二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途
阅读：1033发布：2020-05-17
专利汇可以提供二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医药工程技术领域，提供了公开了与可溶性二聚体免疫融合蛋白有关的组合物和方法。所述二聚体免疫融合蛋白包含二聚化的第一条和第二条多肽链。其中第一条多肽链结构通式为Z1-Z2，第二条多肽链结构通式为Y1-Y2。其中Z1是(i)第一种 模式识别 受体的细胞外结构域或其功能变体或 片段 ，或(ii)第一种共受体其功能变体或片段；Z2是二聚化结构域或其功能变体或片段。Y1是(i)第二种模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段，或(ii)第二种共受体或其功能变体或片段，Y2是二聚化结构域或其功能变体或片段。所述二聚体蛋白可以用于阻断病原体入侵、限制 炎症 介质的产生和扩大，可以用于炎症介质相关 疾病 的 预防 或 治疗 产品的制备。，下面是二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途专利的具体信息内容。
1.一种二聚体免疫融合蛋白，其特征在于，包含二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，所述第一条多肽链的结构通式为Z1-Z2，所述第二条多肽链的结构通式为Y1-Y2，其中，Z1是(i)第一种模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段，或(ii)第一种共受体或其功能变体或片段；Z2是二聚化结构域或其功能变体或片段，Y1是(i)第二种模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段，或(ii)第二种共受体或其功能变体或片段；Y2是二聚化结构域或其功能变体或片段。
2.根据权利要求1所述的二聚体免疫融合蛋白，其特征在于：
其中，当Z1和Y1均为模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段时，所述第一模式识别受体和所述第二模式识别受体分别选自：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、Dectin-1、Dectin-2、Mincle、CLEC2、CLEC5A、CLEC12A、DCIR以及CLECSF8中的任一个；
当Z1和Y1均为共受体或其功能变体或片段时，第一共受体和第二共受体分别选自CD14、MD-2、LBP以及CD36中的任一个。
3.根据权利要求1所述的二聚体免疫融合蛋白，其特征在于：
其中，Z2和Y2为IgG的Fc片段或改变其生物活性的Fc突变体，或利用Knob-in-hole技术、改变电荷极性的ART-Ig技术或BiMab技术构建的异源二聚IgG-Fc片段。
4.根据权利要求1所述的二聚体免疫融合蛋白，其特征在于：
其中，二聚化结构域Z2和Y2还包含有肽接头，所述肽接头由15-32个氨基酸残基组成，该氨基酸残基包含多个甘氨酸残基、一至八个半胱氨酸残基以及至少一个丝氨酸残基。
5.根据权利要求1所述的二聚体免疫融合蛋白，其特征在于，
其中，当Z1和Y1均为模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1和Y1具有SEQ ID NO.1～18所示的氨基酸序列中的任一个序列；
当Z1和Y1均为共受体或其功能变体或片段时，Z1和Y1具有SEQ ID NO.19～22所示的氨基酸序列中的任一个序列；
Z2和Y2具有SEQ ID NO.23-29所示的氨基酸序列中的任一个序列。
6.根据权利要求5所述的二聚体免疫融合蛋白，其特征在于：
其中，Z1和Y1来源相同，均为TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、Dectin-1、Dectin-2的细胞外结构域或其功能变体或片段，
当Z1和Y1均为TLR1细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的序列与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性；
当Z1和Y1均为TLR2细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的序列与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性；
当Z1和Y1均为TLR4细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的序列与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性；
当Z1和Y1均为TLR6细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的序列与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性；
当Z1和Y1均为Dectin-1细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的序列与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性；
当Z1和Y1均为Dectin-2细胞外结构域或其功能变体或片段时，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的序列与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
7.根据权利要求5所述的二聚体免疫融合蛋白，其特征在于：
其中，Z1和Y1来源于不同的细胞外结构域：
Z1-Z2多肽链序列与SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50或SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性；
Y1-Y2多肽链序列与SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56或SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
8.含有权利要求1～6任一项所述的二聚体免疫融合蛋白的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的药物载体。
9.权利要求1～6任一项所述的二聚体免疫融合蛋白在制备诊断或治疗去除炎性介质相关疾病药物、试剂、试剂盒中的用途。
10.根据权利要求8所述的二聚体免疫融合蛋白在制备治疗炎性介质相关性疾病药物中的用途，其特征在于：
其中，所述治疗炎性介质相关性疾病药物为能够结合病原微生物表面分子、细胞壁或细胞表面成分的药物；直接杀伤病原微生物或限制病原微生物生长的药物；抑制或减少炎性介质或细胞因子过度表达的药物；减少慢性炎性介质损伤或减轻脏器炎症纤维化作用的药物；抑制局部免疫耐受紊乱的药物；或抑制自身免疫耐受异常介导的炎性介质的药物。
所述炎性介质包括病原微生物、酶、细胞因子、前列腺素、类花生酸、自三烯类、激肽类、补体、凝血因子、内毒素、肠毒素、脂多糖、诱导细胞凋亡的物质、胆汁盐、脂肪酸、磷脂、氧化副产物、活性氧簇、氧自由基、表面活性剂、离子、刺激性物质、细胞碎片、干扰素、免疫调节性抗体中的任一种或至少两种的组合。
二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途
技术领域
背景技术
[0002] 在动物中，当细胞或组织受到细菌、外伤、毒素、物理或化学因素(其可以统称为“炎性物质，inflammatory agent”)损伤时，会发生炎性应答。炎症应答的病理生理特征受到由细胞合成并释放的多种促炎或抗炎剌激物或介质的复杂相互作用的调节。一些己知种类的促炎、抗炎剌激物或介质包括细胞因子、氧化亚氮、血栓皖(thromboxane)、自兰烯、磷脂样血小板活化因子、前列腺素、激肤、补体因子、凝血因子、超抗原、单核因子、趋化因子、干扰素、自由基、蛋白酶、花生四烯酸代谢物、环前列腺素、β内啡肽、心肌抑制因子(myocardial depressant factor)、anadamide，2一花生酷甘油(2-arachidonoylglycerol)、四氢生物蝶岭、细胞碎片以及化学物质(包括组胺、缓激肽和血清素)等。
[0003] 根据被侵袭的位置、炎性物质的性质以及所涉及的促炎或抗炎剌激物或介质的相互作用，炎性应答的性质和强度不同。当受到调节并且为局限性时，炎性应答是有益的。但是，如果不受调节并且广泛化时，炎性应答可造成显著的组织损伤甚至死亡。
[0004] 近年来，高度耐药的微生物感染成为临床常见的棘手问题。由于患者救治时间延长，微生物在体内进一步进化，产生如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resist-ant Staphylococcus aureus，MRSA)等“超级耐药菌”，耐药微生物在体内持续存在，使得参与炎症的细胞因子网络调控紊乱，因此开发能抑制整个微生物-免疫系统作用的药物成为前沿热点。利用超剂量的抗生素可以杀灭微生物，但死亡微生物可以进一步介导炎症因子风暴，且大剂量抗生素造成患者肝肾损害，依然无法对抗疾病。
[0005] 参与炎症的细胞因子主要由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞产生的一类蛋白，通常由上述细胞受到病毒、细菌、真菌或寄生虫感染刺激，以及在免疫应答中由T细胞剌激释放。其他一些细胞也可以释放炎性细胞因子，例如基质细胞如成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，以及上皮细胞、角质形成细胞和肝细胞。细胞因子通常以低浓度存在于血液或组织中。
[0006] 细胞因子的结构和活性是免疫学研究热点。目前研究认为，细胞因子拥有广泛的免疫和非免疫活性，可以影响多种生理功能，例如细胞生长、分化、内稳态和病理生理等；同时，细胞因子具有多种生物活性，并且与参与多种生物调控过程；此外，细胞因子可以促进其自身的合成，以及来其他细胞因子的产生，这些现象被称作“细胞因子级联”。细胞因子级联通常与由感染和组织损伤所造成的全身性变化相关，在这种情况下，整个细胞因子级联网络产生非常复杂的细胞和生物效应，例如，白介素(IL)类、干扰素(IF)类和肿瘤坏死因子(TNF)类的多种细胞因子在免疫和炎性应答中可以产生。
[0007] 通常，细胞因子级联介导正常的宿主防御应答、细胞调节和细胞分化。在级联环境下，细胞因子生产的功能可能变得紊乱。该紊乱可导致出现超过正常浓度的细胞因子，此时，对机体的影响是双面的：一方面对抗入侵物，但另一方面如果过度强烈或缺乏调节，即可以损伤机体。
[0008] 当外源性感染物、内源性的免疫刺激物介导细胞因子级联紊乱，就可以产生全身性炎性应答综合征(SIRS)、脓毒症(以及被称作重症脓毒症(具有器官功能障碍的脓毒症)，甚至脓毒症休克。另一方面，感染物的持续存在和慢性炎症、纤维化性炎症等密切相关。
[0009] 综上所述，能够清除入侵物，又能抑制引起体内过度产生的细胞因子的药物是亟待开发的，目前发明人未见任何报道有类似药物。
发明内容
[0010] 本发明是为解决上述问题而进行的，提供了一种可溶性二聚体免疫融合蛋白，并对该可溶性二聚二聚体免疫融合蛋白的具体结构、制备方法和用途进行了描述，即提供了二聚体免疫融合蛋白、其制备方法和用途。
[0011] 本发明的第一方面，提供了可溶性二聚二聚体免疫融合蛋白，包含二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的结构通式为Z1-Z2，第二条多肽链的结构通式为Y1-Y2。其中，Z1是(i)第一种模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段，或(ii)第一共受体或其功能变体或片段；Z2是二聚化结构域或其功能变体或片段，Y1是(i)第二种模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段，或(ii)第二共受体或其功能变体或片段；Y2是二聚化结构域或其功能变体或片段。
[0012] 术语“模式识别受体”是免疫学概念，模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)是一类主要表达于固有免疫细胞表面、非克隆性分布、可识别一种或多种PAMP的识别分子。是固有免疫中免疫受体的代表，由有限数量的胚系基因编码，进化上十分保守，也表明此类受体对生物体的生存极为重要。其与病原生物表面的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的相互识别和作用是启动固有免疫应答的关键。和适应性免疫中淋巴细胞受体相比较，PRR有四个特点。除了全部由胚系基因编码外，另外三个特点是：组成性地表达、引起快速应答和能够识别各种病原体。任何模式识别受体均适用于本发明所述的融合蛋白结构方案。
[0013] 在本发明的某些优选的实施方案中，当Z1和Y1均为模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段时，该第一种模式识别受体和第二种模式识别受体分别选自：TLR1(Gene ID:7096)，TLR2(Gene ID:7097)，TLR3(Gene ID:7098)，TLR4(Gene ID:7099)，TLR5(Gene ID:7100)，TLR6(Gene ID:10333)，TLR7(Gene ID:51284)，TLR8(Gene ID:51311)，TLR9(Gene ID:54106)，TLR10(Gene ID:81793)，Dectin-1(Gene ID:64581)，Dectin-2(Gene ID:93978)，Mincle(Gene ID:26253)，CLEC2(Gene ID:51266)，CLEC5A(Gene ID:23601)，CLEC12A(Gene ID:160364)，DCIR(Gene ID:50856)，CLECSF8(Gene ID:338339)中的任一个。
[0014] 在Z1和Y1都是模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段的情况下，第一和第二种模式识别受体可以是相同的，也可以不同。
[0015] 在本发明的一些优选的实施方案中，当Z1和Y1均为共受体或其功能变体或片段时，第一共受体和第二共受体分别选自CD14(Gene ID:929)，MD-2(Gene ID:23643)，LBP(Gene ID:3929)，CD36(Gene ID:948)中的任一个。
[0016] 在Z1和Y1都是共受体或其功能变体或片段的情况下，第一种和第二种共受体可以是相同的或不同的。
[0017] 二聚化结构域Z2或Y2包括免疫球蛋白重链恒定区。例如，在具体的变化中，二聚化结构域Z2和Y2是IgG的Fc片段，诸如人免疫球蛋白γ1Fc片段。当Z1与Y1不同时，二聚化结构域Z2和Y2可以采用工程化的手段以增加特异性的异源二聚化形成，如Z2和Y2为IgG的Fc片段或改变其生物活性的Fc突变体，或利用Knob-in-hole技术、改变电荷极性的ART-Ig技术或BiMab技术构建的异源二聚IgG-Fc片段(综述文献Brinkmann U,Kontermann R E.mAbs,2017,9(2):182-212.)。
[0018] 关于改变其生物活性的Fc突变体，如二聚化结构域Z2和Y2可以是人免疫球蛋白Fc片段的活性变体，如采用IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域。在某些实施方案中，可以进一步采用Fc的突变体以降低免疫球蛋白诸如ADCC、补体结合等生物活性，如LALA-PG突变体，L235E、E318A、K320A、K322A突变体等。
[0019] 此外，二聚化结构域Z2和Y2还包含有肽接头，所述肽接头由15-32个氨基酸残基组成，其中这些残基中的1-8个(例如，2个)是半胱氨酸残基。在具体变化中，Z2和Y2包含免疫球蛋白铰链区或其变体，例如，在一个具体实施方案中，Z2和Y2包含免疫球蛋白铰链变体(例如，人免疫球蛋白γ1铰链变体)，其中Fc片段的220相对应的半胱氨酸残基被丝氨酸替代。根据上述二聚化结构域Z2和Y2使用的特别合适的肽接头包括这样的肽接头：所述接头包含多个甘氨酸残基，且任选地包含至少一个丝氨酸残基。
[0020] 关于Z1和Y1的具体结构，通过下述描述进行具体说明：
[0021] (1)当Z1和Y1中的每一种都是相同的一种模式识别受体的细胞外结构域或其功能变体或片段时：在具有上述的通式Z1-Z2和Y1-Y2的可溶性二聚体免疫融合蛋白具体变化中，Z1和Y1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1-18所示的氨基酸中的任一个序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。序列1～18的名称如下：
[0022]
[0023]
[0024] (2)当Z1和Y1中的每一种都是相同的一种共受体或其功能变体或片段时：在具有上述的通式Z1-Z2和Y1-Y2的可溶性二聚体免疫融合蛋白具体变化中，Z1和Y1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.19-22所示的氨基酸中的任一个序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。序列19～22的名称如下：
[0025]序列 名称 序列 名称
19 CD1426-355位氨基酸 21 LBP26-481位氨基酸
20 MD-217-160位氨基酸 22 CD361-472位氨基酸
19 CD1426-355位氨基酸 21 LBP26-481位氨基酸
20 MD-217-160位氨基酸 22 CD361-472位氨基酸
[0026] (3)二聚化结构域Z2和Y2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.23-28所示的氨基酸中的任一个序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。序列23～29的名称如下：
[0027] 序列 名称 序列 名称23 IgG-Fc 27 IgG4-Fc
24 IgG-Fc-LALAGP 28 人IgG4FC-hole突变体
25 IgG-Fc-hole 29 人IgG4FC-knob突变体
