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一种鉴别 银杏幼苗性别的血清学方法

阅读：554发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物学鉴定技术领域，具体揭示了一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，包括制备已知性别的银杏成年植株组织提取液，分别用雌雄株的银杏成年植株组织提取液注射家兔进行免疫程序，提取家兔血液得到血清，然后将血清与相反性别的雌雄株的银杏成年植株组织充分混合，利用混合溶液离心后获得的雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清，在琼脂扩散凝集试验中鉴定得到待检测的银杏幼苗的性别；相比目前的多种鉴定方法，操作难度小，简便易行，且较少使用价格昂贵或毒性大的药品，而且容易量产。，下面是一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：包括以下步骤，
S1制备已知性别的银杏成年植株组织提取液；
S2分别用步骤S1中得到的雌雄株的银杏成年植株组织提取液注射家兔进行免疫程序；
S3检测步骤S2中免疫家兔的抗血清效价为1：64以上时，提取家兔血液，滤除其中的血红蛋白质，得到血清；然后将血清与相反性别的步骤S1中获得的雌雄株的银杏成年植株组织充分混合；再将混合溶液离心，滤除其中的沉淀，则分别获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清；
S4利用步骤S3中获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清，在琼脂扩散凝集试验中鉴定得到待检测的银杏幼苗的性别。
2.根据权利要求1所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：步骤S1包括以下步骤，
S11分别采集已知性别的成年银杏植株组织；
S12在步骤S1中获得的成年银杏植株组织内加入pH值为8.3的Tir-HCl缓冲液和石英砂，然后进行研磨以获得组织提取液；
S13将步骤S12中得到的组织提取液进行离心处理10min，离心机转速为2000rpm，然后取上清液，加入浓度为1%的凡士林继续研磨匀浆，制备成凝胶乳剂。
3.根据权利要求1所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：步骤S2中的家兔免疫程序为，选取两只家兔，分别向体内注射银杏成年植株组织提取液，每只兔子均注射8至10个点，每个点的注射量为0.1至0.2ml；等待4至7天后，再次注射以加强免疫一次。
4.根据权利要求3所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：家兔免疫程序可以进行两次以上的加强免疫注射，以提高抗体效价。
5.根据权利要求1所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：步骤S3包括以下步骤，
S31在家兔免疫程序最后一次注射家兔的一周后，通过耳采方式采集家兔静脉血液
3ml；
S32将耳采得的家兔静脉血液置于5ml离心管内，在37度保温箱中静置9至12h，S33将静置后的家兔静脉进行离心处理10min，离心机转速2000rpm，滤除沉淀，分别获得雌雄株的家兔抗血清；
S34将雄株的银杏组织提取液加入到雌株的家兔抗血清中，或者将雌株的银杏组织提取液加入雄株的家兔抗血清中，振荡充分后进行离心处理10min，离心机转速2000rpm，滤除沉淀，分别获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清。
6.根据权利要求1所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：步骤S3中，采用琼脂扩散凝集沉淀法检测所述雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清的效价。
7.根据权利要求7所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：使用琼脂扩散凝集沉淀法检测抗血清效价前，可以采用倍增法稀释抗血清。
8.根据权利要求1所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：重复步骤S1至S3，可以量产步骤S3中得到的雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清。
9.根据权利要求8所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：量产时采用胸腔放血法采集兔血。
10.根据权利要求1所述一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其特征在于：所述方法可以用于鉴定银杏幼苗性别，也可以用于鉴定银杏成年植株性别。

说明书全文

一种鉴别 银杏幼苗性别的血清学方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学鉴定技术领域，具体为一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法。

背景技术

[0002] 银杏雌雄异株，是一种集食用、药用、材用、保健、观赏、生态防护于一体的多用途特种经济生态树种。在集约化果园中，为了提高白果产量，绝大多数应为雌株，同时也需要少量雄株，以便于授粉受精。而在城市绿化过程中，由于银杏雌株种子成熟落下腐烂后会产生一种特殊的臭味，因此只宜种植雄株，不宜种植雌株。换言之，不同性别的银杏具有不同的用途，需要运用得当。因此银杏幼苗性别的早期鉴定，对农林生产和城市建设都有重要现实意义和生态意义。

[0003] 前人已经对银杏性别鉴别开展多年研究，提出了许多实用便捷的方法，也有的一些理论性探讨，包括染色体核型区别鉴定，抗氧化酶及其同工酶谱鉴别，化学药剂耐性区别鉴定，特异蛋白质鉴定以及基因鉴别等多种方式，均为银杏雌雄鉴别提供了有力依据。但上述鉴定方法普遍操作工序复杂，需要多种价格昂贵或毒性较大的鉴定药品，而且对仪器设备要求高，要有较高专业知识的人操作，普通实验室难以进行，因此上述方法均不宜在集约化种植或城市园林绿化工程等领域推广。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，具备操作难度小，简便易行，推广泛用性高，且成本低廉，造成污染和毒害小等优点，解决了现有的多种鉴定方法普遍操作工序复杂，鉴定药品成本高昂或毒性较大，不利于推广的问题。

