技术领域
[0001] 本
发明涉及
土壤修复领域，具体涉及一种有效的用于重金属
土壤污染的修复方法。
背景技术
[0002] 土壤是人类赖以生存的资源，也是大自然最具循环能
力的资源,随着城市化、工业化
进程的
加速，我国的重金属污染土壤问题已经成为不容忽视的焦点环境问题。重金属土壤污染的修复方法通常有物理控制、化学和
生物修复等方法。物理控制是利用物理或物理化学的原理来治理重金属土壤污染，主要有客土、换土、翻土、去表土、淋洗法、
热处理法、
电解法等方法，缺点是操作复杂、治理
费用高且容易引起
土壤肥力降低。化学治理是通过向污染土壤中投加改良剂、
抑制剂，改变土壤理化性质，使土壤中的重金属发生
氧化、还原、沉淀、
吸附等作用，降低土壤的生物可给性，这种方法治理效果和费用适中，但重金属容易再度被活化。生物修复技术是指利用动
植物和
微生物等生物的某些特性来适应、缓解和改良重金属污染的措施，其中
植物修复技术因具有效果明显、费用较低、环境扰动小等优点受到广泛重视。植物修复技术是以植物耐受和超积累某种或某些化学元素的理论为
基础，利用植物及其共生微生物体系清除环境中污染物的一项环境污染治理技术。
[0003] 重金属污染土壤的植物修复技术中，选择高耐受和吸收能力强且生物量大的植物非常重要。而超积累植物又称超富集植物，是一种可在植物体内超量积累重金属并能将其大量转移到地上部分的特殊植物，这类植物对重金属的积累量超过一般植物在统一生长条件下的100倍以上，超积累植物富集Cu、Cr、Co、Ni、Pb的含量一般在0.1％以上，积累的Mn、Zn含量一般在1％以上。通过国内外研究报道可知，超积累植物对重金属的解毒机理为：重金属沉淀与细胞壁；植物体内植物络合素和
有机酸等对重金属的螯合作用；植物细胞内液泡的房室化作用。超积累植物根系分泌物对土壤中重金属具有活化作用等。
[0004] 龙葵是已经报道的重金属Cd的超积累植物，能够在植物生长未受明显抑制的情况下对重金属镉进行富集，不仅是研究植物吸收、转运和超积累Cd机理的良好模式材料，也是提升植物修复重金属污染技术的良好材料，其植物体中重金属浓度是土壤中的几倍甚至几十倍。但其修复土壤重金属污染的效率还是受到生长慢、生物量小、适应性弱和土壤重金属可给性的限制。而从超积累植物龙葵中分离出的
内生菌，能够在龙葵的植物体中进行定殖，促进龙葵的生长、抗逆、提高生物量和对土壤重金属的吸收、转运、积累重金属能力，这对于应用龙葵修复重金属污染土壤的实际应用具有十分重要的意义，而
现有技术中，对于使用超积累植物龙葵与其内生菌联合修复重金属污染土壤，还未见具体报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种有效的用于重金属土壤污染的修复方法，首先通过特定的方法制备内生菌，再以制备得到的内生菌接种到龙葵上，将接种后的龙葵种植到待修复的重金属污染地，使得重金属污染土壤得到快速有效的修复，同时简单易行，维护成本低。
[0006] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0007] 一种有效的用于重金属土壤污染的修复方法，包括以下步骤：
[0008] (1)内生菌的制备：
[0009] 将龙葵植株样品洗净、切成小段，进行表面消毒后
研磨，使内生菌分离
浸出，将内生菌浸出液稀释涂布于平板，划线培养至纯后，经筛选得到沙雷氏菌属内生菌；
[0010] (2)重金属污染土壤的修复：
[0011] a、接种沙雷氏菌属内生菌：将经步骤(1)所得沙雷氏菌属内生菌接种到龙葵上，使龙葵
幼苗根部浸入含沙雷氏菌属的内生菌悬液中，培养1-2天，得接种内生菌的龙葵；
[0012] b、施加土壤调理剂：在重金属污染土壤表面施加土壤调理剂，厚度为15-25cm，然后喷雾洒
水，翻耕均匀；
[0013] c、种植：在重金属污染土壤中种植接种内生菌的龙葵，移栽完要给龙葵苗浇水，成活之后施加尿素以促苗；
[0014] d、刈割：对龙葵进行轻度刈割。
[0015] 优选地，步骤(1)中，所述内生菌通过以下方法制备得到：
[0016] a、植物预处理：将采集好的新鲜龙葵用清水冲净并将其根、茎、叶切成2cm-3cm的小段；
[0017] b、表面消毒：将预处理后的根、茎、叶小段在70％