26 IgG-Fc-knob
24 IgG-Fc-LALAGP 28 人IgG4FC-hole突变体
25 IgG-Fc-hole 29 人IgG4FC-knob突变体
26 IgG-Fc-knob
[0028] 根据Z1和Y1的来源，Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的具体序列举例如下：
[0029] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR1的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.30所示的TLR1-IgG1-Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0030] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR1的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.31所示的TLR1-IgG1-Fc-LALAPG氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0031] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR2的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.32所示的TLR2-IgG1-Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0032] 在本发明的一些个具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR2的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.33所示的TLR2-IgG1-Fc-LALA氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0033] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.34所示的TLR4-IgG1-Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0034] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.35所示的TLR4-IgG1-Fc-LALAGP氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0035] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR6的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.36所示的TLR6-IgG1-Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0036] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是TLR6的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.37所示的TLR6-IgG1-Fc-LALAGP氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0037] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR1的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是TLR2的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.38所示的TLR1-Fc-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.39所示的TLR2-Fc-Hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.39所示的TLR2-Fc-Hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0038] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR1的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是TLR6的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.38所示的TLR1-Fc-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.40所示的TLR6-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.40所示的TLR6-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0039] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR2的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.39所示的TLR2-Fc-Hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0040] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR2的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是TLR6的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.39所示的TLR2-Fc-Hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.42所示的TLR6-Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.42所示的TLR6-Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0041] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是TLR6的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.40所示的TLR6-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.40所示的TLR6-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0042] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是LBP或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.43所示的LBD-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少
95％和最优选至少99％同一性；
95％和最优选至少99％同一性；
[0043] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CD14的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.44所示的CD14 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.44所示的CD14 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0044] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是MD-2或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.45所示的MD-2Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少
95％和最优选至少99％同一性；
95％和最优选至少99％同一性；
[0045] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是CD14的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是MD-2或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.46所示的CD14 Fc knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.45所示的MD-2Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少
95％和最优选至少99％同一性；
95％和最优选至少99％同一性；
[0046] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR4的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CD36的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.41所示的TLR4-IgG-Knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.47所示的CD36 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.47所示的CD36 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0047] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR6的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CD36的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.42所示的TLR6-Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.47所示的CD36 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.47所示的CD36 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0048] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是Dectin-1的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.48所示的Dectin-1 IgG Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0049] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是Dectin-2的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.49所示的Dectin-2 IgG Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0050] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是Dectin-1的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是Mincle的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.50所示的Dectin-1 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.51所示的Mincle IgG Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少
60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0051] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是Dectin-2的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CLEC2的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.52所示的Dectin-2 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.53所示的CLEC2-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0052] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是Dectin-1的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CLEC5A的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.50所示的Dectin-1 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.54所示的CLEC5A-Fc-hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0053] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是Dectin-2的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CLEC12A的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.52所示的Dectin-2 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.55所示的CLEC12AFc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0054] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是Dectin-1的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是DCIR的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.50所示的Dectin-1 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.56所示的DCIR Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0055] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是Dectin-2的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是CLECSF8的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.52所示的Dectin-2 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.57所示的CLECSF8 Fc hole氨基酸序列一致的序列或具有至少
60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；
[0056] 在本发明的一些具体的优选实施例中，Z1和Y1都是Dectin-1的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链和Y1-Y2多肽链的每一条包含与下述的SEQ ID NO.58所示的Dectin-1 IgG4 Fc氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0057] 本发明的一些具体的优选实施例中，Z1是TLR2的细胞外结构域或其功能变体或片段。Y1是Dectin-1的细胞外结构域或其功能变体或片段。例如，所述Z1-Z2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；所述Y1-Y2多肽链包含与下述的SEQ ID NO.50所示的Dectin-1 IgG Fc-knob氨基酸序列一致的序列或具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。
[0058] 本发明的第二方面，提供了编码上述的二聚体免疫融合蛋白的多核苷酸、运载该核苷酸的载体以及包含这种载体的细胞。
[0059] 本发明提供的表达载体包含下述可操作地连接的元件：转录启动子、编码上述二聚体免疫融合蛋白的DNA区和转录终止子。
[0060] 通过培养包含载体的细胞，用于生产如上公开的多肽或二聚蛋白，包括：(i)培养包含如上公开的表达载体的细胞，其中细胞表达由所述DNA区段编码的二聚体免疫融合蛋白，并生产编码的二聚体免疫融合蛋白；(ii)回收可溶性二聚体免疫融合蛋白。
[0061] 类似地，制备二聚蛋白的方法包括：(i)培养包含如上公开的表达载体的细胞，其中细胞表达由所述DNA区段编码的二聚体免疫融合蛋白，并生产编码的二聚体免疫融合蛋白作为二聚蛋白；和(ii)回收二聚蛋白。
[0062] 本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述可溶性二聚体免疫融合蛋白和至少一种药学上可接受的载体。该药物组合物以可溶性二聚体免疫粘融合蛋白为主要或唯一活性成分，辅料可以保证本发明公开的二聚体免疫融合蛋白氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)，从而更稳定地发挥疗效。
