技术领域

本发明涉及用作生物接种剂的协同组合物，该组合物含有保藏号为单独的 NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL B-30488的细菌菌株的组合物或者所有 可能的组合，以及任选的载体，各菌株显示植物促进作用、植物致病性真菌控制 活性、非生物压力条件耐受能力、非生物压力条件下磷酸盐增溶能力；此外，本 发明还涉及一种制备所述组合物的方法，和从沙希华母牛(Sahiwal)分离所述细菌 的方法。

                           背景技术

微生物世界是其活性对生物圈起到重要作用的微观世界。微生物产物对环 境、植物、公众以及土壤健康产生影响。微生物在其生态学和生理学方面有惊人 的多样性。它们已进化到在几乎各个生态位中竞争并繁衍，而不论这种生态位是 否适合它们居住。微生物之间以及微生物与其它植物和动物之间还产生广泛联系。 它们可以是病原体、寄生虫共生生物、共生动物和腐生性植物，因而，它们的生 态影响渗透到生命的所有营养水平和可能的生态系统的全部范围。已证明微生物 是格外丰富的新产物来源，有各种指示表明，微生物在将来会继续扮演这样的角 色。因此，开发具有生态学重要性或经济价值的新颖微生物的生物多样性是非常 重要的。这促使微生物学家继续从仍未表征的来源中寻找新的有用的微生物。

根据印度神话以及印度传统的医学实践(两者都是传统的系统，如印度草药疗 法和Siddha，以及农村村民的口头流传)，牛奶具有恢复健康的保护特性和促进健 康的特性，因此被认为是活力激发剂(vitaliser)中最好的一种〔Caraka-Samhita， Editor-translator P.Sharma，Chaukhambha Orientalia，Varanasi，印度，第1卷， 第213页(1981)；P.Pushpangadan，《印度人种生物学：状态报告》(Ethnobioligy in India：A status report)，印度环境和森林部，新德里(1994)；P.Pushpangadan，《关 于人种生物学的所有印度协同研究项目：最终的技术报告》(All India Coordinated research proiect on ethnobiology：Final technical report)，1982-1998，印度环境和森 林部，新德里(1998)〕。

牛奶可以定义为哺乳动物乳腺的正常分泌物。由哺乳动物的腺体分泌的牛奶 是无微生物的。但是，奶头上的微生物沿着奶头导管移动，并进入乳房的内部〔J. C.Olsen和G.Mocquot，《牛奶和乳制品》(Milk and Milk Products)，在：International commission on microbiological specification for foods.Microbial ecology of foods. Food commodities，第2卷，纽约：Academic出版社(1980)，第470-486页〕。这 使无菌挤出的牛奶含有微生物(大多数是细菌)。无菌挤出的牛奶中的细菌，其数 量通常有限，最常见的是球菌、乳球菌、葡糖球菌、链球菌以及芽胞杆菌〔F；L. Bryan，《食物保护杂志》(Joumal of Food Protect)，第46卷，第637-649页(1983)； R.A.Ledford，《鲜奶和液体乳制品》(Raw milk and fluid milk products)，在：《应 用乳制品微生物学》(Applied dairy microbiology)，E.H.Marth和J.L.Steele编辑， 纽约：Marcel Dekker，Inc.(1998)，第55-64页〕。

在过去40多年，已知牛奶中常见的多种细菌对基质相对不利，由此可见， 牛奶具有显著的选择特性〔T.Gibson和Y.A.Abd-E1-Malek，《加拿大微生物学 杂志》(Canadian Journal of Micriobiology)，第3卷，第203-213页(1957)〕。因此， 侵入奶头和/或乳房的细菌群必须具有持续能力，以使自己能在这些次优的条件下 生存和繁殖。因此，本申请所述的对牛奶进行的工作涉及维持在奶头和/或乳房中 的细菌群，这些细菌群已获得进入无菌挤出的牛奶中，我们试图从仍未表征的生 态学生态位中寻找新的微生物。

提高土壤肥力是增加农业和林业产量的最常见的策略之一。我们已从母牛牛 奶中分离出植物有益菌。多年来已用用于提高农作物的有益微生物与种子或土壤 孕育。已鉴定出对这种植物生长促进作用负责的各种机制。例如，某些微生物通 过抑制有害微生物的生长间接促进植物生长；或者通过产生生长激素直接增加植 物的生长；和/或通过帮助农作物摄取养分，如磷(P)〔C.S.Nautiyal等，FEMS Microbiology Letters，第1 82卷，第291-296页(2000)〕。

但是，生物接种剂商业化不成功的一个主要因素是田间测试的结果由于其建 立和执行受到环境因素(尤其土壤中的压力条件，如盐、pH和温度)的严重影响而 不一致〔C.S.Nautiyal等，FEMS Microbiology Letters，第182卷，第291-296页 (2000)〕。因此，需要提供耐受压力的细菌菌株作为生物接种剂〔C.S.Nautiyal， 《与农业可持续能力有关的植物疾病的生物控制》(Biocontrol of plant disease for agricultural sustainability)，在：“生物控制潜力及其在可持续的农业中的开发” (Biocontrol potential and its explotation in sustainable agriculture)，第1卷，R.K. Upahyay、K.G.Mukerji和b.P.Chamola编辑，Kluwer Academic/Plenum出版社， 纽约(2000)，第9-23页〕。

促进植物生长的微生物包括但不限于假单胞菌属Pseudomonas)、根瘤菌属 (Rhizobium)、固氮螺菌(Azospirillum)和芽胞杆菌(Bacillus)等〔A.K.Saxena等，“细 菌生物控制剂及其在植物疾病管理中的作用”(Bacterial biocontrol agents and their role in plant disease management)，在：《生物控制潜力及其可持续的农业中的开 发》，第1卷，R.K.Upadhyay、K.G.Mukerji和B.P.Chamola编辑，Kluwer Academic/Plenum出版社，纽约(2000)，第25-37页〕。

枯草芽胞杆菌(B.subtilis)作为植物致病性真菌齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的 拮抗剂来源的有用性是已知的〔P.Broadbent等，《澳大利亚生物科学杂志》 (Australian Journal of Biological Science)，第24卷，第975页(1971)〕。Baker等 〔《植物病理学》(Phytopathology)，第73卷，1148-1152(1983)〕还报道了枯草芽 胞杆菌作为真菌植物致病性的生物控制剂的用途。Pusey等〔《植物疾病》(Plant Disease)，第72卷，第622-626页(1988)〕和P.L.Pusey〔美国专利5047239〕公 开了使用枯草芽胞杆菌对丰收后的果实腐烂进行控制。S.D.Heins等〔美国专利 6103228〕已公开使用枯草芽胞杆菌保护或处理植物，使其免受真菌的细菌感染及 玉米根虫侵扰。

缓病芽胞杆菌(B.lentimorbus)是日本甲虫和相关的金龟子幼虫的乳白病的病 原体〔K.E.Rippere等，《国际系统细菌学杂志》(International Journal of Systematic Bacterioligy)，第48卷，第395-402页(1998)〕，因此，用于某些昆虫幼虫的生物 控制〔R.E. Gordon等，芽胞杆菌属，第427号农业手册，美国农业部，美国政 府印刷所，华盛顿特区(1973)〕。还已使用缓病芽胞杆菌增加鱼的生产〔W.T.Logan 等，美国专利5746155〕和用来处理垃圾〔W.T.Logan等，美国专利6017525〕。

为了繁殖常用的细菌，市场上用于接种剂的载体是蛭石、木炭、羧甲基纤维 素、泥煤、珍珠岩、聚乙烯基-吡咯烷酮和滑石粉。在糖生产过程中获得的一种“废 弃”物——压滤泥浆也已用作褐球固氮菌(Azotobacter chroooccum)和大豆慢生根 瘤菌(Rhizobium japonicum)的载体〔K.S.Jauhri，《印度农业研究杂志》(Indian Journal Agriculture Research)，第24卷，第189-197页(1990)〕。压滤泥浆与其它任何有 机肥料一样，影响土壤的物理、化学和生物特性。它还有助于增加土壤中的水稳 定性聚集物。它可与酒厂的酒糟水混合，用作比单独的压滤泥浆更好的有机肥料 〔D.P.Yadav，“糖厂压滤泥浆在农业中的再利用”(Recycling of sugar factory press mud in agriculture)，在：《农作物、动物、人和工业废弃物在农业中的再利用》 (Recycling of crop，animal，human，and industrial wastes in agriculture)，H.L.S.Tandon 编辑，肥料发展和咨询组织，新德里(1995)，第91-108页〕。因此，农业和环境 工业将明显地从简单、低廉的用于植物、种子和土壤的微生物接种剂的方法中受 益。

