山葡萄组织培养基及山葡萄组织培养方法
阅读：531发布：2024-02-19
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1.一种山葡萄组织培养基，其特征在于，所述培养基为MS基本培养基中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂以及蔗糖，并进一步加入活性炭和/或青霉素钠制成；
其中，6-苄氨基嘌呤在所述培养基中的含量为0.1-2.0mg/L，萘乙酸在所述培养基中的含量为0.001-0.01mg/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述山葡萄组织培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为0.1-2.0mg/L，萘乙酸的含量为0.001-0.01mg/L，琼脂含量为5.0-10.0g/L，蔗糖的含量为20-50g/L，活性炭含量为0.1-2.0g/L，青霉素钠的含量为1-3mg/L。
3.一种山葡萄组织培养的方法，其特征在于，所述组织培养包括如下步骤：
将山葡萄外植体接种于权利要求1或2所述山葡萄组织培养基中进行诱导培养；
将诱导培养后的外植体进行过渡培养；
将过渡培养后的外植体转入1或2所述山葡萄组织培养基中进行增殖培养，并得到山葡萄植株；
其中，所述过渡培养所用培养基为1/2MS基本培养基中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂和蔗糖，并进一步加入活性炭所制成的；
所述过渡培养所述培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为0.1-1.0mg/L，萘乙酸的含量为
0.001-0.005mg/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导培养、过渡培养以及增殖培养是在玻璃培养瓶中进行的。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的温度为21～23℃，培养的环境湿度为30～50％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导培养是在光照条件下进行的，所述光照时数为12-18h/d，光照强度为2000-2500lx；其中，所述诱导培养的时间为20-24d。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述过渡培养的温度为21～23℃，培养的环境湿度为30～50％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过渡培养时间为7-10d。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述增殖培养是在光照条件下进行的；
其中，所述光照时数为12-18h/d，光照强度为2000-2500lx；增殖培养的温度为21～23℃，培养的环境湿度为30～50％。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述增殖培养的时间为40-45d。
山葡萄组织培养基及山葡萄组织培养方法
技术领域
背景技术
[0002] 山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)原产中国东北及朝鲜、前苏联远东地区。山葡萄也是我国东北地区葡萄酒酿造工业的主要原料，所酿制的葡萄酒酒体鲜艳透明，风味独特，因此深受消费者喜爱。同时山葡萄也是葡萄属中最抗寒的一个种，对白腐病、白粉病、炭疽病和黑豆病等也有较强的抵抗能力。因此，它是葡萄抗寒抗逆育种的重要种质资源，具有较高的经济价值。
[0003] 中国农业科学院特产研究所建有国家果树种质左家山葡萄圃，资源圃露地保存中国北方各省、区及俄罗斯远东地区山葡萄种质资源400余份，是当前世界上保存山葡萄种质资源份数最多、面积最大的山葡萄种质资源圃。为避免田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭的危险，采用组织培养腋芽成苗(亦简称组培苗)的途径，已成为山葡萄种质资源保存以及优良单株快速繁殖的主要途径，但获得的再生植株均存在不同程度的玻璃化现象，严重时甚至出现图1所示的由于发生玻璃化而折断的山葡萄组织培养幼苗，这会导致幼苗死亡。