[0064] 对于本发明公开的上述二聚体免疫融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中，表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能双特异性抗体蛋白的颗粒化趋势最小；溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态；等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
[0065] 本发明所述的二聚体免疫融合蛋白及其作为活性成分的组合物具有如下的用途：1)结合病原微生物表面分子、细胞壁或细胞表面成分，如实施例1所述；2)直接杀伤病原微生物、限制病原微生物生长、提高免疫细胞对病原微生物入侵的抵抗作用，如实施例2-9所述；3)抑制和减少过度表达、分泌的炎性介质和/或细胞因子，如HMGB1、TNFα、IFN-γ、IL-6、COX-2等。如实施例10-11；4)减少脏器炎症介质过度表达释放、减轻脏器炎症损伤、增强脏器抗应激能力、抵抗急慢性脏器损伤、抵抗浓毒血症等，如实施例12-13；5)减少慢性炎性介质损伤、减轻脏器炎症纤维化的作用，如实施例14-15；6)抑制局部的免疫耐受紊乱，如实施例16所述的免疫不孕不育；7)抑制自身免疫耐受异常介导的炎性介质过度疾病，如狼疮等自身免疫病，如实施例17。
[0066] 因此，在本发明的一些方面，本发明所述的二聚体免疫融合蛋白及其作为活性成分的组合物具有如下的用途：包括预防、诊断和治疗需要去除炎性介质相关疾病药物、试剂、试剂盒用途中的任意一种或至少两种的组合。
[0067] 在一些方法中，所述炎性介质包括：病毒、细菌或寄生虫等病原微生物，还包括酶、细胞因子、前列腺素(prostaglandins)、类花生酸(eicosanoids)、自三烯类(Leukotrienes)、激肽类(kinins)、补体、凝血因子、毒素、内毒素、肠毒素、脂多糖、诱导细胞凋亡的物质、腐蚀性物质、胆汁盐、脂肪酸、磷脂、氧化副产物、活性氧簇、氧自由基、表面活性剂、离子、刺激性物质、细胞碎片、干扰素、以及免疫调节性抗体、生物制品(biologics)、药物中的任一种或至少两种的组合。
[0068] 在一些方面，所述炎性介质存在于受试者的生理性流体或载体流体中，所述生理性流体包括以下的流体:生理性流体包括以下的流体:鼻咽、口腔、食道、胃、胰腺、肝、胸膜、心包、腹膜、肠、前列腺、精液、阴道分泌物、眼泪、唾液、粘液、胆汁、血液、淋巴、血浆、血清、滑液、脑脊液、尿，以及间隙、细胞内和细胞外的流体。
[0069] 所述炎性介质相关性疾病包括：全身性炎性应答综合征(SIRS)或脓毒症(例如源自病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)、自身免疫病、外科手术、细胞毒性化疗、骨髓操作、大的组织损伤或外伤、肠系膜灌注不足、肠粘膜损伤、疟疾、胃肠道炎性疾病、肠道感染、宫腔感染、流行性感冒、急性肺炎如急性呼吸窘迫综合症或急性肺损伤、肺栓塞、胰腺炎、自身免疫和胶原血管病、输血相关疾病、烧伤、烟或吸入肺损伤、移植物抗宿主病、缺血或梗死、再灌注损伤、出血、过敏反应、药物过量、辐射损伤或化学损伤。在一些实施方案中，炎性介质由生物战的病原体、毒素或制剂导致的疾病产生，例如病毒性出血热、水母毒素、汉坦病毒心肺综合征(汉坦病毒)、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、草麻毒素、Q热[博纳特氏立克次氏体(Coxiellaburnetii)]、斑痊伤寒症(Rickettsia prowaszekii)或鹦鹉热[鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)]。
[0070] 炎性介质相关性疾病还包括：接受移植，免疫不孕等需要去除目的免疫因素的疾病。
[0071] 本发明的有益保障及效果：
[0072] 本发明提供的二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途，构建和表达过程简单，通过实验证实二聚体免疫融合蛋白一方面可以直接杀伤病原微生物，限制外来病原体的入侵，另一方面抑制过度产生的炎症因子，减轻组织损伤，对炎性介质相关性疾病等具有良好的治疗作用，通过单独应用或与其他相关病症药物联用，能有效预防和/或治疗炎性介质相关性疾病，具备广阔的临床应用前景。附图说明
[0073] 图1为二聚体免疫融合蛋白的结构示意图。
具体实施方式
[0074] 以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
[0075] 实施例1.可溶性二聚体免疫融合蛋白的构建、表达、表征
[0076] 如图1所示，可溶性二聚体免疫融合蛋白是一种带有抗体Fc的二聚体，二聚体免疫融合蛋白本身的构建和表达的方法为领域内的常规实验技术，简单描述如下：
[0077] (1)委托基因合成商(苏州金维智公司)针对本实施例需要的二聚体免疫融合蛋白的氨基酸序列进行编码核苷酸密码子优化和全基因合成，优化后的核苷酸序列直接装载到PCDNA3.4载体上，所有载体编码后的氨基酸序列描述见表1。
[0078] (2)委托蛋白质制备商(义翘神州公司)针对本实施例需要二聚体免疫融合蛋白进行表达纯化。采用文献Finck B K.Science,265.；Mihara M et al..Journal ofClinical Investigation.2000；106:91-101；Yu X,et al.Nature Immunology.2009；10:48-57.Liu S,et al.Clin Immunol.2019Jun；203:72-80.)方法，利用293F系统进行瞬时转染表达技术进行蛋白表达，然后利用protein A和离子交换的方法获取大量的可溶性二聚体免疫融合蛋白，SDS-PAGE、western blot、质谱证实目的蛋白。
[0079] (3)测定二聚体免疫融合蛋白对配体结合能力
[0080] 利用ELISA方法检测二聚体免疫融合蛋白对特定配体的结合能力，如表2所示。
[0081] 表1可溶性二聚体免疫融合蛋白信息
[0082]
[0083]
[0084] 表2二聚体免疫融合蛋白结合能力检测
[0085]
[0086]
[0087] *+++：结合力达PM级别；++结合力达NM级别。
[0088] 实施例2二聚体免疫融合蛋白对金葡菌作用
[0089] 表达绿色荧光蛋白的金黄色葡萄球菌来自中国科学院微生物所保藏，感染复数采用1:10的感染比。采集健康志愿者外周血样分离外周单核细胞(PBMC，采用碧云天淋巴细胞分离试剂盒分离)。新分离的细胞在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中稳定2h(37.5℃，5％CO2)。
[0090] 按实验需求培养金黄色葡萄球菌，在台式离心机中以10000g离心30秒收集细菌，并用重悬到108CFU/ml左右的细菌密度。取该细菌悬液作梯度稀释涂板计数以确定准确细菌密度。PBMC细胞更换培养基后加入10微升PBS重悬的金黄色葡萄球菌菌液(约106左右细菌)，轻轻振荡混匀，于37℃孵育2小时。吸取培养基上清，用1mL冰PBS清洗细胞三次，合并上清培养基和清洗液，梯度稀释涂板计数，计算未被吞噬的金黄色葡萄球菌数。
[0091] 加入新鲜培养基，添加10μg/ml红霉素培养12小时以彻底清除PBMC细胞外残余细菌，12小时更换无抗生素的新鲜培养基。分别取吞噬实验起始后12小时、24小时、36小时、小时和48小时的细胞，清洗后加入胰蛋白酶水溶液,用枪头彻底吹吸重悬细胞,该过程同时造成巨噬细胞的溶胀并破裂。将该裂解液取梯度稀释涂板计数,得到被吞噬后在巨噬细胞内存活的细菌数量，计算金葡菌的裂解率，结果如表3和表4所示。
[0092] 表3：金葡菌吞噬率
[0093]
[0094]
[0095] 表4：金葡菌裂解率
[0096]组别 吞噬率(％已吞噬细菌) SD p值
空白对照 22.45 2.47
对照IgG 24.62 1.39
TLR1-Fc 99.15 5.72 p＜0.05
TLR2-Fc 95.61 5.72 p＜0.05
TLR4-Fc 70.73 9.63 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 96.60 10.39 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 88.31 11.60 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 75.46 9.83 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 81.89 8.68 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 94.65 8.66 p＜0.05
空白对照 22.45 2.47
对照IgG 24.62 1.39
TLR1-Fc 99.15 5.72 p＜0.05
TLR2-Fc 95.61 5.72 p＜0.05
TLR4-Fc 70.73 9.63 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 96.60 10.39 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 88.31 11.60 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 75.46 9.83 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 81.89 8.68 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 94.65 8.66 p＜0.05
[0097] 这些实验可以证实，二聚体免疫融合蛋白可以有效增强巨噬细胞吞噬、裂解能力，证实二聚体免疫融合蛋白可以作为对抗感染的产品。
[0098] 实施例3免疫二聚体对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用
[0099] BALB/c小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～20g，国际标准株MRSA-252，购自美国组织培养库(American Tissue Culture Collection，ATCC)。建立小鼠模型，经尾静脉注射0.1mL洗涤后的菌液(菌液浓度为1×109CFU/mL)，空白组小鼠经尾静脉注射等量无菌生理盐水。然后将小鼠分为对照组和处理组，每组10只，对照组给与对照IgG，处理组给与本发明所述的二聚体免疫融合蛋白的代表物，剂量为10mg/kg，静脉注射一天一次，连续观察10d。如有小鼠死亡或最后一天实验结束处死全部老鼠，立即无菌条件下取血液铺板计数细菌，同时无菌取肾脏、脾脏、肝脏全器官，去部分组织用玻璃匀浆器磨碎后铺板计数细菌，同时进行病理检查。结果如表5～表9所示：
[0100] 表5：小鼠生存率％
[0101]
[0102]
[0103] 表6：各组小鼠死亡前血液相对菌落数
[0104] 组别 相对菌落数％ SD p值空白对照 0 0
模型组 94.65 8.66
对照IgG 100 7.88
TLR1-Fc 14.94 1.31 p＜0.05
TLR2-Fc 21.03 3.10 p＜0.05
TLR4-Fc 13.90 0.71 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 13.41 1.29 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 23.31 1.34 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 14.75 1.93 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 13.03 1.17 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 23.17 2.38 p＜0.05
模型组 94.65 8.66
对照IgG 100 7.88
TLR1-Fc 14.94 1.31 p＜0.05
TLR2-Fc 21.03 3.10 p＜0.05
TLR4-Fc 13.90 0.71 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 13.41 1.29 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 23.31 1.34 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 14.75 1.93 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 13.03 1.17 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 23.17 2.38 p＜0.05
[0105] 表7：各组小鼠死亡前肝脏相对菌落数
[0106]
[0107]
[0108] 表8：各组小鼠死亡前脾脏相对菌落数
[0109]组别 相对菌落数％ SD p值
空白对照 0 0
模型组 107.97 11.57
对照IgG 100 6.97
TLR1-Fc 5.51 0.37 p＜0.05
TLR2-Fc 18.70 1.53 p＜0.05
TLR4-Fc 8.29 0.61 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 2.40 0.19 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 11.32 1.12 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 1.80 0.25 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 14.27 1.23 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 17.36 2.40 p＜0.05
空白对照 0 0
模型组 107.97 11.57
对照IgG 100 6.97
TLR1-Fc 5.51 0.37 p＜0.05
TLR2-Fc 18.70 1.53 p＜0.05
TLR4-Fc 8.29 0.61 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 2.40 0.19 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 11.32 1.12 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 1.80 0.25 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 14.27 1.23 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 17.36 2.40 p＜0.05
[0110] 表9：各组小鼠死亡前肾脏相对菌落数
[0111]组别 相对菌落数％ SD p值
空白对照 0 0
模型组 108.35 12.42
对照IgG 100 8.15
TLR1-Fc 5.28 0.29 p＜0.05
TLR2-Fc 10.12 0.55 p＜0.05
TLR4-Fc 14.27 2.07 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 2.22 0.01 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 19.15 1.47 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 16.16 0.89 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 8.00 0.48 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 15.90 2.36 p＜0.05
空白对照 0 0
模型组 108.35 12.42
对照IgG 100 8.15
TLR1-Fc 5.28 0.29 p＜0.05
TLR2-Fc 10.12 0.55 p＜0.05
TLR4-Fc 14.27 2.07 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 2.22 0.01 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 19.15 1.47 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 16.16 0.89 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 8.00 0.48 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 15.90 2.36 p＜0.05
[0112] 这些结果表明，本发明所述的二聚体免疫融合蛋白具有较强的微生物杀灭作用、抗感染作用、减少脏器菌落数量，有效对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球。
[0113] 实施例4二聚体免疫融合蛋白治疗的动物系统性真菌感染实验
[0114] 选用雌性C57BL/6小鼠作为实验动物(20g左右)，经尾静脉注射给予5×106CFU/ml浓度的新生隐球菌0.1ml(5×105CFU/ml)，造成系统性真菌感染模型。然后进行分组，每组10只小鼠，处理组分别经脉施用10mg/kg本发明所述二聚体免疫融合蛋白，每日一次，对照组给予对照IgG，给药共5天，在第5天将小鼠处死、取脑、将脑组织匀浆均匀，将匀浆液稀释一定倍数后加入到蛋白胨琼脂基涂板，将培养基上的菌落计数，计算小鼠脑部真菌荷菌量，结果如表10所示。
[0115] 表10：脑组织来源菌落计数
[0116]组别 相对菌落(％) SD p值
正常小鼠 0 0
模型组 95.95 4.82
对照IgG 100 6.68
TLR1-Fc 17.27 1.36 p＜0.05
