【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組織培養法を用いてニンニクのウイルスフリー苗を大量培養し、この苗を栽培することによって良質なニンニクを大量に生産するための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】周知のようにニンニクは、古くから調味料として広く使用されており、更に昨今では、ニンニクに含まれるある種の成分が健康の増進に極めて有効であることが認められ、各種の健康食品や医療用の加工原料としてその需要は増加の一途を辿っている。

【０００３】一方、ニンニクは、栽培を行なう場合に、
有性繁殖ができず、結花するものの結実せず、その繁殖は主として鱗茎（製品ニンニク）の鱗片や珠芽を用いて行なっていることから、生産効率が悪く、大量生産は非常に困難である。 また栽培中、ウイルス病による生産力の低下も問題となっている。 このため、ニンニクの生産サイドでは、在来品種より極めて品質の優れているウイルスフリー苗の大量増殖方法の確立に大きな期待が寄せられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】現在までに知られている組織培養法を用いたニンニクの増殖に関する研究を表１に示した。

【０００５】

【表１】

【０００６】このように現在までのところ、１つのニンニク生長点から多数の苗を短期間で生産するまでには至っていない。

【０００７】よって、本発明が解決すべき課題は、組織培養法を用いてニンニクのウイルスフリー苗を大量培養し、この苗を栽培することによって良質なニンニクを大量に生産する方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かかる課題は、ニンニクの生長点または生長点とその近傍組織を無菌的に取り出す第１工程、取り出された生長点や近傍組織を、オーキシンを０．２〜１．０ppm含み、かつゲル化剤濃度を０．４重量％（以下、単に％という）以下とした培地に置き、この生長点や近傍組織からカルスを誘導し、さらにカルスを増殖せしめる第２工程、増殖したカルスを、
オーキシンを０．２〜１．０ppm、サイトカイニンを０．５〜３．０ppm含み、かつゲル化剤濃度を０．４％
以上とした培地を用いて培養し、不定芽を誘導する第３
工程、得られた不定芽を、ホルモンフリーでかつゲル化剤濃度を０．４％以上とした培地で増殖させるとともに、発根させて苗を得る第４工程、得られた苗を栽培して成苗あるいは製品ニンニクを得る第５工程を順次行なうことを特徴とするニンニクの大量増殖方法によって解消される。 また前記第２工程のオーキシンには2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、前記第３工程のオーキシンにはナフタレン酢酸、サイトカイニンには6-ベンジルアミノプリンをそれぞれ使用することが望ましい。 またゲル化剤にはジェランガム（ジェルライト）が特に好適に使用される。

【０００９】本発明において用いられるニンニク試料は、特に限定される事無く、種々の品種の製品ニンニクや栽培途中の幼ニンニクを使用することができる。 供試ニンニクは、まず、図１に示すような操作により生長点またはその近傍組織を無菌的に切り出し、培養組織を得る（第１工程）。

【００１０】図１に示すように、（ａ）の供試ニンニク（鱗茎）を割り、６個の小鱗茎に分け（ｂ）、この小鱗茎の表皮を除去する（ｃ）。 次に、この小鱗茎を中性洗剤を含ませたスポンジを用い、流水下洗浄する（ｄ）。
次に、洗浄した小鱗茎を殺菌剤中に浸漬する（ｅ）。 ７
０％エタノールで３０秒〜１分処理した後、１％アンチホルミン水溶液や１０分間浸漬する。 これを殺菌剤に浸漬したままクリーンベンチ内に持ち込み、小鱗茎を滅菌水中に入れ、殺菌剤を洗い流す。 次に滅菌したメスで消毒済みの小鱗茎を（ｆ）に示すように切断し、さらに（ｇ），（ｈ），（ｉ）の順序に従って切断し、生長点またはその近傍組織を切り出す。 このようにして６つの小鱗茎を有するニンニク鱗茎から６つの生長点を切り出すことができる。

