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一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种中的用途

阅读：132发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及水稻品种培育领域，具体而言，涉及一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种中的用途。QTL1：位于水稻12号染色体上，该垩白度高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM3326和RM7018之间；QTL2：位于水稻5号染色体上，该垩白粒率高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM1200和RM5796之间。这两个QTLs位点在不同高温胁迫处理模式以及不同世代群体中其控制的垩白度或垩白粒率高温钝感性表现均很稳定，是极具应用价值的QTLs，可用于稻米垩白性状高温钝感育种及应用基础研究。，下面是一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种中的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种鉴定垩白性状高温钝感水稻植物的方法，其特征在于，包括在所述水稻植物的DNA中检测下述SSR标记中至少一种的存在：
RM3326、RM7018、RM1200、RM5796以及RM1024。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测所述SSR标记存在的方法为PCR扩增或测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增所用上下游引物的核苷酸序列分别为：
RM3326：SEQ ID NO：1和2；
RM7018：SEQ ID NO：3和4；
RM1200：SEQ ID NO：5和6；
RM5796：SEQ ID NO：7和8；
RM1024：SEQ ID NO：9和10。
4.产生被赋予垩白高温钝感水稻植物的方法，其特征在于，包括使水稻植物携带包含垩白度高温钝感QTL1和/或垩白粒率高温钝感QTL2的遗传决定因子，其中：
QTL1：位于水稻12号染色体上，该垩白度高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM3326和RM7018之间；
QTL2：位于水稻5号染色体上，该垩白粒率高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM1200和RM5796之间。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述使水稻植物携带包含QTL1和/或QTL2的遗传决定因子的方法包括下述步骤：
1）. 采用权利要求1 3任一项所述的方法测定第一种水稻植物是否具有垩白度和/或~
垩白粒率高温钝感特性；
2）. 任选地对垩白度和或垩白粒率高温钝感表型进行验证；
3）. 选择包含垩白度和/或垩白粒率高温钝感特性的第一种水稻植物，并将其与第二种水稻植物杂交，以产生包含QTL1和/或QTL2的子代植物；
4）. 任选地使用步骤3）中所述的子代植物作为原材料，重复步骤1）-3）2-10次，以产生其它子代植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二种水稻植物属于农学上优良的品种。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选择包含QTL1和/或QTL2，和农学上优良特征的水稻植物。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述第一种水稻植物和/或第二种水稻植物为亚洲栽培水稻。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一种水稻植物和/或第二种水稻植物为籼稻。
10.由权利要求4～9任一项所述的方法产生的水稻植物用于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的水稻繁殖材料的用途，所述繁殖材料适合于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的，且包含所述QTL1和/或QTL2的水稻植物或其种子；
其中繁殖材料适宜于有性繁殖；适宜于有性繁殖的所述繁殖材料选自小孢子，花粉，子房。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料为胚珠。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料为胚囊。
13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料为卵细胞。
14.由权利要求4～9任一项所述的方法产生的水稻植物用于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的水稻繁殖材料的用途，所述繁殖材料适合于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的，且包含所述QTL1和/或QTL2的水稻植物或其种子；
其中繁殖材料适宜于植物性繁殖；适宜于植物性繁殖的所述繁殖材料选自插枝，根，茎。
15.由权利要求4～9任一项所述的方法产生的水稻植物用于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的水稻繁殖材料的用途，所述繁殖材料适合于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的，且包含所述QTL1和/或QTL2的水稻植物或其种子；
其中繁殖材料适宜于可再生的细胞的组织培养；适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自叶，分生组织细胞，根，花，种子和茎。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述根包括根端。
17.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自花粉和胚。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述胚包括子叶和/或下胚轴。
19.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料为花药。

说明书全文

一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种

中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及水稻品种培育领域，具体而言，涉及一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种中的用途。

