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一种兴安藜芦农杆菌转化方法

阅读：619发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种兴安藜芦农杆菌转化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种兴安藜芦农杆菌转化方法，包括以下操作步骤：收集兴安藜芦种子，消毒后在解刨显微镜下抠出未成熟胚，培养后，得到胚性愈伤组织；用胚性愈伤组织作为侵染的外植体，培养农杆菌菌株，将胚性愈伤组织放入农杆菌菌液中，恒温摇床培养后，把胚性愈伤组织共培养，暗培养后，将愈伤组织用无菌水水洗，用滤纸滤干，暗培养，4周继代一次；重复上述步骤3-4轮后，将植物组织放入含有草丁膦的选择培养基中，光照培养，4-5周后，将得到的幼苗移到锥形瓶中生根培养，1个月后将长势好的苗移栽到温室。本发明克服了现有技术中以茎段或叶柄为外植体的农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，为兴安藜芦遗传转化研究提供了基础。，下面是一种兴安藜芦农杆菌转化方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)愈伤组织诱导
收集兴安藜芦种子，消毒后在解刨显微镜下抠出未成熟胚，放在MS培养基上，暗培养，
3-4周继代一次，3-4个月后胚性愈伤组织转移到愈伤AA培养基中，3-4周继代一次，得到胚性愈伤组织；
(2)转化与植株再生
用胚性愈伤组织作为侵染的外植体，农杆菌菌株用LBA4404，农杆菌Ti双元载体为pCAMBIA3300，pCAMBIA3300包含一个BAR基因，抗性是除草剂抗性，将上述农杆菌菌株培养至菌液的OD值为0.4-0.6时，将胚性愈伤组织放入农杆菌菌液中，恒温摇床培养后，把胚性愈伤组织转移到含有40-60μM的乙酰丁香酮，25-35g/L蔗糖，2-4g/L 植物凝胶的共培养的培养基上共培养，暗培养后，将愈伤组织用无菌水水洗，用滤纸滤干，放入加有3-5mg/l的2,4-D,25-35g/L蔗糖,2-4g/L植物凝胶,240-260mg/L替卡钠,90-110mg/L头孢，15-17mg/L磷百菌素的转化AA培养基中，暗培养，4周继代一次；重复上述步骤3-4轮后，将植物组织放入含有草丁膦的选择培养基中，24-26℃光照培养，4-5周后，将得到的幼苗移到锥形瓶中生根培养，1个月后将长势好的苗移栽到温室。
2.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述兴安藜芦种子消毒处理的方法为：用70％的乙醇水溶液进行表面消毒后，再用加入几滴吐温20的质量分数为1.6％的次氯酸钠水溶液消毒15分钟,灭菌水洗3遍后，消毒完成。
3.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(1)中MS培养基包括146mg/l的谷氨酰胺，200mg/l酪蛋白水解物，质量分数为3％的植物凝胶，
8mg/l毒莠定。
4.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(1)中愈伤AA培养基包括4mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸，质量分数为0.3％的植物凝胶。
5.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(2)中农杆菌菌株培养的方法为：将农杆菌菌株在含100mg/L卡那霉素，50mg/L利福平，50mg/L 链霉素的LB固体培养基上28℃培养2-3天，菌液用含有50μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬。
6.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述暗培养的温度均为25℃。
7.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(2)中，恒温摇床培养的温度为24-26℃，转速为30转，培养时间为30min。
8.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(2)中，选择培养基包括2-4mg/L 6-苄氨基嘌呤,2-4g/L植物凝胶,7-9mg/L草丁膦。

说明书全文

一种兴安藜芦农杆菌转化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及兴安藜芦农杆菌转化技术领域，具体涉及一种兴安藜芦农杆菌转化方法。

背景技术

[0002] 兴安藜芦也被称为山苞米，在我国传统中药中主要用于治疗中风、痢疾、黄疸、头痛以及慢性疟疾等疾病，主要分布于中国东北的长白山地区。兴安藜芦为藜芦属，多年生草本植物。藜芦属包括45个种，分布在欧洲、亚洲和北美的北极地区。藜芦甾体生物碱具有广泛药用价值。

