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一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法

阅读：660发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法。本发明还公开了一种粳、籼稻通用型的组织培养的培养基，所述培养基由溶质和溶剂组成，所述溶质包括硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、碘化钾、五水硫酸铜、二水钼酸钠、六水氯化钴、甘氨酸、维生素B1、维生素B6、烟酸、肌醇、七水硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠。本发明开发的通用型组织培养基具有如下优点：1、通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，使粳、籼稻均可实现愈伤诱导及再生出苗；2、通过农杆菌介导，粳、籼稻均可实现稳定转化。，下面是一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于水稻遗传转化的培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质包括硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、碘化钾、五水硫酸铜、二水钼酸钠、六水氯化钴、甘氨酸、维生素B1、维生素B6、烟酸、肌醇、七水硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：每升所述培养基包括所述硝酸钾2300-
2850mg、所述硫酸铵380-490mg、所述磷酸二氢钾210-420mg、所述七水硫酸镁175-447.5mg、所述二水氯化钙270-550mg、所述硫酸锰15-30mg、所述七水硫酸锌6-12mg、所述硼酸5-
15mg、所述碘化钾4-8mg、所述五水硫酸铜0.025-0.05mg、所述二水钼酸钠0.25-0.5mg、所述六水氯化钴0.025-0.5mg、所述甘氨酸1.2-2.5mg、所述维生素B1 1-1.2mg、所述维生素B6
0.5-1mg、所述烟酸0.5-1mg、所述肌醇0-100mg、所述七水硫酸亚铁28-55mg和所述乙二胺四乙酸二钠37-74.5mg；
或，所述硝酸钾在所述培养基中的浓度为2300-2850mg/L；
所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为380-490mg/L；
所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为210-420mg/L；
所述七水硫酸镁在所述培养基中的浓度为175-447.5mg/L；
所述二水氯化钙在所述培养基中的浓度为270-550mg/L；
所述硫酸锰在所述培养基中的浓度为15-30mg/L；
所述硫酸锌在所述培养基中的浓度为6-12mg/L；
所述硼酸在所述培养基中的浓度为5-15mg/L；
所述碘化钾在所述培养基中的浓度为4-8mg/L；
所述五水硫酸铜在所述培养基中的浓度为0.025-0.05mg/L；
所述二水钼酸钠在所述培养基中的浓度为0.25-0.5mg/L；
所述六水氯化钴在所述培养基中的浓度为0.025-0.05mg/L；
所述甘氨酸在所述培养基中的浓度为1.2-2.5mg/L；
所述维生素B1在所述培养基中的浓度为1-1.2mg/L；
所述维生素B6在所述培养基中的浓度为0.5-1mg/L；
所述烟酸在所述培养基中的浓度为0.5-1mg/L；
所述肌醇在所述培养基中的浓度为0-100mg/L；
所述七水硫酸亚铁在所述培养基中的浓度为28-55mg/L；
所述乙二胺四乙酸二钠在所述培养基中的浓度为37-74.5mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基为继代培养基；所述继代培养基为将权利要求1或2所述的培养基与蔗糖或麦芽糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和2,4-D混匀得到的；
或，所述蔗糖或麦芽糖在所述继代培养基中的浓度为20-30g/L；
所述山梨醇在所述继代培养基中的浓度为10-20g/L；
所述水解酪蛋白在所述继代培养基中的浓度为500-800mg/L；
所述谷氨酰胺在所述继代培养基中的浓度为500-800mg/L；
所述脯氨酸在所述继代培养基中的浓度为500-800mg/L；
所述2,4-D在所述继代培养基中的浓度为1.5-2mg/L。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述培养基为诱导培养基；所述诱导培养基为将所述继代培养基与植物凝胶混匀得到的；
所述植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为2.5-4g/L。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述培养基为共培养培养基；
所述共培养培养基为将所述诱导培养基与乙酰丁香酮混匀得到的；
或，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的浓度为100-200uM；
或，所述培养基为恢复培养基；所述恢复培养基为将所述诱导培养基与特美汀混匀得到的；
或，所述特美汀在所述恢复培养基中的浓度为200-300mg/L；
或，所述培养基为筛选培养基；所述筛选培养基为将所述诱导培养基与特美汀和筛选剂混匀得到的；
或，所述特美汀在所述筛选培养基中的浓度为200-300mg/L；
或，所述筛选剂在所述筛选培养基中的浓度为35-65mg/L；
或，所述筛选剂为潮霉素；
或，所述培养基为再生培养基；所述再生培养基为将所述诱导培养基中的2,4-D去除后与特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸混匀得到的；
或，所述特美汀在所述再生培养基中的浓度为150-400mg/L；
或，所述激动素在所述再生培养基中的浓度为0.5-1mg/L；
或，所述6-苄氨基嘌呤在所述再生培养基中的浓度为1-2mg/L；
或，所述萘乙酸在所述再生培养基中的浓度为0.2-0.3mg/L；
或，所述培养基为生根培养基；所述生根培养基为将1/2权利要求1或2所述培养基与蔗糖、萘乙酸和植物凝胶混匀得到的；
或，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度为10-20g/L；
或，所述萘乙酸在所述生根培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L；
或，所述植物凝胶在所述生根培养基中的浓度为2.5-3.5g/L。
6.权利要求1-5任一所述的培养基在如下a1)-a4)中任一种中的应用：
a1)培养水稻愈伤组织；
a2)制备培养水稻愈伤组织的产品；
a3)水稻遗传转化；
a4)制备水稻遗传转化的产品。
7.一种水稻的遗传转化方法，包括如下步骤：
1)将水稻种子在权利要求1-5中任一所述的诱导培养基中培养，得到诱导培养后的愈伤组织；
2)将所述诱导培养后的愈伤组织在权利要求1-5中任一所述的继代培养基中培养，得到继代培养后的愈伤组织；
3)将所述继代培养后的愈伤组织在农杆菌重悬液中侵染，得到侵染后的愈伤组织；
所述农杆菌重悬液是将含有目的基因表达载体的农杆菌在含有乙酰丁香酮的侵染液中震荡混匀得到的；所述侵染液为将权利要求1或2所述的培养基与水解酪蛋白、脯氨酸、蔗糖和葡萄糖混匀得到的；
4)将所述侵染后的愈伤组织表面的侵染液吸干，然后在浸透所述侵染液的无菌滤纸上暗培养，得到表面无褐色斑点的愈伤组织；
5)将所述表面无褐色斑点的愈伤组织在权利要求1-5中任一所述的筛选培养基中培养，得到抗性愈伤；
6)将所述抗性愈伤在再生培养基中培养，直至所述抗性愈伤长出绿色叶片，得到水稻幼苗；
7)将所述水稻幼苗在权利要求1-5中任一所述的生根培养基中培养，得到转基因水稻植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤1)前还包括对水稻种子进行消毒的步骤；
或，步骤1)中，所述培养的条件为32-35℃暗培养16-24天；
或，步骤2)中，所述培养的条件为120-200rpm，26-28℃暗培养7-10天；
或，步骤3)中，所述乙酰丁香酮在所述侵染液中的浓度为100-200uM；
或，所述水解酪蛋白在所述侵染液中的浓度为200-400mg/L；
或，所述脯氨酸在所述侵染液中的浓度为300-500mg/L；
或，所述蔗糖在所述侵染液中的浓度为20g/L；
或，所述葡萄糖在所述侵染液中的浓度为10g/L；
或，所述侵染液的OD660为0.1-0.2，所述侵染的条件为室温浸泡10-15min；
或，步骤4)中，所述暗培养的条件为19-21℃暗培养1-2天；
或，步骤4)还包括如下步骤：若暗培养后的愈伤表面有褐色斑点，则转移至权利要求1-
5中任一所述的恢复培养基中进行培养；所述恢复培养的时间为3天；
或，步骤5)中，所述培养的条件为28-32℃暗培养18-24天；
或，步骤6)中，所述培养的条件为25-28℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养15-
25天；
或，步骤7)中，所述培养的条件为25-28℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养8-
10天。
9.用于水稻遗传转化的产品，其包括权利要求1-5中任一所述的诱导培养基和/或权利要求1-5中任一所述的继代培养基和/或权利要求1-5中任一所述的恢复培养基和/或权利要求1-5中任一所述的筛选培养基和/或权利要求1-5中任一所述的再生培养基和/或权利要求1-5中任一所述的生根培养基和/或权利要求7或8中所述的侵染液；
或，权利要求9所述的产品在水稻遗传转化或制备水稻遗传转化的产品中的应用。
10.根据权利要求1-5任一所述的培养基或权利要求6所述的应用或权利要求7或8所述的方法或权利要求9所述的产品或应用，其特征在于：所述水稻为籼稻和/或粳稻。