乙醇中浸泡3min，再用2％
次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水多次冲洗，取最后一次洗液涂布平板上进行恒温培养作为表面消毒的对照，若对照平板无微生物长出，表明消毒彻底，后续步骤所分离获得的均为龙葵内生菌；
[0018] c、内生菌的分离与浸出：经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下，于10mL含重量体积分数为1％的
纤维素酶和0.25％的Tween80的灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥形瓶中于150rpm、30℃条件下保持1h，得到内生菌浸出液；
[0019] d、内生菌的分离纯化：在无菌条件下将内生菌浸出液作梯度稀释，分别取原液、10倍、100倍稀释液100mL涂布于TBS琼脂平板，30℃恒温培养，然后挑取不同形态的菌落，其中细菌至TSB固体培养基，
真菌至察氏培养基中，划线培养至纯后，筛选出沙雷氏菌属内生菌；
[0020] e、内生菌悬液的制备：将沙雷氏菌属内生菌接种培养为
种子液，种子液再接种至
发酵培养基中培养，得到沙雷氏菌属的内生菌悬液。
[0021] 优选地，步骤(2)的步骤a中，含沙雷氏菌属的内生菌悬液浓度为1×107-1×109CFU/mL。
[0022] 优选地，步骤(2)的步骤b中，土壤调理剂的用量为土壤
质量的6％-10％，所用水的质量为土壤调理剂质量的60％-80％，土壤调理剂原料按质量份数计，包括：发酵
粪便50-60份、玉米秸秆粉24-26份、赤泥20-25份、石灰粉28-30份、
硅钙钾肥14-16份。
[0023] 优选地，步骤(2)的步骤c中，种植期为4-9月份，每株相隔30-50cm，种植量为10-15株/cm2。
[0024] 优选地，步骤(2)的步骤d中，对龙葵进行轻度刈割，留茬30cm，每年可对地上部进行3次刈割，以实现高效连续修复。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1、本发明将超积累植物龙葵接种内生菌，强化了龙葵对污染土壤中重金属的吸收能力，能够很好的解决超积累植物在修复重金属土壤污染中，存在的生长缓慢、修复周期长、生物量小等技术问题。具有良好的社会效益、经济效益和环境效益。
[0027] 2、本发明利用植物-微生物联合修复重金属污染土壤，极大地提高了重金属污染土壤的修复效率。本发明中的内生菌能够长期稳定地定殖于龙葵中，与其形成互利共生的关系，不仅能帮助植株从外界环境中获取养分，还能提高植株对生物胁迫或
非生物胁迫的抵抗力。促进超积累植物龙葵的生长，使其地上部与地下部的生物量均明显提高，对增强了其对高浓度重金属污染土壤的耐性。
[0028] 3、本发明操作简单，易于大面积实施，维护成本低廉，有利于解决现有技术中单一植物修复重金属污染土壤中的
缺陷，且有利于减少二次污染问题，修复效率高。
具体实施方式
[0029] 为使本发明
实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1：
[0031] (1)内生菌的制备：
[0032] a、植株预处理：将采集好的新鲜龙葵用清水冲净并将其根、茎、叶切成2cm的小段；
[0033] b、表面消毒：将预处理后的根、茎、叶小段在70％乙醇中浸泡3min，再用2％次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水多次冲洗，取最后一次洗液涂布平板上进行恒温培养作为表面消毒的对照，若对照平板无微生物长出，表明消毒彻底，后续步骤所分离获得的均为龙葵内生菌；
[0034] c、内生菌的分离与浸出：经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下，于10mL含重量体积分数为1％的
纤维素酶和0.25％的Tween80的灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥形瓶中于150rpm、30℃条件下保持1h，得到内生菌浸出液；