背景技术

[0002] 近年来，在全球变暖的大环境中，我国水稻高温热害频繁发生。在高温胁迫条件下，水稻垩白的形成与光合作用及籽粒粒灌浆情况息息相关。李健陵等(2013)研究表明，经高温处理后水稻垩白粒率和垩白度明显增大。抽穗期和乳熟期，温度超过35℃，水稻光合系统受到损害，垩白品质下降，日最高温度为38℃时，水稻垩白增多，品质显著下降。石军等(2011)用不同的籼稻杂交组合在不同的地区种植，结果表明自然高温使稻米垩白粒率增加，垩白面积增大，垩白度增加。李飞等(2013)研究也认为，水稻灌浆结实期遇35℃高温将严重影响稻米品质，高温使巧粒灌浆加快，淀粉粒间空隙增大，稻米垩白增加。谢晓金等(2010)研究显示，在水稻抽穗期，高温胁迫増加稻米的白粒率和垩白度，并且胁迫温度和胁迫时长与稻米品质呈负相关关系。李健陵等(2013)的研究结果表明，在抽穗结实期温度超过38℃会将对水稻的光合作用，同化物运输造成影响，这样在巧粒灌浆时，将导致库源功能不良，水稻籽粒充实不好，淀粉粒间出现空隙，米粒散光形成垩白。灌浆结实期高溫，导致籽粒千粒重増加，但随着胁迫时间延长，籽粒干物质的积累减少，籽粒充实度不良，粒重下降；灌浆结实期高湿胁迫下，水稻籽粒中淀粉含量、可溶性糖含量、薦糖含量和蛋白质含量上升，但随着胁迫时间延长呈现降低趋势。高温条件下，稻米胚乳淀粉粒排列不紧密，淀粉粒间空隙大，多为籽粒淀粉体，导致光线的多角度散射，胚乳透明度降低，垩白形成(廖斌等，
2016)。

[0003] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0004] 本发明涉及一种新颖的与水稻垩白性状高温钝感有关的QTLs位点，并对这些QTLs位点的检测、应用等方面进行研究。

[0005] 这些QTLs位点存在于水稻基因组中，因而能够用于水稻垩白性状高温钝感的相关研究。

[0006] 本发明具体涉及一种产生被赋予垩白性状高温钝感水稻植物的方法，包括使水稻植物携带包含垩白度高温钝感QTL1和/或垩白粒率高温钝感QTL2的遗传决定因子，其中：

[0007] ·QTL1：位于水稻12号染色体上，垩白度高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM3326和RM7018之间；

[0008] ·QTL2：位于水稻5号染色体上，垩白粒率高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM1200和RM5796之间。

[0009] 其中QTL1与SSR标记RM3326和RM7018连锁；

[0010] QTL2与SSR标记RM1200、RM5796和RM1024连锁；

[0011] 因而可以通过检测上述五个SSR标记中的至少一种来指示QTL1和/或QTL2的存在，进而鉴定垩白度高温钝感水稻植物。

[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0013] 1.发明人利用位于水稻12号染色体和5号染色体上，源于非洲栽培稻的渗入片段上6-9对栽培稻种间多态SSR标记加密图谱，完成垩白性状高温钝感QTLs筛选鉴定工作。

[0014] 结果显示，在BC6F2，BC6F3和BC6F4分离群体中：

[0015] QTL分析发现在水稻12号染色体上检测到一个垩白度高温钝感性主效位点qHTCD12(QTL1的主效位点)，标记区间为SSR/RM3326-SSR/RM7018，解释的表型变异率为24.5％-33.2％。有2个SSR记SSR/RM3326和SSR/RM7018与之紧密连锁(图1)；

[0016] 在水稻5号染色体上检测到一个垩白粒率高温钝感性主效位点qHTCGR5(QTL2的主效位点)，标记区间为SSR/RM1200-SSR/RM5796，解释的表型变异率为11.3％-17.5％。有3个SSR记SSR/RM1200，SSR/RM5796，和SSR/RM1024与之紧密连锁(图2)。

[0017] 2.在不同高温胁迫处理模式以及不同世代群体中的研究表明，qHTCD12和qHTCGR5在不同高温胁迫处理模式以及不同世代群体其各自控制的垩白度和垩白粒率高温钝感性表现均很稳定，是极具应用价值的QTLs。为提高我国籼型水稻品种的垩白性状高温钝感水平奠定了基础。

[0018] 3.本发明不但有助于解决我国籼型水稻垩白性状高温钝感性育种进展迟缓的问题，而且有助于克服现有育种技术对垩白性状高温钝感性存在鉴定成本高、时间长、稳定性低等特点；利用本发明垩白性状高温钝感性QTL主效位点及其分子标记可以提高籼型水稻垩白性状高温钝感性的选择效率，尽快提高我国水稻品种的垩白性状高温钝感水平，并应用于水稻垩白性状高温钝感性品种的生产与品质检测，大大加快我国稻米垩白性状高温钝感性籼型水稻新品种培育与产业化进程。附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0020] 图1为QTL主效位点qHTCD12在水稻染色体上的位置示意图；