虽然到目前为止，牛奶的微生物学研究是对嗜冷菌进行的(因为它们在牛奶和 乳制品中的重要性)〔M.A.Cousin，Journal of food protection，第45卷，第172-207 页，1982；R.A.Ledford，《鲜奶和液体乳制品》，在《应用乳制品微生物学》， E.H.Martha和J.L.Steele编辑，纽约，Marcel Dekker，Inc.(1998)，第55-64页〕， 目前，并未从母牛的牛奶中发现细菌菌株具有控制植物致病性真菌、促进植物生 长、对非生物压力的耐受以及在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的能力。

印度是世界上具有丰富的国际牲畜基因库和动物种群改善的少数几个国家之 一。牛和水牛几乎占其国民总收入的15％。印度具有世界牛种群的23％。牛(Cattle) 通常指驯养的食草哺乳动物，属于牛科(Bovidae)中的牛属(Bos)。现代的牛被分成 两个种类：起源于欧洲的牛(B.taurus)，包括牛奶场最现代的品种和肉牛；起源于 印度的印度牛(B.indicus)，其特征是驼背和衰弱。后者现在广泛分布在亚洲和非 洲，在北美(主要在美国南部)、中美洲和北美洲以及中美洲输入的量较少。

乳牛是主要用来生产牛奶的品种。在北美，乳牛的主要品种是霍斯坦牛、艾 尔夏牛、褐色瑞士牛(Brown Swiss)和泽西种乳牛。在印度，印度牛的主要乳牛品 种是吉尔牛(Gir)、哈里亚纳牛(Hariana)、辛地红牛(Red Sindhi)、塔派尔克牛 (Tharparker)和沙希华牛。到目前为止，沙希华牛是次大陆最好的品种。当与其它 非常类似的辛地红牛相比时，沙希华牛是具有对称的体形和松弛的皮肤的比较重 的品种。该动物通常是体形长、肉多，且比较重。其颜色为微暗红色或浅红色， 有时长有白色的斑块。这个品种的许多兽群都在印度。牛奶产量在1400-2500kg。 这个特性的遗传率为0.2-0.3。首次产犊的年龄在37-48个月，产犊的时间间隔为 430-580天。沙希华牛是次大陆最流行的品种之一。它已被出口到斯里兰卡、肯 尼亚和拉丁美洲的许多国家以及西印度群岛，在西印度群岛，已由沙希华牛和泽 西种乳牛杂交培育出新品种，称为牙买加侯普牛(Jamaca Hope)〔P.N.Bhat，《动 物饲养手册》(Handbook of animal Husbandry)，农业出版和信息理事会，Krishi Anusandhan Bhawan，Pusa，新德里(1997)〕。

因此，迄今并没有明显的指示表明，从母牛中分离得到的任何细菌可作为生 物控制剂，当然没有直接显示植物本身的生长受到细菌介导的刺激。尽管如此， 如果能分离出一种能促进植物生长、对非生物压力的耐受和在非生物压力条件下 使磷酸盐增溶的细菌菌株，则即可将该菌株用于如受植物致病性感染、养分如磷 利用率差以及环境压力等影响的土壤，以及没有获得农作物发育中的所需改善的 土壤中，但是，没有关于选择这种细菌菌株的方法的报道。我们对各种植物类型 进行直接比较，已发现选择的细菌菌株的独特组合能有效提高植物生长和健康。

本发明涉及从母牛出分离得到的细菌的新菌株，该菌株具有控制植物致病性 真菌、促进植物生长、增强植物对非生物压力的耐受、在非生物压力条件下使磷 酸盐增溶的能力。本发明还涉及一种选择这些菌株的方法。

                           本发明的目的

本发明的主要目的是从母牛中分离用作生物接种剂的细菌菌株。

本发明的另一主要目的是从沙希华母牛分离具有植物促进作用的细菌菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛分离具有促进植物作用至少5％干重的细 菌菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛中分离具有较少的种子死亡率、较好的种 子萌芽、植株高度、荚的数量以及种子干重方面的植物促进作用的细菌菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛分离具有植物致病性真菌控制活性的细菌 菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛分离具有磷酸盐增溶特性的细菌菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛分离具有耐受非生物压力条件作用的细菌 菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛分离具有4-8％盐耐受能力的细菌菌株。

本发明又一目的是从沙希华母牛分离具有耐受pH4-10能力的细菌菌株。

本发明的又一目的是从沙希华母牛分离具有耐受50-60℃的能力的细菌菌 株。

本发明的又一目的是开发一种协同制剂，该制剂含有从沙希华母牛分离得到 的三种菌株，所述菌株含有具有控制植物致病性真菌、促进植物生长、对非生物 压力耐受、在非生物压力条件下使磷酸盐增溶、产生抗真菌代谢物的特性的组合 物。

本发明的又一目的是开发一种用作生物接种剂的制剂，该制剂含有从沙希华 母牛分离得到的三种菌株，在各种存储或温室或田间条件下显示出最大的生存力。

本发明的又一目的是开发一种制剂，该制剂含有从沙希华母牛分离得到的保 藏号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的三种分离菌株，其中 所述制剂可以是液体形式或干燥形式，用于种子、植物和土壤。

                            发明概要

本发明涉及一种用作生物接种剂的协同组合物，所述组合物含有单独的保藏 号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的三种菌株或所有可能的 组合，该组合物还任选地含有载体，各菌株显示出植物促进作用、植物致病性真 菌控制活性、非生物压力条件耐受能力、非生物压力条件下磷酸盐增溶能力；此 外，本发明还涉及一种制备所述组合物的方法，和从沙希华母牛分离所述细菌的 方法。

                         发明的详细描述

因此，本发明涉及一种用作生物接种剂的协同组合物，所述组合物含有单独 的保藏号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的三种菌株或所有 可能的组合，该组合物还任选地含有载体，各菌株显示出植物促进作用、植物致 病性真菌控制活性、非生物压力条件耐受能力、非生物压力条件下磷酸盐增溶能 力；此外，本发明还涉及一种制备所述组合物的方法，和从沙希华母牛分离所述 细菌的方法。

在本发明一个实施例中，本发明涉及一种用作生物接种剂的协同组合物，所 述组合物含有单独的保藏号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488 的三种菌株或所有可能的组合，和任选的载体。