【００１１】取り出された生長点組織は、カルス形成用の培地に置床してカルスを誘導し、さらに増殖させる。
このカルス形成用の培地として好適なものを例示すれば、組織培養の分野で一般に使用されるＭＳ培地を基本培地とし、これにオーキシンを０．２〜１．０ppm含み、かつゲル化剤濃度を０．４％以下としたものであり、添加するオーキシンとしては、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（以下、2,4-Ｄという）が好適に使用される。
この2,4-Ｄの添加量が０．２ppm未満であると、生長点からのカルス誘導の確率が低くなり、また添加量が２．
０ppmより多いとカルス化が阻害され、カルス化する確率が低くなる。 またこの培地には、オーキシンの他に０．２ppm以下の低濃度で6-ベンジルアミノプリン（以下、ＢＡという）などのサイトカイニンを添加することもできる。 この培地に加えるゲル化剤としては、ジェランガム（以下、ＧＧという）、寒天などが使用され、Ｇ
Ｇとしての添加量は０．４％以下、好ましくは０．２％
程度とされる。 ゲル化剤濃度を０．４％以上とすると、
培地のゲル強度が高くなり、培地の物質移動速度が緩慢になってカルス誘導や増殖が遅くなり好ましくない。 またこの培地には、３％のショ糖が添加される。

【００１２】前記カルス形成用の培地に生長点を置き、
２〜３ヶ月程度培養を行なうと、小さなカルスが形成される。 そして同じ培地で増殖を行なうことにより、生長点培養開始から６〜１０ヶ月培養して数十ｇ以上の増殖カルスを得る。 このカルス形成および増殖においては、
１ヶ月に１回程度の植え替えを行なうことが望ましい。
また、このカルス誘導期間および増殖期間におけるカルスの増殖能は、培地中の2,4-Ｄ濃度により左右され、2,
4-Ｄ濃度が低いとカルスの増殖が遅くなる傾向がある。

【００１３】次に、増殖カルスを不定芽形成用の培地に移し、増殖カルスから多数の不定芽を誘導する（第３工程）。 この不定芽形成用の培地としては、ＭＳ培地などの基本培地に、オーキシンを０．２〜１．０ppm、サイトカイニンを０．５〜３．０ppm含み、かつゲル化剤濃度を０．４％以上とした培地が使用される。 オーキシンとしてはα-ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡという）、
インドール酪酸などが使用可能であるが、ＮＡＡが好ましい。 またサイトカイニンとしてはＢＡが好ましい。 Ｎ
ＡＡ濃度が０．２ppm未満であり、サイトカイニン濃度が０．５ppm未満であると不定芽が生じ難く、一方、オーキシン濃度が１．０ppmより多く、カイネチン濃度が３．０ppmより多いと、カルスや不定芽の成育が阻害され好ましくない。 また培地に添加するゲル化剤濃度がＧ
Ｇとして０．４％未満であると不定芽が水浸化し易くなり望ましくない。 ゲル化剤濃度は好ましくはＧＧとして０．６％程度とする。 またこの培地中にも３％のショ糖が添加される。

【００１４】この不定芽形成培養を１〜３ヶ月程度行なうことによって、カルス１ｇあたり２０本程度の不定芽が形成される。 形成された不定芽は、それぞれ分割してホルモンフリーの不定芽増殖用培地に移して培養し、不定芽を増殖させる。

【００１５】この不定芽増殖用培地としてはＭＳ培地などのホルモンフリーの基本培地に、ゲル化剤をＧＧとして０．４％以上、好ましくは０．６％程度添加した培地などが好適に用いられる。 このような培地に分割した不定芽を植え、１〜２ヶ月程度培養することにより、不定芽が３〜５倍程度に増殖し、かつ発根して幼苗が得られる（第４工程）。

【００１６】そして、このようにして得られた幼苗を適宜な培養基に移して栽培することにより、成苗が得られ、幼苗を１年程度栽培することによって製品ニンニクが得られる（第５工程）。

【００１７】このような増殖方法によれば、１つの生長点から１年程度で約３０００本の苗が生産でき、従来法に比べ生産効率を大幅に向上させることができる。 またこのようにして得られる苗はウイルスフリーであり、品質のバラツキが殆どないことから、きわめて良質のニンニクを大量に生産することができる。

【００１８】

【実施例】

（１）生長点からのカルス誘導および不定芽形成条件の検討 図１に示した操作に従って供試ニンニク（ホワイト種）
の生長点部分を無菌的に切り出し、表２に示した各種のオーキシン含有培地あるいはオーキシンとＢＡ含有培地にそれぞれ置床して培養し、生長点からのカルス誘導状態、不定芽発生状態を調べた。 なお使用培地は、ＭＳ培地を基本培地とし、これにオーキシンあるいはオーキシンとＢＡとを添加し、さらに３％ショ糖、０．２％ＧＧ
（ジェランガム）を加えた培地を用い、２５℃で３ヶ月間培養した。 その結果を表２に示した。