说明书全文

一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法，特别涉及一种农杆菌介导的同时适用于粳稻和籼稻的遗传转化方法。

背景技术

[0002] 水稻在我国人工种植历史至少7000年，在长期进化和人工驯化下分化为籼稻、粳稻两个亚种，长期以来我国以籼稻种植为主，粳稻占比不足30％，因此在水稻遗传转化研究方面籼稻被更多的关注。但鉴于粳稻米质与口感俱佳，随着经济发展和生活水平的提高，近年城乡居民的稻米消费出现由籼转粳的趋势。据2016年水稻分品种成本受益数据显示，粳稻每亩净利润是中籼稻的1.5倍、晚籼稻的2.9倍，亩产亦与中籼稻匹敌，因此无论从产量、品质、经济价值衡量，还是从国家粮食安全角度考虑，粳、籼稻方面的研究有必要双向推进。

[0003] 对于水稻遗传转化的研究中，普遍认为粳稻较籼稻更易组建高效、稳定的转化体系，而籼稻较难组培、难转化，因此转化系统的组建以粳、籼品种为界。但从实际应用角度出发，若能开发出一个可兼顾粳稻、籼稻两个品种的遗传转化体系，同时满足粳稻、籼稻两个品种的遗传转化需求，无疑可降低开发成本、为技术研究、生产开发提供更高效优质的基础支撑。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种同时适用于籼稻和粳稻的遗传转化方法。

[0005] 为了实现上述目的，本发明首先提供了一种用于水稻遗传转化的培养基，将其记作培养基RC。所述培养基RC由溶质和溶剂组成，所述溶质包括硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、碘化钾、五水硫酸铜、二水钼酸钠、六水氯化钴、甘氨酸、维生素B1、维生素B6、烟酸、肌醇、七水硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠。

[0006] 进一步的，每升所述培养基RC包括所述硝酸钾2300-2850 mg、所述硫酸铵380-490 mg、所述磷酸二氢钾210-420 mg、所述七水硫酸镁175-447.5 mg、所述二水氯化钙270-550 mg、所述硫酸锰15-30 mg、所述七水硫酸锌6-12 mg、所述硼酸5-15 mg、所述碘化钾4-8 mg、所述五水硫酸铜0.025-0.05 mg、所述二水钼酸钠0.25-0.5 mg、所述六水氯化钴0.025-0.05 mg、所述甘氨酸1.2-2.5 mg、所述维生素B1 1-1.2 mg、所述维生素B6 0.5-1 mg、所述烟酸 0.5-1 mg、所述肌醇0-100 mg(所述肌醇的质量可为0)、所述七水硫酸亚铁28-55 mg和所述乙二胺四乙酸二钠37-74.5mg。

[0007] 更进一步的，所述溶剂为双蒸水；

[0008] 所述硝酸钾在所述培养基RC中的浓度为2300-2850mg/L或2300mg/L或2650mg/L或2750mg/L或2850mg/L；

[0009] 所述硫酸铵在所述培养基RC中的浓度为380-490mg/L或380mg/L或490mg/L；

[0010] 所述磷酸二氢钾在所述培养基RC中的浓度为210-420mg/L或210mg/L或420mg/L；

[0011] 所述七水硫酸镁在所述培养基RC中的浓度为175-447.5mg/L或175mg/L或447.5mg/L；

[0012] 所述二水氯化钙在所述培养基RC中的浓度为270-550mg/L或270mg/L或550mg/L；

[0013] 所述硫酸锰在所述培养基RC中的浓度为15-30mg/L或15mg/L或23mg/L或30mg/L；

[0014] 所述硫酸锌在所述培养基RC中的浓度为6-12mg/L或6mg/L或12mg/L；

[0015] 所述硼酸在所述培养基RC中的浓度为5-15mg/L或5mg/L或10mg/L或15mg/L；

[0016] 所述碘化钾在所述培养基RC中的浓度为4-8mg/L或4mg/L或6mg/L或8mg/L；

[0017] 所述五水硫酸铜在所述培养基RC中的浓度为0.025-0.05mg/L或0.025mg/L或0.03mg/L或0.05mg/L；

[0018] 所述二水钼酸钠在所述培养基RC中的浓度为0.25-0.5mg/L或0.25mg/L或0.3mg/L或0.5mg/L；

[0019] 所述六水氯化钴在所述培养基RC中的浓度为0.025-0.05mg/L或0.025mg/L或0.03mg/L或0.05mg/L；

[0020] 所述甘氨酸在所述培养基RC中的浓度为1.2-2.5mg/L或1.2mg/L或2.5mg/L；

[0021] 所述维生素B1在所述培养基RC中的浓度为1-1.2mg/L或1mg/L或1.2mg/L；

[0022] 所述维生素B6在所述培养基RC中的浓度为0.5-1mg/L或0.5mg/L或1mg/L；

[0023] 所述烟酸在所述培养基RC中的浓度为0.5-1mg/L或0.5mg/L或1mg/L；

[0024] 所述肌醇在所述培养基RC中的浓度为0-100mg/L或0mg/L或100mg/L；

[0025] 所述七水硫酸亚铁在所述培养基RC中的浓度为28-55mg/L或28mg/L或42mg/L或55mg/L；

[0026] 所述乙二胺四乙酸二钠在所述培养基RC中的浓度为37-74.5mg/L或37mg/L或56mg/L或74.5mg/L。

[0027] 为了实现上述目的，本发明又提供了用于水稻遗传转化的继代培养基、诱导培养基、共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基、再生培养基和生根培养基。

