一种油点草组织培养与快速繁殖的方法
阅读：1624发布：2021-01-18
专利汇可以提供一种油点草组织培养与快速繁殖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种油点草组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤1）外植体的消毒：剪取油点草茎段，清洗后消毒，接种到添加 植物 生长调节剂 的MS培养基中；2） 腋芽 的诱导；3)丛生芽的诱导；4）不定芽的增殖和壮苗；5）不定芽的生根培养；6）再生苗的炼苗和移栽。在上述步骤中采用了不同成分和配比的培养基。采用本发明方法，油点草茎段腋芽诱导率达98.7%，丛生芽诱导率达88.3%，不定芽增殖倍数达5.4， 幼苗 生根率为96.6%以上，植株炼苗成活率为97.5%以上，移栽成活率达98%以上，按此方法，每年可以繁殖超过100万株幼苗。，下面是一种油点草组织培养与快速繁殖的方法专利的具体信息内容。
1.一种油点草组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）油点草的消毒
4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒11-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次；
（2）腋芽的诱导
将上一步得到的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.2 g/L，6-BA 4.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照
2
时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(ms)，光源为白色节能灯；
（3）丛生芽的诱导
待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2s)，光源为白色节能灯；
（4）不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，以正常的极性方向接种到添加6-BA 2.0mg/L，IAA 1.0 mg/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2s)，光源为白色节能灯；
（5）再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0.2 mg/L，活性炭 0.5 ~
g/L的50% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为15-20 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2s)；
（6）炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：2-3的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应5 d后统计发现炼苗成活率为97.5%以上，炼好苗后，小心挖出移栽入大田。
一种油点草组织培养与快速繁殖的方法
技术领域
背景技术
[0002] 油点草（Tricyrtis macropoda Miq.），又名粗柄油点草、粗轴油点草，是百合科（Liliaceae）油点草属（Tricyrtis）多年生草本植物，产浙江、江西、福建、安徽、江苏、湖北、湖南、广东、广西和贵州等地。生于山地林下、草丛中或岩石缝隙中。其根或全草入药，名红酸七，也叫白七、牛尾参、水扬罗，其性平，味甘，具补肺止咳之功效，主治肺虚咳嗽；其花被片绿白色或白色，内面具多数紫红色斑点，具有良好的观赏价值，有待于商业化。油点草属植物在全世界约15种，国内有4种，分别为台湾油点草（T. Formosana）、油点草（T. Macropoda）、黄花油点草（T. Maculata）、紫花油点草（T. Stolonifera），目前尚未有该属植物的组织培养快速繁殖的研究报道。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利于实现产业化生产的油点草组织培养与快速繁殖的方法。
[0004] 为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种油点草组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0005] （1）油点草的消毒
[0006] 4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒11-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次，即可得到消完毒的外植体；
[0007] （2）腋芽的诱导
[0008] 将上一步得到的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.1-0.5 g/L，6-BA 1.0-5.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，活性炭的添加量为0-2.0 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(252
±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m·s)，光源为白色节能灯；
±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m·s)，光源为白色节能灯；
[0009] （3）丛生芽的诱导
[0010] 待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
[0011] （4）不定芽的增殖
[0012] 将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到装有添加6-BA 0-6.0mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时
2
间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m·s)，光源为白色节能灯；
2
间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m·s)，光源为白色节能灯；
[0013] （5）再生植株的生根培养
[0014] 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0-1.0 mg/L ，AC ~0.5 g/L的12.5%-100% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为10-50 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；
[0015] （6）炼苗移栽