[0021] 图2为QTL主效位点qHTCGR5在水稻染色体上的位置示意图；

[0022] 图3为分子标记RM3326经SEQ ID NO：1和2所示引物扩增所得目的片段(箭头所示)；

[0023] 图4为分子标记RM7018经SEQ ID NO：3和4所示引物扩增所得目的片段(箭头所示)；

[0024] 图5为分子标记RM1200经SEQ ID NO：5和6所示引物扩增所得目的片段(箭头所示)；

[0025] 图6为分子标记RM5796经SEQ ID NO：7和8所示引物扩增所得目的片段(箭头所示)；

[0026] 图7为分子标记RM1024经SEQ ID NO：9和10所示引物扩增所得目的片段(箭头所示)；

[0027] 其中在附图3-7中：泳道1为DNA maker，泳道2为栽培籼稻R9311基因型扩增带型，泳道3为非洲栽培稻IRGC102309基因型扩增带型。

具体实施方式

[0028] 本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

[0029] 在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

[0030] 名词定义

[0031] 在陈述本发明的详细内容之前，应当了解被使用于本说明书中的数个用语。

[0032] 农学上优良的：如本文使用的，指基因型，其具有许多可辨别性状的最佳表现，如种子产量、突出体、萌发势、营养势、抗病性、种子结实、站立能力(standability)和脱粒能力，其允许生产者收获具有商业重要性的产品。

[0033] 杂交：两种亲本植物的交配。

[0034] F1杂种/F1代：两种非等基因植物杂交的第一代子代。

[0035] F2杂种/F2代：F1代自交所产生的子代。

[0036] SSR：Simple Sequence Repeat的缩写，中文含义为简单重复序列标记，SSR是以PCR技术为核心的DNA分子标记技术，也可称为微卫星序列标记(Microsatellite sequence，MS)，或短串联重复标记(Short Tandem Repeat，STR)。

[0037] 数量性状基因座(QTL)：数量性状基因座(QTL)指在一定程度上控制通常连续分布的以数值表示的性状的遗传基因座。

[0038] 连锁：一种现象，其中相同染色体上的等位基因比如果等位基因的传递是独立的而偶然预期的更倾向于一起分离。

[0039] 本发明的示例性实施方案

[0040] 本发明涉及一种鉴定垩白度高温钝感水稻植物的方法，包括在所述水稻植物的DNA中检测下述SSR标记中至少一种的存在：

[0041] RM3326、RM7018、RM1200、RM5796以及RM1024。

[0042] 本发明中用到的SSR分子标记RM序列除特殊说明外，都按照gramene(http://www.gramene.org/)网站公布的序列合成。

[0043] 本发明涉及RM3326、RM7018、RM1200、RM5796以及RM1024位点用于在水稻植物中鉴定垩白性状高温钝感水稻的QTL的用途。

[0044] QTL可通过使用分子标记进行鉴定。QTL可通过遗传图谱上的位置、或通过指示连锁群或染色体上的位置来鉴定。因此，QTL赋予的遗传性状可通过分子标记进行鉴定与表征。

[0045] 其中，RM3326和RM7018与位于水稻12号染色体上的QTL1(主效QTL位点称为qHTCD12)连锁，且这种连锁是紧密连锁，鉴定二者其一即可确定QTL1的存在；qHTCD12距离分子标记SSR/RM3326的遗传距离为0.2-1.5cM，距离分子标记SSR/RM7018的遗传距离为0.3-1.4cM。

[0046] RM1200、RM5796以及RM1024与位于水稻5号染色体上的QTL2(主效QTL位点称为qHTCCGR5)连锁，且这种连锁是紧密连锁，鉴定三者任一即可确定QTL2的存在；qHTCGR5距离分子标记SSR/RM1200的遗传距离为0.3-1.2cM，距离分子标记SSR/RM5796的遗传距离为0.1-1.2cM，距离分子标记SSR/RM1024的遗传距离为0.3-1.4cM。

