技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物种质资源的超低温保存方法，，具体地说，涉及菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法。
背景技术
[0002] 菊芋(Helianthus tuberous L.)又名‘洋姜’、‘鬼子姜’，为菊科向日葵属多年生草本植物，因其地上似菊，地下似芋而得名。原产北美洲，在美国、加拿大、墨西哥等国均有广泛分布。17世纪经欧洲传入我国，目前分布在东北三省、内蒙古、北京、河北、河南、湖北、湖南、甘肃、青海、浙江、陕西、新疆、安徽、宁夏、江苏、山东、山西等省市。菊芋具有很强的抗逆性，生态适应性很广。菊芋为
无性繁殖作物，其繁殖能
力很强，地下
块茎繁殖速度可达每年20倍以上。菊芋是一种不可多得的生态经济型植物，喜温暖、耐严寒、耐盐
碱，具有很高的经济价值、药用价值、观赏价值和生态价值。菊芋在工业上应用广泛，利用其块茎转
化成乙醇和
生物燃料等生物
能源，应用于化工、生物制药、航天等领域。菊芋块茎中含有丰富的菊粉，是理想的
功能性食品配料，用作甜味增味剂，营养价值高。菊芋地上部分生物量很大，茎叶可直接用于
家畜的青
饲料，被联合国粮农组织称为“21世纪人畜共用作物”。菊芋可入药，性甘味凉，有清
热解毒之功效，提取的菊糖对血糖具有双向调节的作用，对糖尿病的
治疗具有很好的防治作用。菊芋含有的菊粉及低聚果糖还具有超强增殖人体双歧杆菌的作用。
[0003] 菊芋种质资源目前主要采用非原生境保存中的田间圃位保存和试管苗保存。田间圃位保存时，易受环境的影响而导致种质消失。如地下块茎容易受到病毒的侵害，使病毒大量积累，导致品种退化，产量降低；另外，城市土地开发、环境恶化也严重威胁菊芋种质资源的安全保存。试管苗保存虽然具有占地面积小、不易受
自然灾害和病原菌影响以及人力、财力投入少、便于种质资源交换及运输等优点，但需要经常继代更新，且经过多次继代培养后面临发生退化现象或产生变异等威胁。
[0004] 超低温保存技术是可长期安全保存种质资源的可选择的较佳途径之一，不但节约空间，而且成本低廉。现已开发出多种超低温保存方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同品种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同。迄今为止，国际上尚未建立起具有普适性的超低温保存方法，这也是超低温保存技术实际应用中的主要
瓶颈之一。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明基于小滴
玻璃化法超低温保存技术，提供的一种菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法，包括以下步骤：材料获得、茎尖剥取、
蔗糖预培养、装载液装载、PVS2玻璃化保护液脱
水处理、超低温冷冻保存、解冻洗涤和恢复再生培养步骤。
[0007] 材料获得具体步骤如下：
[0008] 1)将菊芋块茎种植到花盆中，待其生长到35-45cm(优选40cm)，剪下生长健壮的枝条作为外植体，将其剪成2-3.5cm长(优选3cm)的带芽茎段，用水冲洗表面污渍，用10％NaClO溶液表面消毒8～9min(优选8min)，无菌水冲洗3～5次后，将外植体接种到MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂培养基中进行试管苗培养；
[0009] 2)试管苗生长稳定后转入MS+0.1mg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L琼脂培养基中进行试管苗扩繁培养；培养
温度为20±1℃，光照14h/d，光照强度2000～3000lux。
[0010] 茎尖剥取具体方法如下：经试管苗培养，选取生长4～5周的健康植株，在无菌条件下，剪取带顶芽的茎段，去除包裹在外面的大
叶片，然后在
显微镜下剥去小叶片，切取大小2～3mm，带2个叶原基的茎尖。
[0011] 蔗糖预培养具体方法如下：将剥取下来的茎尖放入盛有含0.2～0.4M(优选0.4M)蔗糖的MS液体培养基的小烧杯中，然后将其置于摇床中暗培养1～4d(优选3d)；预培养温度为25℃，摇床转速60rpm/min。
[0012] 装载液装载具体方法如下：将预培养后的离体茎尖置于装载液中于25℃装载20～60min(优选30min)。
[0013] 所述装载液的配方为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。
[0014] PVS2玻璃化保护液脱水处理的具体方法如下：将装载后的茎尖置于PVS2玻璃化保护液中，0℃处理10～40min(优选15min)。
[0015] 所述PVS2玻璃化保护液的配方为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。
[0016] 超低温冷冻保存具体方法如下：将经过PVS2玻璃化保护液脱水处理后的茎尖，放入含有15～25μl(优选20μl)PVS2玻璃化保护液小滴的
铝箔条上，然后将铝箔条直接浸入液氮中，待其与液氮充分