[0004] 组培苗玻璃化现象在植物组织培养中普通存在，玻璃化的植株形态畸形，叶片、茎梢常呈半透明水渍状，叶片皱缩、易碎，生理功能异常，分化能力低。玻璃化苗后续培养期间也很难恢复正常生长，在继代培养中仍然形成玻璃化苗。因此，玻璃化现象是亟待解决的组织培养三大难题之一，能否有效控制玻璃化苗问题已成为山葡萄组织培养能否成功的关键所在。同时，目前对如何控制山葡萄组培苗玻璃化的问题也鲜见报道。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0006] 山葡萄组织培养主要包括：诱导培养、增殖培养、生根培养和无菌苗移栽四个过程。玻璃化现象主要发生在诱导培养和增殖培养这两个阶段，特别是最初的诱导培养阶段。因此，如何有效地控制诱导培养和增殖培养过程中外植体玻璃化问题，对克服山葡萄组培苗玻璃化现象至关重要。本发明主要通过提供一种山葡萄组织培养基和一种山葡萄组织培养方法，两种综合手段极大克服了山葡萄组培苗玻璃化现象的发生。具体如下：
[0007] 本发明的第一目的在于提供一种山葡萄组织培养基，本发明所述培养基中，通过控制培养基中6-苄氨基嘌呤等外源激素的用量来调节接种外植体内源激素的水平；并通过增加培养基内琼脂、蔗糖等物质的浓度，来降低培养基的水势，这在一定程度上较好地减轻了山葡萄组培苗玻璃化现象的发生，特别是诱导阶段的玻璃化现象。同时，培养基内活性炭的加入可避免因培养基蔗糖浓度的增加而导致的组培苗褐变现象的发生，进而提高山葡萄组织培养的成功率。
[0008] 本发明的第二目的在于提供一种山葡萄组织培养方法，本发明方法中，通过在现有的组织培养幼苗过程中进一步加入过渡培养步骤，并使用本发明所述培养基作为诱导培养基以及增殖培养基，从而通过对培养流程以及所用培养基的优化，有效控制了诱导培养和增殖培养过程中的玻璃化现象。
[0009] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0010] 一种山葡萄组织培养基，所述培养基为MS基本培养基中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂以及蔗糖，并进一步加入活性炭和/或青霉素钠所制成的；其中，6-苄氨基嘌呤在所述培养基中的含量为0.1-2.0mg/L，萘乙酸在所述培养基中的含量为0.001-0.01mg/L。
[0011] 本发明中，通过控制培养基中激素用量，并降低培养基水势及培养容器的相对湿度，进而克服了培养过程中，尤其是诱导培养和增殖培养过程中玻璃化现象的发生。同时，本发明中，通过在培养基内加入活性炭可避免因培养基蔗糖浓度的增加而导致的组培苗褐变现象的发生，进而提高山葡萄组织培养的成功率。可选的，本发明中，所述MS基本培养基中，添加6-苄氨基嘌呤的含量为0.1-2.0mg/L，萘乙酸的含量为0.001-0.01mg/L，琼脂含量为5.0-10.0g/L，蔗糖的含量为20-50g/L，活性炭含量为0.1-2.0g/L，青霉素钠的含量为1-3mg/L。
[0012] 本发明中，通过增加培养基中蔗糖以及琼脂等物质的含量，从而降低了培养基水势，进而克服了培养过程中玻璃化现象的发生，提高了山葡萄组织培养的成功率。
[0013] 可选的，本发明中，所述MS培养基中，添加各组分含量分别为：6-苄氨基嘌呤0.5-1.0mg/L，萘乙酸0.001-0.005mg/L，琼脂7.0-7.5g/L，蔗糖30-35g/L，活性炭0.4-0.8g/L。
[0014] 可选的，本发明中，所述MS培养基中，添加各组分含量分别为：6-苄氨基嘌呤1.0-2.0mg/L，萘乙酸0.005-0.01mg/L，琼脂7.0-7.5g/L，蔗糖28-32g/L，青霉素钠1-3mg/L。
[0015] 本发明同时还提供了一种山葡萄组织培养的方法，其包括如下步骤：
[0016] 将山葡萄外植体接种于本发明所述山葡萄组织培养基中进行诱导培养；
[0017] 将诱导培养后的外植体进行过渡培养；
[0018] 将过渡培养后的外植体转接到本发明所述的山葡萄组织培养基中进行增殖培养，并得到增殖的山葡萄植株。
[0019] 其中，所述过渡培养所用培养基为1/2MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂和蔗糖，并进一步加入活性炭，6-苄氨基嘌呤在所述过渡培养基中的含量为0.1-1.0mg/L，萘乙酸在所述过渡培养基中的含量为0.001-0.005mg/L。