[0003] 在20世纪中期，怀孕早期的绵羊食用了加州山藜芦，很高比例的羊生下了畸形羊羔，畸形有独眼到轻度变形的上颌骨等，主要分布于美国西北部的高海拔地区。畸形主要由固醇类生物碱环杷明和蒜藜芦碱引起的。最新研究表明该化合物能选择性阻断Shh 信号通路，其在人胚胎发生和组织分化中起关键作用。

[0004] Shh信号通路中的许多基因与某些人类肿瘤有关。环杷明及其衍生物能够有效阻断Shh信号传导途径，包括胰腺癌，肾细胞癌，基底细胞癌，髓质母细胞瘤，小细胞肺癌等，是有巨大市场潜力的抗癌药物。环杷明及其半合成类似物IPI-926已经用于治疗包括髓母细胞瘤、胰腺癌等多种癌症。

[0005] 目前，该次生代谢物只能从野生藜芦中提取。由于野生资源不足，药用成分含量低且不稳定，因此环杷明价格昂贵，不能满足市场需求。环杷明的化学结构复杂，近年来虽然环杷明和类环杷明半合成研究已取得一定进展，但人工完全合成环杷明仍然难度较大且成本较高。

[0006] 随着现代生物技术的迅速发展，有望利用基因工程生产该化合物。目前藜芦体外培养体系已经建立，并已经鉴定出一些环杷明合成相关基因。然而，目前还尚未建立藜芦高效遗传转化技术体系。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种兴安藜芦农杆菌转化方法，以帮助建立藜芦高效遗传转化技术体系。

[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0009] 一种兴安藜芦农杆菌转化方法，包括以下操作步骤：

[0010] (1)愈伤组织诱导

[0011] 收集兴安藜芦种子，消毒后在解刨显微镜下抠出未成熟胚，放在MS培养基上，暗培养，3-4周继代一次，3-4个月后胚性愈伤组织转移到愈伤AA培养基中，3-4周继代一次，得到胚性愈伤组织；

[0012] (2)转化与植株再生

[0013] 用胚性愈伤组织作为侵染的外植体，农杆菌菌株用LBA4404，农杆菌Ti双元载体为pCAMBIA3300，pCAMBIA3300包含一个BAR基因，抗性是除草剂抗性，将上述农杆菌菌株培养至菌液的OD值为0.4-0.6时，将胚性愈伤组织放入农杆菌菌液中，恒温摇床培养后，把胚性愈伤组织转移到含有40-60μM的乙酰丁香酮，25-35g/L蔗糖，2-4g/L植物凝胶的共培养的培养基上共培养，暗培养后，将愈伤组织用无菌水水洗，用滤纸滤干，放入加有3-5mg/l的2,4-D,25-35g/L蔗糖,2-4g/L植物凝胶,240-260mg/L替卡钠,90-110mg/L头孢，15-17mg/L磷百菌素的转化AA培养基中，暗培养，4周继代一次；

[0014] 重复上述步骤3-4轮后，将植物组织放入含有草丁膦的选择培养基中，24-26℃光照培养，4-5周后，将得到的幼苗移到锥形瓶中生根培养，1个月后将长势好的苗移栽到温室。

[0015] 进一步地，上述兴安藜芦种子消毒处理的方法为：用70％的乙醇水溶液进行表面消毒后，再用加入几滴吐温20的质量分数为1.6％的次氯酸钠水溶液消毒15分钟,灭菌水洗3遍后，消毒完成。

[0016] 进一步地，上述步骤(1)中MS培养基包括146mg/l的谷氨酰胺，200mg/l酪蛋白水解物，质量分数为3％的植物凝胶，8mg/l毒莠定。

[0017] 进一步地，上述步骤(1)中愈伤AA培养基包括4mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸，质量分数为0.3％的植物凝胶。

[0018] 进一步地，上述步骤(2)中农杆菌菌株培养的方法为：将农杆菌菌株在含100mg/L卡那霉素，50mg/L利福平，50mg/L 链霉素的LB固体培养基上28℃培养2-3天，菌液用含有50μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬。

[0019] 进一步地，上述暗培养的温度均为25℃。

[0020] 进一步地，上述步骤(2)中，恒温摇床培养的温度为24-26℃，转速为30转，培养时间为30min。

[0021] 进一步地，上述步骤(2)中，选择培养基包括2-4mg/L 6-苄氨基嘌呤,2-4g/L植物凝胶,7-9mg/L草丁膦。

[0022] 由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

[0023] 本发明提供的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，操作简单，成本低，克服了现有技术中以茎段或叶柄为外植体的农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，为兴安藜芦遗传转化研究提供了基础。