[0047] 由于上述连锁关系，所述方法还可以描述为：

[0048] 一种鉴定垩白性状高温钝感水稻植物的方法，包括在所述水稻植物的DNA中检测下述SSR标记中至少一种的存在：

[0049] RM3326和RM7018中的至少一种；

[0050] 和/或；

[0051] RM1200、RM5796以及RM1024中的至少一种。

[0052] 在一些实施方式中，检测所述SSR标记存在的方法为PCR扩增或测序。

[0053] 在一些实施方式中，所述PCR扩增所用上下游引物的核苷酸序列分别为：

[0054] ·RM3326：SEQ ID NO：1和2；在非洲栽培稻IRGC102309中可扩增出长度为392bp的DNA片段(图3)；

[0055] ·RM7018：SEQ ID NO：3和4；在非洲栽培稻IRGC102309中可扩增出长度为486bp的DNA片段(图4)；

[0056] ·RM1200：SEQ ID NO：5和6；在非洲栽培稻IRGC102309中可扩增出长度为179bp的DNA片段(图5)；

[0057] ·RM5796：SEQ ID NO：7和8；在非洲栽培稻IRGC102309中可扩增出长度为100bp的DNA片段(图6)；

[0058] ·RM1024：SEQ ID NO：9和10；在非洲栽培稻IRGC102309中可扩增出长度为293bp的DNA片段(图7)。

[0059] 根据本发明的一方面，本发明还涉及产生被赋予垩白性状高温钝感水稻植物的方法，包括使水稻植物携带包含QTL1和/或QTL2的遗传决定因子，其中：

[0060] ·QTL1：位于水稻12号染色体上，垩白度高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM3326和RM7018之间；

[0061] ·QTL2：位于水稻5号染色体上，垩白粒率高温钝感主效QTL位点标记区间位于SSR分子标记RM1200和RM5796之间。

[0062] 在一些实施方式中，所述使水稻植物携带包含QTL1和/或QTL2的遗传决定因子的方法包括下述步骤：

[0063] 1).采用如上所述的方法测定第一种水稻植物是否具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感；

[0064] 2).任选地对垩白度和或垩白粒率高温钝感表型进行验证；

[0065] 3).选择包含垩白度和/或垩白粒率高温钝感的第一种水稻植物，并将其与第二种水稻植物杂交，以产生包含QTL1和/或QTL2的子代植物；

[0066] 4).任选地使用步骤3)中所述的子代植物作为原材料，重复步骤1)-3)2-10次，以产生其它子代植物。

[0067] 在一些实施方式中，所述第二种水稻植物属于农学上优良的品种。

[0068] 在一些实施方式中，所述方法还包括选择包含QTL1和/或QTL2，和农学上优良特征的水稻植物。

[0069] 在一些实施方式中，所述第一种水稻植物和/或第二种水稻植物为亚洲栽培水稻，优选为籼稻，还可以为非洲栽培稻，例如IRGC102309。

[0070] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及由如上所述的方法产生的水稻植物用于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的水稻繁殖材料的用途，所述繁殖材料适合于产生具有垩白度和/或垩白粒率高温钝感的，且包含所述QTL1和/或QTL2的水稻植物或其种子；

[0071] 其中繁殖材料适宜于有性繁殖、植物性繁殖或可再生的细胞的组织培养。

[0072] 在一些实施方式中，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料选自小孢子，花粉，子房，胚珠，胚囊和卵细胞；

[0073] 在一些实施方式中，适宜于植物性繁殖的所述繁殖材料选自插枝，根，茎，细胞，原生质体；

[0074] 在一些实施方式中，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自叶，花粉，胚，子叶，下胚轴，分生组织细胞，根，根端，花药，花，种子和茎。