[0028] 所述继代培养基为将所述培养基RC与蔗糖或麦芽糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和2,4-D混匀得到的。

[0029] 进一步的，所述蔗糖或麦芽糖在所述继代培养基中的浓度为20-30g/L或20g/L或30g/L；

[0030] 所述山梨醇在所述继代培养基中的浓度为10-20g/L或10g/L或20g/L；

[0031] 所述水解酪蛋白在所述继代培养基中的浓度为500-800mg/L或500mg/L或600mg/L或800mg/L；

[0032] 所述谷氨酰胺在所述继代培养基中的浓度为500-800mg/L或500mg/L或600mg/L或800mg/L；

[0033] 所述脯氨酸在所述继代培养基中的浓度为500-800mg/L或500mg/L或800mg/L；

[0034] 所述2,4-D在所述继代培养基中的浓度为1.5-2mg/L或1.5mg/L或2mg/L。

[0035] 更进一步的，所述继代培养基的PH值为5.8。

[0036] 所述诱导培养基为将所述继代培养基与植物凝胶混匀得到的。

[0037] 进一步的，所述植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为2.5-4g/L或2.5g/L或3g/L或4g/L。

[0038] 更进一步的，所述诱导培养基的PH值为5.8。

[0039] 所述共培养培养基为将所述诱导培养基与乙酰丁香酮混匀得到的。

[0040] 进一步的，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的浓度为100-200uM或100uM或200uM。

[0041] 更进一步的，所述共培养培养基的PH值为5.4。

[0042] 所述恢复培养基为将所述诱导培养基与特美汀混匀得到的。

[0043] 进一步的，所述特美汀在所述恢复培养基中的浓度为200-300mg/L或200mg/L或300mg/L。

[0044] 更进一步的，所述恢复培养基的PH值为5.8。

[0045] 所述筛选培养基为将所述诱导培养基与特美汀和筛选剂混匀得到的。

[0046] 进一步的，所述特美汀在所述筛选培养基中的浓度为200-300mg/L或200mg/L或300mg/L；

[0047] 所述筛选剂在所述筛选培养基中的浓度为35-65mg/L或35mg/L或45mg/L或50mg/L或65mg/L。

[0048] 更进一步的，所述筛选剂为潮霉素。

[0049] 所述筛选培养基的PH值为5.8。

[0050] 所述再生培养基为将所述诱导培养基中的2,4-D去除后与特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸混匀得到的。

[0051] 进一步的，所述特美汀在所述再生培养基中的浓度为150-400mg/L或150mg/L或200mg/L或400mg/L；

[0052] 所述激动素在所述再生培养基中的浓度为0.5-1mg/L或0.5mg/L或1mg/L；

[0053] 所述6-苄氨基嘌呤在所述再生培养基中的浓度为1-2mg/L或1mg/L或1.5mg/L或2mg/L；

[0054] 所述萘乙酸在所述再生培养基中的浓度为0.2-0.3mg/L或0.2mg/L或0.3mg/L。

[0055] 更进一步的，所述再生培养基的PH值为5.8。

[0056] 所述生根培养基为将1/2所述培养基RC与蔗糖、萘乙酸和植物凝胶混匀得到的。

[0057] 进一步的，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度为10-20g/L或10g/L或20g/L；

[0058] 所述萘乙酸在所述生根培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L或0.1mg/L或0.5mg/L；

[0059] 所述植物凝胶在所述生根培养基中的浓度为2.5-3.5g/L或2.5g/L或3g/L或3.5g/L。

[0060] 更进一步的，所述生根培养基的PH值为5.8。

[0061] 在本发明的一个实施例中，所述水稻品种为武运粳23、武运粳27时，[0062] 所述培养基RC(记作培养基RCⅠ)由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：硝酸钾2300mg/L、硫酸铵380mg/L、磷酸二氢钾420mg/L、七水硫酸镁175mg/L、二水氯化钙550mg/L、硫酸锰15mg/L、七水硫酸锌12mg/L、硼酸10mg/L、碘化钾8mg/L、五水硫酸铜0.05mg/L、二水钼酸钠0.5mg/L、六水氯化钴0.05mg/L、甘氨酸2.5mg/L、维生素B1 1mg/L、维生素B6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇0mg/L、七水硫酸亚铁42mg/L、乙二胺四乙酸二钠56mg/L。

[0063] 所述诱导培养基(记作诱导培养基RC-1)为将所述培养基RCⅠ与蔗糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶混匀得到的，所述蔗糖在所述诱导培养基RC-1中的浓度为30g/L，所述山梨醇在所述诱导培养基RC-1中的浓度为20g/L，所述水解酪蛋白在所述诱导培养基RC-1中的浓度为600mg/L，所述谷氨酰胺在所述诱导培养基RC-1中的浓度为600mg/L，所述脯氨酸在所述诱导培养基RC-1中的浓度为800mg/L，所述2,4-D在所述诱导培养基RC-1中的浓度为2mg/L，所述植物凝胶在所述诱导培养基RC-1中的浓度为3g/L。

[0064] 所述继代培养基(记作继代培养基-1)为将所述诱导培养基RC-1中的植物凝胶去除后得到的。

[0065] 所述共培养基培养基(记作共培养培养基RCO-1)为将所述诱导培养基RC-1与乙酰丁香酮混匀得到的。所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基RCO-1中的浓度为200uM。

[0066] 所述恢复培养基(记作恢复培养基REC-1)为将所述诱导培养基RC-1与特美汀混匀得到的。所述特美汀在所述恢复培养基REC-1中的浓度为300mg/L。

[0067] 所述筛选培养基(记作筛选培养基RSH-1)为将所述诱导培养基RC-1与特美汀和潮霉素混匀得到的。所述特美汀在所述筛选培养基RSH-1中的浓度为300mg/L，所述潮霉素在所述筛选培养基RSH-1中的浓度为35mg/L。

[0068] 所述再生培养基(记作再生培养基RG-1)为将所述诱导培养基RC-1中的2,4-D去除后与特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸混匀得到的。所述特美汀在所述再生培养基RG-1中的浓度为200mg/L，所述激动素在所述再生培养基RG-1中的浓度为1mg/L，所述6-苄氨基嘌呤在所述再生培养基RG-1中的浓度为1mg/L，所述萘乙酸在所述再生培养基RG-1中的浓度为0.2mg/L。