TLR2-Fc 27.88 3.84 p＜0.05
TLR4-Fc 13.40 1.29 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 28.48 4.24 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 21.69 2.80 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 12.55 0.69 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 29.82 3.81 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 27.37 2.29 p＜0.05
正常小鼠 0 0
模型组 95.95 4.82
对照IgG 100 6.68
TLR1-Fc 17.27 1.36 p＜0.05
TLR2-Fc 27.88 3.84 p＜0.05
TLR4-Fc 13.40 1.29 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 28.48 4.24 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 21.69 2.80 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 12.55 0.69 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 29.82 3.81 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 27.37 2.29 p＜0.05
[0117] 通过表10可以看出，二聚体免疫融合蛋白系统性给药可以有效的抑制脑组织内的真菌生长，达到真菌杀灭效果疗效明显。
[0118] 实施例5二聚体免疫融合蛋白治疗对须癣毛癣菌感染豚鼠模型的治疗试验研究[0119] 选取须癣毛癣菌(ATCC)作为致病菌，实验前恢复其致病力并接种于沙堡琼脂(SDA)斜面试管，26℃培养，7～10d后小心刮取菌落，用生理盐水制成感染真菌混悬液备用。SDA由4％葡萄糖、1％蛋白胨和2％琼脂组成。
[0120] 健康白色豚鼠48只，雌雄兼用，体重250～350g。将所有白色豚鼠的腹背部的长毛剪短，然后用刮须刀脱去毛做出8cm×10cm去毛区，并在脱毛区涂适量甘油以防皮肤干裂，再用砂纸反复磨擦去毛区皮肤，损伤面约3cm×5cm，以皮肤有渗出液但又不大出血为准，将制备的须癣毛癣菌混悬液涂擦于损伤皮肤，感染真菌后，于第10天，观察白色豚鼠的感染区皮肤的病变程度，刮取皮疹、鳞屑或痂皮，镜检出真菌的菌丝或孢子。证明磨砂创伤感染法感染豚鼠动物模型成功。
[0121] 须癣毛癣菌感染豚鼠动物模型制成后，然后进行分组，每组10只，处理组分别经脉施用10mg/kg本发明所述二聚体免疫融合蛋白，每2日一次，对照组给予对照IgG，给药共5天。治愈为皮损消退，真菌镜检连续2次阴性及真菌培养阴性；无效为皮损未消退，真菌镜检阳性。记录各组动物的痊愈数并计算治愈率，停药后观察治愈动物的复发情况。
[0122] 各组分别给药克霉唑乳膏、茯茶提取物外用膜剂、对照外用膜剂和外用空白膜剂，连续治疗观察14d，其中检查7、l0、14d的治愈率如表11所示。由表11的试验统计结果可以看出，本发明所述二聚体免疫融合蛋白对治疗豚鼠须癣毛癣菌感染模型具有较好的疗效。
[0123] 表11：各组须癣毛癣菌感染豚鼠的疗效比较
[0124] 7d治愈率(％) 10d治愈率(％) 14d治愈率(％)模型组 0 0 0
对照IgG 0 0 0
TLR1-Fc 90 100 100
TLR2-Fc 100 100 100
TLR4-Fc 80 100 100
TLR2/TLR4-Fc 100 100 100
TLR4/TLR6-Fc 100 100 100
TLR4/MD-2-Fc 100 100 100
TLR4/CD36-Fc 100 100 100
TLR2/Dectin-1-Fc 100 100 100
对照IgG 0 0 0
TLR1-Fc 90 100 100
TLR2-Fc 100 100 100
TLR4-Fc 80 100 100
TLR2/TLR4-Fc 100 100 100
TLR4/TLR6-Fc 100 100 100
TLR4/MD-2-Fc 100 100 100
TLR4/CD36-Fc 100 100 100
TLR2/Dectin-1-Fc 100 100 100
[0125] 通过结果可以看出，二聚体免疫融合蛋白有效的抑制皮肤浅表真菌生长，达到真菌杀灭效果疗效明显。
[0126] 实施例6二聚体免疫融合蛋白对创伤弧菌的治疗作用
[0127] 1)结合实验
[0128] 分别用灭活的创伤弧菌和鳗弧菌、迟缓爱德华菌、和溶藻弧菌(均来自中科院微生物研究所)进行本实验，利用ELISA方法检测本发明所述的二聚体免疫融合蛋白的代表物跟上述菌体的结合力，检测方法同文献(Goldberg M E,Djavadi-Ohaniance L.Current opinion in immunology,1993,5(2):278-281.)对照组采用对照IgG或TIGIT-Ig，检测结果如表12所示：
[0129] 表12：菌体结合力(nM)
[0130]
[0131]
[0132] 2)乳鼠保护实验
[0133] 首先建立动物模型，用腹腔注射法人工感染乳鼠，以3×109菌量腹腔注射乳鼠，感染12h后分组，每组n＝10。对照组给与IgG，各处理组给与本发明所述二聚体免疫融合蛋白，10mg/kg,每2d，一次，腹腔注射。观察和记录乳鼠发病和死亡情况共3周，计算小鼠存活率，结果如表13所示：
[0134] 表13：创伤弧菌存活率
[0135] 组别 0周存活率％ 1周存活率％ 2周存活率 3周存活率 p值空白对照 100 0 0 0 -
对照IgG 100 0 0 0 -
TLR1-Fc 100 60 60 60
TLR2-Fc 100 60 60 60 p＜0.05
TLR4-Fc 100 60 60 60 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
对照IgG 100 0 0 0 -
TLR1-Fc 100 60 60 60
TLR2-Fc 100 60 60 60 p＜0.05
TLR4-Fc 100 60 60 60 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 100 70 70 70 p＜0.05
[0136] 通过结果可以看出，二聚体免疫融合蛋白有效的抑制创伤弧菌为代表的烈性菌微生物生长，达到微生物杀灭效果疗效明显。
[0137] 实施例7二聚体免疫融合蛋白对抗登革病毒感染
[0138] 登革1型病毒128株(Gen Bank FJ176780)、登革4型病毒43株(GeneBank AF119661)、登革3型病毒80-2株(Gen BankAF317645)、登革4型病毒B5株(Gen Bank AF289029)，C6/36细胞和BHK21细胞：均为军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供；登革病毒培养采用C6/36细胞。待细胞长至单层，弃去培养液，加入不同病毒悬液，于37℃培养，观察细胞病变。待细胞病变达到+++时，冻融病毒培养液，于2,000rpm离心5min，收集上清即为病毒原液。分装后于-80℃保存。为了测定不同病毒的滴度，首先用含2％FCS的细胞维持液将病毒原液10倍比稀释，然后将不同稀释度的病毒液加入细胞单层，37℃孵育
1h。弃上清，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM细胞维持液，继续培养5天。显微镜下观察，细胞出现病变后，4％甲醛溶液固定细胞30min，弃上层琼盖，用去离子水清洗后，加入1％结晶紫染色30min，去离子水清洗后计数蚀斑数，病毒滴度用蚀斑形成单位(plaque form unit，PFU/ml)表示。
1h。弃上清，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM细胞维持液，继续培养5天。显微镜下观察，细胞出现病变后，4％甲醛溶液固定细胞30min，弃上层琼盖，用去离子水清洗后，加入1％结晶紫染色30min，去离子水清洗后计数蚀斑数，病毒滴度用蚀斑形成单位(plaque form unit，PFU/ml)表示。
[0139] 1)体外实验
[0140] 采用固定病毒稀释抗体的方法进行蚀斑减少中和试验：将不同浓度单抗与含[0141] 100PFU的登革4型病毒悬液等量混合，37℃水浴作用1h。将混合液加入培养于6孔板的BHK21细胞，37℃孵育1h，弃去混合液，用PBS缓冲液洗细胞。加入营养琼盖，继续培养5d后固定染色，计数蚀斑数。处理组各药物含量为50μg/ml，对照组给与空白IgG并计算各给药组的中和率，中和率为(1－处理组/空白对照)×100％，结果如表14所示。
[0142] 表14：登革病毒中和率
[0143]组别 中和率％ SD p值
空白对照 0 4.67 -
对照IgG 3.82 0.57 -
TLR1-Fc 91.65 9.68
TLR2-Fc 87.90 11.58 p＜0.05
TLR4-Fc 88.21 8.76 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 64.82 4.96 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 98.16 14.24 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 91.09 11.45 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 84.52 12.60 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 93.86 10.43 p＜0.05
空白对照 0 4.67 -
对照IgG 3.82 0.57 -
TLR1-Fc 91.65 9.68
TLR2-Fc 87.90 11.58 p＜0.05
TLR4-Fc 88.21 8.76 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 64.82 4.96 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 98.16 14.24 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 91.09 11.45 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 84.52 12.60 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 93.86 10.43 p＜0.05
[0144] 2)体内实验
[0145] 将与105PFU/ml的各型登革病毒等量混匀，37℃孵育1h。将病毒合液颅内接种1日龄昆明种乳鼠，每只约30μL，每组n＝10。感染24h后分组，对照组给与IgG，各处理组给与本发明所述二聚体免疫融合蛋白，10mg/kg，每天一次，腹腔注射。观察和记录乳鼠发病和死亡情况共3周，计算小鼠存活率，如表15所示。
[0146] 表15：登革病毒存活率
[0147]
[0148]
[0149] 通过结果可以看出，二聚体免疫融合蛋白有效的抑制以登革病毒为代表的烈性微生物生长，达到微生物杀灭效果疗效明显。
[0150] 实施例8二聚体免疫融合蛋白对血吸虫为代表的的寄生虫杀伤作用研究
[0151] 新西兰大白兔(雄性,2.5-3.0Kg)购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；5周龄的BALB/c小鼠(雄性)购自上海杰思捷实验动物有限公司；新西兰大白兔通过腹部皮肤贴片的方法感染1000±5条日本血吸虫尾蚴，于感染后第14d进行剖杀，以主动脉灌注法从肝门静脉收集相应感染时间的日木血吸虫虫体，然后用RPMI1640培养基充分洗涤虫体。
[0152] 1)体外研究
[0153] 将105个PBMC每孔培养于含有10％胎牛血淸的RPMI1640培养基中，处理组给与本发明所述的二聚体免疫融合蛋白的代表物，对照组给与对照IgG，空白组不给与任何药物。给药浓度为1mg/ml，每孔分别加入10条(14d)活力较好的日本血吸虫，然后放入37℃，5％CO2培养箱中培养(每24h更换一次培养基)，每组均设置三个复孔。利用倒置显微镜分别在培养的第24h、48h、72h和96h观察不同组别的日本血吸虫的活动性和形态学变化，并计算相应培养时间时日本血吸虫的存活率。日本血吸虫的死亡定义为:连续观察2min虫体静止不动则视为虫体死亡，结果如表16所示。
[0154] 表16：PBMC对14d血吸虫存活率影响
[0155]
[0156] 2)体内研究
[0157] 将5周龄雄性的BALB/c小鼠随机分组，分别为健康对照组(空白组)、感染对照组(模型组)、对照IgG组合二聚体免疫融合蛋白处理各组。除空白组外，通过腹部皮肤贴片的方法每只小鼠感染40±2条日本血吸虫尾蚴，在感染的第14d进行给药，处理各组给与本发明所述的二聚体免疫融合蛋白的代表，对照组给与对照IgG，给药剂量为10mg/kg静脉给药，每3天给药一次。于感染的第42d进行剖杀，收集虫体，并对每组的小鼠体内的日本血吸虫进行计数，计算减虫率。减虫率的计算方法如下：减虫率＝(1-实验组平均虫体数/对照组平均虫体数)×100％，结果如表17所示：
[0158] 表17：血吸虫减虫率
[0159]组别 减虫率％ SD p值
空白对照(健康小鼠) - - -
模型组 - -
对照IgG 0 1.25 -
TLR1-Fc 99.47 9.40
TLR2-Fc 78.08 8.92 p＜0.05
TLR4-Fc 91.02 10.01 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 81.87 11.41 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 78.55 7.01 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 97.68 8.06 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 90.50 6.23 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 92.70 7.82 p＜0.05
空白对照(健康小鼠) - - -
模型组 - -
对照IgG 0 1.25 -
TLR1-Fc 99.47 9.40
TLR2-Fc 78.08 8.92 p＜0.05
TLR4-Fc 91.02 10.01 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 81.87 11.41 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 78.55 7.01 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 97.68 8.06 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 90.50 6.23 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 92.70 7.82 p＜0.05
[0160] 通过结果可以看出，二聚体免疫融合蛋白有效的抑制以血吸虫为代表的寄生虫类病原微生物生长，达到微生物杀灭效果疗效明显。
[0161] 实施例9向暴露于未知病原体的患者施用二聚体融合蛋白举例
[0162] 在突发公共安全或生物恐怖主义袭击中，人们暴露于未知的病原体或毒素。暴露模式为很多不同方式中的一种，例如食物或水摄取、气雾剂吸入或皮肤接触。病原体为众多中的一种，例如炭疽杆菌(炭疽热)、流感病毒、天花病毒、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、埃博拉病毒或马尔堡病毒、土拉弗朗西斯菌(野兔病)、汉坦病毒、登革病毒、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、蓖麻毒素、沙门氏菌、大肠杆菌如E.coli 0157:H7、志贺氏杆菌、李斯特菌等。
[0163] 当威胁性的微生物尚未确定时，一些病人已经迅速开始患有相似症状的严重疾病，包括高烧、寒颤、咳嗽、严重疲劳和腹泻。患者可接受标准治疗，例如抗病毒药、抗生素、抗毒素、免疫球蛋白。
[0164] 然后可以利用本发明所述的免疫二聚体快速中和炎症介质，如作为发生感染症状和炎症体征(发烧、寒颤等)的患者的预防措施或治疗手段，向患者静脉施用本发明所述二聚体二聚体免疫融合蛋白，例如包含活性成分为10mg/kg TLR2-Fc的药物组合物、包含活性成分为10mg/kg TLR2/TLR4-Fc的药物组合物、包含活性成分为10mg/kg TLR4/TLR6-Fc的药物组合物等实施例1中的二聚体免疫融合蛋白活性成分的药物组合物。一旦药物分布到体液(尤其是消化道血液)中，二聚体免疫融合并且隔绝外源引入或局部产生或通过生理性流体如胆汁引入消化道造成的血液中的炎性介质，这发生在这些炎性介质可能造成进一步的炎症或毒性，或造成可导致恶化的炎症感染、内毒素血症和脓毒症之前。通过去除这些炎性介质，二聚体免疫融合蛋白减少患者体内额外全身性炎症的引发物，减少全身性炎性介质(如细胞因子)的产生，从而防止或限制细胞因子或其他炎性介质诱导的细胞死亡、器官损伤、多器官衰竭和潜在死亡的发生。
[0165] 实施例10二聚体免疫融合蛋白对巨噬细胞抗炎活性
[0166] Raw 264.7巨噬细胞(中科院细胞库)以含有10％的胎牛血清(FBS；Gibco Laboratories)的DMEM培养基培养，培养条件为在37℃和5％CO2。以1×106个细胞/mL的密度将Raw 264.7细胞接种至96孔板中并贴壁培养过夜。次日，用新鲜的DMEM培养基替换上述培养基，并将实施例1所述的5μg/mL的多种二聚体免疫融合蛋白加至细胞中，对照组加入对照人IgG(Sigma)。将细胞与蛋白孵育30分钟后，培养基添加LPS(终浓度1μg/mL)，并将细胞再温育24小时后进行检测实验。
[0167] 1)NO水平测试
