技术领域
[0001] 本
发明涉及重金属污染土壤
生物修复技术领域，具体是利用丛枝菌根真菌与火炬树修复镉污染土壤的方法。
背景技术
[0002] 土壤重金属污染是威胁生态安全和人类生存的重要环境问题之一。火炬树(Rhus typhina L.)
别名鹿
角漆，属漆树科(Anacardiaceae)盐肤木属(Rhus)落叶灌木或小乔木。火炬树具有优良的生物学特性，适应能
力强，耐旱，耐瘠薄，根系发达，生长快，根蘖萌发力强。在最近半个世纪的生态修复工程中受到极大欢迎，成为中国北方主要造林树种之一。
发明内容
[0003] 本发明提供利用丛枝菌根真菌与火炬树修复镉污染土壤的方法，解决了
现有技术中修复重金属镉污染土壤过程中施用化学添加剂等会影响土壤理化性质，尤其是改变土壤pH、田间持
水量等的技术问题。
[0004] 本发明是这样实现的：包括以下步骤：
[0005] (1)制备丛枝菌根真菌菌剂
[0006] 丛枝菌根真菌选用根内球囊霉菌，将初始菌剂加入基质，
播种寄主
植物，寄主植物生长过程中每3周按照基质
质量的10％浇1/4强度的霍格兰
营养液1次，所述霍格兰营养液的配方为：KNO3 5mM/L，Ca(NO3)2·4H2O 5mM/L，MgSO4·7H2O 2mM/L，KH2PO4 1mM/L，H3BO3 0.045mM/L，MnCl2·4H2O 0.01mM/L，ZnSO4·7H2O 0.8μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O
0.4μM，FeSO4·7H2O 0.02μM/L，EDTA-Na2 0.02μM/L，3～4个月后得到被真菌侵染的寄主植物和含有丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的基质，将寄主植物地上部剪去后，剪碎根段，并将根段与含有丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的基质混匀，得丛枝菌根真菌菌剂；
[0007] (2)菌剂施用
[0008] 将步骤(1)所得的菌剂，按照质量比为3％～5％的接种量与土壤混合，装入无菌盆内；
[0009] (3)催芽
[0010] 火炬树
种子进行种子表面消毒后用去离子水洗净，放入超纯水中浸泡1d，将浸泡后的种子放入垫有
滤纸的无菌培养皿中，置于28℃保温箱内培养；
[0011] (4)移栽
[0012] 将步骤(3)培养得到的7d
幼苗移栽至步骤(2)的无菌盆中，培养60d；
[0013] (5)种植
[0014] 将步骤(4)得到的火炬树幼苗移栽至待修复区域，进行常规田间管理。
[0015] 作为一种优选的实施方案，所述初始菌剂按照基质质量比的3％～5％加入基质中。
[0016] 作为一种优选的实施方案，所述基质为灭菌
石英砂。
[0017] 作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，使用10％NaClO对火炬树种子进行表面消毒10～15min。
[0018] 作为一种优选的实施方案，所述寄主植物为三叶草。
[0019] 作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，接种方法采用层施法或混施法。
[0020] 本发明的有益效果：本发明制备菌剂所用扩繁基质中含有的霍格兰营养液成分不仅可以作为扩繁丛枝菌根真菌时的营养物质，还可以在菌剂施加到含重金属镉土壤初期帮助丛枝菌根真菌抵抗重金属镉胁迫，起到真菌保护剂的作用。本发明采用盆栽法研究了重金属镉污染下接种根内球囊霉菌对火炬树长势、生物量、磷元素含量、镉离子含量等的影响。接种根内球囊霉菌显著促进了重金属胁迫下的火炬树的生长、减少了重金属镉离子的吸收，可见根内球囊霉菌在降低重金属镉的抑制作用和促进火炬树生长方面效果显著。本发明利用丛枝菌根真菌和火炬树共生，不仅可以改善火炬树的矿质营养状况，尤其是磷元素，从而促进火炬树生长，增加生物量；更重要的是，可以降低火炬树的吸收重