在本发明另一实施例中，所述菌株NRRL B-30486和NRRL B-30488属于缓 病芽胞杆菌属。

在本发明又一实施例中，菌株NRRL B-30487属于枯草芽胞杆菌。

在本发明又一实施例中，菌株NRRL B-30486具有下述特性：

  特性                                NRRL B-30486

  形状                                杆状

  大小：宽，μm                       1.5-2.0

        长，μm                       3.0-6.0

  革兰氏反应                          +

  过氧化氢酶反应                      -

  厌氧生长                            +

  伏-波反应                           -

  V-P肉汤中的pH                       5.5

  从D-葡萄糖产酸                      +

  从L-阿拉伯糖产酸                    -

  从D-木糖产酸                        -

  从D-甘露糖醇产酸                    -

  从葡萄糖中产气                      +

  酪蛋白水解                          -

  明胶水解                            -

  淀粉水解                            -

  柠檬酸盐的使用                      -

  硝酸盐转变为亚硝酸盐                -

  形成吲哚                            -

  在营养肉汤中生长的pH：6.8           +

                        5.7           +

  在NaCl中的生长：2％                 +

                  5％                 +

                  7％                 +

                  10％                +

在30℃的生长                         +

在40℃的生长                         +

在50℃的生长                         +

在55℃的生长                         +

在65℃的生长                         -

在本发明又一实施例中，菌株NRRL B-30487具有下述特性：

特性                                 NRRL B-30487

形状                                 卵状

大小：宽，μm                        2.5

革兰氏反应                           +

过氧化氢酶反应                       +

厌氧生长                             -

伏-波反应                            +

V-P肉汤中的pH                        5.8

从D-葡萄糖产酸                       +

从L-阿拉伯糖产酸                     +

从D-木糖产酸                         +

从D-甘露糖醇产酸                     +

从葡萄糖中产气                       -

酪蛋白水解                           +

明胶水解                             +

淀粉水解                             +

柠檬酸盐的使用                       +

硝酸盐转变为亚硝酸盐                 +

形成吲哚                             -

在营养肉汤中生长的pH：6.8            +

                      5.7            +

在NaCl中的生长：2％                  +

                5％                  +

                7％                  -

               10％                  -

在30℃的生长                         +

在40℃的生长                         +

在50℃的生长                         +

在55℃的生长                         +

在65℃的生长                         -

在本发明又一实施例中，所述菌株NRRL B-30488具有以下特性：

特性                                 NRRL B-30488

形状                                 杆状

大小：宽，μm                        1.5-2.0

      长，μm                        5.0-10.0

革兰氏反应                           +

过氧化氢酶反应                       -

厌氧生长                             +

伏-波反应                            -

V-P肉汤中的pH                        5.2

从D-葡萄糖产酸                       +

从L-阿拉伯糖产酸                     -

从D-木糖产酸                         -

从D-甘露糖醇产酸                     -

从葡萄糖中产气                       +

酪蛋白水解                           -

明胶水解                             -

淀粉水解                             -

柠檬酸盐的使用                       -

硝酸盐转变为亚硝酸盐                 -

形成吲哚                             -

在营养肉汤中生长的pH：6.8            +

                      5.7            +

在NaCl中的生长：2％                  +

                  5％            +

                  7％            +

                  10％           +

在30℃的生长                     +

在40℃的生长                     +

在50℃的生长                     +

在55℃的生长                     +

在65℃的生长                     -

在本发明又一实施例中，所述载体选自蛭石、木炭、发酵糖厂亚硫酸化处理 的压滤泥浆与酿酒厂的酒糟水的混合物、以及糖厂碳化的压滤泥浆。

在本发明又一实施例中，所述三种菌株的比例约为1∶1∶1。

在本发明又一实施例中，所述菌株的总浓度为4-10cfu/g载体，较佳为6-8cfu/g 载体。

在本发明又一实施例中，所述各菌株的浓度为4-10cfu/g载体，较佳为7-8cfu/g 载体。

在本发明又一实施例中，所述菌株在30℃的增代时间为55-65分钟，30℃。

在本发明又一实施例中，所述菌株在植物根部集群。

在本发明又一实施例中，所述菌株在植物的所有季节中生存。

在本发明又一实施例中，所述菌株在组合物中生存至少2/3年。

在本发明的又一实施例中，本发明涉及从沙希华母牛分离保藏号为NRRL B- 30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的细菌菌株的体外方法，所述菌株具有 控制植物致病性真菌、促进植物生长、对非生物压力耐受、在非生物压力条件下 使磷酸盐增溶、产生抗真菌代谢物、从沙希华母牛收集牛奶的特性。

在本发明又一实施例中，涉及在培养基中平板接种牛奶。

在本发明又一实施例中，涉及在25-35℃培育培养物1-3天。

在本发明又一实施例中，涉及从培养物中选择所有形态学不同的细菌。

在本发明又一实施例中，涉及通过在30-35℃、优选为28℃培育20-35天、 优选为27天，筛选先前步骤中的所述菌株，这些菌株将抑制植物致病性真菌，显 示出至少2mm的抑制区。

在本发明又一实施例中，涉及使植物在选择的细菌的存在下，在细菌浓度约 为Log 6-10CFU/种子或约为Log 6-8CFU/克土壤的浓度中生长，从而从先前步 骤中的所述菌株中筛选出增加至少5％的植物干重的促进植物生长的菌株。

在本发明又一实施例中，涉及在4-8％盐压力耐受下对先前步骤中的所述菌 株进行筛选，以用于进一步的选择。

在本发明又一实施例中，涉及在pH4-10压力耐受下对先前步骤中的所述菌 株进行筛选，以用于进一步的选择。

在本发明又一实施例中，涉及在50-60℃温度耐受下对先前步骤中的所述菌 株进行筛选，以用于进一步的选择。

在本发明又一实施例中，涉及对先前步骤中的所述菌株进行筛选，选出具有 在高盐、pH和温度的非生物压力条件下使磷酸盐增溶的菌株，用于进一步的选择。

在本发明又一实施例中，涉及分离所需的三种细菌菌株。

在本发明又一实施例中，所述具有生长促进作用的植物选自玉蜀黍(Zea mays)、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)、丝瓜(Luffa cylindrica)、番茄(Lycopersicon esculentum)、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)和黄瓜(Cucumis sativus)。

在本发明又一实施例中，所述培养基是营养琼脂，所述培养基含有牛肉膏(2- 10克)、蛋白胨(5-15克)、氯化钠(2-10克)、琼脂(10-20克)、蒸馏水(约1.0升)，pH 为7.0-7.4。

在本发明又一实施例中，在30℃测试所述pH耐受。

在本发明又一实施例中，所述土壤湿度为15-30％，较佳为20％。

在本发明又一实施例中，所述盐较佳是NaCl。

在本发明又一实施例中，所述菌株在营养肉汤(NB)培养基中生长，该培养基 含有牛肉膏(0.5％)、蛋白胨(1％)、NaCl(0.5％)和蒸馏水，pH为7.2。

在本发明又一实施例中，所述致病真菌选自串珠镰孢(F.moniliforme)、镰形 刺盘孢(C.falcatum)、尖镰孢(F.oxysporum f.sp.ciceri)、立枯丝核菌(R.solani)、腐 霉属(Pythium sp.)、茎点霉(Phoma sorghii)、齐整小核菌、立枯链格孢(Alternaria solani)、弯孢(Curvularia lunata)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和黑曲霉 (Aspergillus niger)。

在本发明又一实施例中，所述菌株的浓度为4-10CFU/ml。

在本发明又一实施例中，在温度、盐和pH组合增加后，磷酸盐的增溶增加 约428％。

在本发明又一实施例中，所述磷酸盐增溶随着盐浓度的增加而增加约160％。

在本发明又一实施例中，所述磷酸盐增溶随着pH的增加而增加约130％。

在本发明又一实施例中，根据高pH压力耐受性选择菌株，较佳是pH为9。

在本发明又一实施例中，根据55℃压力耐受性选择菌株。

在本发明又一实施例中，所选择的细菌在较少幼苗死亡率、较好种子萌芽、 植株高度、荚数量和种子干重方面都是最佳的。

在本发明又一实施例中，所述植物促进作用达到3-400％。

在本发明又一实施例中，真菌的浓度为4-7孢子/ml培养基。

在本发明又一实施例中，所述使磷酸盐增溶的非生物压力条件选自7-9的pH 范围、30-45℃的高温范围和0.1-4％的盐浓度范围。

在本发明另一实施例中，涉及一种制备植物生长促进剂的方法，该促进剂含 有单独的保藏号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的细菌菌株， 或者所有可能的组合，以及载体。

在本发明又一实施例中，使单种细菌在约Log 8-11cfu/ml、较佳Log 9-10cfu /ml的浓度下生长，接着在制备聚生体的例子中，任选地使等比例的培养物混合。

在本发明又一实施例中，用水以1∶50到1∶150、较佳是1∶100的比例稀 释所述培养物，较佳是含有Log 8-9cfu/ml的细菌。

在本发明另一实施例中，将约1-3升的培养物/吨新鲜匀浆的载体、较少是2 升培养基/吨新鲜匀浆的载体喷洒并混合。

在本发明又一实施例中，每天搅拌堆料(windrow)至少两次，搅拌约2天，使 堆料的温度升高到70-75℃。

在本发明又一实施例中，将酒糟水或水喷洒到搅拌的堆料中，喷洒约40天， 以维持约55-65％的潮湿水平。

在本发明又一实施例中，再搅拌堆料约3-5天，使发酵产品的湿度降低到约 30％，温度降低到40-45℃。

在本发明又一实施例中，将植物生长促进生物接种剂包装备用。

在本发明又一实施例中，所述载体选自刚亚硫酸化的压滤泥浆和碳化的压滤 泥浆。

在本发明又一实施例中，所述培养基是NB培养基。

在本发明又一实施例中，手工和使用气垫式耕种机(aero tiller)将所述混合物 搅匀。

在本发明又一实施例中，证明所述制剂在各种存储或温室或田间条件下具有 最大生存力。

在本发明又一实施例中，所述菌株的比例约为1∶1∶1。

在本发明又一实施例中，在植物、种子和土壤上使用所述制剂。

在本发明又一实施例中，涉及使用植物生长促进剂的方法，该促进剂含有单 独的保藏号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的细菌菌株，或 者所有可能的组合，以及载体，所述方法包括将液体或干燥形式的所述生物接种 剂施加到种子、植物和土壤中。