[0020] 本发明中，通过在现有的组织培养幼苗过程中进一步加入过渡培养步骤，并使用本发明所述培养基作为诱导培养基以及增殖培养基，从而克服了山葡萄组培苗玻璃化的发生。
[0021] 具体的，本发明中，通过控制诱导培养和增殖培养过程中所用培养基中6-苄氨基嘌呤等激素浓度，调节了接种外植体内源激素的水平，从而降低了玻璃化现象的发生；同时，本发明中，通过提高诱导培养和增殖培养所用培养基中蔗糖以及琼脂等物质含量，从而有效的降低了培养基的水势，进而能够有效的控制诱导培养和增殖培养过程中的玻璃化现象。进一步的，本发明中，通过增加过渡培养步骤，并将过渡培养基中MS的大量元素降低至1/2，并逐步提高激素浓度，将激素浓度提高一倍，但不改变激素比例，从而实现了诱导培养和增殖培养过程间培养基激素浓度和有效成分的逐步改变，从而防止由于初期诱导阶段激素浓度过高所导致的诱导出的组培苗易发生玻璃化的现象，因而既有利于进一步的增殖培养，又不易发生玻璃化问题。
[0022] 可选的，本发明中，所述外植体为山葡萄茎尖分生组织、单芽茎段中的一种；优选的，本发明中，所述外植体为山葡萄单芽茎段。
[0023] 可选的，本发明中，所述1/2MS基本培养基为大量元素减半的MS基本培养基。
[0024] 可选的，本发明中，所述过渡培养的培养基为MS基本培养基中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并进一步加入活性炭所制成。进一步的，所述培养基中，各组分含量分别为：6-苄氨基嘌呤0.5-1.0mg/L，萘乙酸0.001-0.005mg/L，琼脂7.0-7.5g/L，蔗糖30-35g/L，活性炭0.4-0.8g/L。
[0025] 可选的，本发明中，所述增殖培养的培养基为MS基本培养基中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并进一步加入青霉素钠所制成。进一步的，所述培养基中，各组分含量分别为：6-苄氨基嘌呤1.0-2.0mg/L，萘乙酸0.005-0.01mg/L，琼脂7.0-7.5g/L，蔗糖28-32g/L，青霉素钠1-3mg/L。
[0026] 可选的，本发明中，所述诱导培养、过渡培养以及增殖培养是在玻璃培养瓶中进行的。
[0027] 本发明中，通过使用玻璃培养瓶进行培养，从而避免了普通的塑料培养瓶在灭菌后，其瓶体内水汽过大，且不易蒸发，从而使得外植体容易发生玻璃化、水渍化，甚至使得外植体腐烂死亡的问题，从而进一步能够减轻山葡萄组织培养所得山葡萄幼苗的玻璃化程度。
[0029] 可选的，本发明中，每次配制好的培养基装入玻璃三角瓶中以后，应先经过高压灭菌，并放置1周左右，待三角瓶内水汽消减后再进行接种培养，每瓶培养基中最多培养不超过3个外植体。
[0030] 可选的，本发明中，所述诱导培养的温度为21～23℃，环境湿度为30～50％。
[0031] 本发明中，通过对诱导培养过程中环境温度以及湿度的控制，从而进一步降低了组织培养幼苗发生玻璃化的可能性。
[0032] 可选的，本发明中，所述诱导培养的时间为20-24d。
[0033] 可选的，本发明中，所述诱导培养是在光照条件下进行的；其中，所述光照时数为12-18h/d，光照强度为2000-2500lx。
[0034] 可选的，本发明中，所述过渡培养的温度为21～23℃，环境湿度为30～50％。
[0035] 可选的，本发明中，所述过渡培养是将过渡培养基转移至培养架的最底端，关掉日光灯，从而使得过渡培养基不接受照光的条件下进行的。
[0036] 可选的，本发明中，所述过渡培养时间为7-10d。
[0037] 可选的，本发明中，所述增殖培养是在光照条件下进行的；其中，所述光照时数为12-18h/d，光照强度为2000-2500lx。
[0038] 可选的，本发明中，所述增殖培养的时间为40-45d。
[0039] 可选的，本发明中，所述增殖培养的温度为21～23℃，环境湿度为30～50％。
[0040] 可选的，本发明方法还可以进一步用于在诱导培养过程后产生玻璃化现象外植体的培养。具体的，可以将已发生玻璃化的诱导培养所得茎尖转移至本发明所述过渡培养基中，并进行本发明方法所述过渡培养；然后，将过渡培养后外植体转移至本发明所述增殖培养基中，并进行本发明所述增殖培养，即可得到正常生长的植株。
[0041] 进一步的，所述产生玻璃化现象外植体可以为普通培养基中经诱导培养得到的外植体；同时，所述外植体为山葡萄茎尖分生组织、单芽茎段中的一种。