[0005] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，包括以下步骤，S1制备已知性别的银杏成年植株组织提取液；
S2分别用步骤S1中得到的雌雄株的银杏成年植株组织提取液注射家兔进行免疫程序；
S3检测步骤S2中免疫家兔的抗血清效价为1：64以上时，提取家兔血液，滤除其中的血红蛋白质，得到血清；然后将血清与相反性别的步骤S1中获得的雌雄株的银杏成年植株组织充分混合；再将混合溶液离心，滤除其中的沉淀，则分别获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清；
S4利用步骤S3中获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清，在琼脂扩散凝集试验中鉴定得到待检测的银杏幼苗的性别。

[0006] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中步骤S1包括以下步骤，S11分别采集已知性别的成年银杏植株组织；S12在步骤S1中获得的成年银杏植株组织内加入pH值为8.3的Tir-HCl缓冲液和石英砂，然后进行研磨以获得组织提取液；
S13将步骤S12中得到的组织提取液进行离心处理10min，离心机转速为2000rpm，然后取上清液，加入浓度为1%的凡士林继续研磨匀浆，制备成凝胶乳剂。

[0007] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中步骤S2中的家兔免疫程序为，选取两只家兔，分别向体内注射银杏成年植株组织提取液，每只兔子均注射8至10个点，每个点的注射量为0.1至0.2ml；等待4至7天后，再次注射以加强免疫一次。

[0008] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中家兔免疫程序可以进行两次以上的加强免疫注射，以提高抗体效价。

[0009] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中步骤S3包括以下步骤，S31在家兔免疫程序最后一次注射家兔的一周后，通过耳采方式采集家兔静脉血液3ml；
S32将耳采得的家兔静脉血液置于5ml离心管内，在37度保温箱中静置9至12h，S33将静置后的家兔静脉进行离心处理10min，离心机转速2000rpm，滤除沉淀，分别获得雌雄株的家兔抗血清；
S34将雄株的银杏组织提取液加入到雌株的家兔抗血清中，或者将雌株的银杏组织提取液加入雄株的家兔抗血清中，振荡充分后进行离心处理10min，离心机转速2000rpm，滤除沉淀，分别获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清。

[0010] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中步骤S3中，采用琼脂扩散凝集沉淀法检测雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清的效价。

[0011] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中使用琼脂扩散凝集沉淀法检测抗血清效价前，可以采用倍增法稀释抗血清。

[0012] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中重复步骤S1至S3，可以量产步骤S3中得到的雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清。

[0013] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中量产时采用胸腔放血法采集兔血。

[0014] 本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，其中方法可以用于鉴定银杏幼苗性别，也可以用于鉴定银杏成年植株性别。

[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本方案通过已知性别的银杏植株组织的提取液来免疫家兔后，使用不同性别银杏组织提取液与性别相反的银杏组织免疫的家兔的抗血清混合并滤除杂质，以获得特异性抗血清，再利用这种特异性抗血清，在琼脂扩散凝集试验中根据琼脂凝胶上有无扩散凝集的沉淀，以达到鉴别银杏幼苗的性别的目的，相比于现有的多种鉴定方法，本方案的操作难度小，简便易行，且较少使用价格昂贵或毒性大的药品，而且容易量产。
附图说明

[0016] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为本发明不同性别银杏组织制备所得的抗血清在琼脂凝胶板上与银杏植株组织提取液的相互识别的示意图。

具体实施方式

[0017] 为明确说明起见，许多实务上的细节将在以下叙述中一并说明。然而，应了解到，这些实务上的细节不应用以限制本发明。也就是说，在本发明的部分实施方式中，这些实务上的细节是非必要的。

[0018] 另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，并非特别指称次序或顺位的意思，亦非用以限定本发明，其仅仅是为了区别以相同技术用语描述的组件或操作而已，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

[0019] 请参阅图1，本发明的一种鉴别银杏幼苗性别的血清学方法，包括以下步骤，S1制备已知性别的银杏成年植株组织提取液；S2分别用步骤S1中得到的雌雄株的银杏成年植株组织提取液注射家兔进行免疫程序；
S3检测步骤S2中免疫家兔的抗血清效价为1：64以上时，提取家兔血液，滤除其中的血红蛋白质，得到血清；然后将血清与相反性别的步骤S1中获得的雌雄株的银杏成年植株组织充分混合；再将混合溶液离心，滤除其中的沉淀，则分别获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清；
S4利用步骤S3中获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清，在琼脂扩散凝集试验中鉴定得到待检测的银杏幼苗的性别。

[0020] 进一步的，步骤S1包括以下步骤，S11分别采集已知性别的成年银杏植株组织；
S12在步骤S1中获得的成年银杏植株组织内加入pH值为8.3的Tir-HCl缓冲液和石英砂，然后进行研磨以获得组织提取液；
S13将步骤S12中得到的组织提取液进行离心处理10min，离心机转速为2000rpm，然后取上清液，加入浓度为1%的凡士林继续研磨匀浆，制备成凝胶乳剂。