[0168] 使用Griess试剂系统(Promega，USA)测量上述Raw 264.7细胞培养基中的中的一氧化氮(NO)水平。将50μL培养基加入96孔板，接着加入相同量的Griess试剂I(NED)溶液和Griess试剂II(对氨基苯磺酰胺溶液)，孵育10分钟，之后，使用微孔板读取仪(Molecular Devices，USA)在30分钟内测量540nm下的光密度。使用亚硝酸钠标准曲线(0～100μM)来计算NO的浓度。
[0169] 如下表18所示，以LPS刺激细胞增加了NO的表达，但在以LPS与本发明所述的二聚体免疫融合蛋白共同处理时，上述NO表达水平降低了。支持了二聚体免疫融合蛋白的减少巨噬细胞自身炎性渗出的效果。
[0170] 表18相对NO含量
[0171]
[0172]
[0173] 2)细胞因子检测
[0174] 收集含有细胞培养基的上清液样品，并使用HMGB1、TNFα、IFN-γ和IL-6ELISA试剂盒(eBioscience，San Diego)分析细胞因子的水平。在4℃下用100μL捕获抗体(在涂布缓冲液中稀释至制造商的操作规程所建议的浓度)涂布96孔板过夜。接着，在洗涤该板5次之后，每孔中加入200μL测定稀释液，并于室温下温育1小时以进行封闭。在用洗涤缓冲液洗涤各孔5次之后，将细胞培养物样品或每个细胞因子标准蛋白样品稀释，并在每孔中加入100μL各样品。在4℃下过夜温育含有样品的板。接着，在用洗涤缓冲液洗涤该板5次之后，加入100μL与抗生物素蛋白偶联的二抗，并在室温下温育1小时。在与二抗温育之后，洗涤该板5次，并在室温下与100μL抗生物素蛋白-HRP(BDBioscience)温育30分钟。在洗涤该板7次之后，加入100μL TMB溶液(Pierce)并在室温下温育15分钟。在各孔中加入50μl硫酸来终止反应。使用微孔板读取仪测量450nm下的光密度。使用SPSS程序的ANOVA操作进行方差分析，从而进行统计学分析，并使用邓肯氏多变域检验法来验证分析之间的显著性。检测结果如表19～22所示：
[0175] 表19各处理组HMGB1水平
[0176] 组别 HMGB1(pg/ml) SD p值(vs.对照IgG+LPS)空白对照(仅培养基) 26.63 3.21
对照IgG 30.46 2.32
对照IgG+LPS 575.15 32.18
TLR1-Fc+LPS 144.23 11.13 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 154.83 19.01 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 155.32 20.34 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 295.83 39.24 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 147.27 15.17 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 61.96 5.71 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 85.82 8.82 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 187.14 11.97 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 104.50 14.40 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 262.44 27.69 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 132.86 10.30 p＜0.05
对照IgG 30.46 2.32
对照IgG+LPS 575.15 32.18
TLR1-Fc+LPS 144.23 11.13 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 154.83 19.01 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 155.32 20.34 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 295.83 39.24 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 147.27 15.17 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 61.96 5.71 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 85.82 8.82 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 187.14 11.97 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 104.50 14.40 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 262.44 27.69 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 132.86 10.30 p＜0.05
[0177] 表20各处理组TNFα水平
[0178]组别 TNFα(pg/ml) SD p值(vs.对照IgG+LPS)
空白对照(仅培养基) 38.81 3.04
对照IgG 26.97 1.55
对照IgG+LPS 846.19 109.55
TLR1-Fc+LPS 222.31 29.63 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 283.73 32.10 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 109.83 12.84 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 280.92 41.07 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 231.82 25.73 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 156.57 13.75 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 96.98 10.40 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 212.85 10.79 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 77.54 5.55 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 54.13 5.91 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 176.33 20.53 p＜0.05
空白对照(仅培养基) 38.81 3.04
对照IgG 26.97 1.55
对照IgG+LPS 846.19 109.55
TLR1-Fc+LPS 222.31 29.63 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 283.73 32.10 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 109.83 12.84 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 280.92 41.07 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 231.82 25.73 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 156.57 13.75 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 96.98 10.40 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 212.85 10.79 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 77.54 5.55 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 54.13 5.91 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 176.33 20.53 p＜0.05
[0179] 表21各处理组IFN-γ水平
[0180] 组别 IFN-γ(pg/ml) SD p值(vs.对照IgG+LPS)空白对照(仅培养基) 32.19 3.38
对照IgG 41.47 4.76
对照IgG+LPS 468.55 26.07
TLR1-Fc+LPS 174.12 25.90 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 70.74 9.15 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 237.00 28.58 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 174.12 25.90 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 136.35 19.16 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 206.10 30.47 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 77.88 6.72 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 216.75 28.28 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 91.34 10.97 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 202.65 15.46 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 199.29 23.21 p＜0.05
对照IgG 41.47 4.76
对照IgG+LPS 468.55 26.07
TLR1-Fc+LPS 174.12 25.90 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 70.74 9.15 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 237.00 28.58 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 174.12 25.90 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 136.35 19.16 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 206.10 30.47 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 77.88 6.72 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 216.75 28.28 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 91.34 10.97 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 202.65 15.46 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 199.29 23.21 p＜0.05
[0181] 表22各处理组IL-6水平
[0182] 组别 IL-6(pg/ml) SD p值(vs.对照IgG+LPS)空白对照(仅培养基) 31.47 4.69
对照IgG 41.00 3.53
对照IgG+LPS 634.98 71.06
TLR1-Fc+LPS 160.10 12.29 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 71.72 7.42 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 295.24 34.62 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 157.59 8.61 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 211.16 13.26 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 262.55 21.10 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 89.26 5.95 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 57.33 5.83 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 109.77 8.01 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 189.63 13.57 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 171.20 21.51 p＜0.05
对照IgG 41.00 3.53
对照IgG+LPS 634.98 71.06
TLR1-Fc+LPS 160.10 12.29 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 71.72 7.42 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 295.24 34.62 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 157.59 8.61 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 211.16 13.26 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 262.55 21.10 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 89.26 5.95 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 57.33 5.83 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 109.77 8.01 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 189.63 13.57 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 171.20 21.51 p＜0.05
[0183] 进一步确定二聚体免疫融合蛋白对细胞因子蛋白表达的抑制效果。将所述的对照组和处理组细胞裂解，利用qPCR方法分析细胞内的细胞因子mRNA的表达如下表23～26所示，以LPS刺激细胞增加了细胞因子的表达(HMGB1、TNF-α、IL-6、COX-2)。然而，若用LPS和本发明所描述的二聚体免疫融合蛋白同时处理细胞，上述促炎细胞因子的表达水平显著降低。这些结果强烈的提示和支持支持本发明所述的二聚体免疫融合蛋白的抗炎效果。
[0184] 表23各处理组细胞HMGB1表达水平
[0185]
[0186]
[0187] 表24各处理组细胞TNFα表达水平
[0188]组别 TNFα相对表达水平％ SD p值(vs.对照IgG+LPS)
空白对照(仅培养基) 10.67 0.98
对照IgG 10.12 0.69
对照IgG+LPS 100 7.84
TLR1-Fc+LPS 17.63 1.99 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 23.04 2.93 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 14.33 1.04 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 18.87 2.13 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 24.65 2.80 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 13.46 1.47 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 14.82 0.75 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 20.77 2.98 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 35.86 5.38 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 18.47 2.62 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 22.18 2.26 p＜0.05
空白对照(仅培养基) 10.67 0.98
对照IgG 10.12 0.69
对照IgG+LPS 100 7.84