接触后再装入盛满液氮的冷冻管中，拧紧
盖子，投入液氮中进行保存。
[0017] 解冻洗涤具体方法如下：将超低温冷冻保存后的茎尖取出，投入卸载液中进行解冻和洗涤，洗涤2～3次(优选2次)，每10min更换一次卸载液。
[0018] 所述卸载液的配方为：MS+1.2mol/L蔗糖。
[0019] 恢复再生培养具体方法如下：将解冻洗涤后的茎尖转移到盛有恢复再生培养基的培养皿中进行恢复培养，在25℃
培养箱中暗培养3～5d，然后转入正常光照条件下继续培养。
[0020] 所述恢复再生培养基的配方为：MS+0.1mg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L琼脂；所述正常光照条件为：光照强度1500lux，光照时间为16h/d。
[0021] 本发明采用小滴玻璃化法超低温保存技术，植物组织材料经一系列的超低温保存步骤后投入液氮保存，经解冻洗涤后仍能在一定培养条件下再生出新的植株，并保持其遗传
稳定性。它避免了田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭，以及试管苗组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。
[0022] 采用本发明的小滴玻璃化法超低温保存技术，超低温保存后的菊芋试管苗离体茎尖经过化冻处理，恢复培养后直接再生成苗。表明该方法是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存菊芋种质资源的方法，存活率可达90％以上，再生率可达80％以上，再生植株恢复生长良好。
附图说明
[0023] 图1为本发明
实施例1中菊芋离体茎尖超低温保存后形态观察结果；其中，a为离体茎尖；b为存活茎尖；c为再生正常茎尖；d为再生植株。
[0024] 图2为本发明实施例2的预培养液中蔗糖浓度对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。
[0025] 图3为本发明实施例3中预培养时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。
[0026] 图4为本发明实施例4中装载液装载时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。
[0027] 图5为本发明实施例5中PVS2玻璃化保护液处理时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。
具体实施方式
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029] 实施例1菊芋试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存技术及植株再生培养方法
[0030] 实验材料：来自国家种质库试管苗库，种质编号为‘2009331028’。
[0031] 实验方法具体步骤如下：
[0032] 1、材料获得：
[0033] 1)将菊芋块茎种植到花盆中，待生长到40cm左右，剪下生长健壮的枝条作为外植体，将其剪成3cm左右的带芽茎段，
自来水冲洗表面污渍，用10％NaClO溶液表面消毒8min，无菌水冲洗3～5次后，将外植体接种到MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂培养基中进行培养。
[0034] 2)试管苗生长稳定后转入MS+0.1mg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基中进行扩繁培养。培养温度为20±1℃，光照14h/d，光照强度2000～3000lux。
[0035] 2、茎尖剥取：经试管苗培养，选取生长4～5周的健康植株，在无菌条件下，用
剪刀剪取带顶芽的茎段，去除包裹在外面的大叶片，然后在双目显微镜下用剪刀和解剖针剥去小叶片，切取大小2～3mm，带2个叶原基的茎尖。
[0036] 3、蔗糖预培养：将剥离下来的茎尖放入含有0.4M蔗糖的液体MS培养基的小烧杯中，然后将其置于摇床中暗培养3d。预培养温度为25℃，摇床转速60rpm/min。
[0037] 4、装载液装载：将预培养后的离体茎尖置于装载液中于25℃装载30min。其中装载液的配方为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。
[0038] 5、PVS2玻璃化保护液脱水处理：将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃下处理15min。其中PVS2玻璃化保护液的配方为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。
[0039] 6、超低温冷冻保存：将经PVS2玻璃化保护液脱水处理后的茎尖，放入含有20μl新鲜PVS2玻璃化保护液小滴的铝箔条上，然后将铝箔条直接浸入液氮中，待其与液氮充分接触后再装入盛满液氮的冷冻管中，拧紧盖子，投入液氮中进行保存。
