技术领域
[0001] 本
发明属于转基因
植物的培育技术领域，具体涉及一种转基因百脉根组培苗的培育方法。
背景技术
[0002]
生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用，它能为粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少环境污染，防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展。豆科植物能够与
土壤中的根瘤菌共生形成根瘤，根瘤可将空气中的氮气固定并提供给植物生长发育。根瘤固氮必须满足两个条件，一是根瘤菌通过根毛进入根表皮细胞形成侵入线(infection threads,IT)，即表皮细胞的遗传途径；二是植物根皮层细胞不断分裂形成膨大的根瘤原基(nidulation primodium,NP)，即皮层细胞的遗传途径。在产生有效根瘤时，植物体中有很多的基因都参与其中，其中就包括
钙调素基因(CaM)。早前有研究表明钙调蛋白可能是IT途径参与重要调节，同时钙调蛋白基因是一个家族基因，即在生物体中存在结构和功能都有相似性的基因。在高等植物体中不同钙调蛋白基因能编码不同蛋白亚型，而且不同植物体中的钙调蛋白数量也不尽相同。早年间，有人已经研究了大豆钙调蛋白家族(SCaMs)在不同胁迫条件下具有不同的生物化学特征及表达模式，表明不同大豆钙调蛋白家族成员有着不同功能。
[0003] 百脉根作为豆科多年生植物，二倍体(2n＝12)，自花
授粉，具有相对紧凑的基因组(470Mb)，
种子产量高，成熟时间短等特点，因此是研究豆科植物根瘤固氮机理的模式植物。但是值得注意的是，至今少有见到钙调素家族蛋白在根瘤菌-豆科植物共生固氮方面的研究报道，如百脉根中钙调素家族蛋白中哪些参与了根瘤菌-豆科植物共生固氮，表达机制如何等鲜有报道。
发明内容
[0004] 针对
现有技术中的上述不足，本发明提供了一种转基因百脉根组培苗的培育方法，通过农杆菌介导，将百脉根钙调蛋白基因转化到百脉根中，然后通过转基因组培实验获得过表达百脉根植株，为钙调素蛋白在根瘤菌-豆科植物共生固氮的影响奠定
基础。
[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 一种转基因百脉根组培苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] (1)用
砂纸轻柔摩擦种子，然后对其进行消毒；
[0008] (2)种子萌发
[0009] 将消毒后的种子放置于浸湿的无菌
滤纸上，置于室温、黑暗条件下，直至百脉根下胚轴长度为1.5-2cm；
[0010] (3)农杆菌转化及培养
[0011] 将百脉根钙调素基因插入质粒中得到重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，然后接种在YEP培养基中，于28℃下培养，然后挑选阳性菌，在选择培养基中划线培养，培养
温度为28℃，培养时间为2-3天；
[0012] (4)共培养
[0013] 将步骤(3)所得菌置于YEP培养基中，制成细胞悬浮液，然后将5-8层滤纸用共培养基浸泡，然后加入细胞悬浮液，将步骤(2)所得
幼苗下胚轴切成0.5-0.6cm长，置于浸泡过细菌的滤纸上，在24℃，黑暗条件下孵育4-5天；
[0014] (5)重生
[0015] 将含有下胚轴外植体的最上层滤纸从共培养基转移至再生培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养3-4天；
[0016] (6)选择培养
[0017] 将含有下胚轴外植体的滤纸从再生培养基中转移到选择培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养，直至可分离的愈伤组织；
[0018] (7)芽诱导和延长
[0019] 从下胚轴外植体中分离愈伤组织并置于含选择剂的芽诱导培养基上，然后置于24℃、光照强度为8000Lx、光照时间为16h/8h day/night条件下孵育愈伤组织，每2周将其转移至新鲜的芽诱导培养基上，培养4周后去除选择剂；当形成肉眼可见的芽时，将含有芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基中进行培养，培养温度为24℃，光照强度为8000Lx，光照时间为16h/8h day/night；
[0020] (8)根诱导和延长
[0021] 当单个芽长到1-2cm时切下，移至含有根诱导培养基的培养皿中，置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养一周，然后转移到根伸长培养基中进行培养，当根系发达后，将根置于培养了2天的根瘤菌菌液中浸泡5min，然后移栽到含有蛭石/砂混合物的栽培基质中进行炼苗，炼苗过程中温度为24℃，光照强度为5000Lx，光照时间为16h/8h day/night。
[0022] 进一步地，步骤(3)中YEP培养基中还含有100μg/ml的Rif、100μg/ml的Kan和100μg/ml的Strep。
[0023] 进一步地，1L共培养基包括：5mM的MES 0.976g、0.1X维生素B5和NAA0.05μg/mL，余量为
水，pH值为5.2。
[0024] 进一步地，步骤(5)中1L再生培养基包括：MS培养基4.75g、
蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％、1X维生素B5、BA 0.5μg/mL、NAA 0.05μg/mL、头孢噻肟300μg/mL，余量为水，pH值为5.7。
[0025] 进一步地，步骤(6)中1L选择培养基包括：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％、1X维生素B5、BA 0.5μg/mL、NAA 0.05μg/mL、头孢噻肟300μg/mL、Kan
100μg/mL，余量为水，pH值为5.7。
[0026] 进一步地，步骤(7)中1L芽诱导培养基包括：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％、1X维生素B5、BA 0.5μg/mL、NAA 0.05μg/mL、头孢噻肟150μg/mL、Kan
100μg/mL，余量为水，pH值为5.7。
[0027] 进一步地，步骤(7)中1L芽伸长培养基包括：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％、1X维生素B5、BA 0.2μg/mL、头孢噻肟150μg/mL，余量为水，pH值为5.7。
[0028] 进一步地，步骤(8)中1L根诱导培养基成分为：MS培养基2.375g、蔗糖10g、Agar 0.6％、1/2X维生素B5、NAA 0.5μg/mL，余量为水，pH值为5.7。
[0029] 进一步地，步骤(8)中1L根伸长培养基成分为：MS培养基2.375g、蔗糖10g、Agar 0.6％、1/2X维生素B5，余量为水，pH值为5.7。
[0030] 本发明提供的转基因百脉根组培苗的培育方法，具有以下有益效果：
[0031] (1)本发明成本低，实际操作简单。
[0032] (2)扩增系数大，少量材料就能得到大量植株，即一颗种子就能取3-4段外植体，每个外植体脱分化可得到大量愈伤组织，一团愈伤组织就能够得到数个芽苗，最后都能诱导成完整的植株。
[0033] (3)培育过程不受时间和空间限制，能够按照人为需要进行培养。
[0034] (4)转化效率高，在短时间内能够成功转化出大量转基因植株。
具体实施方式
[0036] 一种转基因百脉根组培苗的培育方法，包括以下步骤：
[0037] (1)种子预处理
[0038] 由于百脉根种子种皮较厚不透水，可先用砂纸轻柔摩擦种子，将种皮打磨轻薄，有利于种子的快速萌发。
[0039] (2)种子消毒
[0040] 将预处理后的种子浸入体积分数为70％的
乙醇和
质量浓度为1％的SDS的混合溶液中，消毒5min，然后除去乙醇，再用质量浓度为20％的NaClO和质量浓度为0.1％的SDS的混合溶液对种子进行消毒，消毒10min，消毒完毕后，取出种子，在无菌超净
工作台中，用无菌MilliQ水冲洗消毒后的种子15-20次，最后将洗好的种子浸泡于无菌MilliQ水中，室温下过夜。
[0041] (3)种子萌发
[0042] 在灭菌后的培养皿上铺0.5cm厚的无菌滤纸，用无菌MilliQ水浸湿，然后将步骤(2)所得种子放置于浸湿的无菌滤纸上，室温、黑暗条件下使种子发芽5-7天，直至百脉根下胚轴长度为1.5-2cm。
[0043] (4)农杆菌转化及培养
[0044] 将目的基因即百脉根钙调素基因LjCaMs插入pUB-GFP质粒中得到重组质粒，将重组质粒转化LBA4404农杆菌，然后接种在YEP培养基(加入工作浓度为100μg/ml的Rif、100μg/ml的Kan抗生素和100μg/ml的Strep)后，于28℃下培养，然后挑选单个菌落，经PCR检测，挑选出阳性菌；采用无菌牙签挑取阳性农杆菌，然后在选择培养基中划线培养，在28℃下培养3天，以未转化农杆菌作为阴性对照。
[0045] 本发明培养基中所表述
激素和抗生素浓度均为最终浓度。
[0046] (5)共培养
[0047] 准备共培养板：将大于5层无菌滤纸放置在培养皿的中心，并用约8mL共培养培养基浸泡，每个菌种制作5个平板。
[0048] 上述共培养培养基成分为：浓度为5mM的MES 0.976g，然后添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.2，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为0.1X维生素B5(Sigma G5768)和NAA 0.05μg/mL。
[0049] 使用无菌刮刀将步骤(4)中在选择培养基中培养3天的细菌刮到含有约5mLYEP培养基的无菌管中，轻轻
旋涡以使悬浮细胞浸入培养基中，然后将1ml的悬浮细胞均匀地倒入含有共培养培养基的培养皿中。
[0050] 将幼苗下胚轴横向切成2-3片，每个长度约0.5cm，将其直接放在细菌浸泡的滤纸表面，在24℃，黑暗条件下孵育5天，如果培养过程中纸张变干，则要继续添加YEP培养基；每个共培养板中需转移30个下胚轴外植体。
[0051] (6)重生
[0052] 将含有下胚轴外植体的最上层滤纸从共培养基转移至再生培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养4天，此时下胚轴切段会变成绿色。
[0053] 上述再生培养基成分为：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％，添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为
1X维生素B5、BA 0.5μg/mL、NAA 0.05μg/mL、头孢噻肟300μg/mL。
