RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
阅读：299发布：2020-05-12
专利汇可以提供RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 植物 基因工程技术领域，具体涉及RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明发现玉米RAF49基因正调控植物抗旱性，通过提高RAF49基因的表达量，能够有效提高植物的抗旱性。本发明构建了RAF49过表达转基因玉米植株，该植株在干旱条件下的生长情况明显优于野生型玉米植株， 叶片 萎蔫程度明显降低，且蒸腾速率和气孔导度均明显低于野生型玉米植株，有效减少了植物的 水 分流失，抗旱性显著提高。RAF49的抗旱功能的发现为培育抗旱植物新品种提供了新的基因靶点和资源，为阐明植物干旱逆境 信号 应答的分子机制提供了理论依据。，下面是RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用专利的具体信息内容。
1.RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物抗旱性中的应用。
2.RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物在干旱条件下的生长和/或存活率中的应用。
3.RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物蒸腾速率或气孔导度中的应用。
4.RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在植物抗旱性遗传育种中的应用。
5.RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，通过提高所述植物中所述RAF49蛋白的表达量和/或活性，提高所述植物的抗旱性，或者提高所述植物在干旱条件下的生长和/或存活率。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述RAF49蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
9.一种抗旱玉米的选育方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，提高玉米中RAF49蛋白的表达量和/或活性；
所述RAF49蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转基因为将包含所述RAF49蛋白的编码基因的过表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。
RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
背景技术
[0002] 干旱是影响作物产量和质量的重要非生物胁迫因素，是全球农业生产面临的主要难题之一。水分胁迫会抑制作物营养和生殖生长，导致株高变矮，叶片萎蔫，光合作用减少，有机物积累和结实率下降，籽粒或果实不饱满，使作物产量和品质收到严重影响。玉米是世界三大粮食作物之一，种植区域广泛，起源于湿热的热带地区，不耐干旱。培育抗旱新品种能够有效应对干旱胁迫造成的产量损失，提高水分利用效率。如何利用新技术和新方法，通过对重要基因进行遗传改造，提高玉米抗旱性，最终获得抗逆新品种，是现代基础生物学和农业育种的共同目标之一。通过基因工程手段将重要基因进行过表达和突变，是现代分子育种的一个重要组成部分。在作物中常用方法是将某个或几个参与重要生理过程的基因进行过量表达，或通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术将基因进行突变，获得抗逆新品种。
[0003] 在植物生长发育过程中会遭受各种生物和非生物胁迫，植物为了生存，进化出了一系列完整的胁迫信号感知、传递、应答系统，调节生长发育和适应性。MAPK(mitogen-activated protein kinase)在植物响应多种胁迫中发挥了重要作用，典型的MAPK级联由MAPKKK(MAPK kinase kinase)、MAPKK(MAPK kinase)、MAPK(MAP kinase)所组成，MAPKKK可以磷酸化MAPKK，磷酸化的MAPKK可以磷酸化MAPK，从而将信号向下游传递。植物中的MAPKKK主要分为三类：ZIKs、MEKKs、RAF-like MAPKKKs，模式植物拟南芥中有80个MAPKKK，其中有48个RAF-like MAPKKKs，玉米中有74个MAPKKKs，其中有46个RAF。
发明内容
[0004] 为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供RAF49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
[0005] 本发明通过转基因过表达了玉米中的1000多个基因，获得了5000多个转基因玉米株系，对这些植株进行干旱处理，观察抗旱表型，发现过表达RAF49基因的植株具有优异的抗旱性能。RAF49属于MAPKKK类蛋白激酶，通过转基因过表达提高RAF49基因的表达量，能够显著增强植物的抗旱性。
[0006] 具体地，本发明的技术方案如下：
[0007] 第一方面，本发明提供RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物抗旱性中的应用。
[0008] 第二方面，本发明提供RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物在干旱条件下的生长和/或存活率中的应用。
[0009] 第三方面，本发明提供RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物蒸腾速率或气孔导度中的应用。
[0010] 第四方面，本发明提供RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在植物抗旱性遗传育种中的应用。
[0011] 第五方面，本发明提供RAF49蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
[0012] 优选地，上述应用中，通过提高所述植物中所述RAF49蛋白的表达量和/或活性，提高所述植物的抗旱性，或者提高所述植物在干旱条件下的生长和/或存活率。