[0040] 7、解冻洗涤：将超低温冷冻保存后的茎尖取出，投入卸载液中进行解冻和洗涤，洗涤次数为2次，每10min更换一次卸载液。其中卸载液的配方为：MS+1.2mol/L蔗糖。
[0041] 8、恢复再生培养：将洗涤后的茎尖转移到装有恢复再生培养基的培养皿中进行恢复培养，先在25℃培养箱中暗培养3～5d，然后转入正常光照条件下继续培养。其中恢复再生培养基的配方为：MS+0.1mg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L琼脂。所述正常光照条件：光照强度1500lux，光照时间为16h/d。
[0042] 菊芋离体茎尖超低温保存后形态观察结果见图1。其中，a为离体茎尖；b为存活茎尖；c为再生正常茎尖；d为再生植株。
[0043] 实施例2 预培养液中蔗糖浓度对菊芋离体茎尖超低温保存的影响
[0044] 仅改变预培养液中的蔗糖浓度，其余步骤同实施例1，研究预培养液中蔗糖浓度对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。结果如图2所示。
[0045] 从图2可以看出，蔗糖浓度为0.2mol/L时，存活率和再生率均为50％左右。随着蔗糖浓度的升高，在浓度为0.4mol/L时，存活率和再生率达到最高，分别为93％和83％。而过高的蔗糖浓度会使存活率和再生率降低。当蔗糖浓度为0.5mol/L时，存活率和再生率仅为10％左右。茎尖在蔗糖浓度为0.4mol/L预培养液中预培养，与在0.2mol/L和0.5mol/L蔗糖浓度下预培养相比，差异显著(P<0.05)。试验结果表明，预培养蔗糖浓度过低或过高均会影响超低温保存的效果。
[0046] 实施例3 预培养时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响
[0047] 仅改变预培养时间，其余步骤同实施例1，研究预培养时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。结果如图3所示。
[0048] 从图3可以看出，预培养对提高菊芋离体茎尖超低温保存后存活率和再生率作用显著。随着预培养时间的延长，存活率和再生率呈现先升高后降低的趋势。茎尖不经过预培养，超低温保存后存活率和再生率仅为6％；预培养3d后存活率和再生率达到最大值，分别为93％和83％；预培养4d后，存活率和再生率仅为31％和28％。试验结果表明，预培养时间过短或过长均会影响超低温保存的效果。
[0049] 实施例4 装载液装载时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响
[0050] 仅改变装载液装载时间，其余步骤同实施例1，研究装载液装载时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。结果如图4所示。
[0051] 从图4可以看出，随着装载液装载时间的延长，超低温保存后存活率和再生率呈现先升高后降低的趋势。装载30min，存活率和再生率最高，分别为93％和83％，且差异显著(P<0.05)。装载时间达到30min以上后，存活率和再生率逐渐下降，装载60min后存活率仍为83％，而再生率仅为40％。可见，过长或过短的装载液装载时间都会导致存活率和再生率的降低。
[0052] 实施例5 PVS2玻璃化液处理时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响
[0053] 仅改变PVS2玻璃化液处理时间，其余步骤同实施例1，研究PVS2玻璃化液处理时间对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。结果如图5所示。
[0054] 从图5可以看出，PVS2玻璃化液处理时间过长或过短，均会导致茎尖超低温保存后存活率和再生率降低。其中PVS2玻璃化液处理15min时，存活率和再生率最高，分别为93％和83％。
[0055] 实施例6 恢复培养基对菊芋离体茎尖超低温保存的影响
[0056] 仅改变恢复培养基，其余步骤同实施例1，研究恢复培养基对菊芋离体茎尖超低温保存的影响。结果见表1。
[0057] 表1恢复培养基对菊芋离体茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响
[0058]
[0059] 注：a、b、c表示显著性差异：不同字母表示差异显著。
[0060] 从表1可以看出，恢复培养基A2和A4的存活率较高，分别为93％和84.4％，A2的再生率为83.1％，但A4再生苗为玻璃化苗，其他恢复培养基的存活率均较低。茎尖在除A2以外的其它四种恢复培养基中恢复培养后生长为愈伤组织或玻璃化苗，均无法得到正常的再生植株。
[0061] 若恢复培养基中不添加
激素，茎尖形成愈伤组织，不分化成苗。加入不同激素后又会形成玻璃化苗，只有加入GA3才能形成正常的再生植株。因此，GA3对菊芋茎尖超低温保存后的存活和再生均起到重要作用。
[0062] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明
基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