[0021] 进一步的，步骤S2中的家兔免疫程序为，选取两只家兔，分别向体内注射银杏成年植株组织提取液，每只兔子均注射9个点，每个点的注射量为0.15ml；等待6天后，再次注射以加强免疫一次。

[0022] 进一步的，家兔免疫程序可以进行两次以上的加强免疫注射，以提高抗体效价。

[0023] 进一步的，步骤S3包括以下步骤，S31在家兔免疫程序最后一次注射家兔的一周后，通过耳采方式采集家兔静脉血液
3ml；
S32将耳采得的家兔静脉血液置于5ml离心管内，在37度保温箱中静置11h，
S33将静置后的家兔静脉进行离心处理10min，离心机转速2000rpm，滤除沉淀，分别获得雌雄株的家兔抗血清；
S34将雄株的银杏组织提取液加入到雌株的家兔抗血清中，或者将雌株的银杏组织提取液加入雄株的家兔抗血清中，振荡充分后进行离心处理10min，离心机转速2000rpm，滤除沉淀，分别获得雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清。

[0024] 进一步的，步骤S3中，采用琼脂扩散凝集沉淀法检测雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清的效价。

[0025] 进一步的，使用琼脂扩散凝集沉淀法检测抗血清效价前，可以采用倍增法稀释抗血清。

[0026] 进一步的，重复步骤S1至S3，可以量产步骤S3中得到的雌雄株的特异性银杏性别鉴定抗血清。

[0027] 进一步的，量产时采用胸腔放血法采集兔血。

[0028] 进一步的，方法可以用于鉴定银杏幼苗性别，也可以用于鉴定银杏成年植株性别。

[0029] 本方案的原理是，用已知性别的银杏植株组织，可以是叶片或花芽，的提取液来免疫家兔，以获得抗血清；然后用不同性别银杏组织提取液与性别相反的银杏组织免疫的家兔的抗血清混合，滤除其中的非特异性成份，即可获得特异性抗血清。再利用这种特异性抗血清，在琼脂扩散凝集试验中根据琼脂凝胶上有无扩散凝集的沉淀，以达到鉴别银杏幼苗的性别的目的。该方法操作难度小，简便易行，且较少使用价格昂贵或毒性大的药品，有利于大批量的量产这种特异性抗血清来鉴定银杏植株性别。

[0030] 参阅图1，采用琼脂扩散凝集试验进行鉴定的具体操作为，在一块标准载玻片上，用浓度为1%琼脂溶液乘热铺片；待琼脂溶液冷却凝固后，用直径为0.5cm的空心塑料软管在琼脂上打上一个中心孔和四周六个小孔；再将雌株血清或雄株血清添加至中心孔内，并将多个待鉴定对象的银杏植株叶片汁液分别添加到四周的小孔中；将载玻片放在一个密封的盒内，其下面垫有水饱和的吸水纸，并将盒子置于37度烘箱内静置7至12h。

[0031] 待静置后，观察中心孔和相邻的小孔之间是否有沉淀。如果有，便是性别相同的；反之，性别相反。利用这种特性，可以非常方便的鉴别出待测植株的性别。

[0032] 其中，如图1所示，左边为用雌株叶片制备获得的抗血清，右边为用雄株叶片制备获得的抗血清，中心孔和小孔之间存在的明显黑色直线代表有沉淀反应发生。

[0033] 为了验证本方案的鉴定准确性和操作便捷性，本发明人进行了多次试验，并得到以下案例。

[0034] 案例1：2019年8月23日，从江苏省邳州市铁富镇银杏苗圃地里1至2年生银杏苗叶片为材料，随机选取苗木104株，每株选取长枝中部成熟叶片1张，用冰冻带回实验室。经50mLTris-HCl缓冲液（pH8.3）和石英砂研磨提取后，在2000rpm条件下离心10min，取20ul上清液加入到事先制备的银杏性别鉴定抗血清系统中。

[0035] 结果发现，有49株叶片提取液只与雄株抗血清有凝集沉淀反应，另外的55株只与雌株血清有沉淀反应，说明前面的银杏植株为雄性，后面的植株为雌性。雌雄比例为1：1.12，接近于自然条件下银杏实生苗性别1：1的基本规律。

[0036] 案例2：2019年9月15日，从江苏省丰县赵庄镇银杏苗圃里随机选取248株5至6年银杏植株成熟叶片，采用和案例1相同的试验条件和操作步骤鉴定植株性别。

[0037] 结果发现，有127株叶片提取液只与雄株抗血清有凝集沉淀反应，另外的121株只与雌株血清有沉淀反应，说明前面的银杏植株为雄性，后面的植株为雌性。雌雄比例为1：0.95，接近于自然条件下银杏实生苗性别1：1的基本规律。

[0038] 以上所述仅为本发明的实施方式而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理的内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的权利要求范围之内。

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