[0075] 本发明也涉及种子生产的方法，包括使包含垩白性状高温钝感特性的水稻植物生长，允许植物产生种子，及收获那些种子。种子的产生适宜地通过杂交或自交进行。

[0076] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0077] 需要说明的是，本发明的实施程序是：IRGC102309(Oryza glaberrima)为国际水稻种质中心(IRGC)非洲栽培稻品种资源保藏编号，江西省超级水稻研究发展中心经过高温胁迫筛选与鉴定，发现该编号资源垩白性状对高温明显钝感，高温胁迫条件下垩白粒率为7.4％，正常温度下垩白粒率为6.9％，钝感值IV＝1.072，垩白度1.2％，正常温度下垩白度为1.1％，钝感值IV＝1.091，在不同温度条件表现稳定。由本单位从国际水稻研究所国际水稻种质中心引进，并在国际水稻所种质中心数据库公开信息。其中全球性稻种资源的搜集、鉴定、保存和分发既是国际水稻所的主要研究任务之一，也是该所进行全球稻资源服务的重要内容(应存山，1985)。本领域相关育种单位或个人只需到相关行政管理部门开具进出口检验检疫证就可就保藏编号材料开放获取。R9311，又名扬稻6号(O.sativa)，是我国长江流域区大面积推广应用的栽培籼稻品种，在高温胁迫条件下垩白粒率55.5％(正常温度下垩白粒率为24.7％)，钝感值IV＝2.27，垩白度7.4％(正常温度下垩白度为4.6％)，钝感值IV＝1.61，在在不同温度条件下表现为高温敏感。由江苏里下河地区农业科学研究所张洪熙等选育。上述材料经江西省超级水稻研究发展中心(江西省农科院海南水稻育种中心)引进后，多年自交保存繁殖，如果其他同行需要，江西省超级水稻研究发展中心(江西省农科院海南水稻育种中心)保证自申请日起20年内可向国内研究单位提供这些种质材料。

[0078] 实施例

[0079] 1、供试材料

[0080] 2008年江西省超级水稻研究发展中心以亚洲栽培籼稻R9311为受体亲本，非洲栽培稻IRGC102309为供体亲本，进行种间杂交。为了使非洲栽培稻IRGC102309与亚洲栽培稻R9311能够正常出穗相遇杂交。将非洲栽培稻IRGC102309幼苗从分蘖盛期开始都采用了短日照处理。在处理期间，每天给予光照9h，其余时间均罩以红黑双层遮光布，连续处理20d以上。

[0081] 2、杂交和胚拯救

[0082] 杂交采用手工剪颖去雄的方法进行，以栽培稻品种R9311为杂交母本，授以IRGC102309为供体亲本，进行种间杂交。为了使非洲栽培稻IRGC102309与亚洲栽培稻R9311能够正常出穗相遇杂交。将非洲栽培稻IRGC102309幼苗从分蘖盛期的成熟花粉。自授粉当天起，连续5d给杂交穗喷以75mg/L的GA3，一天两次。杂种胚的拯救参照颜辉煌等(1997)的方法进行。授粉10-14d后检查杂交的稻穗，剥取明显膨大的子房经70％乙醇和20％次氯酸钠溶液消毒后，在超净台内切取幼胚接种于无生长素的1/4MS培养基上进行暗培养；当杂种幼胚在培养基上萌发生长至1cm左右时，即将其转到添加有1/2MS+1mg/L NAA+1.8mg/L MET的培养基上，采用正常的光照培养至三叶期，然后移入土壤继续生长。

[0083] 3、回交后代选择

[0084] 3.1 2008年冬季在海南三亚育种基地种植F1，共6株，回交获得BC1F1种子，成熟后全部混收。2009年夏季在江西省农业科学院南昌试验基地种植BC1F1群体(40株)继续与轮回亲本回交得到BC2F1种子。2009年冬季在江西省农业科学院海南育种中心基地种BC2F1群体(150株)，随机挑选10株与轮回亲本R9311回交，混收得到BC3F1种子。2010年夏季在江西省农业科学院南昌试验基地种植BC3F1群体(160株)，随机挑选30株继续回交，混收得到BC4F1种子，冬季稻江西省农业科学院海南育种中心基地种BC4F1群体(400株)，随机挑选60株与轮回亲本继续回交，混收得到BC5F1种子。2011年夏季在江西省农业科学院南昌试验基地种植BC5F1群体400株获得BC5F2种子。挑选20株综合农艺性状良好的单株自交套袋收种。主要农艺性状及经济性状具体选择标准如下：①生育期140天以内；②株高114.0厘米左右；③穗长23.0厘米以上；④每穗实粒数174粒以上；⑤单株有效穗9.2根以上；⑥千粒重29克以上。田间管理按常规方法进行。2011年冬季将中选材料海南三亚育种试验站加代繁殖获得BC5F3群体。