[0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0043] (1)本发明所述培养基中，通过控制培养基中激素用量来调节外植体内源激素水平，通过增加培养基内琼脂、蔗糖等物质浓度来降低培养基水势，并且通过控制培养时间与培养温度等方法，降低了诱导培养以及增殖培养过程中发生玻璃化的可能性。
[0044] (2)本发明中，通过在现有的组织培养幼苗过程中进一步加入过渡培养步骤，并使用本发明所述培养基作为诱导培养基以及增殖培养基，从而通过对培养流程以及所用培养基的优化，有效控制了诱导培养和增殖培养过程中的玻璃化现象。同时，本发明中，通过将过渡培养基中MS的大量元素降低至1/2，并逐步提高激素浓度，将激素浓度提高一倍，但不改变激素比例，从而实现了诱导培养和增殖培养过程间培养基激素浓度和有效成分的逐步改变，因而既有利于增殖培养，又不易发生玻璃化问题。
[0045] (3)本发明中，通过使用玻璃培养瓶，从而避免了普通的塑料培养瓶在灭菌后，其瓶体内水汽过大，且不易蒸发水汽所带来的外植体容易玻璃化、水渍化，甚至使得外植体腐烂死亡的问题，从而进一步能够减轻山葡萄组织培养所得山葡萄幼苗的玻璃化程度。
[0047] 图1为由于发生玻璃化而折断的山葡萄组织培养幼苗；
[0048] 图2为正常生长的山葡萄组织培养幼苗；
[0049] 图3为茎尖培养发生玻璃化的山葡萄诱导芽；
[0050] 图4为由玻璃化山葡萄诱导芽长成的正常植株。
具体实施方式
[0051] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0052] 实施例1
[0053] 以山葡萄品种北冰红为试验材料，材料取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃。取山葡萄枝条后在水中进行萌芽培养，剪下长出4～5片叶的1年生新捎，去掉叶片，剪成约2cm长的单芽茎段，然后，将这些单芽茎段放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，于超净工作台上用0.1％升汞表面消毒3min，无菌水冲洗5次后，并按照如下所述步骤进行培养，具体步骤如下：
[0054] (1)诱导培养：将消毒冲洗后的2cm长的山葡萄单芽茎段接种于诱导培养基中，并在培养条件为室温21℃、光照时数16h/d、光照强度2000Lx、室内湿度控制在30％的培养条件下，诱导培养时间20d。
[0055] 其中，所述诱导培养基为MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并添加有活性炭。所述诱导培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为1.0mg/L、萘乙酸的含量为0.005mg/L、琼脂含量为7.0g/L、蔗糖含量为35g/L、活性炭含量为0.5g/L，诱导培养基pH值为5.8。
[0056] (2)过渡培养：将诱导培养中培养得到的萌芽2～3节的单芽茎段转入过渡培养基上，然后将过渡培养基转移至培养架的最底端，关掉日光灯，从而使得过渡培养基不接受照光，并在室温21℃，室内湿度控制在30％的条件下过渡培养7d。
[0057] 其中，所述过渡培养基为1/2MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并添加有活性炭。所述过渡培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为1.0mg/L、萘乙酸的含量为0.005mg/L、琼脂含量为7.0g/L、蔗糖含量为35g/L、活性炭含量为0.5g/L，过渡培养基pH值为5.8。
[0058] (3)增殖培养：将过渡培养所得到的2～3节的单芽茎段，剪掉叶片后，转移至增殖培养基中，并在室温23℃，光照时数16h/d，光照强度2500Lx，室内湿度30％的条件下，增殖培养40d，即得到图2所示正常生长的山葡萄组织培养幼苗。
[0059] 其中，所述增殖培养基为MS基本培养基，溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并添加有青霉素钠。所述增殖培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为2.0mg/L、萘乙酸的含量为0.01mg/L、琼脂含量为7.0g/L、蔗糖含量为30g/L、青霉素钠的含量为2mg/L，增殖培养基pH值为5.8。