金属离子的浓度，同时也降低了重金属离子对火炬树的毒害，可应用于修复镉污染土壤。本发明的方法简单实用、易于掌握、成本较低、绿色环保，不会引起二次污染。
具体实施方式
[0021] 以下结合具体
实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的
试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，所用试剂和材料均为市购。
[0022] 1.实验材料
[0023] 下述实施例中所用丛枝菌根真菌根内球囊霉菌(Glomus intraradices)购于法国MycAgro菌剂公司；火炬树(Rhus typhina L.)为广谱种，种子由青岛冠中生态股份有限公司提供。
[0024] 本发明根内球囊霉菌属于球囊霉纲(Glomeromycete)、球囊霉目(Glomales)、球囊霉科(Glomaceae)、球囊霉属(Glomus)。
[0025] 本发明根内球囊霉菌可在较为恶劣的含重金属镉污染土壤环境中生长，最适生长
温度为18～25℃，最适pH值为6.5～7.5。
[0026] 丛枝菌根真菌菌剂由法国MycAgro实验室提供的根内球囊霉菌(Glomus intraradices)。将初始菌剂按照基质质量比的3％～5％加入灭菌石英砂中，播种三叶草种子，生长过程中每3周按照基质质量的10％浇1/4强度的霍格兰营养液1次，3～4个月后得到被真菌侵染的三叶草和含有丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的基质，将三叶草地上部剪去后，剪碎根段，并将根段与含有丛枝菌根真菌孢子、根外菌丝的基质混匀，用作丛枝菌根真菌菌剂。
[0027] 霍格兰营养液营养液配方为：KNO3 5mM/L，Ca(NO3)2·4H2O 5mM/L，MgSO4·7H2O 2mM/L，KH2PO4 1mM/L，H3BO3 0.045mM/L，MnCl2·4H2O 0.01mM/L，ZnSO4·7H2O 0.8μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.4μM，FeSO4·7H2O 0.02μM/L，EDTA-Na2 0.02μM/L。
[0028] 菌剂扩繁操作为无菌操作。无菌操作：操作桌面先用酒精擦拭消毒；桌面上
覆盖若干层灭菌的纸，将
收获的培养物倒在纸上，用火焰消毒的短柄斧剁碎；用两张纸卷起剁碎了的培养物，纸筒的一端插入预先准备的能封口的干净塑料袋中；当所有的培养物都转移入袋中后，轻轻取出纸，封上袋，再在外面套一个相同的塑料袋，然后放置在4℃
冰箱中保存。
[0029] 供试植物火炬树，首先用10％的NaClO对种子进行表面消毒10～15min，去离子水洗净，将洗净的火炬树种子放入超纯水中浸泡1d后，待种子充分膨胀后放入垫有滤纸的无菌培养皿中，置于28℃室温内培养，待种子发芽7d后，选取长势一致的幼苗备用。
[0030] 供试土壤，采自中国海洋大学校园，将土壤经自然
风干后
磨碎，过1mm筛后，连续高温高压
蒸汽灭菌2h(121℃)，分别加入
指定浓度的重金属镉离子，使重金属镉浓度达到50mg/kg。为了让土壤中重金属离子分布均匀且稳定，加去离子水浸润一周后风干两周，循环两次。
[0031] 2.实验设计
[0032] 实验花盆为容量800g土的塑料花盆(上口直径160mm、下口直径110mm、高120mm)。含重金属离子土壤浓度为：50mg/kg。实验分为接种实验组和不接种对照组两种处理。按3％～5％的接种量(质量比)将实验内容中制备的AMF菌剂与土壤均匀混合后装盆，对照组混入等量的灭菌(121℃，2h)的AMF菌剂。每盆移栽3株生长状况良好并且长势一致的火炬树幼苗，每个处理重复三次。将盆栽随机摆放在