【００１９】

【表２】

【００２０】表２から明らかなように、オーキシンとして2,4-Ｄを用いた培地では白色〜クリーム色の水浸化していない良好なカルスが誘導された。 またＮＡＡ＋ＢＡ
培地では生長点は水浸化して成長し、茎盤部は水浸状カルス（緑色）を形成した。 また不定芽（水浸状）の分化も認められた。 不定芽の形成はＮＡＡ０．２ppm、ＢＡ
２．０ppmの培地で良好であった。 ＩＢＡ＋ＢＡ培地でも生長点培養により水浸状の不定芽が分化するが、その頻度はＮＡＡ＋ＢＡ培地よりも低い。 ＩＢＡ＋ＢＡ培地で誘導されるカルスも濃緑色の水浸状カルスであり、Ｎ
ＡＡ添加培地のものと同様のものであった。 2,4-Ｄ＋Ｂ
Ａ添加培地では不定芽の分化は起きない。 この2,4-Ｄ＋
ＢＡ培地で誘導されるカルスは、緑色部分が点在している。 このカルスは生長点の他、貯蔵葉、茎盤部と生長点近傍の組織からも誘導された。 なおホルモンフリーの培地で培養した場合には生長点が水浸化して成長した。

【００２１】この試験結果より、生長点からカルスを培養する場合には、2,4-Ｄ添加培地が好ましく、また不定芽を分化させる場合には、ＮＡＡ＋ＢＡ添加培地が好ましいことがわかった。

【００２２】（２）ＮＡＡ＋ＢＡ培地での生長点培養 ニンニクから無菌的に得た生長点を、ＮＡＡ＋ＢＡ培地に置床し、不定芽分化状況を調べた。 なお培地はＭＳ培地に表２に示す濃度でＮＡＡとＢＡとを添加し、さらにショ糖３％とＧＧ０．５％を添加した培地を用い、２５
℃で２ヶ月間培養した。 培養の結果を表３に示した。

【００２３】

【表３】

【００２４】表３の結果より、生長点から直接不定芽を分化させるには、ＮＡＡ０．２〜０．３ppm＋ＢＡ１．
０〜２．０ppmの範囲の培地が好適であった。 また培地のＧＧ濃度を０．５％としたことによって、不定芽の水浸化が抑制された。

【００２５】（３）カルス形成条件の検討 2,4-Ｄ添加培地を用いて生長点からカルスを誘導する際の最適条件を調べた。 培地としてはＭＳ培地に2,4-Ｄあるいは2,4-ＤとＢＡを添加し、さらにショ糖３％、ＧＧ
０．２％を添加した培地を用い、２５℃で３ヶ月間培養した。 その結果を表４に示した。

【００２６】

【表４】

【００２７】表４の結果より、生長点からカルスを誘導するのに好適な培地条件としては、2,4-Ｄを０．２〜
１．０ppm含む培地で生長点を培養するのが好ましいことが判明した。 また2,4-ＤにＢＡを０．１ppm添加した培地でも同様であり、カルス形成においてはＢＡの存在が必須ではなく、逆に2,4-Ｄに０．３ppm以上のＢＡを添加した培地ではカルス形成が阻害された。

【００２８】（４）カルスからの不定芽形成条件の検討 前記（３）カルス形成条件の検討において、2,4-Ｄを０．５ppm添加した培地で生成したカルスを分割し、Ｎ
ＡＡ＋ＢＡ添加培地に置き、２５℃で２ヶ月間培養し、
カルスからの不定芽形成条件を検討した。 なお、培地としては、ＭＳ培地にＮＡＡ＋ＢＡを添加し、さらにショ糖３％、ＧＧ０．６％を添加した培地を用いた。 その結果を表５に示した。

【００２９】

【表５】

【００３０】表５から明らかなように、カルスから不定芽を形成するのに最も好適な培地のホルモン組成は、Ｎ
ＡＡ０．２ppm＋ＢＡ２．０ppmであり、カルス１ｇ当り２０本の不定芽が得られた。