[0060] (4)生根培养：选取一簇增殖培养所得到的植株，并转移至生根培养基中，并在室温23℃，光照时数16h/d，光照强度2500Lx，室内湿度50％的条件下，生根培养30d，即得山葡萄幼苗。
[0061] 其中，所述生根培养基为1/2MS基本培养基，其中溶有吲哚丁酸、琼脂、蔗糖，并添加有活性炭。所述生根培养基中，吲哚丁酸的含量为0.01mg/L、琼脂含量为7.0g/L、蔗糖含量为15g/L、活性炭含量为0.2g/L，培养基pH为6.0。
[0062] 以上各阶段培养中，所用培养瓶均为50mL玻璃三角瓶，所述三角瓶内含有约20mL培养基，并用通气好的封口膜进行封口。每次配制好的培养基装入三角瓶中以后，应先经过高压灭菌，并放置1周左右，待三角瓶内水汽消减后再进行接种培养，每瓶培养液中最多培养不超过3个外植体。
[0063] 实施例2
[0064] 以山葡萄品种左优红为试验材料，材料取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃，并按照实施例1所述方法步骤进行山葡萄幼苗培养。
[0065] 其中，该实施例山葡萄幼苗培养过程中，所述诱导培养的条件为，室温23℃、光照时数16h/d、光照强度2500Lx、室内湿度控制在50％的培养，诱导培养的时间为25d。
[0066] 所述诱导培养基中，各组分含量为6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.001mg/L、琼脂含量为7.5g/L、蔗糖含量为30g/L、活性炭含量为0.8g/L，诱导培养基pH值为6.0。
[0067] 该实施例中，其余培养步骤中所用培养基基和培养条件均与实施例1中相同。
[0068] 实施例3
[0069] 以山葡萄品种双红为试验材料，材料取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃，并按照实施例1所述方法步骤进行山葡萄幼苗培养。
[0070] 其中，该实施例山葡萄幼苗培养过程中，所述过渡培养的条件为：将过渡培养基转移至培养架的最底端，关掉日光灯，从而使得过渡培养基不接受照光，并在室温25℃，室内湿度控制在50％的条件下过渡培养10d。
[0071] 所述过渡培养基为1/2MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并添加有活性炭。所述过渡培养基中，各组分含量为：6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.001mg/L、琼脂7.5g/L、蔗糖30g/L、活性炭0.8g/L，过渡培养基pH值为5.8。
[0072] 该实施例中，其余培养步骤中所用培养基和培养条件均与实施例1中相同。
[0073] 实施例4
[0074] 以山葡萄品种双丰为试验材料，材料取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃。并按照实施例1所述方法步骤进行山葡萄幼苗培养。
[0075] 其中，该实施例山葡萄幼苗培养过程中，所述增殖培养的条件为：在室温21℃，光照时数16h/d，光照强度2000Lx，室内湿度50％的条件下，增殖培养45d。
[0076] 其中，所述增殖培养基中添加各组分含量为：6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.005mg/L、琼脂7.5g/L、蔗糖32g/L、青霉素钠的含量为1mg/L，增殖培养基pH值为6.0。
[0077] 该实施例中，其余培养步骤中所用培养基和培养条件均与实施例1中相同。
[0078] 实施例5
[0079] 以山葡萄品种双优为试验材料，材料取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃。并按照实施例1所述方法步骤山葡萄幼苗培养。
[0080] 其中，该实施例山葡萄幼苗培养过程中，所用诱导培养基为MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖，并添加有活性炭。所述诱导培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为1.0mg/L、萘乙酸的含量为0.005mg/L、琼脂含量为7.0g/L、蔗糖含量为35g/L、活性炭含量为0.4g/L，诱导培养基pH值为5.8。