[0085] 3.2 2012年于南昌试验站中稻季节灌浆期(8月16～26日)经历自然高温胁迫，日平均温度不低于32℃，最高温度不低于36℃。种植BC5F3群体134行，每行8株。成熟后单株收获，脱壳调查垩白性状，以迟播种15天，灌浆期自9月初开始避开高温胁迫正常温度条件下的对应株系垩白性状做对照计算钝感值(注：钝感值的计算：IV＝X1/X2，其IV为钝感值，其中X1，X2分别为高温胁迫处理下和正常温度条件处理下的垩白粒率。当X1＝X2时，IV＝1。从理论上讲，性状IV越接近1其钝感性越强，在不同温度条件下越稳定，性状IV超过1.2其高温敏感显著，当IV超过1.5时表现为高温敏感极显著)。

[0086] 垩白性状观察利用JSE-II稻米垩白观测仪(郑州中谷机械设备有限公司生产)，具体参数要求：

[0087] 1、电源要求：单相交流220伏50赫兹、40瓦，接地良好。

[0088] 2、光源：松下、环形日光灯管型号YH32RR、32W。

[0089] 3、测定方法：

[0090] A、垩白粒率：从整精米样品中随机取出整精米100粒，置于乳白板上观察，拣出有垩白(包括心白、腹白、背白)的米粒，按公式求出垩白米的百分率。重复一次，取二次测定结果的平均值，即为垩白粒率。垩白粒率＝垩白米粒数/总粒数*100。

[0091] B、垩白大小随机取垩白米10粒，在乳白板上平放，逐粒目测垩白面积占整个籽粒面积的百分数，求出垩白面积的平均值。重复一次，取二次测定结果的平均值即为垩白大小。

[0092] C、垩白度垩白度指整精米样品中垩白的面积占样品总面积的百分比。垩白度按公式计算：垩白度＝垩白粒率/垩白大小。

[0093] 3.2.1选择垩白粒率低于20％的株系1个，具体表现为高温胁迫处理下垩白粒率三株平均值为17.8％，而正常对照温度下垩白粒率三株平均值为17.1％，钝感值IV＝1.041，比值接近1，两者差异不显著，对高温表现为强钝感性，于是对这个株系留种，冬季到海南繁殖得到BC5F4种子。2013年种植BC5F4株系命名为CSIL05-23，与轮回亲本R9311杂交，同年海南自交繁殖获得BC6F2种子，2014年夏季在南昌试验站种植200个BC6F2单株。应用CTAB法(Rogers and Bendich 1989)提取DNA，本实验室根据gramene数据库(http://www.gramene.org)选择均匀覆盖基因组的430对SSR引物行PCR扩增，扩增体系10μL，DNA模板lμL，94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃再延伸10min，扩增产物经非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳：凝胶浓度为6％，电泳缓冲液为0.5倍TBE，220V恒压电泳1小时。电泳分析发现5号染色体上SSR标记RM1200和RM5796基因型在BC6F2群体出现分离。通过单标记分析，发现RM1200和RM5796与群体垩白粒率耐高温性状显著关联(P＝0.0015)。非洲栽培稻IRGC102309的基因型能够显著提高导入系垩白粒率的高温耐性，即能够显著降低高温胁迫下的垩白粒率。2015年种植RM1200和RM5796片段杂合的BC6F2单株自交获得的BC6F3分离群体380株，2016年种植目标区段杂合的BC6F3单株自交获得的BC6F4群体420株，用人工气候室在灌浆期(扬花后7-25天)模拟高温结合田间高温胁迫鉴定垩白粒率高温钝感性。人工气候室(北京易盛泰和科技)模拟高温胁迫的条件为：早八点到晚五点温度不低于38.0±0.5℃，其余时间均为25.0±0.5℃。相对湿度为75±5％，光照时间为14h，光照强度为20000～25000lx。正常对照条件为：早八点到晚五点温度不低于32.0±0.5℃，其余时间均为25.0±0.5℃。相对湿度为75±5％，光照时间为14h，光照强度为20000～25 000lx。对灌浆期经历上述条件下人工气候室模拟高温胁迫后逼熟的导入系材料及人工温室模拟正常温度处理下垩白粒率性状调查并计算垩白粒率高温钝感值。利用目标区域附近20对SSR引物中筛选到的9对多态性SSR标记(表1)，对BC6F3和BC6F4群体进行单株基因型检测。

[0094] 表1导入系CSIL05-23目标片段上分子标记信息

[0095]