在本发明又一实施例中，所述生物接种剂还含有树胶或糖，以改善其粘附性。

在本发明又一实施例中，所述菌株的比例为1∶1∶1。

在本发明又一实施例中，所述制剂证明在各种存储或温室或田间条件下具有 最大的生存力。

在本发明又一实施例中，所述载体选自刚亚硫酸化的压滤泥浆和碳化的压滤 泥浆。

在本发明又一实施例中，在细菌以约Log 7-9cfu/种子或约Log 6-8cfu/克土 壤的浓度存在下，在田间测试各种植物的植物生长促进作用。

在本发明又一实施例中，单独使用制剂，或者于其它化学品组合使用，该化 学品对细菌的生长和生存无害。

在本发明又一实施例中，所述化学品选自杀昆虫剂、肥料、杀线虫剂和除草 剂，该化学品中有或者没有如石灰颗粒，以限制这些物质的影响的严重程度。

在本发明又一实施例中，涉及一种制备用作生物接种剂的组合物的方法，所 述组合物含有保藏号为NRRL B-30486、NRRL B-30487和NRRL-B 30488的一种 或多种新的细菌菌株和载体。

在本发明又一实施例中，用水以1∶10到1∶100000的比例稀释所述培养物， 较佳的比例是1∶100。

在本发明又一实施例中，细菌菌株在培养基中生长到对数期。

在本发明又一实施例中，使所述稀释的培养物与惰性的粉末状载体混合，以 湿物质计，该混合物的潮湿水平为20-40％，较佳约为30％。

在本发明又一实施例中，将所述混合物培育至少约两天，使所述混合物维持 恒定的潮湿水平。

在本发明又一实施例中，增加所述混合物中的细菌数量到约Log 4-10CFU/g 载体的范围。

在本发明又一实施例中，监测细菌在所述组合物中至少1年时间内的生存率 率，其中所述细菌菌株较佳以约Log 7-9CFU/g载体存在，生存率长的微生物用 于接种。

在本发明又一实施例中，所述载体选自蛭石、木炭、发酵糖厂亚硫酸化的压 滤泥浆和酿酒厂的酒糟水的混合物、以及糖厂碳化的压滤泥浆、稻壳、羧甲基纤 维素、泥煤、珍珠岩、滑石粉和聚乙烯基吡咯烷酮。

在本发明又一实施例中，优选的载体选自蛭石、木炭和发酵的压滤泥浆。

在本发明又一实施例中，细菌的数量最佳约为Log 8 CFU/g载体。

在本发明又一实施例中，用于进行生长刺激的植物选自：鹰嘴豆(A. esculentus)、咖啡黄葵、黄瓜、和玉蜀黍、普通小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)和凤仙花(Impatiens balsamina)。

在本发明又一实施例中，在聚生体的例子中，所述菌株的比例约为1∶1∶1。

在本发明又一实施例中，所述生长培养基是NB培养基。

在本发明又一实施例中，使细菌单独在约Log 9-10CFU/ml的浓度中生长， 接着以约1∶1∶1的比例混合培养物。

在本发明又一实施例中，用水以较佳的1∶10的比例稀释所述培养物，使其 含有大约Log 8-9cfu/ml。

在本发明又一实施例中，用堆料调节所述产物的湿度。

在本发明又一实施例中，申请人已发现一种筛选细菌的新方法，以选择具有 控制植物致病性真菌、促进植物生长、对非生物压力耐受和在非生物压力条件下 使磷酸盐增溶的能力的细菌菌株。当采用我们的方法获得的新的细菌用作生物接 种剂时，它们具有在田间条件下控制植物致病性真菌和促进植物生长的能力。

申请人还发现了芽胞杆菌的三种新菌株，当这些菌株单独使用，或者作为聚 生体的新混合物时，它们能提供独特的协同作用，这些菌株具有在田间条件下控 制作为病原体真菌、在田间条件下促进植物生长、对非生物压力耐受和在非生物 压力条件下使磷酸盐增溶的能力。 筛选方法包括：

1.在体外条件下，在营养琼脂平板(NA)上，从牛奶中分离出细菌菌株，选 择具有抑制植物致病性真菌镰形刺盘孢、齐整小核菌、立枯链格孢、青霉属 (Penicillium sp.)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、弯孢、核盘菌和黑曲霉的潜力的细菌。在体外条件下，在营养琼脂平 板(NA)上，在靠近在90毫米直径的培养皿的边缘划出1-4个单独的细菌菌落，然 后在28℃培育两天；接着分别从真菌的来源平板将要测试的真菌的琼脂块接种物 (5平方毫米)转移到上述平板的中心，在NA上培育2-7天；然后选择出具有抑制 真菌生长的生物控制活性的细菌。

2.在温室中筛选步骤1中的细菌，选出在体外条件下具有抑制病原体真菌 生长的潜力的细菌，用作植物生长促进细菌，具体如下：使玉米植株在温室中， 在未灭菌土壤中以约Log 8集落形成单位(cfu)/种子的浓度中生长；使对照玉米植 物如上述生长，但是没有加入细菌；选择使处理的植物具有较大干重的细菌作为 植物生长促进细菌。

3.在体外条件下，对步骤2中的细菌进行筛选，选出在非生物压力(盐、pH 和温度)下具有耐受的植物生长促进剂，具体如下：选择步骤2中具有对6％盐(NaCl) 耐受、pH5-9耐受和55℃温度耐受的细菌作为压力耐受菌。

4.根据步骤3中具有非生物压力耐受的细菌在非生物压力(盐、pH和温度) 条件下使磷酸盐增溶的能力表征细菌，具体如下：使用国家植物学研究所磷酸盐 生长培养基(National Botanical Research Institute′s phosphate growth medium，NBRIP) 在肉汤中进行磷酸盐增溶的定量评估；通过使菌株在含有所示的不同量的 NaCl(w/v)、pH和温度的NBRIP上生长，阐明盐(NaCl)、pH和温度对磷酸盐增溶 的影响。用约Log 9cfu/ml的细菌菌株接种NBRIP培养基；将高压灭菌过的未接 种培养基作为对照。

5.对步骤3中选择的菌株进行筛选，选出能在载体中生存以及具有商业用 途的菌株作为生物接种剂，具体如下：在生长培养基中培育细菌；将对数生长期 细胞加到各种载体中，尤其是蛭石、木炭和发酵的压滤泥浆；之后将接种体施加 到种子上(如通过制备含有载体/细菌混合物和树胶或糖的浆液，以改善其粘附性)， 或者直接施加到土壤中，或者将载体/细菌悬浮液滴加到种植犁沟中，或者玉其它 种植材料混合；使用证明了对植物、种植和土壤具有最大生存能力(在各种存储或 温室或田间条件下)的制剂。

6.使用各种载体如蛭石，将步骤3所选的对非生物压力耐受的细菌进行田 间试验，测试其控制植物致病性〔尤其是真菌，如尖镰孢(Fusarium oxysporum f.sp. ciceri)〕的能力，即减少田间生长的鹰嘴豆上疾病的发病率或严重程度，以及控 制植物致病性(尤其是真菌，如田间生长的甘蔗上的串珠镰孢和镰形刺盘孢)的能 力。

7.使用各种载体，如蛭石和发酵的压滤泥浆，对步骤3中所选的具有非生 物压力耐受的细菌进行田间试验，测试其促进田间生长的植物(如甘蔗)的生长的 能力。

采用上述方法选择的细菌菌株具有控制植物致病性真菌、促进植物生长、对 非生物压力耐受和在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的能力。

根据此发现，本发明的一个目的是提供一种选择这些具有控制植物致病性真 菌、促进植物生长、对非生物压力受和在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的能力 的菌株。

本发明还有一个目的是提供一种筛选细菌的方法，以筛选出具有控制植物致 病性真菌和促进田间条件下植物生长的能力的细菌。

本发明又一目的是提供缓病芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌中具有控制植物致病性 真菌、促进植物生长、对非生物压力耐受和在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的 能力的新菌株。

本发明另一目的是提供用于细菌菌株(尤其是步骤3中在各种载体中生存的缓 病芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的新菌株)的合适载体，用于植物、种子和土壤的生物 接种剂的商业生产。

本发明又一目的是提供缓病芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的新的菌株，该菌株具 有在田间条件下控制植物致病性真菌的能力。

本发明又一目的是提供提供缓病芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的新的菌株，这些 菌株具有在田间条件下促进植物生长的能力。

