技术领域
[0001] 本
发明属于
植物育种技术领域，具体涉及一种抗稻瘟病、抗螟虫转基因水稻不育系的育种方法。
背景技术
[0002] 水稻是我国第一大粮食作物，水稻的年
播种面积在3000万公顷左右，总
收获量约占我国粮食总产量的40％，水稻生产是保证国家粮食安全的砥柱。目前应用于生产的水稻品种抗病虫能
力较差，易受到病虫害的危害而导致水稻的减产和品质表现的不稳定，因此，选育同时具有抗病、抗虫能力的水稻品种是提高水稻抗病、抗虫及产量的综合能力的重要措施。
[0003] 基因聚合是指将分散在不同品种中的目标基因聚合到一个品种中，通过这种方法，就可能在较短的时间内培育出集高产、优质、多抗于一体的优良水稻杂交稻亲本或品种。基因聚合可以增加水稻抗病虫能力的持久性，也可以将不同的抗病虫基因聚合到一个作物品种中，当前水稻聚合育种的主要技术手段是采用杂交回交的方法将抗病基因与抗虫基因聚合到一个种质中。
[0004] 长期以来，危害我国水稻的主要病虫害有稻瘟病、螟虫、褐飞虱等等。稻瘟病是水稻三大主要病害之一，可引起水稻大幅度减产，严重时减产40％-50％，甚至绝收。稻瘟病在我国各大稻区均有不同程度发生，近年来发生逐渐呈上升趋势。培育并推广抗稻瘟病水稻品种是防治稻瘟病最经济、最有效的方法。水稻鳞翅目
害虫如二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等是我国水稻生产中的主要害虫，危害面积高达5000万亩亩以上，褐飞虱是阻碍水稻稻株体内水分和养分输导，也是传播水稻各种病害的虫媒，因此，培育并推广同时具有抗稻瘟病、抗褐飞虱、抗螟虫能力的多个抗性目标聚合的水稻新品种是解决上述问题的主要目标。
发明内容
[0005] 本发明的目的是克服
现有技术中水稻病害、虫害制约水稻生产能力的问题，提供一种转基因水稻不育系的多目标性状聚合育种方法。
[0006] 为实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007] 一种抗稻瘟病、抗螟虫转基因水稻不育系的育种方法，依次包括以下步骤：
[0008] 一、先以携带水稻内源抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的不育系E农1S为母本、具有无选择标记转抗虫基因Cry1Ab的水稻纯合株系mfb-MH86为父本，两者杂交得到F1
种子，再种植F1种子后与母本回交获得BC1F1种子；
[0009] 二、先种植BC1F1种子以获得BC1F1群体，然后在BC1F1群体中选择抗虫基因Cry1Ab得到表达的植株与母本回交得到BC2F1种子；
[0010] 三、先种植BC2F1种子以获得BC2F1群体，然后在BC2F1群体中选择抗虫基因Cry1Ab得到表达的植株与母本回交得到BC3F1种子；
[0011] 四、先种植BC3F1种子以获得BC3F1群体，然后在BC3F1群体中选择多株分子检测结果为阳性且农艺性状优良的植株，单株收种后种植得到BC3F2株系；
[0012] 五、先种植BC3F2种子以获得BC3F2株系，然后在BC3F2株系中选择育性鉴定合格、抗虫基因Cry1Ab得到表达且农艺性状优良的植株多株，单株收种得到BC3F3种子；
[0013] 六、先种植BC3F3种子获得BC3F3株系，然后在苗期对BC3F3株系逐株进行Cry1Ab基因分子检测，并通过人工冷水池处理选择育性转换起点
温度低于23.5℃、Cry1Ab基因分子检测结果为纯合的株系多株，在其中筛选出农艺性状与母本差异最小的株系，收获该株系种子继续种植得到BC3F4种子；
[0014] 七、先种植BC3F4种子以获得BC3F4群体，然后收获多个单株获得BC3F5种子，繁殖选中株系得到的自交种子即为培育得到的抗稻瘟病、抗螟虫的水稻新材料，此时，完成育种。
[0015] 所述步骤二、三、五中，检测抗虫基因Cry1Ab是否得到表达的方法为Cry1Ab蛋白
试纸条检测。
[0016] 所述Cry1Ab蛋白试纸条检测为：先取1﹣2cm水稻苗期或成熟期
叶片置于EP管中，加入无菌水
研磨成匀浆，离心后静置，再取Bt Cry1Ab蛋白
免疫层析试纸条放入EP管中，使EP管的液面不超过试纸条的检测线，5min后观察试纸条，若试纸条上control带和阳性带都出现则判断抗虫基因Cry1Ab得到表达，若试纸条上只出现control带则判断抗虫基因Cry1Ab没有得到表达。
[0017] 所述步骤四中，分子检测为抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2以及抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测；
[0018] 所述步骤五中，育性鉴定为1％I2-KI溶液
染色花粉法；