[0035] d、内生菌的分离纯化：在无菌条件下将内生菌浸出液作梯度稀释，分别取原液、10倍、100倍稀释液100mL涂布于TBS琼脂平板，30℃恒温培养，然后挑取不同形态的菌落，其中细菌至TSB固体培养基，真菌至察氏培养基中，划线培养至纯后，筛选出沙雷氏菌属内生菌；
[0036] e、内生菌悬液的制备：将沙雷氏菌属内生菌接种培养为种子液，种子液再接种至发酵培养基中培养，得到沙雷氏菌属的内生菌悬液。
[0037] (2)重金属污染土壤的修复：
[0038] a、接种沙雷氏菌属内生菌：将经步骤(1)所得沙雷氏菌属内生菌接种到龙葵上，使龙葵幼苗根部浸入含沙雷氏菌属的内生菌悬液中，培养1天，得接种内生菌的龙葵，菌悬液浓度为1×107CFU/mL；
[0039] b、施加土壤调理剂：在重金属污染土壤表面施加土壤调理剂，厚度为15cm，土壤调理剂的用量为土壤质量的6％，然后喷雾洒水，用水的质量为土壤调理剂质量的60％，翻耕均匀，所述土壤调理剂原料按质量份数计，包括：发酵粪便50份、玉米秸秆粉24份、赤泥20份、石灰粉28份、硅钙钾肥14份；
[0040] c、种植：在重金属污染土壤中种植接种内生菌的龙葵，于4月份种植，每株相隔30cm，10株/cm2，移栽完要给龙葵苗浇水，成活之后施加尿素以促苗；
[0041] d、刈割：对龙葵进行轻度刈割，留茬30cm，每年可对地上部进行3次刈割，以实现高效连续修复。
[0042] 实施例2：
[0043] (1)内生菌的制备：
[0044] a、植株预处理：将采集好的新鲜龙葵用清水冲净并将其根、茎、叶切成2cm的小段；
[0045] b、表面消毒：将预处理后的根、茎、叶小段在70％乙醇中浸泡3min，再用2％次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水多次冲洗，取最后一次洗液涂布平板上进行恒温培养作为表面消毒的对照，若对照平板无微生物长出，表明消毒彻底，后续步骤所分离获得的均为龙葵内生菌；
[0046] c、内生菌的分离与浸出：经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下，于10mL含重量体积分数为1％的纤维素酶和0.25％的Tween80的灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥形瓶中于150rpm、30℃条件下保持1h，得到内生菌浸出液；
[0047] d、内生菌的分离纯化：在无菌条件下将内生菌浸出液作梯度稀释，分别取原液、10倍、100倍稀释液100mL涂布于TBS琼脂平板，30℃恒温培养，然后挑取不同形态的菌落，其中细菌至TSB固体培养基，真菌至察氏培养基中，划线培养至纯后，筛选出沙雷氏菌属内生菌；
[0048] e、内生菌悬液的制备：将沙雷氏菌属内生菌接种培养为种子液，种子液再接种至发酵培养基中培养，得到沙雷氏菌属的内生菌悬液。
[0049] (2)重金属污染土壤的修复：
[0050] a、接种沙雷氏菌属内生菌：将经步骤(1)所得沙雷氏菌属内生菌接种到龙葵上，使龙葵幼苗根部浸入含沙雷氏菌属的内生菌悬液中，培养1天，得接种内生菌的龙葵，菌悬液浓度为1×108CFU/mL；
[0051] b、施加土壤调理剂：在重金属污染土壤表面施加土壤调理剂，厚度为20cm，土壤调理剂的用量为土壤质量的8％，然后喷雾洒水，用水的质量为土壤调理剂质量的70％，翻耕均匀，所述土壤调理剂原料按质量份数计，包括：发酵粪便55份、玉米秸秆粉25份、赤泥23份、石灰粉29份、硅钙钾肥15份；
[0052] c、种植：在重金属污染土壤中种植接种内生菌的龙葵，于4月份种植，每株相隔40cm，13株/cm2，移栽完要给龙葵苗浇水，成活之后施加尿素以促苗；
[0053] d、刈割：对龙葵进行轻度刈割，留茬30cm，每年可对地上部进行3次刈割，以实现高效连续修复。
[0054] 实施例3：
[0055] (1)内生菌的制备：
[0056] a、植株预处理：将采集好的新鲜龙葵用清水冲净并将其根、茎、叶切成2cm的小段；
[0057] b、表面消毒：将预处理后的根、茎、叶小段在70％乙醇中浸泡3min，再用2％次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水多次冲洗，取最后一次洗液涂布平板上进行恒温培养作为表面消毒的对照，若对照平板无微生物长出，表明消毒彻底，后续步骤所分离获得的均为龙葵内生菌；