温室中进行培养，光照14h，温度为22℃～28℃，每两天浇一次无菌水。一周后将每盆火炬树筛减至1株。实验结束后收获植物。将收获的植物种植于待修复区域，进行常规田间管理。
[0033] 3.丛枝菌根真菌浸染率的测定
[0034] 测定方法如下：
[0035] 用蒸馏水将火炬树根洗净，剪成约lcm长的小段，放入15％的KOH溶液中，90℃恒温水浴30min，用蒸馏水轻轻漂洗根样；用10％的H2O2漂白30min，用蒸馏水冲洗；再将根浸入1％的HC1溶液中静置3min，用蒸馏水洗去HCl溶液后，加入0.05％的Trypanblue染液，90℃水浴下
染色30min；染色后，用酸性甘油(乳酸：甘油＝1:1)洗去根的浮色，随机挑取50条根段于
显微镜下观察侵染情况。参照Trouvelot等的方法计算AMF侵染强度。结果如表1所示。
[0036] 4.火炬树生物量的测定
[0037] 将植物收获后，用去离子水冲洗干净，置于80℃烘箱中72h至恒重，称干重。测定结果如表1所示。
[0038] 5.火炬树磷含量的测定
[0039] 将火炬树植株用清水洗干净，然后放入烘箱内75℃烘干48h，直至恒重。用
硫酸-过
氧化氢进行消化，冷却稀释后，采用钼锑抗分光光度法测定其磷含量。测定结果如表1所示。
[0040] (1)未接种AMF处理中，火炬树没有AMF侵染。
[0041] (2)接种AMF明显促进了火炬树的生长，生物量明显增加，最大增幅为32.26％。
[0042] 7.火炬树重金属镉离子含量的测定
[0043] 将火炬树苗从盆中取出，根系先用蒸馏水冲洗，再用去离子水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分，105℃下杀青30min，然后在60℃下烘干至恒重，测定植物生物量。然后准确称取火炬树样品0.2g，采用HNO-HClO2(87:13，v/v，分析纯)湿灰化-
原子吸收法测定钠含量(TAS-986火焰型原子吸收仪)。测定结果如表1所示。
[0044] 8.土壤有磷元素含量的测定
[0045] 用硫酸-过氧化氢联和消解，冷却稀释后，采用钼锑抗分光光度法测定其磷元素含量。测定结果如表1所示。
[0046] 表1AMF对火炬树重金属镉离子吸收浓度的影响
[0047]
[0048] 如表1所示结果表明：
[0049] (1)接种AMF明显降低了火炬树体内重金属镉离子浓度，最大降低幅达14.16％；
[0050] (2)接种AMF明显提高了火炬树体内磷元素吸收量，磷元素吸收量最大增幅达16.82％；
[0051] (3)接种AMF显著提高了火炬树在正常条件下与重金属胁迫条件下的生物量。
[0052] 本发明的有益效果：本发明制备菌剂所用扩繁基质中含有的霍格兰营养液成分不仅可以作为扩繁丛枝菌根真菌时的营养物质，还可以在菌剂施加到含重金属镉土壤初期帮助丛枝菌根真菌抵抗重金属镉胁迫，起到真菌保护剂的作用。本发明采用盆栽法研究了不同重金属镉浓度下接种根内球囊霉菌对火炬树长势、生物量、镉离子含量、磷元素含量等的影响。接种根内球囊霉菌显著促进了重金属胁迫下的火炬树的生长、减少了重金属离子的吸收，可见根内球囊霉菌在降低重金属的抑制作用和促进火炬树生长方面效果显著。本发明利用丛枝菌根真菌和火炬树共生，不仅可以改善火炬树的矿质营养状况，尤其是磷元素，从而促进火炬树生长，增加生物量；更重要的是，可以降低火炬树的吸收重金属离子的浓度，同时也降低了重金属离子对火炬树的毒害，可应用于修复镉污染土壤。本发明的方法简单实用、易于掌握、成本较低、绿色环保，不会引起二次污染。
[0053] 以上实施例仅为对本发明的基本构思和实施方式所作的解释说明，不能理解为对本发明的限制，任何不脱离本发明基本构思情况下的
修改和替换，均应纳入本发明的保护范围。
