一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法
专利汇可以提供一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种提高毕赤 酵母 发酵 脂肪酶酶活 力 及甲醇蛋白产量的制备方法，包括：一级 种子 的培养、二级种子的培养、高 密度 发酵、诱导产酶、酶的提取、酶液 喷雾干燥 、单细胞甲醇蛋白的获得，所述诱导产酶阶段，将高密度发酵阶段的种子培养至溶 氧 反弹后继续饥饿培养2-3h，进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种,在甲醇中按照0.5-2:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，1mL/L/h-6mL/L/h,每小时增加1mL/L/h，控制溶氧在10%-20%。本 发明 能够提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力同时增加甲醇蛋白的产量。，下面是一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，包括：
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其特征在于，所述诱导产酶阶段，将高密度发酵阶段的种子培养至溶氧反弹后继续饥饿培养 2-3h，进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种,在甲醇中按照0.5-2:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。搅拌转速不变，恒速流加含 12 mL/L PTM1 的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，1 mL/L/h-6 mL/L/h,每小时增加1 mL/L/h，控制溶氧在10%-20%。
2.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
一级种子培养阶段：将毕赤酵母接入至一级种子培养基上，在30℃摇床中振荡培养22-
26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子。
3.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
二级种子培养阶段：每升无机盐培养基中加入4mL 的微量元素溶液后，再调整pH值到
5.0，将一级摇瓶种子接种到加入微量元素溶液后的无机盐培养基上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2v/(v×min)，搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h 。
4.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
高密度发酵阶段：
A种子液准备及接种
取-80℃甘油管保存的重组菌株，在YPD固体平板上划线，并置于 30℃恒温培养箱培养
2-3 天至长出单菌落。挑取单菌落接种于含 50mL YPD液体培养基的500 mL 三角摇瓶，置于 30℃ ,220 rpm 培养24h。
高密度补料发酵在含有1200 mL BSM培养基的3-L发酵罐上执行，发酵参数如下：
温度 30℃，pH 5.5，通气量 2.0 vvm和初始转速 200 rpm。
B分批培养及甘油流加
培养 16 h 的150 mL种子液被接入发酵罐培养基中，自动添加氨水将 pH 控制在5.5。
每小时转速为100 rpm至500 rpm。培养16 h后（17-27h），以指数流加方式进行 50% (v/v)甘油（含 12 mL/L PTM1）补料，调整通气量 4.0 vvm和转速 850 rpm。补料速率为前 6 h 分别为 20.25、24.3、28.8、34.2、40.8 和 48.6 mL/h/L，随后4 h的补料速率为 45 mL/h/L。
5.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
诱导产酶阶段：将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养 2-3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，在甲醇中按照1:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。转速不变，恒速流加含 12 mL/L PTM1 的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，1 mL/L/h-6 mL/L/h,每小时增加1 mL/L/h，控制溶氧在10%-20%。
6.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
酶的提取阶段：
a、利用蝶片离心机对诱导产酶阶段收集的发酵液进行分离，蝶片离心机转速
12000rpm，进液量500L/h，分别收集上清液和重相；
b、重相加重相体积1倍的清水，搅拌均匀，再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述a 步骤收集的上清液合并；经截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，收集到酶液储存罐中，投加麦芽糊粉，麦芽糊粉投加量= 脂肪酶浓缩液总酶活/计划固体酶活性；其中，脂肪酶浓缩液总酶活指单位体积脂肪酶浓缩液的酶活性与脂肪酶浓缩液总体积的乘积，计划固体酶活性指准备生产得到的固体酶活性，搅拌均匀，输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用。
7.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
酶液喷雾干燥阶段：调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，喷雾干燥结束后，收集干粉即为脂肪酶。
8.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，
单细胞甲醇蛋白的获得阶段：将b 步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白悬液，加入清水，悬液中菌体湿重为700-750g/L，送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白。
一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备
方法
技术领域
背景技术
发明内容
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
所述诱导产酶阶段，将高密度发酵阶段的种子培养至溶氧反弹后继续饥饿培养 2-3h，进入甲醇-多元醇诱导阶段，在甲醇中按照0.5-2:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。搅拌转速不变，恒速流加含 12 mL/L PTM1 的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，1 mL/L/h-6 mL/L/h,每小时增加1 mL/L/h，控制溶氧在10%-20%。
0.02， MoNa2O4·2H2O 0.2，CoCl2·6H2O 0.92，ZnCl2 20，FeSO4·7H2O 65，生物素 0.2，H2SO4 5.0 mL。
取-80℃甘油管保存的重组菌株，在YPD固体平板上划线，并置于 30℃恒温培养箱培养
2-3 天至长出单菌落。挑取单菌落接种于含 50mL YPD液体培养基的500 mL 三角摇瓶，置于 30℃ ,220 rpm 培养24h。
每小时转速为100 rpm至500 rpm。培养16 h后（17-27h），以指数流加方式进行 50% (v/v)甘油（含 12 mL L–1PTM1）补料，调整通气量 4.0 vvm和转速 850 rpm。补料速率为前 6 h 分别为 20.25、24.3、28.8、34.2、40.8 和48.6 mL/h/L，随后4 h的补料速率为 45 mL/h/L。
12000rpm，进液量500L/h，分别收集上清液和重相；
b、重相加重相体积1倍的清水，搅拌均匀，再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述a 步骤收集的上清液合并；经截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，收集到酶液储存罐中，投加麦芽糊粉，麦芽糊粉投加量= 脂肪酶浓缩液总酶活/计划固体酶活性；其中，脂肪酶浓缩液总酶活指单位体积脂肪酶浓缩液的酶活性与脂肪酶浓缩液总体积的乘积，计划固体酶活性指准备生产得到的固体酶活性，搅拌均匀，输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用。
本发明在诱导产酶的过程中，在补加甲醇时同时加入多元醇MPC，可将菌体量从原先的
300g/L提高至500g/L，提高了67%；将发酵液中的脂肪酶活力从1.5×104U/ml提高至2×
104U/ml，提高了33%。
具体实施方式
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养2h。进入甲醇-多元醇诱导阶段,该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照1:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，2mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在13%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养2h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照1:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，3mL/L/h（每小时增加1mL/L/h），控制溶氧在15%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养2h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照1:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，4mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在17%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照1:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，4mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在19%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照0.5:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，4mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在13%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照0.5:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，4mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在15%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照2:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，4mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在17%。
力从1.5×10U/ml提高至1.55×10U/ml，提高了3%。
一级种子的培养；
二级种子的培养；
高密度发酵；
诱导产酶；
酶的提取；
酶液喷雾干燥；
单细胞甲醇蛋白的获得；
其中本实施例的优选方案为在诱导产酶阶段将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种，在甲醇中按照2:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。发酵液搅拌转速不变，恒速流加含12mL/L PTM1的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，4mL/L/h（每小时增加1 mL/L/h），控制溶氧在19%。
力从1.5×10U/ml提高至1.55×10U/ml，提高了3%。
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