[0013] 提高所述植物中所述RAF49蛋白的表达量可通过在所述植物中过表达所述RAF49蛋白的编码基因实现。
[0014] 本发明中，所述RAF49蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
[0015] (1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
[0016] (2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
[0017] (3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。
[0018] 如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为玉米RAF49蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的RAF49蛋白突变体。
[0019] 本发明中，所述RAF49蛋白的编码基因具有如下任一种核苷酸序列：
[0020] (1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0021] (2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；
[0022] (3)在严格条件下可以与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
[0023] 如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为B73型玉米中RAF49基因的序列。在玉米基因组数据库中的编号为GRMZM2G140537。玉米ZmRAF49基因由7186个碱基组成，T01转录本的读码框为自5'端第562位到第6788位碱基。该基因由12个外显子组成，其中编码外显子12个，读码框第1位到第405位碱基，第1219位到第1659位碱基，第2050位到第2668位碱基，第3420位到第3461位碱基，第3552位到第3620位碱基，第4876位到第4955位碱基，第5133位到第5231位碱基，第5310位到第5378位碱基，第5492位到第5541位碱基，第5630位到第5712位碱基，第5882位到第5975位碱基，第6119位到第6227位碱基，其余为其内含子序列。玉米中同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同的蛋白质，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。由于玉米不同自交系的基因型存在自然变异，不同自交系的RAF49基因均在本专利保护范围内。考虑到密码子的简并性，所有编码所述RAF49蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。
[0024] 本发明中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
[0025] 本发明提供含有所述RAF49蛋白的编码基因的克隆载体或各类表达载体。本发明还提供含有所述载体的宿主细胞、含有所述RAF49蛋白的编码基因的转化植物细胞或转基因植物。
[0026] 具体地，所述表达载体可为pBCXUN载体(pBCXUN载体以商业化载体pCAMBIA1300为骨架，将其中的潮霉素抗性基因hpt替换为除草剂抗性基因barM；同时将玉米泛素基因Ubi的启动子通过酶切连接的方式克隆到载体上，驱动下游过表达基因的转录)。
[0027] 第六方面，本发明提供一种抗旱玉米的选育方法，其为：通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，提高玉米中RAF49蛋白的表达量和/或活性；所述RAF49蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
[0028] (1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
[0029] (2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
[0030] (3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。
[0031] 作为优选，所述转基因为将包含所述RAF49蛋白的编码基因的过表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。
[0032] 作为本发明的一种实施方式，所述抗旱玉米的选育方法包括如下步骤：
[0033] (1)提取玉米总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板、如SEQ ID NO.3-4所示序列为引物，扩增RAF49基因，将扩增产物连接至植物表达载体pBCXUN上，得到重组表达载体；
[0034] (2)采用步骤(1)得到的重组表达载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；
[0035] (3)采用步骤(2)得到的重组农杆菌侵染玉米幼胚得到转化苗，采用除草剂筛和PCR鉴定筛选阳性植株；
[0036] 利用上述方法，本发明获得了RAF49过表达的转基因玉米植株，与野生型玉米相比，该植株的抗旱性显著提高。
[0037] 本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于玉米、水稻、小麦、棉花或大豆。优选地，所述单子叶植物为禾本科植物。更优选为玉米。
[0038] 本发明的有益效果在于：本发明发现玉米RAF49基因正调控植物抗旱性，通过提高RAF49基因的表达量，能够有效提高植物的抗旱性。本发明构建了RAF49过表达转基因玉米植株，该植株在干旱条件下的生长情况明显优于野生型玉米植株，叶片萎蔫程度明显降低，且蒸腾速率和气孔导度均明显低于野生型玉米植株(分别降低了19.17％和38.23％)，有助于植物保水和耐旱，抗旱性显著提高。RAF49的抗旱功能的发现为培育抗旱植物新品种提供了新的基因靶点和资源，为阐明植物干旱逆境信号应答的分子机制提供了理论依据。本发明提供的抗旱植物的选育方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短、目的性强等优势，显著缩短了育种周期，提高了育种效率。附图说明