[0069] 在本发明的另一个实施例中，所述水稻品种为日本晴、龙粳31、粳65B时，[0070] 所述培养基RC(记作培养基RCⅡ)由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：硝酸钾2650mg/L、硫酸铵490mg/L、磷酸二氢钾210mg/L、七水硫酸镁447.5mg/L、二水氯化钙270mg/L、硫酸锰30mg/L、七水硫酸锌6mg/L、硼酸5mg/L、碘化钾4mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、甘氨酸1.2mg/L、维生素B11.2mg/L、维生素B61mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L、七水硫酸亚铁28mg/L、乙二胺四乙酸二钠37mg/L。

[0071] 所述诱导培养基(记作诱导培养基RC-2)为将所述培养基RCⅡ与蔗糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶混匀得到的，所述蔗糖在所述诱导培养基RC-2中的浓度为30g/L，所述山梨醇在所述诱导培养基RC-2中的浓度为10g/L，所述水解酪蛋白在所述诱导培养基RC-2中的浓度为500mg/L，所述谷氨酰胺在所述诱导培养基RC-2中的浓度为500mg/L，所述脯氨酸在所述诱导培养基RC-2中的浓度为500mg/L，所述2,4-D在所述诱导培养基RC-2中的浓度为1.5mg/L，所述植物凝胶在所述诱导培养基RC-2中的浓度为3g/L。

[0072] 所述继代培养基(记作继代培养基-2)为将所述诱导培养基RC-2中的植物凝胶去除后得到的。

[0073] 所述共培养基培养基(记作共培养培养基RCO-2)为将所述诱导培养基RC-2与乙酰丁香酮混匀得到的。所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基RCO-2中的浓度为200uM。

[0074] 所述恢复培养基(记作恢复培养基REC-2)为将所述诱导培养基RC-2与特美汀混匀得到的。所述特美汀在所述恢复培养基REC-2中的浓度为300mg/L。

[0075] 所述筛选培养基(记作筛选培养基RSH-2)为将所述诱导培养基RC-2与特美汀和潮霉素混匀得到的。所述特美汀在所述筛选培养基RSH-2中的浓度为300mg/L，所述潮霉素在所述筛选培养基RSH-2中的浓度为65mg/L。

[0076] 所述再生培养基(记作再生培养基RG-2)为将所述诱导培养基RC-2中的2,4-D去除后与特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸混匀得到的。所述特美汀在所述再生培养基RG-2中的浓度为200mg/L，所述激动素在所述再生培养基RG-2中的浓度为1mg/L，所述6-苄氨基嘌呤在所述再生培养基RG-2中的浓度为1.5mg/L，所述萘乙酸在所述再生培养基RG-2中的浓度为0.3mg/L。

[0077] 在本发明的另一个实施例中，所述水稻品种为C815s、黄华占时，

[0078] 所述培养基RC(记作培养基RCⅢ)由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：硝酸钾2750mg/L、硫酸铵380mg/L、磷酸二氢钾420mg/L、七水硫酸镁175mg/L、二水氯化钙550mg/L、硫酸锰15mg/L、七水硫酸锌12mg/L、硼酸10mg/L、碘化钾8mg/L、五水硫酸铜0.05mg/L、二水钼酸钠0.5mg/L、六水氯化钴0.05mg/L、甘氨酸2.5mg/L、维生素B11mg/L、维生素B60.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇0mg/L、七水硫酸亚铁42mg/L、乙二胺四乙酸二钠56mg/L。

[0079] 所述诱导培养基(记作诱导培养基RC-3)为将所述培养基RCⅢ与麦芽糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶混匀得到的，所述麦芽糖在所述诱导培养基RC-3中的浓度为30g/L，所述山梨醇在所述诱导培养基RC-3中的浓度为10g/L，所述水解酪蛋白在所述诱导培养基RC-3中的浓度为500mg/L，所述谷氨酰胺在所述诱导培养基RC-3中的浓度为600mg/L，所述脯氨酸在所述诱导培养基RC-3中的浓度为800mg/L，所述2,4-D在所述诱导培养基RC-3中的浓度为2mg/L，所述植物凝胶在所述诱导培养基RC-3中的浓度为3g/L。

[0080] 所述继代培养基(记作继代培养基-3)为将所述诱导培养基RC-3中的植物凝胶去除后得到的。

[0081] 所述共培养基培养基(记作共培养培养基RCO-3)为将所述诱导培养基RC-3与乙酰丁香酮混匀得到的。所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基RCO-3中的浓度为200uM。

[0082] 所述恢复培养基(记作恢复培养基REC-3)为将所述诱导培养基RC-3与特美汀混匀得到的。所述特美汀在所述恢复培养基REC-3中的浓度为200mg/L。

[0083] 所述筛选培养基(记作筛选培养基RSH-3)为将所述诱导培养基RC-3与特美汀和潮霉素混匀得到的。所述特美汀在所述筛选培养基RSH-3中的浓度为200mg/L，所述潮霉素在所述筛选培养基RSH-3中的浓度为50mg/L。

[0084] 所述再生培养基(记作再生培养基RG-3)为将所述诱导培养基RC-3中的2,4-D去除后与特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸混匀得到的。所述特美汀在所述再生培养基RG-3中的浓度为200mg/L，所述激动素在所述再生培养基RG-3中的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基嘌呤在所述再生培养基RG-3中的浓度为2mg/L，所述萘乙酸在所述再生培养基RG-3中的浓度为0.3mg/L。

[0085] 在本发明的另一个实施例中，所述水稻品种为广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311时，

[0086] 所述培养基RC(记作培养基RCⅣ)由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：硝酸钾2850mg/L、硫酸铵380mg/L、磷酸二氢钾420mg/L、七水硫酸镁175mg/L、二水氯化钙550mg/L、硫酸锰23mg/L、七水硫酸锌12mg/L、硼酸15mg/L、碘化钾6mg/L、五水硫酸铜0.03mg/L、二水钼酸钠0.3mg/L、六水氯化钴0.03mg/L、甘氨酸2.5mg/L、维生素B1 1mg/L、维生素B6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇0mg/L、七水硫酸亚铁55mg/L、乙二胺四乙酸二钠74.5mg/L。

[0087] 所述诱导培养基(记作诱导培养基RC-4)为将所述培养基RCⅣ与麦芽糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶混匀得到的，所述麦芽糖在所述诱导培养基RC-4中的浓度为30g/L，所述山梨醇在所述诱导培养基RC-4中的浓度为10g/L，所述水解酪蛋白在所述诱导培养基RC-4中的浓度为800mg/L，所述谷氨酰胺在所述诱导培养基RC-4中的浓度为800mg/L，所述脯氨酸在所述诱导培养基RC-4中的浓度为800mg/L，所述2,4-D在所述诱导培养基RC-4中的浓度为1.5mg/L，所述植物凝胶在所述诱导培养基RC-4中的浓度为3g/L。