[0081] 该实施例中，其余培养步骤中所用培养基和培养条件均与实施例1中相同。
[0082] 对比例1
[0083] 以山葡萄品种北冰红为试验材料，材料取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃。取山葡萄枝条后在水中进行萌芽培养，剪下长出4～5片叶的1年生新捎，去掉叶片，剪成约2cm长的单芽茎段，然后，将这些单芽茎段放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，于超净工作台上用0.1％升汞表面消毒3min，无菌水冲洗5次后，并按照如下所述步骤进行培养，具体步骤如下：
[0084] (1)诱导培养：将消毒冲洗后的2cm长的山葡萄单芽茎段接种于诱导培养基中，并在培养条件为室温20℃、光照时数10h/d、光照强度2000Lx、室内湿度控制在30％的培养条件下，诱导培养时间20d。
[0085] 其中，所述诱导培养基为MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖。所述诱导培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为2.0mg/L、萘乙酸的含量为0.01mg/L、琼脂含量为5.0g/L、蔗糖含量为30g/L，诱导培养基pH值为5.8。
[0086] (2)增殖培养，将诱导培养所得到的2～3节的单芽茎段，并剪掉叶片后，转移至增殖培养基中，并在培养条件为室温20℃、光照时数16h/d、光照强度2000Lx、室内湿度控制在30％的培养条件下，诱导培养时间40d。
[0087] 其中，所述增殖培养基为MS基本培养基，其中溶有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、琼脂、蔗糖。所述增殖培养基中，6-苄氨基嘌呤的含量为2.0mg/L、萘乙酸的含量为0.01mg/L、琼脂含量为5.0g/L、蔗糖含量为30g/L，增殖培养基pH值为5.8。
[0088] (3)生根培养：选取一簇增殖培养所得到的植株，并转移至生根培养基中，并在室温23℃，光照时数16h/d，光照强度2000Lx，室内湿度50％的条件下，生根培养30d，即得山葡萄幼苗。
[0089] 其中，所述生根培养基为1/2MS基本培养基，其中溶有吲哚丁酸、琼脂、蔗糖。所述生根培养基中，吲哚丁酸的含量为0.01mg/L、琼脂含量为5.0g/L、蔗糖含量为15g/L，培养基pH为6.0。
[0090] 以上各阶段培养中，所用培养瓶均为150mL塑料瓶，所述三角瓶内含有约20mL培养基，并用通气好的带封口膜的塑料瓶盖进行封口，每瓶培养液中最多培养不超过3个外植体。
[0091] 对比例2
[0092] 以山葡萄品种左优红为试验材料，并按照对比例1所述方法步骤培养山葡萄幼苗。
[0093] 对比例3
[0094] 以山葡萄品种双红为试验材料，并按照对比例1所述方法步骤培养山葡萄幼苗。
[0095] 对比例4
[0096] 以山葡萄品种双丰为试验材料，并按照对比例1所述方法步骤培养山葡萄幼苗。
[0097] 对比例5
[0098] 以山葡萄品种双优为试验材料，并按照对比例1所述方法步骤培养山葡萄幼苗。
[0099] 实验例1
[0100] 对实施例1-5以及对比例1-5培养得到的山葡萄幼苗进行观测，并分别对不同实施例或对比例中山葡萄幼苗玻璃化情况进行记录和统计，并分别计算出各组山葡萄幼苗玻璃化率，结果如下表1所示：
[0101] 表1实施例1-5以及对比例1-5山葡萄幼苗玻璃化比例对照
[0102]
[0103]
[0104] 实验例2
[0105] 选取适量如图3所示以茎尖为外植体进行组织培养过程中发生玻璃化的山葡萄诱导芽，然后，将其转移至实施例1所述的过渡培养基中，并按照实施例1所述的步骤以及相应培养基进行过渡培养、增殖培养得到山葡萄植株，并对山葡萄植株玻璃化情况进行记录和统计，并分别计算出各组山葡萄幼苗玻璃化率。经统计和计算，73％的玻璃化的山葡萄诱导芽经过上述过渡培养以及生根培养的步骤后，能够培养得到图4所示由玻璃化山葡萄诱导芽成长的正常植株。
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