技术领域
[0001] 本
发明涉及报春无菌苗的培养方法，具体地，涉及安徽羽叶报春无菌苗的培养方法。
背景技术
[0002] 安徽羽叶报春(Primula merrilliana Schltr.)为报春花科(Primulaceae)报春花属(Primula)两年生小草本；其具有以下特点：花朵
颜色显著为粉红色至深红色，花期长，具有较高的
园艺开发价值。安徽羽叶报春在自然界仅零星分布于安徽南部山区，对生境变化特别敏感。近些年由于人类活动的影响，安徽羽叶报春野生种群分布范围和种群数量以及种群内个体数目日趋减小，是我国特有的濒危(UV级)物种之一。
[0003] 目前，关于安徽羽叶报春组织培养研究，仅有查帅兵利用幼嫩的
叶片、叶轴为外植体，用不同浓度的生长调节物质进行愈伤组织诱导以及再生；除此之外，报春花属的其他
植物如翠南报春(P.sieboldii)、报春花(P.malacoides)、小报春(P.forbesii)、鄂报春(P.obconica)等，多采用幼叶、
腋芽、花蕾、花梗、叶柄等作为外植体；上述组织培养均存在存在污染率较高，周期较长等不足。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种安徽羽叶报春无菌苗的培养方法，该方法较传统栽培方法具有优异的繁殖系数与繁殖效率且培养周期短，另外通过该方法培养而得的安徽羽叶报春无菌苗具有优异的生长速度。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了一种安徽羽叶报春无菌苗的培养方法，包括如下步骤：
[0006] 1)将安徽羽叶报春的
种子进行预处理；
[0007] 2)将预处理后的种子在无菌条件下依次经过
乙醇溶液和过
氧化氢溶液浸泡，然后通过无菌蒸馏
水洗涤以得到无菌外植体；
[0008] 3)将无菌外植体接种于
基础培养基上，并在无菌条件下进行基础培养以获得
幼苗；
[0009] 4)将幼苗的腋芽接种于生根培养基上进行生根培养以得到安徽羽叶报春无菌苗。
[0010] 通过上述技术方案，本发明通过组织培养的方式培育安徽羽叶报春无菌苗，具体过程为：首先将安徽羽叶报春种子进行预处理；接着在无菌条件下依次通过酒精溶液和过氧化氢溶液浸泡、无菌蒸馏水洗涤；再接着接种于基础培养基中，获得无菌苗；然后取幼苗的腋芽进行生根培养，便可获得生长健壮的安徽羽叶报春无菌苗，最后便可取无菌苗进行移栽。该方法可在短时间内能够获得大量的安徽羽叶报春无菌苗，且无菌苗品质高，生长健壮；利用该培养方法有利于安徽羽叶报春种质资源的保护与开发利用，同时也为后续遗传转化体系的建立奠定了基础。
[0011] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0012] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成
说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0013] 图1是
实施例1中种子接种7d种子开始萌动的状态图；
[0014] 图2是实施例1中种子接种40天后得到的幼苗的状态图；
[0015] 图3是实施例5中种子接种60天后得到的幼苗的状态图；
[0016] 图4是实施例6中种子接种25天后得到的幼苗的状态图；
[0017] 图5是实施例1中生根培养25天后得到的无菌苗的状态图。
具体实施方式
[0018] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0019] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0020] 本发明提供了一种安徽羽叶报春无菌苗的培养方法，包括如下步骤：
[0021] 1)将安徽羽叶报春的种子进行预处理；
[0022] 2)将预处理后的种子在无菌条件下依次经过乙醇溶液和过氧化氢溶液浸泡，然后通过无菌蒸馏水洗涤以得到无菌外植体；
[0023] 3)将无菌外植体接种于基础培养基上，并在无菌条件下进行基础培养以获得幼苗；
[0024] 4)将幼苗的腋芽接种于生根培养基上进行生根培养以得到安徽羽叶报春无菌苗。
[0025] 在本发明的步骤1)中，预处理的具体方式可以为多种，为了促进种子的萌发，优选地，在步骤1)中，预处理为：将种子于无菌水中浸泡4-8h。其中，浸泡
温度也可以在宽的范围内选择，为了进一步提高萌发效率，优选地，在步骤1)中，浸泡的温度为20-25℃。
[0026] 在本发明的步骤1)中，酒精溶液以及酒精浸泡的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，在步骤2)中，酒精溶液的浓度为70-80重量％，并且种子于酒精溶液中浸泡至少满足以下条件：浸泡时间为30-50s，浸泡温度为20-25℃，且浸泡过程中将体系进行晃动。
[0027] 在本发明的步骤1)中，过氧化氢溶液以及过氧化氢溶液浸泡的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，在步骤2)中，过氧化氢溶液的浓度为10-20重量％，并且种子于过氧化氢溶液中浸泡至少满足以下条件：浸泡时间为1-6min，浸泡温度为20-25℃，且浸泡过程中将体系进行晃动。
[0028] 在本发明的在步骤1)和步骤2)中，具体的操作的环境以及器皿可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，在步骤1)和步骤2)中的操作于eppendorf离心管中进行。在eppendorf离心管中进行操作时，为了避免种子被吸出，更优选地，在步骤1)的预处理和/或步骤2)的浸泡结束后，该培养方法还包括：将离心管进行离心处理，接着将液体自离心管中吸出。为了降低离心对种子造成的损伤，更优选地，在离心处理中，离心机的转速不超过7200rpm。
