对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用
阅读：514发布：2020-05-13
专利汇可以提供对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种对-香豆酰高丝 氨 酸内酯在防治 烟草 花叶病毒病中的应用，通过将对-香豆酰高丝氨酸内酯叶面喷施烟草 幼苗 ，对-香豆酰高丝氨酸内酯能够促进烟草抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8的表达，激发烟草 系统获得抗性 ，从而增强烟草的免疫能 力 ，抵抗烟草花叶病毒的侵染，从而达到 预防 烟草花叶病毒病的发生。本发明采用对-香豆酰高丝氨酸内酯防治烟草花叶病毒病，由于对-香豆酰高丝氨酸内酯自身并不会对烟草花叶病毒起作用，不会使病毒等产生抗药性，有别于传统的化学 农药 和 生物 农药防治，不会发生农药残留和农药超标的问题，符合我国农业可持续发展和环境保护的最大需求。，下面是对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用专利的具体信息内容。
1.一种对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用。
2.根据权利要求1所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯防治烟草花叶病毒病的应用方法为：将所述对-香豆酰高丝氨酸内酯作为原药，加入溶剂进行溶解，制得母液，然后用无菌水稀释，得到对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液，将所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗。
3.根据权利要求2所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述溶剂为丙酮或甲醇中的一种。
4.根据权利要求3所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯溶解后得到的母液中对-香豆酰高丝氨酸内酯的摩尔浓度为：40～60mM。
5.根据权利要求4所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为1～
10μM。
6.根据权利要求5所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为4～8μM。
7.根据权利要求6所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为5μM。
8.根据权利要求5～7任一项所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述烟草幼苗为生长4～8周的烟草幼苗。
9.根据权利要求8所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液的叶面喷施量为叶面喷施烟草幼苗至叶面药剂溶液开始下滴。
10.根据权利要求1～6任一项所述的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，其特征在于，
所述对-香豆酰高丝氨酸内酯为由沼泽红假单胞菌产生的群体感应激素。
对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 我国是烟草种植大国，近年来，随着烟草种植面积的扩大，导致烟草花叶病毒病逐年扩展。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus；TMV)是一种单链RNA病毒，属于Tobamovirus群，侵染茄科等超过36科400多种植物，能使这些受感染的叶片看起来斑驳污损。烟草等植株染病后，幼嫩叶片侧脉及支脉组织呈半透明状，即明脉，叶脉两侧叶肉组织渐呈淡绿色。病毒在叶片组织内大量增殖，使部分叶肉细胞增大或增多，出现叶片薄厚不匀，颜色黄绿相间，呈花叶状。后花叶斑驳程度加大，并现大面积深褐色坏死斑，中下部老叶尤甚，发病重的叶片皱缩、畸形、扭曲。烟草花叶病毒病广泛分布于我国各烟区，是烟草主要病毒病害。
[0003] 为了有效地控制植物病毒病蔓延，从根本上进行预防病毒病的发生减少损失，科研工作者采用了各种措施，目前，烟草花叶病毒病的防治主要利用化学农药和转基因烟草方法。化学农药的大量使用使病毒的抗药性日益明显，人们不得不加大药量，这是一种恶性循环，结果造成了高量的农药残留。残留的农药不但会危害烟草使用人员的健康，而且直接影响了我国烟草的出口创汇。同样，虽然转基因技术可以高效的控制病毒病的发生和发展，其生物安全性却引起了国内外专家和政府的高度重视。