[0054] (7)选择
[0055] 将含有下胚轴外植体的滤纸从再生培养基中转移到选择培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养，直至开始出现绿色愈伤组织(3-4周)，然后每周更换至新鲜的选择培养基中，此选择培养过程的培养时间总共为1-2个月。
[0056] 上述选择培养基成分为：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％，添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为
1X维生素B5、BA 0.5μg/mL、NAA 0.05μg/mL、头孢噻肟300μg/mL、Kan 100μg/mL。
[0057] (8)芽诱导和延长
[0058] 从下胚轴外植体中分离绿色愈伤组织并置于芽诱导培养基上，然后置于24℃、光照强度为8000Lx、光照时间为16h/8h day/night条件下孵育愈伤组织，每2周将其转移至新鲜的芽诱导培养基上，培养4周后去除选择剂Kan。
[0059] 当形成肉眼可见的芽时，将含有芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基中进行培养，培养温度为24℃，光照强度为8000Lx，光照时间为16h/8h day/night。
[0060] 上述芽诱导培养基成分为：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar 0.6％，添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为
1X维生素B5、BA 0.5μg/mL、NAA 0.05μg/mL、头孢噻肟150μg/mL、Kan 100μg/mL。
[0061] 芽伸长培养基成分为：MS培养基4.75g、蔗糖30g、(NH4)2SO4 1.321g、Agar0.6％，添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1X维生素B5、BA 0.2μg/mL、头孢噻肟150μg/mL。
[0062] (9)根诱导和延长
[0063] 当单个芽长到1-2cm时切下，移至含有根诱导培养基的培养皿中，置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养一周，然后转移到根伸长培养基中进行培养，当根系发达后，将根置于培养了2天的根瘤菌NZP2235菌液中浸泡5min，然后移栽到含有蛭石/砂混合物的栽培基质中进行炼苗，炼苗过程中温度为24℃，光照强度为5000Lx，光照时间为16h/8h day/night，再在苗上盖上
盖子，一周后逐步揭开盖子，防止转基因苗因为环境改变过大，导致大量死亡的情况。
[0064] 上述根诱导培养基成分为：MS培养基2.375g、蔗糖10g、Agar 0.6％，添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1/2X维生素B5、NAA
0.5μg/mL。
[0065] 根伸长培养基成分为：MS培养基2.375g、蔗糖10g、Agar 0.6％，添加ddH2O至1L，并调节培养基pH值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1/2X维生素B5。
[0066] 本发明中使用的维生素B5为购买的
试剂母液，其含量为1000X(即1000倍)。
[0067] (10)筛选
[0068] 待上述植物长至5-6片复叶时，剪取部分
叶片，提取其DNA作为模板，截选部分GFP基因设计引物，然后进行PCR反应，若能扩增出长度为743bp的条带，说明转基因成功。
[0069] 筛选过程中设计的引物序列如下：
[0070] 上游引物：5'-GGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTC-3'(SEQ ID NO：1)；
[0071] 下游引物：5'-CGAGGAATTCGATCCCATGGTGAGC-3'(SEQ ID NO：2)。
[0072] PCR反应体系：DNA模板1μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq酶0.25μl、10×buffer 2.5μl、浓度为2.5mM的dNTPs 2.0μl，用去离子水补足至25μl。
[0073] PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃
退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
[0074] 本发明通过选择具有强启动子CaMV 35S Promoter的质粒pUB-GFP，然后向该质粒上分别连接不同的百脉根钙调蛋白基因(LjCaM1,LjCaM2,LjCaM3,LjCaM4，其序列分别见SEQ ID No:3-6)，然后借由农杆菌介导转化百脉根，再通过转基因组培实验获得过表达百脉根植株。本发明提供的培育方法，培育出的转基因植株，其成活率和转化率均较高，成活率高达90％以上，转化率达25％以上，同时培育时间短，从种子到生长成完整的植株仅需要135-150天。将该转基因植株用来进行钙调素蛋白在根瘤菌-豆科植物共生固氮方面的研究，进而丰富钙调素蛋白在植物体中的功能。