[0096] CSIL05-23与R9311杂交得到的BC6F3和BC6F4分离群体灌浆期高温胁迫后垩白粒率钝感性QTL分析结果见表2。

[0097] 表2 CSIL05-23与R9311杂交得到的BC6F3与BC6F4世代灌浆期高温胁迫后垩白粒率高温钝感性QTL分析

[0098]

[0099]

[0100] a似然比统计值除以4.6得到等效的对数值

[0101] b QTL解释的表型方差

[0102] c加性效应来自非洲栽培稻等位基因

[0103] 利用WinQTL Cartographer 2.5定位作图软件，采用复合区间作图法(Composite interval mapping)，LR闽值为11.5(相当于LOD值2.5)，1000次测验分析垩白粒率高温钝感QTL。研究结果表明在5号染色体上RM1200和RM5796标记区间鉴定出1个垩白粒率高温钝感QTL，命名为qHTCGR5(a QTL for heat tolerance of chalky grain rate)。分析该QTL的LOD值为6.3，解释表型变异达11.3％，我们将其命名为qHTCGR5(a QTL for heattolerance of chalky grain rate)。结合2016年BC6F4群体，分析发现该QTL能够解释17.5％的表型变异，LOD值为7.4。两世代分析结果表明该QTL以加性效应为主，且为主效QTL，解释11.3-17.5％的表型变异，标记区间为RM1200-RM5796。其中有3个SSR标记，RM1200，RM5796，和RM1024与之紧密连锁。3个SSR标记如下所述:

[0104] SSR/RM1200(用RM1200引物对可扩增出179bp的DNA片段)；

[0105] SSR/RM5796(用RM5796引物对可扩增出100bp的DNA片段)；

[0106] SSR/RM1024(用RM1024引物对可扩增出293bp的DNA片段)。

[0107] 上述引物均由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成并应用于本发明。目标QTL在上述BC6F3与BC6F4群体中可解释11.3-17.5％的表型变异。将含有目的片段的染色体片段导入系CSIL05-23，分别于2013年、2014、2015年种植在南昌，高安，南昌基地，种植四行，行长1.2米，株距16.5厘米，行距19.8厘米，二次重复，同时种植R9311和IRGC102309，待水稻成熟收取每行挂牌标记材料(灌浆期经历高温)的稻穗10个，计算垩白粒率钝感表现(表3)。含有非洲栽培稻染色体片段目标QTL的导入系CSIL05-23三年垩白粒率钝感平均值1.09，比对照R9311三年垩白粒率钝感平均值2.29降低48％，即垩白粒率高温钝感水平提高48％，改良效果极显著。因此CSIL05-23的非洲栽培稻染色体片段上的qHTCGR5应用于水稻分子育种，能显著地增加籼稻的垩白粒率高温钝感性。用分子标记辅助选择可有效地开展水稻的垩白粒率高温钝感性分子育种。该目标垩白粒率高温钝感性QTL及相应标记将会在亚洲栽培籼稻的垩白粒率抗高温育种研究中有较高的利用价值。

[0108] 表3导入系CSIL05-23在不同年份、不同环境中垩白粒率高温钝感值表现[0109]

[0110] **差异极显著(p<0.01),t-test

[0111] 3.2.2选择垩白度低于3％的株系1个，具体表现为高温胁迫条件下垩白度三株平均值为2.4％，而正常对照温度条件下垩白度三株平均值为2.3％，钝感值IV＝1.043，比值接近1，两者差异不显著，表现为高温钝感，于是对这个株系留种，冬季到海南繁殖得到BC5F4种子。2013年种植BC5F4株系命名为CSIL12-04，与轮回亲本R9311杂交，同年海南自交繁殖获得BC6F2种子，2014年夏季在南昌试验站种植200个BC6F2单株。应用CTAB法(Rogers and Bendich 1989)提取DNA，本实验室根据gramene数据库(http://www.gramene.org)选择均匀覆盖基因组的430对SSR引物行PCR扩增，扩增方法如3.2.1所示。电泳分析发现SSR标记12号染色体上RM3326和RM7018基因型在BC6F2群体出现分离。通过单标记分析，发现RM3326和RM7018与群体垩白度高温钝感性状显著关联(P＝0.0001)。非洲栽培稻IRGC102309的基因型能够显著提高导入系垩白度的高温钝感性，即能够显著降低高温胁迫下的垩白度。2015年种植RM3326和RM7018片段杂合的BC6F2单株自交获得BC6F3分离群体368株，2016年种植目标区段杂合的BC6F3单株自交获得BC6F4分离群体430株，两年均使用人工气候室(北京易盛泰和科技)在灌浆期(扬花后7-25天)模拟高温结合田间高温胁迫鉴定垩白度高温钝感。人工气候室模拟高温胁迫的条件为：早八点到晚五点温度不低于38.0±0.5℃，其余时间均为25.0±0.5℃。相对湿度为75±5％，光照时间为14h，光照强度为20000～25 000lx。正常对照条件为：早八点到晚五点温度不低于32.0±0.5℃，其余时间均为25.0±0.5℃。相对湿度为75±5％，光照时间为14h，光照强度为20000～25000lx。对灌浆期经历上述条件下人工温室模拟高温胁迫后逼熟的导入系材料及人工温室模拟正常温度处理下垩白粒率性状调查并计算垩白度高温钝感值。利用目标区域附近15对SSR引物中筛选得到的6对多态性SSR标记(表4)，对BC6F3和BC6F4群体进行单株基因型检测。