[0004] 因此，人们必须找到一种更为安全和有效地抵御植物病毒病的方法，以符合我国农业可持续发展和环境保护的需求。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，以解决传统的化学农药防治和生物农药防治容易产生抗药性、造成农药残留和农药超标的技术问题。
[0006] 根据本发明的一个方面，提供一种对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用。
[0007] 进一步地，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯防治烟草花叶病毒病的应用方法为：将所述对-香豆酰高丝氨酸内酯作为原药，加入溶剂进行溶解，制得母液，然后用无菌水稀释，得到对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液，将所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗。
[0008] 进一步地，所述溶剂为丙酮或甲醇中的一种。
[0009] 进一步地，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯溶解后得到的母液中对-香豆酰高丝氨酸内酯的摩尔浓度为：40～60mM。
[0010] 进一步地，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为1～10μM。
[0011] 进一步地，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为4～8μM。
[0012] 进一步地，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为5μM。
[0013] 进一步地，所述烟草幼苗叶片为生长4～8周的烟草幼苗。
[0014] 进一步地，所述对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液的叶面喷施量为叶面喷施烟草幼苗至叶面药剂溶液开始下滴。
[0016] 本发明具有以下有益效果：
[0017] 本发明的对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用，通过将对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗上，对-香豆酰高丝氨酸内酯能够促进烟草抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8的表达，激发烟草系统获得抗性，从而增强烟草的免疫能力，抵抗烟草花叶病毒的侵染，从而达到预防烟草花叶病毒病的发生。而对-香豆酰高丝氨酸内酯自身并不会对烟草花叶病毒起作用，不会使病毒等产生抗药性，有别于传统的化学农药和生物农药防治，不会发生农药残留和农药超标的问题，符合我国农业可持续发展和环境保护的最大需求。
[0020] 图1是实施例1中采用5μM的对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液处理后以及对照组心叶烟叶片的枯斑情况示意图；
[0021] 图2是实施例2以及对照组本氏烟叶片顶端的TMV-GFP情况结果示意图；
[0022] 图3是实施例3和对照组采用Dot blot检测烟草系统叶片TMV的结果示意图；
[0023] 图4为实施例3和对照组采用qRT-PCR检测烟草系统叶片TMV的结果示意图；
[0024] 图5是qRT-PCR检测的实施例3和对照组的植株抗病相关基因PR1在TMV接毒后的表达量结果示意图；
[0025] 图6是qRT-PCR检测的实施例3和对照组的植株抗病相关基因PR10在TMV接毒后的表达量结果示意图。
[0026] 图7是qRT-PCR检测的实施例3和对照组的植株抗病相关基因WRKY8在TMV接毒后的表达量结果示意图。
具体实施方式
[0027] 以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由下述所限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0028] 本实施例中提供了一种对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用。
[0029] 对-香豆酰高丝氨酸内酯(p-Coumaroyl)-L-homoserine lactone，pC-HSL)，是由沼泽红假单胞菌产生的群体感应激素，是一种新型的酰基高丝氨酸内酯信号分子，具有以下结构式：
[0030]
[0031] 植物在长期的进化过程中能感知微生物群体间的传递信号，即群体感应激素。本发明发现对-香豆酰高丝氨酸内酯作为沼泽红假单胞菌产生的一种群体感应激素，能够促进烟草抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8的表达，激发烟草系统获得抗性，从而增强烟草的免疫能力，抵抗烟草花叶病毒的侵染，因此预先用对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草植株能预防烟草花叶病毒病的发生。而对-香豆酰高丝氨酸内酯自身并不会对烟草花叶病毒起作用，不会使病毒等产生抗药性，有别于传统的化学农药和生物农药防治，符合我国农业可持续发展和环境保护的最大需求。