从这些确切的描述中，将明白本发明的其它目的和优点。但是，应注意的是， 虽然是以详细的描述和特殊的实施例来描述本发明的优选实施方式，但这些描述 和实施例仅仅是阐述性的，因为本领域熟练的技术人员从此详细的描述中将认识 到，在本发明的精神和范围之内有各种改变和修改。

在本说明书中，术语“从牛奶得到的细菌”指通过侵入奶头和/或乳房获得进 入无菌挤出的牛奶中，并在这些次优条件下具有生存和繁殖的持续能力的细菌。 因此，本申请中所述的细菌属于存留在奶头和/或乳房中、代表仍未表征的生态学 生态位的细菌。

已发现，具有针对植物致病性真菌的生物控制活性的细菌菌株百分比在沙希 华母牛的牛奶中是最大的，接着是人、霍斯坦(Holestien)母牛和水牛。从这个参数 可以看出，沙希华母牛的奶要优于人乳、霍斯坦母牛和水牛的牛奶。对从人乳、 沙希华母牛、霍斯坦母牛和水牛的牛奶中收集到的大量细菌菌株进行的广泛筛选 显示，这些菌株中的一些如上述具有刺激植物生长的能力。

因此，本发明的一个方面涉及从人乳、沙希华母牛、霍斯坦母牛和水牛的牛 奶中筛选出有用的细菌以及这些细菌在促进植物生长中的应用。

首先，采用如Eklund和Lankford在《普通微生物学的实验室手册》(Laboratory manual for general microbiology)〔Prentice-Hall，Inc.，USA(1967)，第21-27页〕。 例如，制备连续稀释的牛奶样品，可将其以散铺在各种普通培养基上。可繁殖大 量的细菌的普通培养基的例子包括NA等。接着在适合细菌生长的温度下培育NA 平板1-3天，温度一般约为25-35℃。平板培育的优选温度为30℃。

接着，如先前所述，对该细菌的单个菌株进行第一次筛选，选择出在体外条 件下具有抑制植物致病性真菌的细菌〔C.S.Nautiyal，《当前的微生物学》(Current Microbiology)，第35卷，第52-58页，1997〕。在靠近90毫米直径的培养皿的 边缘划线接种NA平板上的细菌菌落，然后在25-35℃培育平板1-2天。然后分别 从真菌的来源平板将要测试的真菌的琼脂块接种物(5平方毫米)转移到上述平板的 中心。培育5-7天后，在具有生物控制活性的细菌例子中，很容易观察到抑制区。

在用要测试的致病真菌进行激发之前在平板上培育细菌菌落的时间选择，和 后来培育平板以观察抑制区的时间选择依赖于要测试的致病真菌的生长速率。例 如，如果真菌长得较快，如根瘤菌属，则较佳是在要测试的真菌的琼脂块接种物 转移到培养皿的中心之前，预先将NA平板上的细菌菌落在靠近90毫米直径培养 皿的边缘划线接种至少2天。相反，如果真菌生长较慢，如尖镰孢属，则较佳的 是在靠近培养皿边缘划线接种NA平板上的细菌菌落之前，先将要测试的真菌的 情况中接种物转移到培养皿的中心，培养皿培育2-3天，以使真菌有足够的时间 生长。

如先前所述，对先前步骤中分离的细菌菌株进行筛选，选择出在温室条件下 在特殊的浓度中促进植物生长的菌株〔C.S.Nautiyal，《当前的微生物学》，第34 卷，第12-17页，1997〕。在此测试中，玉米的灭菌种子在未灭菌的土壤中生长， 并逐一用所述细菌菌株接种，浓度为Log 6-10cfu/种子。接种体的优选浓度是Log 8cfu/种子。已发现，每托盘具有16个(4×4)空间的托盘(35×35cm)〔每个空间宽 7cm、深10cm，各空间之间间隔1cm〕具有非常便利的尺寸用于温室测试的玉米 和其它植物生长。用未灭菌的土壤将各空间填满到8cm。虽然也可使用灭菌的土 壤或其它任何植物生长支持材料(如蛭石)代替未灭菌的土壤，但是，较佳是在温 室试验中使用从要释放这些细菌于其中的田间获得的未灭菌土壤。

在播种之前，先将自来水加到各个洞中，使土壤有15-30的湿度。优选的土 壤湿度是20％。每个洞加入4粒经细菌处理的种子。温室中的试验各以4组不同 的16粒玉米种子进行，种子分别是未经细菌处理的(对照)和经细菌处理的(处理)。 在各组中，根据16棵植株的平均干重记录21天龄种子的数据。为了将该细菌菌 株用作植物生长促进剂，用该细菌处理的种子的平均干重必须比未经细菌处理的 植株至少高10％。

通过对由此选择得到的细菌菌株在180rpm的New Brunswick Scientific，USA， Innova 4230型冷冻培养摇床中，在含有6％盐(NaCl，pH7，30℃)的营养肉汤(NB) 上过夜(14-16小时)生长的能力进行首次筛选，使该菌株进一步进行非生物压力耐 受测试。对6％盐耐受的菌株在pH9生长(6％NaCl和30℃)，最后对6％盐和pH9 耐受的菌株在55℃生长。在压力存在或缺乏的条件下，在各个时间取出样品，计 算存活的细胞，如本文所述。将连续稀释的各样品(25μl)点到NA平板上，然后在 30℃培养，每份样品做3组试验，如先前所述〔C.S.Nautiyal等，FEMS Microbiology Letters，第182卷，第291-296页，2000〕。在2-3天后计算存活的细胞。

根据它们在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的能力，进一步筛选上述选择的 对非生物压力(盐、pH和温度)耐受的3种细菌菌株。使用国家植物学研究所磷酸 盐生长培养基(NBRIP)在肉汤中进行磷酸盐增溶的定量评估，如先前所述〔C.S. Nautiyal，FEMS Microbiology Letters，第170卷，第265-270页，1999〕。

通过使这些菌株在NBRIP上，在NaCl、pH和温度的存在下生长，测试盐 (NaCl)、pH和温度对磷酸盐增溶的影响，还可配合采用Fiske和Subbarow的方法 〔C.H.Fiske和Y.Subbarow，《生物化学杂志》(Journal of Biological Chemistry)， 第66卷，第375-400页，1925〕。

本主题菌株缓病芽胞杆菌NBR10725、枯草芽胞杆菌NBR11205和缓病芽胞 杆菌NBR13009的分类学特征列在表1中，表中还对比列出了现有技术菌株缓病 芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的特征。

缓病芽胞杆菌NBR10725(本发明)、缓病芽胞杆菌NBR13009(本发明)、缓病 芽胞杆菌(描述)、枯草芽胞杆菌NBR11205(本发明)和枯草芽胞杆菌(描述)的生化 和物理特征的比较如下：

                        缓病芽胞杆菌                  枯草芽胞杆菌

特征                    本发明    本发明    描述*    本发明      描述

                        NBR10725  NBR13009            NBR11205

形状                    杆状      杆状      杆状      卵状        杆状

大小：宽，μm           1.5-2.0   1.5-2.0   0.5-0.5   2.5         0.7-0.8

      长，μm           3.0-6.0   5.0-10.0  1.8-7.0   2.0-3.0  

革兰氏反应              +         +         +         +           +

过氧化氢酶反应          -         -         -         +           +

厌氧生长                +         +         +         -           -

伏-波反应               -         -         -         +           +

V-P肉汤中的pH           5.5       5.2       5.9-6.9   5.8         5.0-8.0

从D-葡萄糖产酸          +         +         +         +           +

从L-阿拉伯糖产酸        -         -         -         +           +

从D-木糖产酸            -         -         -         +           +

从D-甘露糖醇产酸        -         -         -         +           +

从葡萄糖中产气          +         +         +         -           -

酪蛋白水解              -         -         -         +           +

明胶水解                -         -         -         +           +

淀粉水解                -         -         -         +           +

柠檬酸盐的使用          -         -         -         +           +

硝酸盐转变为亚硝酸盐    -         -         -         +           +

形成吲哚                     -      -      -      -      -

在营养肉汤中生长的pH：6.8    +      +      -      +      +

                      5.7    +      +      -      +      +

在NaCl中的生长：2％          +      +      -      +      +

                5％          +      +      -      +      +

                7％          +      +      -      -      +

                10％         +      +      -      -      ND

在30℃的生长                 +      +      +      +      +

在40℃的生长                 +      +      -      +      +

在50℃的生长                 +      +      -      +      +

在55℃的生长                 +      +      -      +      +

在65℃的生长                 -      -      -      -      -

*如以下文献中所述：R.E.Gordon等，《芽胞杆菌属》(The genus Bacillus)， 《农业手册》第427期，美国农业部，美国政府印刷所，华盛顿特区(1973)，ND ＝没有可获得的数据。

