactt 1740 aatacatgtg tgtattaaga tgaataagag ggtatccaaa taaaaaactt gttcgcttac 1800 gtctggatca aattgggttg gaaacgatta aatctcttcc tagtcaaaat tgaatagaag 1860 gagatttaat ctctcccaat ccccttcgat catccaggtg caaccgtata agtcctaaag 1920 tggtgaggaa cacgaaacaa ccatgcattg gcatgtaaag ctccaagaat ttgttgtatc 1980 cttaacaact cacagaacat caaccaaaat tgcacgtcaa gggtattggg taagaaacaa 2040 tcaaacaaat cctctctgtg tgcaaagaaa cacggtgagt catgccgaga tcatactcat 2100 ctgatataca tgcttacagc tcacaagaca ttacaaacaa ctcatattgc attacaaaga 2160 tcgtttcatg aaaaataaaa taggccggac aggacaaaaa tccttgacga gtaaagtaaa 2220 tttacaacaa aaaaaaagcc atatgtcaag ctaaatctaa ttcgttttac gtagatcaac 2280 aacctgtaga aggcaacaaa actgagccac gcagaagtac agaatgattc cagatgaacc 2340 atcgacgtgc tacgtaaaga gagtgacgag tcatatacat ttggcaagaa accatgaagc 2400 tgcctacagc cgtctcggtg gcataggaac acaagaaatt gtgttaatta atcaaagcta 2460 taaataacgc tcgcatgcct gtgcacttct ccatcaccac cactgggtct tcagaccatt 2520 agctttatct actccagagc gcagaagaac ccgatcgaca ccatgagggt gttgctcgtt 2580 gccctcgctc tcctggctct cgctgcgagc gccacctcca cgcataacag cggcggctgc 2640 ggctgccagc caccgccgcc ggttcatcta ccgccgccgg tgcatctgcc acctccggtt 2700 cacctgccac ctccggcgca tctcccaccg ccggtccacc tgccgccgcc ggtccacctg 2760 ccaccgccgg tccatgcgcc gccgccggtt catctgccgc cgccaccatg ccactaccct 2820 actcaaccgc cccggcctca gcctcatccc cagccacacc catgcccgtg ccaacagccg 2880 catccaagcc cgtgccagct gcagggaacc tgcggcgttg gcagcacccc gatcctgggc 2940 cagtgcgtcg agttcctgag gcatcagtgc agcccgacgg cgacgcccta ctgctcgcct 3000 cagtgccagt cgttgcggca gcagtgttgc cagcagctca ggcaggtgga gccacagcac 3060 cggtaccagg cgatcttcgg cttggtcctc cagtccatcc tgcagcagca gccgcaaagt 3120 ggccaggtcg cggggctgtt ggcggcgcag atagcgcagc aactgacggc gatgtgcggt 3180 ctgcagcagc cgactccatg cccctacgct gctgccggcg gtgtccccca ctgaagaaac 3240 tatgtgctgt agtatagccg ctgcccgctg gctagctagc tagttgagtc atttagcggc 3300 gatgattgag taataatgtg tcacgcatca ccatgggtgg cagtgtcagt gtgagcaatg 3360 acctgaatga acaattgaaa tgaaaagaaa atactccatc tgttccaaat taaaattcat 3420 tttaaccttt taataggttt atacaataat tgatatatgt tttctgtata tgtctaattt 3480 gttatcatcc atttagatat agacaaaaaa aaatctaaga actaaaacaa atgctaattt 3540 gaaatgaagg gagtatatat tgggataatg tcgatgagat ccctcgtaat atcaccgaca 3600 tcacacgtgt ccagttaatg tatcagtgat acgtgtattc acatttgttg cgcgtaggcg 3660 tacccaacaa ttttgatcga ctatcagaaa gtcaacggaa gcga 3704 <210>24 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>24 ggctcgagta agtatgcagg a                                           21 <210>25 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>25 ggctcgagca ctcggcttgc t                                            21 <210>26 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>26 cgggctgatc ctggccggca ccgt                                          24 <210>27 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>27 gtgttctcct ggatgtacaa gtac                                           24 <210>28 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成引物 <400>28 tccaaggccc gcgacgtcaa gga                                           23
相关专利内容
标题 发布/更新时间 阅读量
一种能够提高产量的旱沙区葡萄温室栽培方法 2020-05-15 722
抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用 2020-05-16 492
一种表征植物抗盐能力的方法 2020-05-19 494
一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用 2020-05-20 348
一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用 2020-05-15 551
一种提高植物基础抗逆的方法及其应用 2020-05-15 306
中间锦鸡儿CiCPK32基因在调控植物抗逆性的应用 2020-05-17 250
一种利用抗倒伏指数辅助水稻育种的方法 2020-05-18 62
一种生物炭基土壤调理营养剂及其生产工艺 2020-05-21 238
一种基于超声波技术的种子冷诱导装置及方法 2020-05-22 1021
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。

申请试用

生物逆境热门专利
热门分类
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈
提交反馈
使用该功能遇到问题

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

购买VIP 申请VIP试用
您也可以联系官方QQ: 2157717237     电话: 13264338900
关于PatentHub
关于我们 使命宗旨 加入我们 联系我们 帮助中心
PatentHub产品
专利百科 专利交易 业务平台 专利交易大厅 专利需求大厅
 
API接口 数据定制 专利资讯 最新中国发明专利 最新美国发明专利 看视频学检索 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库
 
历年真题 模拟考试 资料库 问答专区 专栏文章 知识分享 求职 招聘 代理所排行榜 代理人排行榜 代理所地域排行榜 找代理所 找代理人
PatentHub联系方式
官方Q群：924368187 官方Q群：931673531 官方Q群：529775260 商务QQ：2157717237 运营QQ：3307693423 电话：13264338900