[0058] c、内生菌的分离与浸出：经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下，于10mL含重量体积分数为1％的纤维素酶和0.25％的Tween80的灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥形瓶中于150rpm、30℃条件下保持1h，得到内生菌浸出液；
[0059] d、内生菌的分离纯化：在无菌条件下将内生菌浸出液作梯度稀
[0060] 释，分别取原液、10倍、100倍稀释液100mL涂布于TBS琼脂平板，30℃恒温培养，然后挑取不同形态的菌落，其中细菌至TSB固体培养基，真菌至察氏培养基中，划线培养至纯后，筛选出沙雷氏菌属内生菌；
[0061] e、内生菌悬液的制备：将沙雷氏菌属内生菌接种培养为种子液，种子液再接种至发酵培养基中培养，得到沙雷氏菌属的内生菌悬液。
[0062] (2)重金属污染土壤的修复：
[0063] a、接种沙雷氏菌属内生菌：将经步骤(1)所得沙雷氏菌属内生菌接种到龙葵上，使龙葵幼苗根部浸入含沙雷氏菌属的内生菌悬液中，培养1天，得接种内生菌的龙葵，菌悬液9
浓度为1×10CFU/mL；
[0064] b、施加土壤调理剂：在重金属污染土壤表面施加土壤调理剂，厚度为25cm，土壤调理剂的用量为土壤质量的10％，然后喷雾洒水，用水的质量为土壤调理剂质量的80％，翻耕均匀，所述土壤调理剂原料按质量份数计，包括：发酵粪便60份、玉米秸秆粉26份、赤泥25份、石灰粉30份、硅钙钾肥16份；
[0065] c、种植：在重金属污染土壤中种植接种内生菌的龙葵，于4月份种植，每株相隔50cm，15株/cm2，移栽完要给龙葵苗浇水，成活之后施加尿素以促苗；
[0066] d、刈割：对龙葵进行轻度刈割，留茬30cm，每年可对地上部进行3次刈割，以实现高效连续修复；
[0067] 对比例1：
[0068] 一种有效的用于重金属土壤污染的修复方法，包括以下步骤：
[0069] (1)重金属污染土壤的修复：
[0070] a、施加土壤调理剂：在重金属污染土壤表面施加土壤调理剂，厚度为15cm，土壤调理剂的用量为土壤质量的6％，然后喷雾洒水，用水的质量为土壤调理剂质量的60％，翻耕均匀，所述土壤调理剂原料按质量份数计，包括：发酵粪便50份、玉米秸秆粉24份、赤泥20份、石灰粉28份、硅钙钾肥14份；
[0071] c、种植：在重金属污染土壤中种植未接种内生菌的龙葵，于4月份种植，每株相隔30cm，10株/cm2，栽完要给龙葵苗浇水，成活之后施加尿素以促苗；
[0072] d、刈割：对龙葵进行轻度刈割，留茬30cm，每年可对地上部进行3次刈割，以实现高效连续修复。
[0073] 根据国家环境质量标准GB15618-2008土壤pH在6.5-7.5的情况下，农业用地重金属Cd、Pb、Cu、Zn的二级标准分别为0.45mg/kg、80mg/kg、100mg/kg、250mg/kg。
[0074] 性能测试：
[0075] 对某重金属复合污染土壤的修复
[0076] (1)试验材料：采集被重金属污染的土地，该重金属污染土地的基本理化性质如下：
[0077] 土壤pH为5.32，重金属有效态含量：Cd 1.8mg/kg、Pb 128.9mg/kg、Cu 167.23mg/kg、Zn 276.6mg/kg。
[0078] (2)试验方法：将土地分为12
块试验地，随机分为3组，每组4块试验地。第1-3组中的试验地分别按照实施例1-3和对比例1中的方法进行重金属污染土壤的修复，至龙葵成活两年后，测定土壤的pH值，并测定Cd、Pb、Cu、Zn的有效含量。测试结果如表1所示。
[0079] 表1改良后土壤中重金属有效态含量
[0080]
[0081]
[0082] 由表1可知，本发明中实施例1-3中的方法修复重金属污染土壤效果优异，可见本发明通过将制备得到的内生菌接种于龙葵上，增强了龙葵对Cd等重金属的吸收能力，极大低提高了重金属土壤污染的修复效率。
[0083] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