采用上述筛选方法从沙希华母牛分离得到的缓病芽胞杆菌NBR10725、枯草 芽胞杆菌NBR11205和缓病芽胞杆菌NBR13009的三种菌株具有控制植物致病性 真菌、促进植物生长、对非生物压力耐受和在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的 能力。已根据布达佩斯条约，在2001年7月5日将缓病芽胞杆菌NBR10725、枯 草芽胞杆菌NBR11205和缓病芽胞杆菌NBR13009保藏到ARS专利培养物保藏 中心，美国农业部，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，美国。缓 病芽胞杆菌NBR10725、枯草芽胞杆菌NBR11205和缓病芽胞杆菌NBR13009的 细菌菌株已分别获得下述NRRL编号：缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞 杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488。

除了上述其它特征以外，这些特殊的缓病芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌菌株的意 想不到和令人惊讶的属性包括下述特征。已从沙华希母牛的牛奶中分离出所有这 三种菌株。这些菌株在培养中有快速的增代时间(55-65分钟，30℃)。纯培养物的 菌株抑制多种植物致病真菌的生长。这些菌株能移居于植物根部。这些细菌减少 温室和田间条件下土壤中的植物病。本发明的菌株能促进温室和田间条件下植物 在土壤中的生长。此外，这些菌株在植物的整个生长季节里在土壤中继续生存。

本发明的芽胞杆菌菌株还对非生物压力如6％盐(NaCl)、5-9pH和55℃耐受。

本发明芽胞杆菌菌株具有使磷酸盐在非生物压力条件下〔如0-4％盐(NaCl)、 pH7-9和30-45℃〕增溶的能力。这些菌株的磷酸盐增溶活性是在存在高盐、高pH 和高温的条件下诱导的。

分离具有控制植物致病性真菌、促进植物生长、对非生物压力耐受和在非生 物压力条件下使磷酸盐增溶的能力的任何类型的细菌也包括在本发明范围之内， 但是，芽胞杆菌是选择的细菌，因为(1)它们易于分离、培养和鉴别；(2)它们是 天然的分离物或菌株，而不需进行遗传工程处理才变得有效；(3)它们在营养方 面是多能的，能利用大量有机底物，包括根部渗出物；(4)它们能抑制一种或多 种致病真菌；(5)在其生命周期中具有一个时期，该时期对恶劣的环境条件有抗 性；(6)对非生物压力(高盐、高pH和高温)耐受；(7)能在非生物压力(高盐、高 pH和高温)条件下使磷酸盐增溶；(8)在田间宿主植物的整个生长季节中都移居于 该植物的根部系统的根际；(9)在田间条件下提高宿主植物的产量；和(10)相对 容易开发用于商业目的。

本发明的另一方面涉及一种控制植物病和促进植物在温室和田间条件下的土 壤中生长的方法。在本方法中，被指定为缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽 胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488这三种菌株特别优选。使 用本发明菌株的接种体，集群的范围在Log 4-10个集落形成单位/克根(cfu/g)，较 佳是Log 6-8cfu/g。指定的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、由约Log 6-10cfu/ml、 较佳是Log 7-8cfu/ml各枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B- 30488菌株以1∶1∶1组成的3种菌株的混合物(聚生体)在本方法中特别优选。可 直接将这种接种体施加到种子或植物上，可以在播种前施加到土壤中，或者通过 喷洒、撒粉等分配到农作物或土壤上面或已播种了农作物的土壤犁沟中。

可通过将种子浸入含有这些细菌的液体中、用这些液体喷洒或采用本领域已 知的其它方法将细菌施加到种子上，从而用含有本发明细菌的组合物包涂处理种 子。

根据本发明的又一方面，可在以1∶1到1∶10的比例的水稀释的糖蜜中分 别使缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆 菌NRRL 3-488的培养物生长。但是，在本方法中，1∶5的稀释度是特别优选的。 可单独使用细菌菌株；或者将其以1∶1∶1的聚生体使用，该聚生体由约Log 6-11 cfu/ml、较佳是Log 8-9cfu/ml组成，这是本方法中特别优选的。由此获得的聚生 体还可用水以1∶10到1∶10000的比例稀释。但是，1∶100的稀释度是本方法 中特别优选的。

使细菌在糖蜜中生长使得本发明在经济上非常可行。以这种方式生长的细菌 还可用于处理种子，即将种子浸入含有这些细菌的液体中，用该液体喷洒种子或 采用本领域已知的其它方法将细菌施加到种子上，从而用含有这些细菌的组合物 包涂种子。

根据本发明的另一方面，本发明方法可使用能在非生物压力条件下生存的任 何种类细菌或其它微生物，如对盐、pH和温度耐受。特别感兴趣的是具有杀生物 活性(如杀真菌、杀虫)以及其它性质、促进植物生长以及在非生物压力条件下(如 高盐、高pH和高温)使磷酸盐增溶的、能在土壤中、在植物上存活的细菌。

可用于分散本发明菌株的载体包括所有通常用于接种农作物的载体，包括如 稻壳、羧甲基纤维素、泥煤、珍珠岩、聚乙烯基-吡咯烷酮以及滑石粉。这些组合 物中的细菌的水平约为Log 4-10cfu/g载体。在本方法中，蛭石或木炭或发酵的压 滤泥浆是特别优选的。使细菌在肉汤中生长至所需的量，然后在所需的接种体中 与载体混合，接着采用已知的方法处理混合物。

根据本发明的实施例，优选的载体依使用的细菌而改变。上述任一种组合物、 液体、粉末、泥煤、土壤、蛭石、木炭、发酵的压滤泥浆等都可包含有养分或适 当的载体介质，如水、油，或者固体基料，如粉末、泥煤、土壤、蛭石、木炭、 发酵的压滤泥浆和任何其它载体制剂。但是，如下面的实施例所证明，蛭石、木 炭、发酵的压滤泥浆是优选的。

本发明的另一方面涉及一种方法，从而将本发明所制备协同组合物以本领域 已知的任何方式使用，例如，包括对土壤或种子或预发芽植物根部进行预处理， 可使用该组合物单独进行预处理，或者与对细菌的生长和生存无害的其它化学品 合用，如促进植物生长的化合物、杀虫剂、肥料、杀线虫剂、除草剂，预处理时 还可存在或不存在用于限制这些材料的作用的严重性的石灰粉末。但是，如下面 的实施例所证明，合适的杀虫剂是优选的。

下面给出的实施例是非限制性的，通过这些实施例，将更容易理解本发明。 实施例1 从牛奶中分离出细菌菌种

从健康的人乳、本土母牛(沙华希母牛)、外来母牛(Holestien Frisian)和水牛的 牛奶各三份样品中选择得到存在于平板上的具有明显的形态学差异的50个代表性 细菌菌落。因此，收集得到600种细菌菌株，用于进一步筛选。从3个哺乳期(婴 儿为6-12周大)母亲中获得人乳。从Gajaria农场(动物饲养部门，Uttar Pradesh政 府，Lucknow)的天然纯种沙华希母牛#12、#217和#249获得牛奶。从印度军事农 场(中央司令部，印度军队，Lucknow)的Holestien Frisian(15/16)母牛#154、#412 和#667获得牛奶。从当地的商业乳牛场的水牛收集牛奶样品。在采取正常的程序 将乳头和人操作装置消毒后，在消毒的容器收集牛奶。在早晨收集牛奶样品，使 从乳头中流出的奶中途直接流到无菌容器中，在其转运过程中，没有任何接触， 并保藏在冰箱中。然后在收集后两小时之内将连续稀释的牛奶样品接种到营养琼 脂(NA)平板上(牛肉膏5.0克，蛋白胨10.0克，氯化钠5.0克，琼脂15克，蒸馏 水1000ml，pH 7.2)。

对平板上具有明显的形态学差异的菌落进行随机的筛选，选出具有代表性的 细菌的单个菌株的纯分离物，然后通过将该单个菌株在NA平板上移种，对其进 行纯化，获得纯的培养物。将各分离物保藏在-25℃的30％甘油的水溶液中。