[0029] 在本发明的在步骤2)中，无菌蒸馏水洗涤的次数与方式可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，在步骤2)中，无菌蒸馏水洗涤的次数为3-5次，且在洗涤过程中将体系进行晃动。
[0030] 在本发明的在步骤2)中，基础培养基的具体组分可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，在步骤3)中，基础培养基为MS培养基，且含有6.0-6.5g/L的琼脂、卡拉胶或
脱脂棉中的至少一者。
[0031] 在本发明的在步骤3)中，生根培养基的具体组分可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，生根培养基为1/2MS培养基，且含有0.05-0.1mg/L IBA(吲哚丁酸)。
[0032] 在本发明中，基础培养基、生根培养基的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，基础培养基、生根培养基均满足以下条件：pH为5.8-6.0，且含有25-30g/L的
蔗糖。
[0033] 在本发明中，基础培养、生根培养的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，基础培养与生根培养均满足以下条件：培养温度为18-22℃，
相对湿度为50-60％，培养时间为40-60天；为了进一步提高培养效果，更优选地，基础培养与生根培养还满足以下条件：于光暗交替的条件下进行培养，光照条件下的光照强度为1000-1200lux，光照时间为8-10h/天，黑暗时间为14-16h/天。
[0034] 在本发明的在步骤4)中，接种的腋芽的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步缩短培养周期、提高无菌苗品质高，优选地，在步骤3)中，接种的腋芽满足以下条件：腋芽带有1-2片真叶且长度至少为1cm。
[0035] 优选地，在步骤4)中，生根培养后得到的无菌苗的
羽片长度达到3-5cm。
[0036] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，安徽羽叶报春的种子选自安徽省石台县。
[0037] 实施例1
[0038] 1)选择当年生且饱满的安徽羽叶报春种子，盛放于2ml大小的eppendorf离心管中，向管中加入2ml无菌水中浸泡8h，保持温度23℃±1℃。
[0039] 2)将浸泡过的种子，经过离心并吸干水后，在无菌条件下依次向盛放有种子的离心管中加入70重量％酒精(浸泡时间为35s)和15重量％过氧化氢(浸泡时间为1min)各2ml进行表面消毒，期间不停晃动，离心并用移液器吸干管内溶液，然后用无菌蒸馏水洗涤种子4次。
[0040] 3)将洗涤后的种子接种于MS基础培养基(含有6.0g/L的无菌脱脂棉、30g/L蔗糖，PH为5.8)上并在无菌条件下进行培养得到幼苗；培养条件为：温度为20℃±1℃，相对湿度为55％±1％，光照强度为1200lux，光照时间为10h/天，黑暗时间为14h/天，培养时间为40-60天。
[0041] 4)获得幼苗后，取幼苗的腋芽(腋芽带有1-2片真叶且长度至少为1cm)接种于1/2MS生根培养基(含有6.0g/L琼脂、30g/L蔗糖以及0.05mg/L的IBA，PH为5.8)上进行生根培养(温度为20℃±1℃，相对湿度为55％±1％，光照强度为1200lux，光照时间为10h/天，黑暗时间为14h/天，培养时间为40-60天)，待生根培养的小苗的羽片长度达到3-5cm左右时，便可进行移栽。
[0042] 在该实施例中，种子接种7d种子开始萌动，具体结果参见图1；种子接种40天后得到的幼苗，具体结果参见图2；生根培养25天后得到的无菌苗，具体参见图5。
[0043] 实施例2
[0044] 按照实施例1的方法进行培养，不同的是，过氧化氢溶液浸泡的时间为1.5min。
[0045] 实施例3
[0046] 按照实施例1的方法进行培养，不同的是过氧化氢溶液浸泡的时间为3min。
[0047] 实施例4
[0048] 按照实施例1的方法进行培养，不同的是，过氧化氢溶液浸泡的时间为6min。
[0049] 实施例5
[0050] 按照实施例2的方法进行培养，不同的是，将MS基础培养基中无菌脱脂棉换为6.0g的琼脂；在该实施例中，种子接种60天后得到的幼苗，具体结果参见图3。
[0051] 实施例6
[0052] 按照实施例2的方法进行培养，不同的是，将MS基础培养基中无菌脱脂棉换为6.0g的卡拉胶；在该实施例中，种子接种25天后得到的幼苗，具体结果参见图4。
[0053] 对比例1
[0054] 按照实施例1的方法进行培养，不同的是，MS基础培养基的pH为5.5。
[0055] 对比例2
[0056] 按照实施例1的方法进行培养，不同的是，MS基础培养基的pH为6.2。
[0057] 检测例1
[0058] 统计上述各个实施例以及对比例中的污染率、发芽启动时间、发芽势以及发芽率，其中发芽势所表示的是接种以后30d内的发芽率，具体结果见表1。
[0059] 表1
[0060]
[0061]
[0062] 上表中：每个实施例中接种3瓶，每瓶接种8粒种子；以2片子叶展开且能够形成胚根或胚芽的种子视为正常发芽种子进行统计；所得数值均为平均值(Mean)±表示标准误(Std.Error)。
[0063] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0064] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0065] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