[0019] 所述步骤六中，Cry1Ab基因分子检测为抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测。
[0020] 所述PCR检测的PCR反应体系的总体积为50μL，包括缓冲液、两个终浓度均为1pM/L的引物、终浓度为200μM/L的dNTP、活力为2U的Taq酶、无菌的双蒸水、质粒DNA模板和样品模板，所述缓冲液的体积为5μL，所述两个引物的体积各为1μL，所述dNTP的体积为1μL，所述Taq酶的体积为1μL，所述双蒸水的体积为41μL。
[0021] 所述抗稻瘟病基因Pi-1的PCR检测所采用的引物为：
[0022] L:5'-ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3'
[0023] R:3'-AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-5'；
[0024] 所述抗稻瘟病基因Pi-2的PCR检测所采用的引物为：
[0025] L:5'-GTGCATGAGTCCAGCTCAAA-3'
[0026] R:3'-GTGTACTCCCATGGCTGCTC-5'；
[0027] 所述抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测所采用的引物为：
[0028] L:5'-AAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACG-3'
[0029] R:3'-GATGAATCCATGAGAACATAGGAGC-5'。
[0030] 所述步骤五中，1％I2-KI溶液染色花粉法是指：先用1％I2-KI溶液对花粉进行染色，再通过连续镜检3天观察花粉染色情况和形状选择不育花粉率不低于99.5％的单株，其中，镜检时，每穗上取上、中、下各三朵颖花中的花药放在一个
载玻片上染色，每片各选择2﹣3个
视野观察花粉染色和形状来判断花粉育性，不育花粉率＝不育花粉数/总花粉数*
100％。
[0031] 所述步骤六中，人工冷水池处理是指：先在水稻幼穗分化第4～7期将植株从大田挖出盆栽后置于自然状态下至植株活蔸，再将盆栽活蔸的单株放入冷水池中，灌入冷
水处理6～8天后移至自然状态下生长，然后选择剑叶与倒二叶叶枕距在±2cm内的单穗，待抽穗后镜检，其中，所述处理期间水温设置为：开机温度23.1℃，停机温度22.8℃。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0033] 本发明一种抗稻瘟病、抗螟虫转基因水稻不育系的育种方法以mfb-MH86为父本，以E农1S为母本，通过一次杂交、三次回交的育种方式，将Cry1Ab抗虫基因聚合到抗褐飞虱、抗稻瘟病的优良水稻品种中，并结合Cry1Ab蛋白试纸条检测、分子检测、育性鉴定、田间农艺性状考察以及人工冷水池处理实现了水稻抗稻瘟病基因、抗褐飞虱基因及抗螟虫基因的有效聚合和纯合，保证了不育起点温度低、育性稳定，提高了聚合育种的工作效率。因此，本发明不仅培育出了既抗稻瘟病又抗褐飞虱和螟虫的聚合抗性转基因水稻新品种，而且提高了工作效率。
具体实施方式
[0034] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
[0035] 一种抗稻瘟病、抗螟虫转基因水稻不育系的育种方法，依次包括以下步骤：
[0036] 一、先以携带水稻内源抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的不育系E农1S为母本、具有无选择标记转抗虫基因Cry1Ab的水稻纯合株系mfb-MH86为父本，两者杂交得到F1种子，再种植F1种子后与母本回交获得BC1F1种子；
[0037] 二、先种植BC1F1种子以获得BC1F1群体，然后在BC1F1群体中选择抗虫基因Cry1Ab得到表达的植株与母本回交得到BC2F1种子；
[0038] 三、先种植BC2F1种子以获得BC2F1群体，然后在BC2F1群体中选择抗虫基因Cry1Ab得到表达的植株与母本回交得到BC3F1种子；
[0039] 四、先种植BC3F1种子以获得BC3F1群体，然后在BC3F1群体中选择多株分子检测结果为阳性且农艺性状优良的植株，单株收种后种植得到BC3F2株系；
[0040] 五、先种植BC3F2种子以获得BC3F2株系，然后在BC3F2株系中选择育性鉴定合格、抗虫基因Cry1Ab得到表达且农艺性状优良的植株多株，单株收种得到BC3F3种子；
[0041] 六、先种植BC3F3种子获得BC3F3株系，然后在苗期对BC3F3株系逐株进行Cry1Ab基因分子检测，并通过人工冷水池处理选择育性转换起点温度低于23.5℃、Cry1Ab基因分子检测结果为纯合的株系多株，在其中筛选出农艺性状与母本差异最小的株系，收获该株系种子继续种植得到BC3F4种子；