TLR1-Fc+LPS 17.63 1.99 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 23.04 2.93 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 14.33 1.04 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 18.87 2.13 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 24.65 2.80 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 13.46 1.47 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 14.82 0.75 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 20.77 2.98 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 35.86 5.38 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 18.47 2.62 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 22.18 2.26 p＜0.05
[0189] 表25各处理组细胞IL-6表达水平
[0190]
[0191]
[0192] 表26各处理组细胞COX-2表达水平
[0193]组别 COX-2相对表达水平％ SD p值(vs.对照IgG+LPS)
空白对照(仅培养基) 22.86 3.16
对照IgG 28.89 1.91
对照IgG+LPS 100 8.81
TLR1-Fc+LPS 30.69 3.44 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 26.50 3.03 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 29.65 3.21 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 34.03 3.44 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 28.15 1.65 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 26.32 3.85 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 22.44 2.28 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 23.45 2.82 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 21.64 1.42 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 41.09 3.67 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 38.46 3.76 p＜0.05
空白对照(仅培养基) 22.86 3.16
对照IgG 28.89 1.91
对照IgG+LPS 100 8.81
TLR1-Fc+LPS 30.69 3.44 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 26.50 3.03 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 29.65 3.21 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 34.03 3.44 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 28.15 1.65 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 26.32 3.85 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 22.44 2.28 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 23.45 2.82 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 21.64 1.42 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 41.09 3.67 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 38.46 3.76 p＜0.05
[0194] 通过结果可以看出，二聚体免疫融合蛋白有效的抑制由于外来刺激物介导的以巨噬细胞为代表的免疫细胞炎性渗出。
[0195] 实施例11二聚体免疫融合蛋白对外周单核细胞抗炎活性
[0196] 使用Biocoll Separating Solution(Biochrom AG,Berlin,Germany)从收集自健康受试对象的血样(50ml)中分离出PBMC(外周血单个核细胞)。按照实施例2的方法进行细胞处理同时检测培养基中的细胞因子(TNFα和IL-6)分泌水平、细胞内细胞因子(HMGB1、TNFα)的mRNA水平，结果如表27～30所示：
[0197] 表27各处理组TNFα水平
[0198]
[0199]
[0200] 表28各处理组IL-6水平
[0201]组别 IL-6(pg/ml) SD p值(vs.对照IgG+LPS)
空白对照(仅培养基) 13.23 1.72
对照IgG 22.60 2.99
对照IgG+LPS 263.02 32.10
TLR1-Fc+LPS 31.13 3.08 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 85.98 7.08 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 95.74 8.38 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 46.93 5.89 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 12.63 1.32 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 84.79 5.11 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 15.60 0.96 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 45.76 6.01 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 44.22 6.54 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 19.75 1.16 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 97.01 6.27 p＜0.05
空白对照(仅培养基) 13.23 1.72
对照IgG 22.60 2.99
对照IgG+LPS 263.02 32.10
TLR1-Fc+LPS 31.13 3.08 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 85.98 7.08 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 95.74 8.38 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 46.93 5.89 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 12.63 1.32 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 84.79 5.11 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 15.60 0.96 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 45.76 6.01 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 44.22 6.54 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 19.75 1.16 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 97.01 6.27 p＜0.05
[0202] 表29各处理组细胞HMGB1表达水平
[0203]
[0204]
[0205] 表30各处理组细胞TNFα表达水平
[0206] 组别 TNFα相对表达水平％ SD p值(vs.对照IgG+LPS)空白对照(仅培养基) 17.13 1.58
对照IgG 15.71 2.15
对照IgG+LPS 100 5.57
TLR1-Fc+LPS 40.85 6.10 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 32.04 2.55 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 27.84 3.89 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 27.57 2.47 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 21.35 1.33 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 27.30 3.66 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 26.88 1.81 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 23.46 1.49 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 24.63 2.64 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 40.76 4.67 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 47.92 3.34 p＜0.05
对照IgG 15.71 2.15
对照IgG+LPS 100 5.57
TLR1-Fc+LPS 40.85 6.10 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 32.04 2.55 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 27.84 3.89 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 27.57 2.47 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 21.35 1.33 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 27.30 3.66 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 26.88 1.81 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 23.46 1.49 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 24.63 2.64 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 40.76 4.67 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 47.92 3.34 p＜0.05
[0207] 通过结果可以看出，二聚体免疫融合蛋白有效的抑制由于外来刺激物介导的以外周单个核细胞为代表的免疫细胞炎性渗出。
[0208] 实施例12.二聚体免疫融合蛋白治疗急性肺损伤
[0209] BALB/c小鼠进行分组(n＝12)，空白组和假手术组均给与PBS，对照组给与对照IgG，各处理组给与本发明所述的二聚体免疫融合蛋白代表物，以按照10mg/kg的给药剂量尾静脉注射小鼠，每天一次连续给药3天，末次给药1h后开始造模，2％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定于37℃恒温手术台。参照文献方法造模，造模主要步骤如下：小心剃去颈部正中毛发，酒精消毒，正中切开颈部皮肤约2cm，暴露及分离气管，利用胰岛素注射器于气管内慢慢滴注LPS5mg/kg(0.5mL/kg)，假手术组气管内滴注等量生理盐水，碘伏消毒伤口并缝合皮肤，建立小鼠急性肺损伤模型。
[0210] 造模24h后摘眼球取血，4℃冰箱静置3h后，3500r/min离心15min,分离血清，液氮保存，待测。各组小鼠小心剪开颈部皮肤并分离气管，行气管插管。剖开胸部，结扎右支气管，用磷酸缓冲液灌洗左肺，共3次，2mL/次，收集支气管肺泡灌洗液并离心(4℃，1300r/min,5min)。
[0211] 检测如下指标：1)BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)检测支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,实验操作均按照试剂盒说明书进行。2)支气管肺泡灌洗液白细胞水平，用800μL0.01mol/L(pH 7.4)的PBS缓冲液重悬支气管肺泡灌洗液沉淀物,吹打均匀后,取400μL于血液分析仪中检测白细胞数目。3)肺湿干质量比(W/D)：称取左肺上叶为湿质量,将左肺上叶放入恒温干燥箱(105℃)烤72h，干燥至恒质量，并称取记录为干质量，按下列公式计算:肺湿干质量比＝湿质量/干质量。4)肺组织病理形态评分：取右肺下叶, 中性甲醛浸泡固定24h,流水冲洗12h,常规石蜡包埋,切片,苏木精伊红染色,封片,显微镜下进行病理观察。选择不同视野按照标准肺炎症评分进行病理评分，评分方法参考文献[朱珊,潘灵辉,林飞,等.临床麻醉学杂志,2013,29(6).]。5)血生化指标检测血清中SOD活性和MDA的含量测定严格按照相应检测试剂盒说明书步骤进行检测。6)肺组织TGF-β1和Smad2的表达水平检测：BCA试剂盒检测肺组织匀浆总蛋白浓度,加入等量样品于电泳槽进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经过转膜、封闭、孵育TGF-β1(1:3000)、Smad2(1:2000)一抗过夜；洗膜、孵育二抗(1:7000)(抗体均购自CST公司)、洗膜、显影,使用ImageJ软件半定量分析各条带灰度值。结果如表31～38所示：
[0212] 表31各组支气管肺泡灌洗液蛋白含量
[0213]组别 蛋白含量(g/L) SD p值(vs.对照IgG+LPS)
假手术组 0.44 0.05
模型组(空白对照) 3.16 0.46
对照IgG 3.41 0.56
TLR1-Fc+LPS 0.77 0.04 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 1.31 0.16 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 0.74 0.07 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 0.47 0.07 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 0.35 0.02 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 0.67 0.01 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 1.10 0.11 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 1.40 0.15 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 0.21 0.02 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 0.75 0.06 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 0.30 0.01 p＜0.05
假手术组 0.44 0.05
模型组(空白对照) 3.16 0.46
对照IgG 3.41 0.56
TLR1-Fc+LPS 0.77 0.04 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 1.31 0.16 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 0.74 0.07 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 0.47 0.07 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 0.35 0.02 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 0.67 0.01 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 1.10 0.11 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 1.40 0.15 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 0.21 0.02 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 0.75 0.06 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 0.30 0.01 p＜0.05