[0032] 本实施例中，对-香豆酰高丝氨酸内酯防治烟草花叶病毒病的应用方法为：将对-香豆酰高丝氨酸内酯作为原药，加入溶剂进行溶解，制得母液，然后用无菌水稀释，得到对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液，将对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗。优选地，溶剂为丙酮或甲醇中的一种。
[0033] 对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗植株，诱导烟草抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8的表达，因此，需要先将对-香豆酰高丝氨酸内酯制成溶液，然后采用叶面喷施的方式处理烟草植株。对-香豆酰高丝氨酸内酯是一种新型的酰基高丝氨酸内酯信号分子，其不溶于水，先将其加入溶剂中进行溶解，丙酮、甲醇均对对-香豆酰高丝氨酸内酯的溶解度较高，用其作为对-香豆酰高丝氨酸内酯的溶剂溶解，用量少，且无毒，对植物的影响相对较小。
[0034] 本实施例中，对-香豆酰高丝氨酸内酯溶解后得到的母液中对-香豆酰高丝氨酸内酯的摩尔浓度为：40～60mM。以上浓度能够使对-香豆酰高丝氨酸内酯完全溶解，且又不会造成溶剂浪费，尽可能减少溶剂对烟草植物生长的影响，确保烟草的品质。
[0035] 优选地，对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为1～10μM。通过实验验证，发现对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度在1～10μM时，均能使烟草产生抗烟草花叶病毒病的抗性，达到防治烟草花叶病毒病的效果。进一步优选地，对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为4～8μM。更进一步优选地，对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液中，对-香豆酰高丝氨酸内酯的浓度为5μM。上述浓度的对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草，对烟草花叶病毒病的防治效果最佳。
[0036] 本实施例中，烟草幼苗为生长4～8周的烟草幼苗。此阶段幼苗为烟草生长早期，较易被烟草花叶病毒侵染，在这个阶段就进行对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施，激发烟草系统相关抗病基因的表达，能够起到预防烟草花叶病毒病的作用。
[0037] 本实施例中，对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液的叶面喷施量为叶面喷施烟草幼苗至叶面药剂溶液开始下滴。对-香豆酰高丝氨酸内酯对防治烟草花叶病毒病的机理是促进烟草抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8的表达，施用太少，起不到促进抗病基因表达的作用，施用太多则成本过高，上述喷施量可以达到防治烟草花叶病毒病的效果，又不会显著增加防治成本。
[0038] 以下结合具体实施例对对-香豆酰高丝氨酸内酯诱导不同烟草品种抗TMV做进一步说明，以下实施例仅选取了心叶烟和本氏烟两个烟草品种，但可以理解，其他品种的烟草对于烟草花叶病毒病的防治亦适用本方法。
[0039] 对-香豆酰高丝氨酸内酯溶液的配制：称量对-香豆酰高丝氨酸内酯作为原药，然后在该原药中加入分析纯丙酮或甲醇进行溶解，制得40mM母液。
[0040] 将上述母液用无菌水稀释至浓度分别为1μM、4μM、5μM、8μM、10μM，由此配制得对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液。
[0041] 实施例1
[0042] 对-香豆酰高丝氨酸内酯诱导心叶烟抗TMV试验。
[0043] 心叶烟，移栽4～8周后，选长势均匀一致的心叶烟植株叶面喷施上述制备好的不同浓度的对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液，采用无菌水(加入等量丙酮或甲醇)作对照，对照组不加对-香豆酰高丝氨酸内酯，其他条件均相同。对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗至叶面药剂溶液开始下滴；24h后，第三、四片叶接TMV病毒粒子。叶面撒金刚砂，每片叶25μL，TMV浓度为(0.74mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每10株为一个处理，重复三次。72h后统计枯斑数。