[0088] 所述继代培养基(记作继代培养基-4)为将所述诱导培养基RC-4中的植物凝胶去除后得到的。

[0089] 所述共培养基培养基(记作共培养培养基RCO-4)为将所述诱导培养基RC-4与乙酰丁香酮混匀得到的。所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基RCO-4中的浓度为200uM。

[0090] 所述恢复培养基(记作恢复培养基REC-4)为将所述诱导培养基RC-4与特美汀混匀得到的。所述特美汀在所述恢复培养基REC-4中的浓度为200mg/L。

[0091] 所述筛选培养基(记作筛选培养基RSH-4)为将所述诱导培养基RC-4与特美汀和潮霉素混匀得到的。所述特美汀在所述筛选培养基RSH-4中的浓度为200mg/L，所述潮霉素在所述筛选培养基RSH-4中的浓度为45mg/L。

[0092] 所述再生培养基(记作再生培养基RG-4)为将所述诱导培养基RC-4中的2,4-D去除后与特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸混匀得到的。所述特美汀在所述再生培养基RG-4中的浓度为200mg/L，所述激动素在所述再生培养基RG-4中的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基嘌呤在所述再生培养基RG-4中的浓度为2mg/L，所述萘乙酸在所述再生培养基RG-4中的浓度为0.2mg/L。

[0093] 所述生根培养基由溶质和溶剂组成，所述溶剂为双蒸水，所述溶质及其浓度分别如下：硝酸钾1150mg/L、硫酸铵190mg/L、磷酸二氢钾210mg/L、七水硫酸镁87.5mg/L、二水氯化钙275mg/L、硫酸锰7.5mg/L、七水硫酸锌6mg/L、硼酸5mg/L、碘化钾4mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、甘氨酸1.25mg/L、维生素B1
0.5mg/L、维生素B6 0.25mg/L、烟酸0.25mg/L、肌醇0mg/L、七水硫酸亚铁21mg/L、乙二胺四乙酸二钠28mg/L、蔗糖15g/L、萘乙酸0.1mg/L、植物凝胶3g/L。

[0094] 上述培养基在如下a1)-a4)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

[0095] a1)培养水稻愈伤组织；

[0096] a2)制备培养水稻愈伤组织的产品；

[0097] a3)水稻遗传转化；

[0098] a4)制备水稻遗传转化的产品。

[0099] 为了实现上述目的，本发明还提供了一种水稻遗传转化的方法。

[0100] 本发明提供的水稻遗传转化的方法包括如下步骤：

[0101] 1)将水稻种子在上述诱导培养基中培养，得到诱导培养后的愈伤组织；

[0102] 2)将所述诱导培养后的愈伤组织在上述继代培养基中培养，得到继代培养后的愈伤组织；

[0103] 3)将所述继代培养后的愈伤组织在农杆菌重悬液中侵染，得到侵染后的愈伤组织；

[0104] 所述农杆菌重悬液是将含有目的基因表达载体的农杆菌在含有乙酰丁香酮的侵染液中震荡混匀得到的；所述侵染液为将上述培养基RC与水解酪蛋白、脯氨酸、蔗糖和葡萄糖混匀得到的；

[0105] 4)将所述侵染后的愈伤组织表面的侵染液吸干，然后在浸透所述侵染液的无菌滤纸上暗培养，得到表面无褐色斑点的愈伤组织；

[0106] 5)将所述表面无褐色斑点的愈伤组织在上述筛选培养基中培养，得到抗性愈伤；

[0107] 6)将所述抗性愈伤在再生培养基中培养，直至所述抗性愈伤长出绿色叶片，得到水稻幼苗；

[0108] 7)将所述水稻幼苗在上述生根培养基中培养，得到转基因水稻植株。

[0109] 进一步的，

[0110] 步骤1)前还包括对水稻种子进行消毒的步骤；所述消毒的方法包括如下步骤：将成熟水稻种子去壳后，在75％(体积分数)乙醇溶液中浸泡灭菌1min，然后在有效氯为2％的次氯酸钠溶液中浸泡灭菌20～30min，灭菌水清洗3～5遍，得到消毒后的种子。

[0111] 步骤1)中，所述培养的条件为32-35℃暗培养16-24天。

[0112] 步骤2)中，所述培养的条件为120-200rpm，26～28℃暗培养7-10天；具体为120rpm，28℃暗培养7-10天。

[0113] 步骤3)中，所述含有目的基因表达载体的农杆菌为含有重组载体pG0051的农杆菌EHA105。所述含有目的基因表达载体的农杆菌在与侵染液混匀前还包括活化的步骤。所述活化的培养基为含有利福平(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的YET培养基。所述YET培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L。所述活化的条件为28℃暗培养36-48小时。

[0114] 所述乙酰丁香酮在所述侵染液中的浓度为100-200uM或100uM或200uM；

[0115] 所述水解酪蛋白在所述侵染液中的浓度为200-400mg/L或200mg/L或300mg/L或400mg/L；

[0116] 所述脯氨酸在所述侵染液中的浓度为200-500mg/L或200mg/L或300mg/L或500mg/L；

[0117] 所述蔗糖在所述侵染液中的浓度为20g/L；

[0118] 所述葡萄糖在所述侵染液中的浓度为10g/L。

[0119] 所述侵染液的OD660为0.1-0.2，所述侵染的条件为室温浸泡10-15min。

[0120] 步骤4)中，所述暗培养的条件为19-21℃暗培养1-2天。

[0121] 步骤4)还包括如下步骤：若暗培养后的愈伤表面有褐色斑点，则转移至上述恢复培养基中进行培养；所述恢复培养的时间为3天。

[0122] 步骤5)中，所述培养的条件为28-32℃暗培养18-24天，具体为30℃暗培养18-24天。

[0123] 步骤6)中，所述培养的条件为25-28℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养15-25天。

[0124] 步骤7)中，所述培养的条件为25-28℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养8-10天。

[0125] 为了实现上述目的，本发明还提供了用于水稻遗传转化的产品；所述产品包括上述诱导培养基和/或上述继代培养基和/或上述恢复培养基和/或上述筛选培养基和/或上述再生培养基和/或上述生根培养基和/或上述侵染液。

[0126] 进一步的，所述产品还包括YET培养基。

[0127] 更进一步的，所述YET培养基为含有利福平和卡那霉素的YET培养基。

[0128] 所述产品在水稻遗传转化或制备水稻遗传转化的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

[0129] 上述培养基或应用或方法中，所述水稻可为籼稻和/或粳稻。所述籼稻具体可为C815s、黄华占、广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号或9311；所述粳稻具体可为武运粳23、武运粳27、日本晴、龙粳31或粳65B。