[0214] 表32各组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数量
[0215]
[0216]
[0217] 表33各组肺组织湿干质量比
[0218]
[0219] 表34各组肺损伤评分
[0220]
[0221]
[0222] 表35各组血清SOD活性
[0223] 表36各组血清MDA含量(μmol/L)活性
[0224]
[0225]
[0226] 表37各组组织TGF-β1相对表达水平
[0227]组别 TGF-β1相对表达％ SD p值(vs.对照IgG+LPS)
假手术组 5.05 0.26
模型组(空白对照) 101.53 12.42
对照IgG 100 8.81
TLR1-Fc+LPS 38.51 2.26 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 39.78 3.35 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 17.13 2.56 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 20.69 2.50 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 28.51 2.28 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 12.17 1.67 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 12.64 1.70 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 28.36 3.45 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 15.73 0.91 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 39.06 5.50 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 5.04 0.31 p＜0.05
假手术组 5.05 0.26
模型组(空白对照) 101.53 12.42
对照IgG 100 8.81
TLR1-Fc+LPS 38.51 2.26 p＜0.05
TLR2-Fc+LPS 39.78 3.35 p＜0.05
TLR4-Fc+LPS 17.13 2.56 p＜0.05
TLR6-Fc+LPS 20.69 2.50 p＜0.05
TLR4-Fc-LALAPG+LPS 28.51 2.28 p＜0.05
TLR1/TLR2-Fc+LPS 12.17 1.67 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc+LPS 12.64 1.70 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 28.36 3.45 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc+LPS 15.73 0.91 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc+LPS 39.06 5.50 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 5.04 0.31 p＜0.05
[0228] 表38各组组织Smad2相对表达水平
[0229]
[0230] 这些实验证实，本发明所描述的二聚体免疫融合蛋白具有降低急性炎症渗出、抑制白细胞渗出、减少组织水肿、减轻组织损伤、增强SOD活性、降低血清MDA含量、抑制Smad2和TGF-β1表达，具有较强的抗炎、抗LPS作用。可以治疗急性脏器炎症损伤。
[0231] 实施例13在盲肠结扎穿孔服毒症的小鼠模型中施用二聚体免疫融合蛋白的方案概述
[0232] C57雄性小鼠，手术如下：使用短效的异氟院进行麻醉，以使麻醉对心血管功能的有害作用最小化。手术过程包括开始在胸板下方2cm处的5cm的中线开腹。将盲肠隔离在腹腔外的无菌纱布上，以避免血管损伤。之后利用2-0薇乔线(vicry1)在紧接回盲瓣的下方结扎，并保持肠的连续性。然后将盲肠内容物挤到盲肠的一端。利用20号针将盲肠刺破3次，然后于动从每个刺破位置单滴挤出排泄物质。然后将腹腔封闭两层，之后是流体复苏，并将动物放回合适的笼中。假手术组小鼠除不进行盲肠结扎穿孔外，其余手术步骤完全相同。在手术后2小时、6小时和12小时检查动物。允许动物随意饮食。手术后12小时，将动物分为空白组(注射PBS)或静脉注射包含活性成分为本发明所述的免疫融合代表药物组合物，n＝10，剂量为10mg/kg，每天连续给给药。每12小时观察并记录小鼠生存情况，直至手术后7天。手术的48小时时采集一次小鼠血样，用ELISA试剂盒(CST)检测各组血浆中TNFα的水平。结果如表39、40所示：
[0233] 表39小鼠存活率(％)
[0234]
[0235]
[0236] 表40 TNFα表达水平
[0237]组别 TNFα(pg/ml) SD p值(vs.对照IgG+LPS)
假手术组 27.49 3.15 p＜0.05
模型组(空白对照) 793.47 62.44 p＜0.05
对照IgG 779.51 64.66 p＜0.05
TLR1-Fc 110.02 15.18 p＜0.05
TLR2-Fc 149.20 15.24 p＜0.05
TLR4-Fc 159.25 22.40 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 198.55 27.01 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 296.06 29.39 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 305.86 26.49 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 337.32 44.67 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 123.03 7.65 p＜0.05
假手术组 27.49 3.15 p＜0.05
模型组(空白对照) 793.47 62.44 p＜0.05
对照IgG 779.51 64.66 p＜0.05
TLR1-Fc 110.02 15.18 p＜0.05
TLR2-Fc 149.20 15.24 p＜0.05
TLR4-Fc 159.25 22.40 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 198.55 27.01 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 296.06 29.39 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 305.86 26.49 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 337.32 44.67 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 123.03 7.65 p＜0.05
[0238] 这些实验证实，本发明所描述的二聚体免疫融合蛋白具有减轻脓毒血症细胞因子、提高患者对抗脓毒血症的存活率。可以治疗急性脏器炎症损伤。
[0239] 实施例14二聚体免疫融合蛋白对血吸虫感染和感染导致肝脏纤维化的作用[0240] 选取Balb/c小鼠，体重20～25g。日本血吸虫感染性钉螺由江苏血吸虫病防治研究所提供。实验动物随机分组，每组10只小鼠，分别为健康对照组(空白组)、感染对照组(模型组)、对照IgG组合二聚体免疫融合蛋白处理各组。除空白组外，其他各组采用腹部贴片法每只小鼠感染(30±2)条尾蚴。自感染后42d开始，连续给药30d。二聚体免疫融合蛋白和对照IgG给药量为10mg/kg,3d一次，最后一次给药24h后，在吸入式异氟烷麻醉机麻醉下处死动物，采集血样，分离血清用于检测。取出小鼠肝脏后，在预冷的生理盐水中清洗2次以去除残余血渍。每个肝脏称重后立即切割为几部分，一部分置于4％中性多聚甲醛溶液中固定，用于后续组织病理学检测，另一部分经液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存用于后续分子生物学检测。
[0241] 血清肝功能指标ALT、AST，血清肝纤维化指标透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量，肝组织氧化损伤指标SOD、GSH-PX、GSH-R、MDA、GSH及羟脯氨酸含量检测均按检测试剂盒说明书执行，结果如表41～49所示。
[0242] 表41各组小鼠肝功能情况
[0243]组别 ALT水平(U/L) SD p值
空白对照 26.05 3.16
模型组 124.47 13.35
对照IgG 126.48 7.09
TLR1-Fc 45.99 2.56 p＜0.05
TLR2-Fc 41.33 5.82 p＜0.05
TLR4-Fc 22.31 2.20 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 33.67 2.27 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 45.37 2.43 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 50.49 5.87 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 25.94 2.72 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 55.24 7.19 p＜0.05
空白对照 26.05 3.16
模型组 124.47 13.35
对照IgG 126.48 7.09
TLR1-Fc 45.99 2.56 p＜0.05
TLR2-Fc 41.33 5.82 p＜0.05
TLR4-Fc 22.31 2.20 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 33.67 2.27 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 45.37 2.43 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 50.49 5.87 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 25.94 2.72 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 55.24 7.19 p＜0.05
[0244] 表42各组小鼠肝功能情况
[0245]组别 AST水平(U/L) SD p值
空白对照 25.53 2.17
模型组 132.65 11.41
对照IgG 121.00 6.43
TLR1-Fc 72.09 9.43 p＜0.05
TLR2-Fc 46.35 3.45 p＜0.05
TLR4-Fc 47.52 5.05 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 69.30 7.45 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 77.13 4.37 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 34.27 6.00 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 55.73 4.18 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 58.59 7.55 p＜0.05
空白对照 25.53 2.17
模型组 132.65 11.41
对照IgG 121.00 6.43
TLR1-Fc 72.09 9.43 p＜0.05
TLR2-Fc 46.35 3.45 p＜0.05
TLR4-Fc 47.52 5.05 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 69.30 7.45 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 77.13 4.37 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 34.27 6.00 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 55.73 4.18 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 58.59 7.55 p＜0.05
[0246] 表43各组小鼠血清透明质酸水平情况
[0247]
[0248]
[0249] 表44各组小鼠血清层黏连蛋白水平情况
[0250] 组别 LN水平(ng/ml) SD p值空白对照 30.83 3.82
模型组 150.79 21.06
对照IgG 145.08 8.68
TLR1-Fc 51.71 6.02 p＜0.05
TLR2-Fc 21.30 1.91 p＜0.05
TLR4-Fc 23.99 1.33 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 33.94 4.30 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 39.10 2.24 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 56.23 8.17 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 34.24 2.74 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 31.47 2.02 p＜0.05
模型组 150.79 21.06
对照IgG 145.08 8.68
TLR1-Fc 51.71 6.02 p＜0.05
TLR2-Fc 21.30 1.91 p＜0.05
TLR4-Fc 23.99 1.33 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 33.94 4.30 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 39.10 2.24 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 56.23 8.17 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 34.24 2.74 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 31.47 2.02 p＜0.05
[0251] 表45各组小鼠肝脏中羟脯氨酸水平情况
[0252]
[0253]
[0254] 表46各组小鼠肝脏氧化损伤指标
[0255]
[0256] 表47各组小鼠肝脏中虫卵肉芽肿面积占比
[0257] 组别 肉芽肿面积比％ SD p值空白对照 0 0
模型组 65.18 7.35
对照IgG 59.77 4.86
TLR1-Fc 11.51 0.69 p＜0.05
TLR2-Fc 13.25 1.28 p＜0.05
TLR4-Fc 13.91 1.62 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 9.38 0.53 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 17.66 1.55 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 15.04 1.95 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 13.85 1.22 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 6.21 0.52 p＜0.05
模型组 65.18 7.35
对照IgG 59.77 4.86
TLR1-Fc 11.51 0.69 p＜0.05
TLR2-Fc 13.25 1.28 p＜0.05
TLR4-Fc 13.91 1.62 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 9.38 0.53 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 17.66 1.55 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 15.04 1.95 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 13.85 1.22 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 6.21 0.52 p＜0.05
[0258] 表48各组小鼠肝脏中TGFβα表达水平
[0259]
[0260]
[0261] 表49各组小鼠肝脏中αSMA表达水平
[0262]组别 TGFβ相对表达％ SD p值
空白对照 1.65 0.19
模型组 99.47 9.40
对照IgG 100 10.55
TLR1-Fc 13.54 1.34 p＜0.05
TLR2-Fc 5.42 0.36 p＜0.05