[0044] 表1为不同浓度对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液处理心叶烟后，再接TMV，平均枯斑数统计，图1为采用5μM的对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液处理后以及对照组心叶烟叶片的枯斑情况示意图。
[0045] 表1 TMV接心叶烟后平均枯斑数统计
[0046]
[0047]
[0048] 参见表1和图1，对-香豆酰高丝氨酸内酯诱导心叶烟抗TMV试验数据显示，对-香豆酰高丝氨酸内酯处理组植株接毒3d后，心叶烟叶面枯斑数明显低于对照组，说明浓度为1～10μM的对-香豆酰高丝氨酸内酯均对防治烟草花叶病毒病具有作用效果，而4～8μM的对-香豆酰高丝氨酸内酯对防治烟草花叶病毒病具有相对较高的作用效果。
[0049] 实施例2
[0050] 对-香豆酰高丝氨酸内酯在本氏烟中TMV的累积试验。
[0051] 本氏烟移栽4-5周后，选长势均匀一致的本氏烟植株叶面喷施5μM对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液，无菌水(加入等量丙酮或甲醇)为对照，对照组不加对-香豆酰高丝氨酸内酯，其他条件均相同。对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液叶面喷施烟草幼苗至叶面药剂溶液开始下滴；24h后，于第三、四片叶摩擦接种带GFP标记的侵染性克隆TMV病毒粒子。叶面撒金刚砂，每片叶25μL TMV，TMV浓度为(0.74mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每10株为一个处理，重复三次。7d后观察叶顶端GFP情况。
[0052] 图2为实施例2以及对照组本氏烟叶片顶端的TMV-GFP情况结果示意图。
[0053] 参见图2，7d后紫外线下GFP结果显示，与对照组相比，经浓度为5μM的对-香豆酰高丝氨酸内酯处理的顶端系统叶片TMV累积量较低。
[0054] 实施例3
[0055] 对-香豆酰高丝氨酸内酯诱导本氏烟抗TMV试验
[0056] 本氏烟移栽4-5周后，选长势均匀一致的本氏烟植株叶面喷施5μM对-香豆酰高丝氨酸内酯药剂溶液，无菌水(加入等量丙酮或甲醇)为对照，对照组不加对-香豆酰高丝氨酸内酯，其他条件均相同。对-香豆酰高丝氨酸内酯剂溶液叶面喷施烟草幼苗至叶面药剂溶液开始下滴；24h后，于第三、四片接TMV。叶面撒金刚砂，每片叶25μL TMV，TMV浓度为(0.74mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每20株为一个处理，重复三次。TMV接毒的第72h，Dot blot检测系统叶片TMV情况；第48h，72h，96h qRT-PCR检测叶片TMV情况；第0h，12h，24h，48h检测抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8表达情况。图3是实施例3和对照组采用Dot blot检测系统叶片TMV的结果示意图，图4为实施例3和对照组采用qRT-PCR检测系统叶片TMV的结果示意图，图5是qRT-PCR检测的实施例3和对照组的植株抗病相关基因PR1在TMV接毒后的表达量，图6是qRT-PCR检测的实施例3和对照组的植株抗病相关基因PR10在TMV接毒后的表达量，图7是qRT-PCR检测的实施例3和对照组的植株抗病相关基因WRKY8在TMV接毒后的表达量(＊表示在95％的置信水平上具有差异显著性)。
[0057] 参见图3，对-香豆酰高丝氨酸内酯诱导本氏烟抗TMV试验数据显示，对-香豆酰高丝氨酸内酯处理的植物接毒72h后，Dot blot检测系统叶片TMV含量结果显示，TMV含量显著低于对照组；由图4可知，qRT-PCR检测48h，72h，96h系统叶片TMV含量显示，对-香豆酰高丝氨酸内酯处理后植株TMV相对表达量在48h和72h显著低于对照组，由此可以得出对-香豆酰高丝氨酸内酯在TMV侵染初期抑制了烟草花叶病毒的增殖，而在96h时与对照组相差不大，说明对-香豆酰高丝氨酸内酯起效时间约为72h；结合图5，图6和图7可知，经qRT-PCR检测，对-香豆酰高丝氨酸内酯处理后植株抗病相关基因PR1，PR10和WRKY8在TMV接毒24h时表达量显著高于对照组，由此可以得出：对-香豆酰高丝氨酸内酯诱导本氏烟抗TMV，是通过诱导烟草本身抗病相关基因的表达从而在TMV侵染前期抑制烟草花叶病毒的增殖从而延缓发病时间、降低发病率；对-香豆酰高丝氨酸内酯起效时间约为72h，所以在田间操作时可于烟草幼苗期每隔72h(每隔三天)施用一次直到度过整个幼苗期。
[0058] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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