具体实施方式

[0024] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0025] 实施例1

[0026] 一种兴安藜芦农杆菌转化方法，包括以下操作步骤：

[0027] (1)愈伤组织诱导

[0028] 收集兴安藜芦种子，消毒后在解刨显微镜下抠出未成熟胚，放在包括146mg/l的谷氨酰胺、200mg/l酪蛋白水解物、质量分数为3％的植物凝胶、8mg/l毒莠定的MS培养基上，25℃暗培养，3周继代一次，3个月后胚性愈伤组织转移到包括4mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.3％的植物凝胶愈伤AA培养基中，4周继代一次，得到胚性愈伤组织，其中安藜芦种子消毒处理的方法为：用70％的乙醇水溶液进行表面消毒后，再用加入几滴吐温20的质量分数为1.6％的次氯酸钠水溶液消毒15分钟,灭菌水洗3遍后，消毒完成；

[0029] (2)转化与植株再生

[0030] 用胚性愈伤组织作为侵染的外植体，农杆菌菌株用LBA4404，农杆菌Ti双元载体为pCAMBIA3300，pCAMBIA3300包含一个BAR基因，抗性是除草剂抗性，将农杆菌菌株在含100mg/L卡那霉素，50mg/L利福平，50mg/L链霉素的LB固体培养基上28℃培养3天，菌液用含有50μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬，培养至菌液的OD值为0.5时，将胚性愈伤组织放入农杆菌菌液中，25℃、转速为30转恒温摇床培养30min后，把胚性愈伤组织转移到含有50μM的乙酰丁香酮，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶的共培养的培养基上共培养，25℃暗培养后，将愈伤组织用无菌水水洗，用滤纸滤干，放入加有4mg/l的2,4-D,30g/L蔗糖,3g/L植物凝胶,
250mg/L替卡钠,100mg/L头孢，16mg/L磷百菌素的转化AA培养基中，暗培养，4周继代一次；

[0031] 重复上述步骤4轮后，将植物组织放入包括3mg/L 6-苄氨基嘌呤,3g/L植物凝胶,8mg/L草丁膦的选择培养基中，25℃光照培养，4周后，将得到的幼苗移到锥形瓶中生根培养，1个月后将长势好的苗移栽到温室。

[0032] 实施例2

[0033] PCR分析

[0034] 用基因组提取试剂盒提取转基因植株和对照植株叶片的基因组DNA，用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中的质粒，扩增BAR基因，扩增BAR基因的引物序列如下：

[0035] 下游引物：5’-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’

[0036] 上游引物：5’-GCACCATCGTCAACCACTACATCG AG-3’，

[0037] 片段大小为441bp，PCR反应体系是25μl(50ng的基因组DNA，10pg的质粒)，0.5μl的10mM dNTP,2.5μl的10×PCR buffer，1μl引物,0.2μl的5U/μl Taq酶和18.8μl水。PCR程序是94℃、5分钟,94℃、30秒,55℃、45秒,72℃、1分钟，35循环s,72℃、10分钟。

[0038] RT-PCR分析

[0039] 用RNA提取试剂盒提取转基因植株和对照植株叶片中的总RNA，RNA用反转录试剂盒反转为cDNA，用cDNA为模板，用BAR基因引物(5’-GCACCATCGTCAACCACTACATCGAG-3’and downstream 5’-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’)扩增BAR基因，片段大小为441bp。

[0040] 利用CTAB法提取植物叶片总DNA,取30μgDNA用EcoR I限制性酶切,经电泳分离后转移到尼龙膜,然后用地高辛标记的基因片段与之进行杂交。杂交完毕后用1×SSC和0.1％SDS于室温漂洗1次,再用65℃的1×SSC和0.2％SDS洗膜液洗涤2次后晾干,在暗处使杂交膜自显影后获得Southern杂交结果，验证了农杆菌转化了兴安藜芦。

[0041] BAR蛋白检测

[0042] 快速检测BAR基因蛋白表达，把新鲜的转基因植物和非转基因植物的叶片放在1.5ML的离心管中，加入提取液研磨，放入BAR基因检测试纸条，检测到BAR基因蛋白是否表达。

[0043] 以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

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