[0112] 表4导入系CSIL12-04目标片段上分子标记信息

[0113]

[0114] CSIL12-04与R9311杂交得到的BC6F3和BC6F4分离群体灌浆期高温胁迫后垩白度高温钝感性QTL分析结果见表5。

[0115] 表5 CSIL12-04与R9311杂交得到的BC6F3与BC6F4世代灌浆期高温胁迫后垩白度高温钝感性QTL分析

[0116]

[0117] a似然比统计值除以4.6得到等效的对数值

[0118] b QTL解释的表型方差

[0119] c加性效应来自非洲栽培稻等位基因

[0120] 利用WinQTL Cartographer 2.5软件，采用复合区间作图法(Compositeinterval mapping)，LR闽值为11.5(相当于LOD值2.5)，1000次测验分析垩白度耐热QTL。研究结果表明在12号染色体上RM3326和RM7018标记区间鉴定出1个垩白度耐热QTL，命名为qHTCD12(a QTL for heattolerance of chalky degree)。分析该QTL的LOD值为8.4，解释表型变异达24.5％。结合2016年BC6F4群体(430株)，分析发现该QTL能够解释33.2％的表型变异，LOD值为11.2。两世代分析结果表明该QTL为主效QTL，解释24.5-33.2％的表型变异，标记区间为RM3326-RM7018。

[0121] 其中有2个SSR标记，RM3326，和RM7018与之紧密连锁。2个SSR标记如下所述：

[0122] SSR/RM3326(用RM3326引物对可扩增出392bp的DNA片段)；

[0123] SSR/RM7018(用RM7018引物对可扩增出486bp的DNA片段)；

[0124] 上述引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成并应用于本发明。目标QTLs在上述BC6F3与BC6F4群体中可解释24.5～33.2％的表型变异。用分子标记辅助选择可有效地开展水稻的垩白性状高温钝感分子育种。这些目标垩白性状高温钝感QTLs及相应标记将会在亚洲栽培籼稻的垩白性状抗高温育种研究中有较高的利用价值。将含有该染色体片段的导入系CSIL12-04，分别于2013年、2014、2015年种植在南昌、高安、南昌基地，种植四行，行长1.2米，株距16.5厘米，行距19.8厘米，二次重复，同时种植R9311和IRGC102309，待水稻成熟收取每行挂牌标记材料(灌浆期经历高温)的稻穗10个，计算垩白度钝感表现(表6)。含有非洲栽培稻染色体片段目标QTL的导入系CSIL05-23三年垩白粒率钝感平均值为
1.03，比对照R9311三年垩白粒率钝感平均值1.70降低37％，即垩白度高温钝感水平提高
37％，改良效果极显著。因此CSIL12-04的非洲栽培稻染色体片段上的qHTCD12应用于水稻分子育种，能显著地增加籼稻的垩白粒率高温钝感性。用分子标记辅助选择可有效地开展水稻的垩白度高温钝感性分子育种。该目标垩白度高温钝感性QTL及相应标记将会在亚洲栽培籼稻的垩白度抗高温育种研究中有很高的利用价值。

[0125] 表6导入系CSIL12-04在不同年份、不同环境中垩白度高温钝感值表现[0126]

[0127] **差异极显著(p<0.01),t-test

[0128] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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