[0042] 七、先种植BC3F4种子以获得BC3F4群体，然后收获多个单株获得BC3F5种子，繁殖选中株系得到的自交种子即为培育得到的抗稻瘟病、抗螟虫的水稻新材料，此时，完成育种。
[0043] 所述步骤二、三、五中，检测抗虫基因Cry1Ab是否得到表达的方法为Cry1Ab蛋白试纸条检测。
[0044] 所述Cry1Ab蛋白试纸条检测为：先取1﹣2cm水稻苗期或成熟期叶片置于EP管中，加入无菌水研磨成匀浆，离心后静置，再取Bt Cry1Ab蛋白免疫层析试纸条放入EP管中，使EP管的液面不超过试纸条的检测线，5min后观察试纸条，若试纸条上control带和阳性带都出现则判断抗虫基因Cry1Ab得到表达，若试纸条上只出现control带则判断抗虫基因Cry1Ab没有得到表达。
[0045] 所述步骤四中，分子检测为抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2以及抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测；
[0046] 所述步骤五中，育性鉴定为1％I2-KI溶液染色花粉法；
[0047] 所述步骤六中，Cry1Ab基因分子检测为抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测。
[0048] 所述PCR检测的PCR反应体系的总体积为50μL，包括缓冲液、两个终浓度均为1pM/L的引物、终浓度为200μM/L的dNTP、活力为2U的Taq酶、无菌的双蒸水、质粒DNA模板和样品模板，所述缓冲液的体积为5μL，所述两个引物的体积各为1μL，所述dNTP的体积为1μL，所述Taq酶的体积为1μL，所述双蒸水的体积为41μL。
[0049] 所述抗稻瘟病基因Pi-1的PCR检测所采用的引物为：
[0050] L:5'-ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3'
[0051] R:3'-AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-5'；
[0052] 所述抗稻瘟病基因Pi-2的PCR检测所采用的引物为：
[0053] L:5'-GTGCATGAGTCCAGCTCAAA-3'
[0054] R:3'-GTGTACTCCCATGGCTGCTC-5'；
[0055] 所述抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测所采用的引物为：
[0056] L:5'-AAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACG-3'
[0057] R:3'-GATGAATCCATGAGAACATAGGAGC-5'。
[0058] 所述步骤五中，1％I2-KI溶液染色花粉法是指：先用1％I2-KI溶液对花粉进行染色，再通过连续镜检3天观察花粉染色情况和形状选择不育花粉率不低于99.5％的单株，其中，镜检时，每穗上取上、中、下各三朵颖花中的花药放在一个载玻片上染色，每片各选择2﹣3个视野观察花粉染色和形状来判断花粉育性，不育花粉率＝不育花粉数/总花粉数*
100％。
[0059] 所述步骤六中，人工冷水池处理是指：先在水稻幼穗分化第4～7期将植株从大田挖出盆栽后置于自然状态下至植株活蔸，再将盆栽活蔸的单株放入冷水池中，灌入冷水处理6～8天后移至自然状态下生长，然后选择剑叶与倒二叶叶枕距在±2cm内的单穗，待抽穗后镜检，其中，所述处理期间水温设置为：开机温度23.1℃，停机温度22.8℃。
[0060] 本发明的原理说明如下：
[0061] 本发明所采用的mfb-MH86是中国科学院遗传与发育
生物学研究所和福建省农业科学院生物技术研究所选育的无选择标记转抗虫基因cry1Ab的水稻纯合株系，E农1S是湖北省农业科学院粮食作物研究所培育的籼型两系核不育系，携带水稻内源抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2基因，2016年通过湖北省审定。
[0062] 育性鉴定：本发明通过观察花粉染色和形状来判断花粉育性。育性正常的花粉粒含有较多的
淀粉粒，遇I2-KI呈圆形紫黑色，而不育花粉粒经I2-KI染色有典败和圆败两种，花粉粒发育不健全，形状皱缩不规则，或圆形，无内含物，对I2-KI无染色反应，无受精能力，通常称典败(典型败育花粉)，花粉并不皱缩，仍为圆形，部分染色，也无受精能力，则为圆败。
[0064] 一、第一年春季在海南以携带水稻内源抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的不育系E农1S为母本、具有无选择标记转抗虫基因Cry1Ab的水稻纯合株系mfb-MH86为父本，两者杂交得到F1种子；