【００３１】（５）不定芽形成の際の培地ゲル化剤濃度の影響について 前記（４）での培養において、培地に添加するゲル化剤（ＧＧ）の添加量と、不定芽水浸化との関係を調べた。
供試カルスとしては（４）と同様に2,4-Ｄを０．５ppm
添加した培地で形成したカルスを用い、培地としてはＭ
Ｓ培地にＮＡＡ＋ＢＡを添加し、ショ糖３％と０．２〜
０．８％ＧＧを添加した培地を用いた。 各培地にカルスを置床し２５℃で２ヶ月間培養し、発生した不定芽のうち正常芽数と水浸芽数を調べた。 その結果を表６に示した。

【００３２】

【表６】

【００３３】表６から明らかなように、培地中のＧＧ濃度を０．６％とすると不定芽の水浸化はかなり抑制される。 しかし０．８％とすると苗の成長速度が低下する。
この理由としては、培地ゲル化剤を０．８％とすると培地が固くなりすぎて、伸び出した根が培地中に入り込めず培地表面に這うように伸長する。 このため苗は自重を支えきれなくなるとともに培地から十分な養分吸収ができなくなるため、さらには培地が固いために培地中の物質移動速度が緩慢になり、苗に十分な栄養分が供給されないためと考えられる。

【００３４】一方、カルス誘導および増殖の際には、培地ゲル化剤濃度を好ましくは０．２％とすることが望ましい。 カルス誘導の際に培地ゲル化剤濃度を０．４％以上とすると、生長点からのカルス誘導が遅くなり、あるいは誘導不能となった。

【００３５】（６）不定芽の増殖 前記（５）で得られた不定芽は、そのままの状態では培地中のホルモンによって成長が阻害された。 そこで、形成された不定芽を分割し、ホルモンフリーの培地に植え替えて不定芽を増殖させた。 この培地としてはＭＳ培地に３％のショ糖と、０．６％のＧＧを添加した培地を用いた。 この培地に不定芽を植えて２５℃で１ヶ月間培養した結果、不定芽は１本当り３〜５本の幼苗に増殖した。

【００３６】（７）生長点から幼苗の生産 前記（１）〜（６）の結果より、生長点からのカルス誘導、カルスの増殖、カルスからの不定芽形成および不定芽の増殖に好適な培養条件を設定して、図２に示すようにニンニク生長点から幼苗の大量培養を行なった。 図２
に示したように無菌的に取り出したニンニク生長点を、
ＭＳ培地に2,4-Ｄを０．５ppm、ショ糖３％、ＧＧ０．
２％添加した培地に置き、２５℃で培養してカルス誘導を行なった。 ３ヶ月間の培養で０．１ｇのカルスに増殖した。 さらにこのカルスを同じ組成の培地に植え替えて増殖させたところ、培養開始から６ヶ月目で１．８ｇに増殖し、さらに９ヶ月目には４８．６ｇに増殖した。 次に、増殖カルスを細分化し、ＭＳ培地にＮＡＡ０．２pp
m、ＢＡ２．０ppm、ショ糖３％、ＧＧ０．６％を添加した培地に移し、２５℃で２ヶ月間培養した。 この結果、
カルス１ｇ当り２０本の不定芽が得られ、これによりトータル９７２本の不定芽が得られることになる。 次に得られた不定芽を分割して、ＭＳ培地にＧＧ０．６％を添加した培地に植え、２５℃で１ヶ月間培養した。

【００３７】この結果、１本の不定芽は３〜５本に増殖し、トータルで約３０００本の良質の幼苗が得られる。

【００３８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のニンニクの大量増殖方法によれば、１つの生長点から１年程度で約３０００本の苗が生産でき、従来法に比べ生産効率を大幅に向上させることができる。 またこのようにして得られる苗はウイルスフリーであり、品質のバラツキが殆どないことから、きわめて良質のニンニクを大量に生産することができるなどの優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ニンニクから生長点を切り出す操作を工程順に示す図である。

【図２】本発明に係わる増殖方法の一例を説明するためのフロー図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 関 昌夫 神奈川県横浜市磯子区新中原町１番地 石 川島播磨重工業株式会社技術研究所内