[0039] 图1为本发明实施例2中RAF49过表达玉米株系中的RAF49基因表达量检测；其中，WT代表野生型玉米植株，RAF49OE代表RAF49基因过表达玉米株系。
[0040] 图2为本发明实施例3中RAF49过表达玉米株系在干旱处理后植株生长情况；其中，WT代表野生型玉米植株，RAF49OE代表RAF49基因过表达玉米株系，靠左侧的3盆为野生型玉米植株，靠右侧的3盆为RAF49基因过表达玉米株系。
[0041] 图3为本发明实施例4中RAF49过表达玉米株系的蒸腾速率和气孔导度测定结果；其中，A为蒸腾速率，B为气孔导度；WT代表野生型玉米植株，RAF49OE代表RAF49基因过表达玉米株系。
具体实施方式
[0042] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中使用的野生型玉米为玉米生态型B73；农杆菌菌株是EHA105；使用的主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Taraka公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；
引物合成和测序由英俊公司完成。
引物合成和测序由英俊公司完成。
[0045] 实施例1 RAF49基因过表达载体的构建和检测
[0046] 从玉米(Zea mays L.)中提取总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增RAF49基因，引物带有酶切位点，酶切后连到过表达载体上。具体构建方法如下：
[0048] (2)用Thermo公司的反转录试剂盒将RNA反转录出cDNA，具体步骤参照试剂盒说明书。
[0049] (3)以cDNA为模板，F和R为引物，扩增RAF49基因cDNA，将扩增产物跑电泳切胶回收，回收方法参照天根公司试剂盒。
[0050] RAF49基因扩增所用引物序列如下：
[0051] SEQ ID NO.3：上游引物F：GCTCTAGAGATGGACTCCAGCG GGGAG；
[0052] SEQ ID NO.4：下游引物R：CCATCGATTCTTCCAGCCTTAGC A。
[0053] (4)将回收的RAF49基因cDNA和pBCXUN载体(pBCXUN载体以商业化载体pCAMBIA1300为骨架，将其中的潮霉素抗性基因hpt替换为除草剂抗性基因barM；同时将玉米泛素基因Ubi的启动子通过酶切连接的方式克隆到载体上，驱动下游过表达基因的转录)用Xba I和Cla I双酶切，酶切产物跑电泳切胶回收；回收产物用T4连接酶连接，将RAF49基因连接至pBCXUN载体，以Ubi启动子驱动RAF49基因的表达。
[0054] (5)取5μL步骤(4)的酶切-连接体系的产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆测序。获得的测序正确的重组表达载体命名为pBCXUN-RAF49。菌落PCR和测序通用引物如下：
[0055] SEQ ID NO.5：UbiP-seq:TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC；
[0056] SEQ ID NO.6：NosR-seq:AGACCGGCAACAGGATTCAATC。实施例2RAF49基因过表达植物的构建和检测
[0057] 将实施例1中构建的pBCXUN-RAF49过表达质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆。将鉴定正确的农杆菌单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD600在0.8-1.0之间。采用获得的重组农杆菌菌悬液侵染无菌条件下扒出B73的玉米幼胚后，诱导愈伤成苗。转基因植株经自交繁种后获得T3代进行后续实验。
[0058] 提取转化pBCXUN-RAF49过表达质粒的4个转基因自交系的RNA，反转录出cDNA，定量PCR检测转基因过表达情况，结果证明4个株系均为RAF49基因过表达株系，其中一株转基因自交系的定量PCR检测结果如图1所示，转基因植株中RAF49基因表达量约为未转基因的野生型对照植株的14倍，远高于未转基因的对照植株。
[0059] 实施例3 RAF49基因过表达玉米旱处理表型检测
[0060] 对实施例2构建的RAF49基因过表达玉米株系T3代进行旱处理实验，具体方法如下：
[0061] 在每个小盆中加入140g土，托盘里加上水，每小盆放4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，在25℃温室培养，出苗后将长势不齐的一棵苗去掉，在托盘里加入1L水，吸满后将水倒掉，开始进行旱处理(继续在25℃温室培养，培养过程不再给予水分)，旱处理约一周，观察野生型和转基因植株旱处理下的生长、叶片萎蔫程度等表型。野生型及转基因植株各种3盆，作为生物学重复。结果如图2所示，结果显示，转基因过表达RAF49的植株生长状况明显好于对照，叶片萎蔫程度明显低于对照，说明转基因过表达RAF49的植株比对照抗旱。
[0062] 实施例4 RAF49基因过表达玉米蒸腾速率和气孔导度测量
[0063] 对实施例2构建的RAF49基因过表达玉米株系进行蒸腾速率和气孔导度的测定，具体方法如下：
[0064] 将单株对照和转基因植株分别种在大桶里，生长至7-8也叶期，测量叶片蒸腾速率和气孔导度等指标。测量仪器是LI-COR公司的LI-6400XT，使用方法参照产品使用说明书。结果如图3所示，与对照相比，过表达RAF49玉米植株的蒸腾速率和气孔导度分别降低了
19.17％和38.23％，可见过表达RAF49玉米植株的蒸腾速率和气孔导度显著低于对照，说明过表达RAF49玉米植株通过蒸腾方式的失水比对照明显减慢，这可能是过表达植株抗旱的原因之一。
19.17％和38.23％，可见过表达RAF49玉米植株的蒸腾速率和气孔导度显著低于对照，说明过表达RAF49玉米植株通过蒸腾方式的失水比对照明显减慢，这可能是过表达植株抗旱的原因之一。
[0065] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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