[0065] 二、同年正季在海武汉种植F1种子获得F1群体，然后与E农1S回交获得BC1F1种子，第二年春季在海南种植BC1F1以获得BC1F1群体，然后对BC1F1群体逐株取叶片进行Cry1Ab蛋白试纸条检测，选择抗虫基因Cry1Ab得到表达的植株作为父本与E农1S进行回交，获得BC2F1种子，其中，Cry1Ab蛋白试纸条检测具体为:先取1-2cm水稻苗期或成熟期叶片置于2mL EP管中，加入400mL无菌水在研磨仪上研磨成匀浆，离心后静置，再取Bt Cry1Ab蛋白免疫层析试纸条放入EP管中，使EP管的液面不超过试纸条的检测线，5min后观察试纸条，若试纸条上出现control带和阳性带则判断抗虫基因Cry1Ab得到表达，若试纸条上只出现control带则判断抗虫基因Cry1Ab没有得到表达；
[0066] 三、同年正季在武汉种植BC2F1种子获得BC2F1群体，对BC2F1群体逐株进行Cry1Ab蛋白试纸条检测，选择抗虫基因Cry1Ab得到表达的植株作为父本与E农1S进行回交，获得BC3F1种子，第三年春季在海南种植BC3F1种子以获得BC3F1群体，然后在BC3F1群体中选择分子检测结果为阳性且农艺性状优良的6株植株进行单株收种，获得6个BC3F2株系种子，分别记为14WT85、14WT86、14WT87、14WT88、14WT89和14WT90，其中，所述分子检测为抗稻瘟病基因Pi-
1、Pi-2以及抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测，PCR检测的PCR反应体系的总体积为50μL，包括缓冲液、两个终浓度均为1pM/L的引物、终浓度为200μM/L的dNTP、活力为2U的Taq酶、无菌的双蒸水、质粒DNA模板和样品模板，所述缓冲液的体积为5μL，所述两个引物的体积各为1μL，所述dNTP的体积为1μL，所述Taq酶的体积为1μL，所述双蒸水的体积为41μL，所述抗稻瘟病基因Pi-1的PCR检测所采用的引物为L:5'-ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3'、R:3'-
AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-5'，所述抗稻瘟病基因Pi-2的PCR检测所采用的引物为L:5'-GTGCATGAGTCCAGCTCAAA-3'、R:3'-GTGTACTCCCATGGCTGCTC-5'，所述抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测所采用的引物为L:5'-AAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACG-3'、R:3'-
GATGAATCCATGAGAACATAGGAGC-5'；
[0067] 四、同年正季在武汉种植上述BC3F2株系种子，各株系均种植100苗的群体，逐株进行Cry1Ab蛋白试纸条检测及育性鉴定，然后选择育性鉴定合格、抗虫基因Cry1Ab得到表达且农艺性状优良的25株植株，保留稻蔸，其中，所述育性鉴定为1％I2-KI溶液染色花粉法，具体为：先用1％I2-KI溶液对花粉进行染色，再通过连续镜检3天观察花粉染色情况和形状选择不育花粉率不低于99.5％的单株，其中，镜检时，每穗上取上、中、下各三朵颖花中的花药放在一个载玻片上染色，每片各选择2﹣3个视野观察花粉染色和形状来判断花粉育性，不育花粉率＝不育花粉数/总花粉数*100％；
[0068] 五、第四年春季稻蔸海南繁种，获得25个BC3F3株系种子，同年正季种植这25个BC3F3株系种子，各株系均种植50苗群体，在苗期逐株进行Cry1Ab基因分子检测和农艺性状考察，并采用人工冷水池处理进行育性鉴定，选择育性转换起点温度低于23.5℃、Cry1Ab基因纯合且农艺性状与E农1S差异最小的株系15WT11，对该株系逐株进行Cry1Ab蛋白试纸条检测，结果显示该株系的各个单株的抗虫基因Cry1Ab均得到表达，保留10个育性合格的单株稻蔸，其中，所述Cry1Ab基因分子检测为抗螟虫基因Cry1Ab的PCR检测，所述人工冷水池处理是指：先在水稻幼穗分化第4～7期将植株从大田挖出盆栽后置于自然状态下至植株活蔸，再将盆栽活蔸的单株放入冷水池中，灌入冷水处理6～8天后移至自然状态下生长，然后选择剑叶与倒二叶叶枕距在±2cm内的单穗，待抽穗后镜检，其中，所述处理期间水温设置为：开机温度23.1℃，停机温度22.8℃；
[0069] 六、第五年春季在海南繁殖该10个稻蔸，获得BC3F4株系种子，同年夏季在武汉种植BC3F4株系，保留其稻蔸，带海南繁种得到BC3F5株系，经鉴定该株系遗传稳定，将其命名为KS11。