[0130] 本发明开发的通用型组织培养基具有如下优点：

[0131] 1、通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，使粳、籼稻均可实现愈伤诱导及再生出苗。

[0132] 2、通过农杆菌介导，粳、籼稻均可实现稳定转化。

[0133] 本发明通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，开发出一种粳、籼稻通用型的组织培养的培养基，并通过农杆菌介导的方式实现粳、籼稻的稳定遗传转化。附图说明

[0134] 图1是以籼稻(9311)及粳稻(粳65B)为例的组培诱导图。

[0135] 图2是以籼稻(9311)及粳稻(粳65B)为例的遗传转化表型图。

[0136] 图3是以籼稻(9311)为例的PCR检测结果。各泳道均为9311的样品PCR检测结果。

具体实施方式

[0137] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0138] 下述实施例中的籼稻材料品种如下：黄华占是湖南农丰种业有限公司的产品。广占63-4S(2003年江苏审定，编号：苏审稻200303)。五山丝苗(2016年安徽审定，编号：皖稻2016055)。粤晶丝苗2号(2010年海南审定，编号：琼审稻2010025)。9311是江苏金土地种业公司的产品。C815S记载于文献：陈立云.两系法杂交水稻研究：上海科学技术出版社，2012-
1-1中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0139] 下述实施例中的粳稻材料品种如下：龙粳31是黑龙江佳木斯垦瑞种业的产品。武运粳23和武运粳27是江苏中江种业股份有限公司的产品。粳65B记载于文献：张城，陈亚君，王先俱，庞秀，丁芬，邵国军.滇I型早花时粳稻三系不育系粳65A的选育，杂交水稻，2017中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。日本晴记载于文献：尹德东，胡宝忠.日本晴水稻悬浮细胞系的建立和保存，东北农业大学学报，2006中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0140] 下述实施例中所涉及的试剂及来源如下：硝酸钾(Simga-P8291)、硫酸铵(Simga-A3920)、磷酸二氢钾(Amresco-0781)、七水硫酸镁(Simga-M7506)、二水氯化钙(Simga-C7902)、硫酸锰(Simga-M7899)、七水硫酸锌(Simga-Z0251)、硼酸(Simga-B6768)、二水氯化钙(Simga-C7902)、碘化钾(Simga-P8166)、五水硫酸铜(国产)、二水钼酸钠(国产)、六水氯化钴(国产)、甘氨酸(Simga-G8898)、维生素B1(Simga-T1270)、维生素B6(Simga-P6280)、烟酸(Simga-N0761)、肌醇(Simga-I7508)、七水硫酸亚铁(Simga-F8633)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA，Sigma-E6635)、麦芽糖(Simga-M5885)、蔗糖(Simga-V900116)、葡萄糖(Amresco-0188)山梨醇(Simga-S3889)、水解酪蛋白(Simga-C7290)、谷氨酰胺(Simga-G8540)、脯氨酸(Simga-P0380)、2,4-D(Simga-D7299)、植物凝胶(Phytagel，Simga-P8169)、乙酰丁香酮(Simga-D134406)、特美汀(GOLDBIO COM-T-104)、潮霉素(Phytotech-H385)、激动素(GOLDBIO COM K-100-25)、6-苄氨基嘌呤(Simga-B3408)、萘乙酸(Simga-N0640)、蛋白胨(Sigma-P5905)、酵母提取物(Sigma-Y1625)、氯化钠(Sigma-S7658)、卡那霉素(GOLDBIO COM-K-120-25)、琼脂(Sigma-A1296)。

[0141] 实施例1、一种适用于粳稻和籼稻愈伤组织生长的培养基

[0142] 一、培养基RC

[0143] 本发明设计了适用于粳稻和籼稻愈伤组织生长的培养基，其中将基础盐部分命名为RC，其溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：硝酸钾2300mg/L、硫酸铵380mg/L、磷酸二氢钾420mg/L、七水硫酸镁175mg/L、二水氯化钙550mg/L、硫酸锰15mg/L、七水硫酸锌12mg/L、硼酸10mg/L、碘化钾8mg/L、五水硫酸铜0.05mg/L、二水钼酸钠0.5mg/L、六水氯化钴0.05mg/L、甘氨酸2.5mg/L、维生素B1 1mg/L、维生素B6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇0mg/L、七水硫酸亚铁42mg/L、乙二胺四乙酸二钠56mg/L。

[0144] 二、适用于粳稻材料(武运粳23、武运粳27)愈伤组织生长的培养基

[0145] 1、粳稻材料(武运粳23、武运粳27)诱导培养基RC-1的制备：在培养基RC中添加如下组分：蔗糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶，使其浓度分别为：蔗糖30g/L、山梨醇20g/L、水解酪蛋白600mg/L、谷氨酰胺600mg/L、脯氨酸800mg/L、2,4-D
2mg/L、植物凝胶3g/L，得到诱导培养基，命名为RC-1。诱导培养基RC-1的PH为5.8，121℃灭菌15分钟后备用。

[0146] 2、粳稻材料(武运粳23、武运粳27)继代培养基-1的制备：去除诱导培养基RC-1中的植物凝胶，得到继代培养基-1。继代培养基-1的PH值为5.8。

[0147] 3、粳稻材料(武运粳23、武运粳27)共培养培养基RCO-1的制备：诱导培养基RC-1灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加乙酰丁香酮，使其浓度为200uM，得到共培养培养基RCO-1。共培养培养基RCO-1的PH值为5.4。

[0148] 4、粳稻材料(武运粳23、武运粳27)恢复培养基REC-1的制备：诱导培养基RC-1灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为300mg/L，得到恢复培养基REC-1。恢复培养基REC-1的PH值为5.8。

[0149] 5、粳稻材料(武运粳23、武运粳27)筛选培养基RSH-1的制备：诱导培养基RC-1灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀和潮霉素，使其浓度分别为：特美汀300mg/L和潮霉素35mg/L，得到筛选培养基RSH-1。筛选培养基RSH-1的PH值为5.8。

[0150] 6、粳稻材料(武运粳23、武运粳27)再生培养基RG-1的制备：去除诱导培养基RC-1中的2,4-D，121℃灭菌15分钟，当培养基冷却至50℃时添加特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸，使其浓度分别为：特美汀200mg/L、激动素1mg/L、6-苄氨基嘌呤1mg/L、萘乙酸0.2mg/L，得到再生培养基RG-1。再生培养基RG-1的PH值为5.8。