[0016] 待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：（1-5）的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后可移栽大田中。
[0017] 作为优选方案：用于丛生芽诱导的材料为步骤（1）和（2）获得的无菌萌发的腋芽。
[0018] 作为优选方案：所述步骤（2）中MS基本培养基中添加了6-BA 4.0 mg/L，NAA 0.2 mg/L，活性炭0.5 mg/L。
[0019] 作为优选方案：所述步骤（3）中MS基本培养基中添加了TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L。
[0020] 作为优选方案：所述步骤（4）中MS基本培养基中添加了6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L。
[0021] 作为优选方案：所述步骤（5）中的生根培养基为50%MS基本培养基，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L。
[0022] 作为优选方案：所述步骤（6）中混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为 1：2-3。
[0023] 与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，能够快速地获得植株，利于产业化生产。采用本发明方法，油点草茎段腋芽诱导率达98.7%，丛生芽诱导率达88.3%，不定芽增殖倍数达5.32，幼苗生根率为96.6%以上，幼苗炼苗成活率达97.5%以上，植株移栽成活率达98%以上，按此方法，在一年内可繁殖出幼苗超过100万株。
具体实施方式
[0024] 实施例1
[0025] 本实施例提供一种组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0026] （1）油点草的消毒
[0027] 4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒11-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次。经此步骤消毒的外植体，接种培养基20 d后统计发现，其污染率3.3%，成活率在92.5%；
[0028] （2）腋芽的诱导
[0029] 将上一步得到的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.2 g/L，6-BA 4.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，活性炭（AC）的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；最早培养5 d后腋芽出现明显的萌动，平均出现萌动的时间为8.2 d；30 d统计腋芽的萌发率达
98.7%；
98.7%；
[0030] （3）丛生芽的诱导
[0031] 待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；在培养9 d时节间膨大起来，14 d开始出现丛生芽，30 d统计丛生芽诱导率为88.3%；
[0032] （4）不定芽的增殖
[0033] 将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，以正常的极性方向接种到装有添加6-BA 2.0mg/L，IAA 1.0 mg/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；30 d统计不定芽的增殖倍数为5.4，不定芽的生长正常，叶色浓绿；
[0034] （5）再生植株的生根培养
[0035] 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0.2 mg/L，AC 0.5 ~g/L的50% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为15-20 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；生根最早在培养8-9 d后出现，30 d统计后发现平均出根时间为10.5 d以下，生根率为96.6%以上；
[0036] （6）炼苗移栽
[0037] 待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：2-3的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应5 d后统计发现炼苗成活率为97.5%以上，炼好苗后，小心挖出移栽入大田，按常规管理，移栽成活率可达98%以上。
[0038] 文中涉及的缩略词：
[0039] 6-BA 6-苄氨基腺嘌呤
[0040] AC 活性炭
[0041] IAA 吲哚乙酸
[0042] NAA 萘乙酸
[0043] TDZ 噻苯隆(脱叶脲)
[0044] MS Murashige和Skoog（1962）
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例与实施例1的区别在于步骤（2）腋芽的诱导：以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.1-0.6 mg/L，6-BA 1.0-6.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，AC添加量为0-2.0 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；30 d后统计发现，腋芽诱导率在0-98.7%之间，腋芽出芽平均时间为7.9-14.6 d之间，其中以NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 0.5 g/L效果最佳，腋芽诱导率为98.7%，腋芽出芽平均时间为8.2 d。结果还表明随着6-BA浓度提高，腋芽诱导率增加，随着NAA浓度增加，腋芽生长速度加快。腋芽在萌发过程中可看到外植体周围的培养基产生褐色，而AC可去除褐化物质，但过多的AC却吸附过多营养，易导致生长的减缓。
[0047] 表1 不同处理对腋芽诱导率和腋芽出芽平均时间的影响
[0048]处理 腋芽诱导率(%) 腋芽出芽平均时间(d) 腋芽生长长势