表2列出了从健康的人乳、沙华希母牛、霍斯坦母牛收集得到的三种牛奶样 品的总细菌数量，为Log 3cfu/ml，表中还列出从水牛得到的牛奶样品的总细菌数 量，为Log 4cfu/ml，高了一个对数单位。

                            表2

参数                        从以下来源获得的牛奶

               人         沙华希母牛    霍斯坦母牛    水牛

细菌(cfu/ml)   Log3.2     Log3.1         Log3.2       Log4.2

实施例2 在体外条件下根据抑制致病真菌和细菌的能力筛选细菌菌株

根据在体外条件下抑制镰形刺盘孢、齐整小核菌、立枯链格孢、青霉属、瓜 果腐霉、棕榈疫霉、弯孢、核盘菌和黑曲霉生长的能力，对实施例1中获得的600 种细菌菌株进行筛选，具体如下：在NA平板上靠近90毫米直径培养皿的边缘在 NA上划线培养四种单独的细菌菌落，将这些平板放置在28℃培育2天。然后分 别从真菌的来源平板将要测试的真菌琼脂块接种物(5平方毫米)转移到上述平板的 中心。在培育5-7天后，在细菌菌株具有生物控制活性的例子中，很容易看到抑 制区，因为在划线周围的真菌的生长被抑制。而在细菌菌株不具有生物控制活性 的例子中，划线周围的真菌生长没有被抑制，真菌向平板的边缘生长(表3)。将显 示出至少2毫米抑制区的菌株选作阳性，并用于下一步工作。

                            表3   致病真菌                  生物控制细菌的％     人   沙华希母牛   霍斯坦母牛     水牛 镰形刺盘孢     0     17     0     8 齐整小核菌     0     8     0     0 立枯链格孢     8     8     8     8 青霉属     8     0     0     0 瓜果腐霉     8     8     8     0 棕榈疫霉     8     8     8     0 弯孢     17     8     8     0 核盘菌     0     17     8     0 黑曲霉     0     17     8     0

已发现，对植物致病真菌显示生物控制作用的细菌菌株％在沙华希母牛中最 大，其次是人、霍斯坦母牛和水牛。从这些参数可以看出，沙华希母牛的奶优于 人乳、霍斯坦母牛和水牛的奶(表2)。将具有至少2毫米抑制区的菌株作为阳性， 用于下一步工作。

根据上述标准，在体外测试的600种菌株中，仅有150种被确定具有生物控 制活性。

实施例3 根据促进温室中植物生长的能力筛选细菌菌株

通过使细菌处理的玉米种子在未灭菌的土壤中生长，并将处理的玉米与未经 细菌处理的玉米植株相比，从而在温室中对体外抑制致病真菌的150种细菌菌株 进行筛选。

本文具体以合玉米为基准，公开对具有促进在本发明温室中的植物生长的能 力的细菌菌株进行筛选的方法。但是，应理解，筛选具有促进温室中的植物生长 的能力的细菌菌株的方法并不限于这种植物，其它任何合适的植物都可使用。

用从国家植物学研究所(Lucknow)的农场获得的未灭菌田间土壤在温室中评 估150种菌株促进植物生长的潜力。

将从平板中得到的生长培养物与10ml、0.85％盐水搅拌48小时，制备用于 玉米种子的细菌接种体。用70％乙醇(5分钟)、20％漂白粉(bleach Chlorox)(10分 钟)在往复摇床上轻微摇动(80RPM，28℃)，接着用无菌水清洗3次。在进行表现 消毒后，将这些种子浸入细菌悬浮液中，在往复摇床上在28℃振摇4小时，该摇 床以100RPM振摇。将对照种子(未经细菌处理)浸入从未接种的平板上洗下来的 0.85％的盐水中。通过搅动各处理组4粒种子，连续稀释后将其接种在NA平板 上，测定种子的细菌化水平。平板在28℃培育48小时后，每个处理组中的3个 种群，进行三组试验，对各种群的cfu/g取平均值，测得平均的cfu/种子。培育经 三种分离物的混合物处理的种子，该混合物中用于接种体的细菌总量与用单分离 物处理所使用的该细菌的量相同。使用该混合物各分离物的1/3标准量。

使用具有16个空间(4×4)的托盘(35×35cm)(每个空间宽7cm、深10cm，相 互之间间隔1cm)种玉米。用未灭菌土壤将各空间填高到8cm。在播种前，将自来 水(25ml)加到各洞中，使土壤的湿度为20％。每个洞中加入4粒经细菌处理的种 子。对于未细菌化(对照)和细菌化(处理)的种子，各分成4个不同组别在温室中进 行试验，对照和处理组各16粒玉米种子。在各组中，根据植物干重，记录21天 大的种子的数据。为了获得用作植物生长促进剂的细菌菌株，经细菌处理的种子 的干重应该必须高于可比的未细菌化植物的至少10％。

在温室试验中测试的150个细菌菌株中，根据上述标准，有50个菌株促进 植物生长。

实施例4 根据非生物压力耐受筛选细菌菌株

进一步对体外抑制致病真菌的、使经细菌处理的玉米种子在未灭菌土壤中生 长时与未经细菌处理的对照玉米植株相比，增加了玉米的植物生长的细菌菌株进 行非生物压力耐受筛选，具体如下：使这些菌株在营养肉汤(NB，牛肉膏5.0g， 蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2)上、在各种压力条件下〔如6 ％盐(NaCl)、5-9pH和55℃温度〕生长，测试它们对盐(NaCl)、pH和温度的压力 耐受。在压力存在或缺乏的情况下，在不同时间取出样品，计算存活的细胞，如 本文所述。首先，使所述50个菌株处于6％的盐压力下。在Innova 4230型致冷 培育摇床(New Brunswick Scientific，美国)上进行测试，该摇床以180rpm摇动。50 种菌株中，有15个能在30℃、6％盐压力下过夜(14-16小时)生长。这15个对6 ％盐压力耐受的菌株也可以在pH 9的压力下过夜生长。但是，15个菌株中，仅 有3个能在55℃的压力下过夜生长。将各样品的连续稀释液(25μl)点到NA平板 上，在30℃培育，进行三组平行试验，如先前所述〔C.S.Nautiyal等，FEMS Microbiology Letters，第182卷，第291-296页(2000)〕。在2-3天后计算存活的 细胞。

在上述进行压力耐受测试的50个菌株中，根据上述标准，有3个菌株，即 缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488具有压力耐受。

实施例5

缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌 NRRL B-30488在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的能力

根据它们在非生物压力条件下使磷酸盐增溶的能力，对体外抑制致病真菌、 使经细菌处理的玉米种子在温室中未灭菌的土壤中生长时比未经细菌处理的对照 玉米植物增加了玉米植株生长、且对非生物压力(盐、pH和温度)耐受的上述3种 菌株，即缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽 胞杆菌NRRL B-30488，进一步进行筛选，具体如下：使用含有10ml培养基的锥 形烧瓶(150ml)进行肉汤中磷酸盐增溶的定量评估，该培养基中接种了细菌菌株 (100μl接种体，大约Log 9cfu/ml)，进行三组平行试验。

当单个菌株在30℃、0％盐(NaCl)、pH 7的条件下，在国家植物研究所磷酸 盐生长培养基〔NBRIP，葡萄糖10g，磷酸钙5g，MgCl2·6H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2g和(NH4)2SO4 0.1g，C.S.Nautiyal，FEMS Microbiology Letters， 第170卷，第265-270页(1999)〕生长时，测试由该菌株增溶的P的量(μg/ml)。 使这些细菌在NaCl(0、1、2和4％)、pH(7和9)、温度(30和45℃)的条件下， 在NBRIP上上生长，测试盐(NaCl)、pH和温度对磷酸盐增溶的影响，如表4所 示。将高压灭菌的、未接种的成批培养物作为阴性对照。在Innova 4230型致冷培 育摇床(New Brunswick Scientific，美国)上在30℃培育烧瓶3天，该摇床以180rpm 摇动。使用Sorvall RC 5C离心机(Dupont，美国)，以10000rpm离心10分钟，收 集菌株。采用Fiske和Subbarow的方法评估培养物上清液中磷酸盐的浓度〔C.H. Fiske和Y.Subbarow，《生物化学杂志》，第66卷，第375-400页，1925〕。

                    表4

                         磷酸盐增溶(μg/ml)