[0151] 三、适用于粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)愈伤组织生长的培养基[0152] 1、粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)诱导培养基RC-2的制备：调整培养基RC中各溶质浓度，并添加如下组分：蔗糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶，得到诱导培养基，命名为RC-2。愈伤诱导培养基RC-2中溶质的浓度分别如下：硝酸钾2650mg/L、硫酸铵490mg/L、磷酸二氢钾210mg/L、七水硫酸镁447.5mg/L、二水氯化钙270mg/L、硫酸锰30mg/L、七水硫酸锌6mg/L、硼酸5mg/L、碘化钾4mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、甘氨酸1.2mg/L、维生素B1 1.2mg/L、维生素B6
1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L、七水硫酸亚铁28mg/L、乙二胺四乙酸二钠37mg/L、蔗糖
30g/L、山梨醇10g/L、水解酪蛋白500mg/L、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2,4-D
1.5mg/L、植物凝胶3g/L。诱导培养基RC-2的PH为5.8，121℃灭菌15分钟后备用。

[0153] 2、粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)继代培养基-2的制备：去除诱导培养基RC-2中的植物凝胶，得到继代培养基-2。继代培养基-2的PH为5.8。

[0154] 3、粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)共培养培养基RCO-2的制备：诱导培养基RC-2灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加乙酰丁香酮，使其浓度为200uM，得到共培养培养基RCO-2。共培养培养基RCO-2的PH值为5.4。

[0155] 4、粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)恢复培养基REC-2的制备：诱导培养基RC-2灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为300mg/L，得到恢复培养基REC-2。恢复培养基REC-2的PH值为5.8。

[0156] 5、粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)筛选培养基RSH-2的制备：诱导培养基RC-2灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀和潮霉素，使其浓度分别为：特美汀300mg/L和潮霉素65mg/L，得到筛选培养基RSH-2。筛选培养基RSH-2的PH值为5.8。

[0157] 6、粳稻材料(日本晴、龙粳31、粳65B)再生培养基RG-2的制备：去除诱导培养基RC-2中的2,4-D，121℃灭菌15分钟，当培养基冷却至50℃时添加特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸，使其浓度分别为：特美汀200mg/L、激动素1mg/L、6-苄氨基嘌呤1.5mg/L、萘乙酸
0.3mg/L，得到再生培养基RG-2。再生培养基RG-2的PH值为5.8。

[0158] 四、适用于籼稻材料(C815s、黄华占)愈伤组织生长的培养基

[0159] 1、籼稻材料(C815s、黄华占)诱导培养基RC-3的制备：调整培养基RC中硝酸钾浓度为2750mg/L，并添加如下组分：麦芽糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶，使其浓度分别为：麦芽糖30g/L、山梨醇10g/L、水解酪蛋白500mg/L、谷氨酰胺600mg/L、脯氨酸800mg/L、2,4-D 2mg/L、植物凝胶3g/L，得到诱导培养基，命名为RC-3。诱导培养基RC-3的PH为5.8，121℃灭菌15分钟后备用。

[0160] 2、籼稻材料(C815s、黄华占)继代培养基-3的制备：去除诱导培养基RC-3中的植物凝胶，得到继代培养基-3。继代培养基-3的PH为5.8。

[0161] 3、籼稻材料(C815s、黄华占)共培养培养基RCO-3的制备：诱导培养基RC-3灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加乙酰丁香酮，使其浓度为200uM，得到共培养培养基RCO-3。共培养培养基RCO-3的PH值为5.4。

[0162] 4、籼稻材料(C815s、黄华占)恢复培养基REC-3的制备：诱导培养基RC-3灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为200mg/L，得到恢复培养基REC-3。恢复培养基REC-3的PH值为5.8。

[0163] 5、籼稻材料(C815s、黄华占)筛选培养基RSH-3的制备：诱导培养基RC-3灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀和潮霉素，使其浓度分别为：特美汀200mg/L和潮霉素50mg/L，得到筛选培养基RSH-3。筛选培养基RSH-3的PH值为5.8。

[0164] 6、籼稻材料(C815s、黄华占)再生培养基RG-3的制备：去除诱导培养基RC-3中的2,4-D，121℃灭菌15分钟，当培养基冷却至50℃时添加特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸，使其浓度分别为：特美汀200mg/L、激动素0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤2mg/L，萘乙酸0.3mg/L，得到再生培养基RG-3。再生培养基RG-3的PH值为5.8。

[0165] 五、适用于籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)愈伤组织生长的培养基

[0166] 1、籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)诱导培养基的制备：调整培养基RC中硝酸钾浓度为2850mg/L、硼酸浓度为15mg/L、硫酸锰浓度为23mg/L、碘化钾浓度为6mg/L、五水硫酸铜浓度为0.03mg/L、二水钼酸钠浓度为0.3mg/L、六水氯化钴浓度为0.03mg/L、七水硫酸亚铁浓度为55mg/L、乙二胺四乙酸二钠浓度为74.5mg/L，且添加麦芽糖、山梨醇、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、2,4-D和植物凝胶，使其浓度分别为：麦芽糖
30g/L、山梨醇10g/L、水解酪蛋白800mg/L、谷氨酰胺800mg/L、脯氨酸800mg/L、2,4-D
1.5mg/L、植物凝胶3g/L，得到诱导培养基，命名为RC-4。诱导培养基RC-4的PH为5.8，121℃灭菌15分钟后备用。

[0167] 2、籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)继代培养基-4的制备：去除诱导培养基RC-4中的植物凝胶，得到继代培养基-4。继代培养基-4的PH为5.8。

[0168] 3、籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)共培养培养基RCO-4的制备：诱导培养基RC-4灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加乙酰丁香酮，使其浓度为200uM，得到共培养培养基RCO-4。共培养培养基RCO-4的PH值为5.4。

[0169] 4、籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)恢复培养基REC-4的制备：诱导培养基RC-4灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为200mg/L，得到恢复培养基REC-4。恢复培养基REC-4的PH值为5.8。

[0170] 5、籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)筛选培养基RSH-4的制备：诱导培养基RC-4培养基灭菌后，当培养基冷却至50℃时添加特美汀和潮霉素，使其浓度分别为：特美汀200mg/L和潮霉素45mg/L，得到筛选培养基RSH-4。筛选培养基RSH-4的PH值为
5.8。

[0171] 6、籼稻材料(广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311)再生培养基RG-4的制备：去除诱导培养基RC-4中的2,4-D，121℃灭菌15分钟，当培养基冷却至50℃时添加特美汀、激动素、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸，使其浓度分别为：特美汀200mg/L、激动素0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤2mg/L、萘乙酸0.2mg/L，得到再生培养基RG-4。再生培养基RG-4的PH值为5.8。

[0172] 六、粳稻与籼稻材料的生根培养基

[0173] 粳稻与籼稻材料的生根培养基命名为RT：在1/2培养基RC的基础上添加蔗糖、萘乙酸和植物凝胶，使其浓度分别为：蔗糖15g/L、萘乙酸0.1mg/L、植物凝胶3g/L，得到生根培养基RT。生根培养基RT的PH值为5.8，121℃灭菌15分钟后备用。