NAA 0.1 mg/L，6-BA 1.0 mg/L 72.8 12.6 出芽慢，生长慢，培养基有少量褐化NAA 0.1 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 79.3 11.5 出芽尚可，生长较慢，培养基有少量褐化NAA 0.1 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 87.9 10.6 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化NAA 0.1 mg/L，6-BA 6.0 mg/L 84.4 10.2 生长较慢，叶稍有水渍化，培养基有褐化NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 87.8 9.9 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化NAA 0.4 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 88.2 9.7 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化NAA 0.6 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 83.8 10.1 出芽尚可，生长较慢，培养基大量褐化NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 0.5 g/L 98.7 8.2 出芽快，生长快
NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 1.0 g/L 97.8 8.5 出芽快，生长较快
NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 2.0 g/L 98.1 9.5 出芽慢，生长慢
NAA 0.1 mg/L，6-BA 1.0 mg/L 72.8 12.6 出芽慢，生长慢，培养基有少量褐化NAA 0.1 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 79.3 11.5 出芽尚可，生长较慢，培养基有少量褐化NAA 0.1 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 87.9 10.6 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化NAA 0.1 mg/L，6-BA 6.0 mg/L 84.4 10.2 生长较慢，叶稍有水渍化，培养基有褐化NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 87.8 9.9 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化NAA 0.4 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 88.2 9.7 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化NAA 0.6 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 83.8 10.1 出芽尚可，生长较慢，培养基大量褐化NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 0.5 g/L 98.7 8.2 出芽快，生长快
NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 1.0 g/L 97.8 8.5 出芽快，生长较快
NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 2.0 g/L 98.1 9.5 出芽慢，生长慢
[0049] 实施例3
[0050] 本实施例与实施例1的区别在于步骤（3）丛生芽的诱导：在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-6.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯。30 d后统计发现，不定芽诱导率介于0-92.6%之间，不定芽数为1.0-7.5之间，其中以MS，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L效果最佳，不定芽诱导率在88.3%，不定芽数在6.6，而且不定芽叶色浓绿，生长良好，株高和茎粗适中。结果还表明，6-BA对于丛生芽的诱导效果较弱，TDZ较强，两者组合效果更佳。
[0051] 表2 不同处理对丛生芽诱导的影响
[0052]处理 丛生芽诱导率(%) 不定芽数 生长情况
TDZ 0.5 mg/L 64.5 6.4 不定芽叶色淡绿，生长尚可
TDZ 1.0 mg/L 72.1 6.8 不定芽叶色浓绿，生长良好
TDZ 2.0 mg/L 74.5 6.4 不定芽玻璃化严重，叶片和茎水渍状
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 88.3 6.6 不定芽叶色淡绿，生长良好
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 91.4 6.7 不定芽叶色淡绿，生长尚可，有水渍化倾向TDZ 0.5 mg/L，6-BA 6.0 mg/L 92.6 7.5 不定芽玻璃化严重，叶片和茎水渍状[0053] 实施例4
TDZ 0.5 mg/L 64.5 6.4 不定芽叶色淡绿，生长尚可
TDZ 1.0 mg/L 72.1 6.8 不定芽叶色浓绿，生长良好
TDZ 2.0 mg/L 74.5 6.4 不定芽玻璃化严重，叶片和茎水渍状
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 88.3 6.6 不定芽叶色淡绿，生长良好
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 91.4 6.7 不定芽叶色淡绿，生长尚可，有水渍化倾向TDZ 0.5 mg/L，6-BA 6.0 mg/L 92.6 7.5 不定芽玻璃化严重，叶片和茎水渍状[0053] 实施例4
[0054] 本实施例与实施例1的区别在于步骤（4）丛生芽的增殖：将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到装有添加6-BA 0-6.0mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40
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μmol/(m·s)，光源为白色节能灯。30 d后统计发现，各培养基中不定芽的增殖倍数在1.0-
6.7之间，高的生长素和细胞分裂素均容易产生玻璃化现象，表现最佳的培养基为MS，6-BA
2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L其增殖倍数在5.4，且无玻璃化苗，植株粗壮，且生长较快。
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μmol/(m·s)，光源为白色节能灯。30 d后统计发现，各培养基中不定芽的增殖倍数在1.0-
6.7之间，高的生长素和细胞分裂素均容易产生玻璃化现象，表现最佳的培养基为MS，6-BA
2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L其增殖倍数在5.4，且无玻璃化苗，植株粗壮，且生长较快。