TLR4-Fc 10.32 2.02 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 8.72 1.11 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 2.94 0.32 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 16.22 2.22 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 19.99 1.06 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 19.05 1.16 p＜0.05
空白对照 1.65 0.19
模型组 99.47 9.40
对照IgG 100 10.55
TLR1-Fc 13.54 1.34 p＜0.05
TLR2-Fc 5.42 0.36 p＜0.05
TLR4-Fc 10.32 2.02 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 8.72 1.11 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 2.94 0.32 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 16.22 2.22 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 19.99 1.06 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 19.05 1.16 p＜0.05
[0263] 这些实验证实，本发明所描述的二聚体免疫融合蛋白具有抑制血吸虫肝脏定植、减少肝脏纤维化、减少脏器炎症性损伤、可以作为对抗脏器纤维化的产品。
[0264] 实施例15二聚体免疫融合蛋白治疗小鼠子宫内膜损伤模型
[0265] (1)动物子宫内膜损伤模型的构建(C57小鼠)
[0266] 取8周龄大的雌性小鼠分为组，每组10只小鼠，采用双重(感染+机械)损伤法构建子宫内膜损伤模型，即小鼠麻醉后，取下腹部正中长约2cm纵切口进腹，于子宫中下1/3处作0.5cm纵行切口，采用子宫内膜刮勺搔刮中上段子宫腔，当刮勺进出子宫凹凸感消失，四壁感觉粗糙时，停止刮宫，刮宫后宫腔留置脂多糖棉线，缝合腹部切口，48h后取出脂多糖棉线。
[0267] 建模完成后，设置空白对照组(假手术组)、仅注射生理盐水(模型)组以及处理组。处理组分别经脉施用10mg/kg本发明所述二聚体免疫融合蛋白的代表，3天一次，共施用3次。在小鼠动情3个周期后将小鼠与雄性小鼠进行交配。1个月后取材行HE染色和Masson染色进行子宫内膜组织功能学评估，3个月后行小鼠妊娠结果评估。结果：术后1个月组织功能学评估显示，与各对照组相比，免疫二聚体处理各组的纤维化程度明显减少(表50)；与各对照组相比，外泌体腺体数量均高于各对照组。妊娠结果评估显示，免疫二聚体处理各组的妊娠率高于各对照组，结果如表51所示。
[0268] 表50各组小鼠子宫内膜纤维化程度
[0269]组别 相对纤维化面积％ SD p值(比对照IgG)
空白对照组 2.05 0.23
模型组 97.46 9.41
对照IgG 100 10.58
TLR1-Fc 17.82 2.40 p＜0.05
TLR2-Fc 24.29 1.56 p＜0.05
TLR4-Fc 40.77 2.89 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 22.39 2.31 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 16.97 1.67 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 25.03 1.70 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 31.30 2.93 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 32.93 2.40 p＜0.05
空白对照组 2.05 0.23
模型组 97.46 9.41
对照IgG 100 10.58
TLR1-Fc 17.82 2.40 p＜0.05
TLR2-Fc 24.29 1.56 p＜0.05
TLR4-Fc 40.77 2.89 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 22.39 2.31 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 16.97 1.67 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 25.03 1.70 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 31.30 2.93 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 32.93 2.40 p＜0.05
[0270] 表51各组小鼠妊娠结果分析
[0271] 组别 怀孕率％ p值(比对照IgG)空白对照组 100
模型组 10
对照IgG 20
对照IgG 70 p＜0.05
TLR1-Fc 80 p＜0.05
TLR2-Fc 70 p＜0.05
TLR4-Fc 80 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 70 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 80 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 80 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 70 p＜0.05
模型组 10
对照IgG 20
对照IgG 70 p＜0.05
TLR1-Fc 80 p＜0.05
TLR2-Fc 70 p＜0.05
TLR4-Fc 80 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 70 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 80 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 80 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 70 p＜0.05
[0272] 这些实验证实，本发明所描述的二聚体免疫融合蛋白具有抑制减少脏器炎症性损伤、抑制脏器慢性炎症，尤其是子宫内膜炎症和纤维化，可以作为对抗脏器纤维化的产品、提高不孕不育疾病的治疗。
[0273] 实施例16.二聚体免疫融合蛋白对自发性流产模型的治疗作用
[0274] 利用CBA/J雌性小鼠和DBA/2J雄性小鼠建立应激流产模型，该流产模型为经典的母胎免疫耐受障碍的研究模型，建立方法、实验方法和观察时间点等同文献(Blois S M,et al..Nature Medicine,2007,13(12):1450-1457.)。CBA/J雌性小鼠合笼前分为阴性对照组，应激压力组，处理组。处理组分别经脉施用10mg/kg本发明所述二聚体免疫融合蛋白，3天一次，共施用3次。第一次施用后3天后合笼。确定阴栓怀孕后立即将小鼠分笼(有效n＝10)。
[0275] 实验结果显示(表52)，治疗组的流产率显著低于应激压力流产组，说明采用二聚体免疫融合蛋白具有良好的治疗效果。
[0276] 表52各组小鼠胚胎吸收率(流产)分析
[0277] 组别 胚胎吸收率 SD p值(比应激压力+对照IgG)空白对照组 7.86 6.80
应激压力组 48.04 5.48
对照IgG 50.83 11.42
TLR1-Fc 19.76 7.36 p＜0.05
TLR2-Fc 21.19 7.57 p＜0.05
TLR4-Fc 17.14 9.27 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 18.39 6.58 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 22.86 8.41 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 21.01 8.76 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 16.25 8.12 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 16.07 8.25 p＜0.05
应激压力组 48.04 5.48
对照IgG 50.83 11.42
TLR1-Fc 19.76 7.36 p＜0.05
TLR2-Fc 21.19 7.57 p＜0.05
TLR4-Fc 17.14 9.27 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 18.39 6.58 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 22.86 8.41 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 21.01 8.76 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 16.25 8.12 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 16.07 8.25 p＜0.05
[0278] 进一步将所述对照组、应激压力组和处理组的小鼠主动脉旁淋巴结分离，检测其中的Foxp3阳性T辅助淋巴细胞水平。分离蜕膜组织中，检测组织中的TNFα的水平；分离和检测的方法同文献(Kim B J,et al..Proceedings ofthe National Academy ofSciences,2015,112(5):1559-1564。结果显示二聚体免疫融合蛋白处理可以有效增加Foxp3阳性T辅助淋巴细胞水平、降低组织TNFα的水平(表53)。
[0279] 表53各组小鼠Foxp3％表达分析
[0280]
[0281]
[0282] 表54各组TNFα组织表达分析
[0283]组别 相对TNFα表达％ SD p值(vs应激压力+对照IgG)
空白对照组 9.73 0.50
应激压力组 92.60 5.19
对照IgG 100 5.56
TLR1-Fc 13.10 1.44 p＜0.05
TLR2-Fc 15.50 1.83 p＜0.05
TLR4-Fc 18.91 2.45 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 11.20 0.77 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 19.27 2.80 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 12.85 1.05 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 37.54 1.46 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 20.29 2.92 p＜0.05
空白对照组 9.73 0.50
应激压力组 92.60 5.19
对照IgG 100 5.56
TLR1-Fc 13.10 1.44 p＜0.05
TLR2-Fc 15.50 1.83 p＜0.05
TLR4-Fc 18.91 2.45 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 11.20 0.77 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 19.27 2.80 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 12.85 1.05 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 37.54 1.46 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 20.29 2.92 p＜0.05
[0284] 这些实验证实，本发明所描述的二聚体免疫融合蛋白具有抑制减少脏器炎症性因子的异常，对抗异常免疫紊乱、提高不孕不育疾病的治疗。
[0285] 实施例17:二聚体免疫融合蛋白对狼疮小鼠模型的治疗作用
[0286] 狼疮性肾炎作为一种代表性免疫系统疾病，发病率约为50/10万，在我国约占人口的0.7‰。90％以上狼疮性肾炎见于女性，主要为青、中年女性，一般认为30岁以下者肾脏受累率高，约有70％病人有不同程度的肾损害临床表现，以程度不等的蛋白尿、镜下血尿为多见，常伴有管型尿及肾功能损害，严重影响患者的正常生活。
[0287] 狼疮小鼠模型多采用NZB雌鼠与NZW雄鼠杂交产生，杂交第一代(NZB×NZW)F1，能产生包括狼疮性肾炎在内的典型狼疮症状，是目前公认的研究狼疮性肾炎动物模型之一。模型的建立参考非专利文献Brinks et al.Circ Res(2010)107:1140-1149。然后将小鼠分组为各蜕膜NK细胞处理组和对照组，每组n＝10。
[0288] 二聚体免疫融合蛋白的施用剂量为:10mg/kg，一周两次尾静脉注射，连续注射十周。对照组注射对照IgG，剂量同处理组。
[0289] 于第30周分别检测各处理组自身抗体水平，各处理组较对照组抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体显著减少，而总IgG水平不变，证实处理对自身免疫性抗体有抑制生成的作用。如表11-13所示。
[0290] 于40周统计蛋白尿发生率，50周统计存活率，小鼠死亡立即进行组织学研究做病理评分，存活小鼠在50周同一处死，肾脏组织学研究进行病理评分，评分方法参考文献[Liu S,et al.Clinical Immunology,2019,203:72-80.]。如表55-60所示，各处理组较对照组有效减少蛋白尿水平、减轻肾脏炎症和病理破坏、提高狼疮小鼠存活力。
[0291] 表55 30周各组小鼠血清抗dsDNA抗体
[0292]
[0293] 表56 30周各组小鼠血清抗组蛋白抗体
[0294]
[0295] 表57 30周各组小鼠血清总IgG水平
[0296]
[0297] 表58 40周各组小鼠蛋白尿发生率
[0298] 组别 蛋白尿发生率％ p值空白组(模型组) 100
对照IgG 100
TLR1-Fc 40 p＜0.05
TLR2-Fc 30 p＜0.05
TLR4-Fc 30 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 30 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 20 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 30 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 30 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 30 p＜0.05
对照IgG 100
TLR1-Fc 40 p＜0.05
TLR2-Fc 30 p＜0.05
TLR4-Fc 30 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 30 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 20 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 30 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 30 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 30 p＜0.05
[0299] 表59 50周各组小鼠存活率
[0300]
[0301]
[0302] 表60各组肾脏病理评分小鼠存活率
[0303]组别 病理评分 SD p值
空白组(模型组) 3.20 0.26
对照IgG 3.30 0.26
TLR1-Fc 0.85 0.47 p＜0.05
TLR2-Fc 0.80 0.35 p＜0.05
TLR4-Fc 0.75 0.26 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 1.05 0.44 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 1.10 0.70 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 1.10 0.66 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 0.80 0.35 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 0.95 0.44 p＜0.05
空白组(模型组) 3.20 0.26
对照IgG 3.30 0.26
TLR1-Fc 0.85 0.47 p＜0.05
TLR2-Fc 0.80 0.35 p＜0.05
TLR4-Fc 0.75 0.26 p＜0.05
TLR2/TLR4-Fc 1.05 0.44 p＜0.05
TLR4/TLR6-Fc 1.10 0.70 p＜0.05
TLR4/MD-2-Fc 1.10 0.66 p＜0.05
TLR4/CD36-Fc 0.80 0.35 p＜0.05
TLR2/Dectin-1-Fc 0.95 0.44 p＜0.05
[0304] 综上，在狼疮小鼠模型中，本发明所述的免疫二聚体融合蛋白可以减少自身免疫抗体、减少脏器病理性炎症渗出、对于免疫系统疾病均具有良好的治疗效果，有利于后续的临床试验的开展。
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