[0174] 七、侵染液

[0175] 粳稻与籼稻材料的侵染液命名为RIn：在培养基RC的基础上添加水解酪蛋白、脯氨酸、蔗糖和葡萄糖，使其浓度分别为：水解酪蛋白300mg/L、脯氨酸300mg/L、蔗糖20g/L和葡萄糖10g/L，得到侵染液RIn。侵染液RIn的PH值为5.2。121℃灭菌15分钟后备用。

[0176] 八、农杆菌活化培养基

[0177] 农杆菌活化培养基为YET培养基，其由溶剂和溶质组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L，121℃灭菌15分钟，当培养基冷却至50℃时添加利福平和卡那霉素，使其浓度分别为：利福平25mg/L、卡那霉素50mg/L。YET培养基的PH值为7。

[0178] 实施例2、农杆菌介导的水稻(籼稻、粳稻)遗传转化

[0179] 分别以粳稻材料：武运粳23、日本晴、龙粳31、粳65B；籼稻材料：C815s、黄华占、广占63-4S、五山丝苗、粤晶丝苗2号、9311作为供试种子材料，使用实施例1中各材料对应的培养基进行遗传转化，制备转基因水稻。具体步骤如下：

[0180] (一)转基因水稻的制备

[0181] 一、愈伤组织诱导培养

[0182] 1、种子的消毒

[0183] 将成熟水稻种子去壳后，在75％(体积分数)乙醇溶液中浸泡灭菌1min，然后在有效氯为2％的次氯酸钠溶液中浸泡灭菌20-30min，灭菌水清洗3-5遍，得到消毒后的种子。

[0184] 2、愈伤组织诱导

[0185] 在超净工作台中将步骤1获得的消毒后的种子吹干后接种至愈伤诱导培养基上，每皿12-16粒种子，置于32-35℃暗室中培养16-24天。按照如下公式计算不同品种诱导产生胚性愈伤组织的效率：成功诱导数/有效接种数。不同品种的诱导效率统计结果见表1。

[0186] 表1、不同品种诱导产生胚性愈伤组织的效率

[0187]

[0188]

[0189] 二、继代培养

[0190] 挑取步骤一获得的质地坚硬、具有光泽感的黄色愈伤颗粒15-20块接种于含有75ml继代培养基的三角瓶(三角瓶容积为200mL)中，在120rpm、28℃条件下暗培养7-10天后即可收获用于侵染。

[0191] 三、农杆菌侵染

[0192] 1、农杆菌准备

[0193] 1)重组载体的制备

[0194] 将序列1第131-4846位所示的pr35s::RFP::t35s//prZmUbi-01::HPT::tNos片段插入改造后的pCAMBIA3301载体的T-DNA区，得到重组载体pG0051。重组载体pG0051的核苷酸序列如序列1所示。

[0195] 2)重组农杆菌的制备

[0196] 将步骤1)制备的pG0051载体导入EHA105(EHA105是上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)农杆菌中，经鉴定，得到含有pG0051载体的EHA105农杆菌。将含有pG0051载体的EHA105农杆菌菌液划线涂布在含有50ug/ml卡那霉素和25ug/ml利福平的YET培养基上，28℃暗培养36-48小时。

[0197] 2、农杆菌重悬液制备

[0198] 将步骤1中农杆菌平板上的农杆菌刮到添加乙酰丁香酮(终浓度100uM)的侵染液RIn中，震荡混匀，得到OD660为0.1～0.2的农杆菌重悬液。

[0199] 3、侵染

[0200] 将步骤二收集的愈伤组织转移至含有农杆菌重悬液的灭菌管中，室温浸泡10～15min。

[0201] 四、共培养及恢复培养

[0202] 将步骤三中沉浸在农杆菌悬浮液中的愈伤组织收集至无菌空皿中(皿内铺有6～8层灭菌滤纸)，放置超净台晾干，期间可替换一次滤纸，至滤纸不再快速洇湿、晃动平皿时愈伤组织间不黏连。然后将愈伤颗粒分散在铺有无菌滤纸的共培养培养基中，19-21℃暗培养1-2天。若暗培养后，愈伤表面有褐色斑点，则转移至恢复培养基中培养3天后转移至筛选培养基中，若愈伤表面无褐色斑点，则可直接转移至筛选培养基上。

[0203] 五、筛选培养

[0204] 将步骤四中获得的愈伤组织均匀放置在筛选培养基上，16-20粒/皿，30℃暗培养18-24天，得到抗性愈伤。按照如下公式计算不同品种的抗愈率：经HPT筛选后存活的愈伤总数/筛选愈伤数。抗愈率统计结果见表2。

[0205] 六、再生培养

[0206] 将步骤五中筛选得到的抗性愈伤转移至再生培养基上，每皿放置5-7粒愈伤，25-28℃光照(光照周期为白光16h/黑暗8h)培养15-25天长绿色叶片后即可转移至生根培养基中进行生根培养。按照如下公式计算不同品种的再生率(再生出苗效率)：可出苗的愈伤总数/再生起始愈伤总数。再生率统计结果见表2。

[0207] 七、生根培养

[0208] 将每个克隆分化出的幼苗转移至含有生根培养基的生根罐中，每罐放置3-5棵幼苗，25-28℃光照(光照周期为白光16h/黑暗8h)培养8-10天，得到转基因水稻。

[0209] (二)转基因水稻的鉴定

[0210] 提取转基因水稻叶片DNA，采用引物F：gcatcaggtcggagacgctgtcgaac和引物R：gagatgctttttgttcgcttgg进行PCR扩增，PCR扩增得到大小为535bp的转基因水稻为阳性转基因水稻。计算不同品种的再生阳性率和转化效率。再生阳性率＝PCR检测HPT阳性苗总数/再生出苗总数，转化效率＝抗愈率×再生率×再生阳性率。9311转化阳性T0苗的部分PCR检测结果见图3。

[0211] 表2、不同品种的农杆菌转化效率

[0212] 品种筛选愈伤数抗愈率再生率再生阳性率转化效率黄华占(籼) 280 21％ 46％ 98％ 9.5％
C815s(籼) 280 38％ 64％ 92％ 22.4％
9311(籼) 280 24％ 63％ 100％ 15％
广占63-4S(籼) 280 12％ 29％ 100％ 3.5％
五山丝苗(籼) 280 16％ 49％ 100％ 7.8％
粤晶丝苗2号(籼) 280 18％ 45％ 100％ 8.1％
龙粳31(粳) 280 22％ 42％ 100％ 9.3％
日本晴(粳) 280 49％ 50％ 96％ 23.5％
粳稻65B(粳) 280 30％ 38％ 100％ 11.4％
武运粳23(粳) 280 9％ 31％ 100％ 2.79％

[0213] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

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一种农杆菌介导的水稻遗传转化方法

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