[0055] 表3 不同处理对不定芽增殖的影响
[0056]不同处理 增殖倍数 生长情况
6-BA 2.0 mg/L 5.0 生长较慢
6-BA 4.0 mg/L 6.1 生长较慢
6-BA 6.0 mg/L 6.4 生长较慢，叶有水渍化
6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.5 mg/L 5.4 生长较快，茎较粗壮
6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L 5.3 生长快，茎粗壮
6-BA 2.0 mg/L，IAA 3.0 mg/L 5.4 生长快，茎较弱，且有水渍
6-BA 2.0 mg/L 5.0 生长较慢
6-BA 4.0 mg/L 6.1 生长较慢
6-BA 6.0 mg/L 6.4 生长较慢，叶有水渍化
6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.5 mg/L 5.4 生长较快，茎较粗壮
6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L 5.3 生长快，茎粗壮
6-BA 2.0 mg/L，IAA 3.0 mg/L 5.4 生长快，茎较弱，且有水渍
[0057] 实施例5
[0058] 本实施例与实施例1的区别在于步骤（5）再生植株的生根培养：切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0-1.0 mg/L，活性炭0.5 0.5 g/L的12.5%-~100% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为10-50 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基置于121℃下高温高压灭菌20 min；
先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；30 d时统计发现，最早生根时间8-10 d，生根率在62.5-97.2%，说明较易生根，MS基本培养基的浓度对于生根基本无影响，只不过太低的浓度下生根的再生植株生长柔弱；蔗糖浓度对于不定芽的生根影响也不大；最佳的组合为50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L，生根时间早，最早8 d就可以生根，生根率可达96.6%以上，根粗适中，叶绿浓绿，适于炼苗移栽。
先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；30 d时统计发现，最早生根时间8-10 d，生根率在62.5-97.2%，说明较易生根，MS基本培养基的浓度对于生根基本无影响，只不过太低的浓度下生根的再生植株生长柔弱；蔗糖浓度对于不定芽的生根影响也不大；最佳的组合为50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L，生根时间早，最早8 d就可以生根，生根率可达96.6%以上，根粗适中，叶绿浓绿，适于炼苗移栽。
[0059] 表4 不同培养基对生根的影响
[0060]培养基 生根率(%) 最早发根时间（d） 平均生根时间（d） 生长情况
12.5%MS，蔗糖30 g/L 64.2 11 13.2 根细、长，叶色黄
25%MS，蔗糖30 g/L 64.4 11 13.1 根粗和根长适中，叶色较黄
50%MS，蔗糖30 g/L 63.8 11 13.4 根较细长，叶色浓绿
MS，蔗糖30 g/L 62.5 12 13.8 根较细长，叶色浓绿
50%MS，蔗糖20 g/L 64.3 12 13.3 根较细长，叶色浓绿
50%MS，蔗糖50 g/L 64.8 13 13.9 根较细长，叶色逍绿
50%MS，NAA 0.1 mg/L，蔗糖20 g/L 95.7 8 10.7 根粗和根长适中，叶色浓绿
50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖20 g/L 96.6 8 10.4 根粗和根长适中，叶色浓绿
50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15 g/L 96.8 9 10.5 根粗和根长适中，叶色浓绿
50%MS，NAA 0.5 mg/L，蔗糖20 g/L 97.2 8 10.1 根粗、短，叶稍有水渍化
12.5%MS，蔗糖30 g/L 64.2 11 13.2 根细、长，叶色黄
25%MS，蔗糖30 g/L 64.4 11 13.1 根粗和根长适中，叶色较黄
50%MS，蔗糖30 g/L 63.8 11 13.4 根较细长，叶色浓绿
MS，蔗糖30 g/L 62.5 12 13.8 根较细长，叶色浓绿
50%MS，蔗糖20 g/L 64.3 12 13.3 根较细长，叶色浓绿
50%MS，蔗糖50 g/L 64.8 13 13.9 根较细长，叶色逍绿
50%MS，NAA 0.1 mg/L，蔗糖20 g/L 95.7 8 10.7 根粗和根长适中，叶色浓绿
50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖20 g/L 96.6 8 10.4 根粗和根长适中，叶色浓绿
50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15 g/L 96.8 9 10.5 根粗和根长适中，叶色浓绿
50%MS，NAA 0.5 mg/L，蔗糖20 g/L 97.2 8 10.1 根粗、短，叶稍有水渍化
[0061] 实施例6
[0062] 本实施例与实施例1的区别在于步骤（6）炼苗移栽：待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：（1-5）的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用非直射性自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后可移栽大田中。适应5 d后统计发现，随着泥炭的比例提高，幼苗的生长变得健壮，但炼苗成活率却有小幅下降，这主要是因为珍珠岩在培养基中起到保水透气的作用，而泥炭提供幼苗生长所需的营养。综合来看，珍珠岩与泥炭的比例在1：2-3时，炼苗成活率和幼苗生长达到最佳。
[0063] 表5 不同栽培基质对炼苗成活率的影响
[0064]珍珠岩、泥炭重量比 炼苗成活率（%） 生长状况
1：1 98.2 苗稍黄
1：2 97.8 苗生长佳
1：3 97.5 苗生长佳
1：4 92.2 苗生长佳
1：5 85.5 苗生长佳
1：1 98.2 苗稍黄
1：2 97.8 苗生长佳
1：3 97.5 苗生长佳
1：4 92.2 苗生长佳
1：5 85.5 苗生长佳
[0065] 对比实施例1至6可知，实施例1为最优选的实施例，实施例1的每个步骤均采用了实施例2至6所述的最佳培养条件，能够获得最高的植株产量。
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