盐(NaCl)％         pH7                    pH9

             30℃       45℃        30℃        45℃

                  菌种：NRRL B-30486

0            3.0        6.6         3.8         6.1

1            4.7        6.5         4.6         11.6

2            4.5        9.9         4.8         11.2

4            4.8        10.5        4.1         10.3

                  菌种：NRRL B-30487

0            2.4        1.3         0.83        1.5

1            3.4        6.0         2.8         3.2

2            6.2        6.0         5.5         5.7

4            2.5        12.5        5.6         13.2

                  菌种：NRRL B-30488

0            33.8       42.9        42.9        43.0

1            17.0       42.9        13.5        43.0

2            12.0       0.0         19.4        43.0

4            13.0       0.0         8.8         43.0

所有3种菌株缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488在高盐、高pH和高温压力存在的体外条件下都 显示出可变的磷酸盐增溶诱导能力。

实施例6

缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌 NRRL B-30488在存在或缺乏高盐和高pH压力的体外条件下抑制致病真菌的能 力

筛选所述3种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株在存在或缺乏高盐和高pH压力的体外条件 下，抗几种植物致病性真菌的生物控制活性(表5)。

                         表5     致病菌株     抑制区(mm)     B-30486     B-30487   B-30488 尖镰孢     pH3，0％盐(NaCl)     10     20   10     pH3，2％盐     20     25   20     pH3，4％盐     10     NG*   20     pH7，0％盐     8     6   7     pH7，2％盐     17     20   15     pH7，4％盐     12     NG   16     pH9，0％盐     5     5   5     pH9，2％盐     20     10   15     pH9，4％盐     13     NG   14     pH11，0％盐     15     10   20     pH11，2％盐     20     20   20     pH11，4％盐     15     10   20 齐整小核菌     pH3，0％盐(NaCl)     5     NZ**   5     pH3，2％盐     10     5   NZ pH3，4％盐     20     5     NG pH7，0％盐     3     10     NZ pH7，2％盐     4     3     2 pH7，4％盐     NG     NG     NG pH9，0％盐     8     NZ     7 pH9，2％盐     13     7     13 pH9，4％盐     25     10     20 pH11，0％盐     5     NZ     NZ pH11，2％盐     20     20     20 pH11，4％盐     20     5     25 在pH7、0％盐的抑制区 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)     6     NZ     3 立枯链格孢     10     6     8 瓜果腐霉     10     4     10 棕榈疫霉     6     12     7 核盘菌     14     10     11 镰形刺孢菌     11     10     NZ 青霉属     2     5     NZ 弯孢     2     3     10 黑曲霉     2     10     3 茎点霉     NZ     5     NZ 串珠镰孢(Fusarium moniliforme)     11     6     10

NG*＝真菌没有生长；NZ**＝没有抑制区

所有3种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓 病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株都证明了在存在高盐和/或pH压力的体外条件下 抗几种植物致病性真菌的可变的生物控制活性。这些菌株还证明可在存在或缺乏 高盐和pH压力的体外条件下抗几种植物致病性真菌的可变的生物控制活性。因 此，开发了使用所有这三种细菌的聚生体的可能性。 实施例7

在体外条件下，单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株以及它们的聚生体与鹰嘴豆植物致病性真菌 的相互作用

进行两个培养试验，使细菌/聚生体在存在或缺乏真菌的情况下在营养肉汤上 生长，测试尖镰孢、立枯链格孢、腐霉属、核盘菌与单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488或者成液 体培养基的聚生体的相互作用。

在含有50ml营养肉汤的150ml锥形烧瓶中分别接种尖镰孢、立枯链格孢、 腐霉属和核盘菌的琼脂块(5毫米直径)。

单独接种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓 病芽胞杆菌NRRL B-30488的悬浮液以及它们的聚生体(含有Log 8.0cfu/ml)，然 后将烧瓶放在30℃的培养摇床中在静止条件下培养7天，对照培养物中没有细菌 的生长。将大约Log 8.0cfu/ml的三种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆 菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488培养物以1∶1∶1的比例混合， 制备它们的聚生体。使用Whatman 1号滤纸滤出用尽的培养基，然后在60℃干燥 真菌团块3天，测定在单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体的存在或缺乏的情况 下真菌生长的菌丝体干重。体外条件下缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞 杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488与尖镰孢、立枯链格孢、腐 霉属、核盘菌的相互作用列在表6中。

                 表6 处理 真菌 干重(mg) 相对于对照的抑制％ 尖镰孢(FO) 1.FO 150 0 2.FO+B-30486 78 48 3.FO+B-30487 96 36 4.FO+B-30488 84 44 5.FO+B-30486+B-30687+B-30488 56 63 立枯链格孢(RS) 1.RS 80 0 2.RS+B-30486 30 63 3.RS+B-30487 34 58 4.RS+B-30488 48 40 5.RS+B-30486+B-30687+B-30488 26 68 腐霉属(PS) 1.PS 50 0 2.PS+B-30486 40 20 3.PS+B-30487 48 4 4.PS+B-30488 23 54 5.PS+B-30486+B-30687+B-30488 21 58 核盘菌(SS) 1.SS 313 0 2.SS+B-30486 72 77 3.SS+B-30487 96 69 4.SS+B-30488 84 73 5.SS+B-30486+B-30687+B-30488 64 80

从表6的结果中可以看出，在体外条件下，所有三种缓病芽胞杆菌NRRL B- 30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株分 别以及它们的聚生体都有效地抑制尖镰孢、立枯链格孢、腐霉属、核盘菌的生长。 但是，这些细菌菌株的聚生体在抑制测试真菌的生长方面最有效。

实施例8

单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞 杆菌NRRL B-30488细菌以及它们的聚生体形式在蛭石载体上的生存

采用下述方法测试单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株以及它们的聚生体形式在10℃ 的温度下，在两个月的时间内在蛭石载体上的生存情况。使缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株 分别在液体生长培养基NB中生长。使培养物在含有1.5升NB培养基的2升烧瓶 中生长，在以180rpm摇动的Innova 4230型冷冻培养摇床(New Brunswick Scientific， USA)中30℃培养2天。生长2天后，将300毫升培养液加到有1kg无菌蛭石的 可高压灭菌的塑料袋中，获得的产物湿度大约为30％。通过以各菌株约Log 8.5 cfu/ml的量以1∶1∶1的比例混合三种菌株，制得缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、 枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株的聚生体。 在30℃培育密封的袋子2天，使其中的生物接种剂制品固化。在固化后，在10℃ 贮存密封的袋子，定期取出等分试样测试存活力(表7)。在NA平板上采用标准连 续稀释方法测定产品的存活力。

                      表7 月数                             Log cfu/g蛭石 B-30486 B-30487 B-30488 B-30486+B-30487+B-30488(聚生体) 0 8.4 8.8 8.4 8.5 1 10.2 9.7 10.3 9.8 2 9.8 9.7 9.9 9.2 4 9.4 9.3 9.6 9.2 6 8.8 8.3 8.9 8.8 9 8.4 8.3 8.5 8.8 12 7.9 7.7 8.3 8.1

如表7所示，在10℃，单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌 NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株以及它们的聚生体形式 在蛭石中长期贮存都显示出良好的生存率。在贮存12个月后，大约存在Log 8cfu/g 蛭石。这些数据表明，蛭石对于以后要接种到种子、植物或土壤上的菌株是一种 优异的载体材料，因为没有观察到细胞存活力有明显的丧失。

实施例9

单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞 杆菌NRRL B-30488细菌以及它们的聚生体形式在温室中对鹰嘴豆植物致病真菌 的生物控制活性

在温室中，针对鹰嘴豆植物致病性真菌，分别筛选缓病芽胞杆菌NRRL B- 30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株以 及它们的聚生体形式。对盛有10g玉米和400g粗砂的1000ml锥形烧瓶进行高 压灭菌，在高压灭菌后，用无菌蒸馏水将湿度调整到15％，从而实现对用于植物 试验的真菌的培养。在30℃，将该烧瓶与一块10毫米直径的琼脂块培育，该琼 脂块是从在黑暗中培养4周的尖镰孢、立枯丝核菌、腐霉属的营养琼脂培养物中 获得。在4周后，风干该混合物，然后研磨，过筛，得到大小为0.5毫米的颗粒。 以每土壤总重0.15％接种体将各接种体与无菌土壤紧密混合，得到每土壤总重0.45 ％的尖镰孢、立枯丝核菌与腐霉的接种体的最终混合物，如先前所述〔C.S. Nautiyal，《当前的微生物学》，第35卷，第52-58页，1997〕。

以4个不同组别进行单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌 NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体形式的生物控 制作用的试验，每组使用30粒鹰嘴豆种子，分为处理种子和未处理种子(对照)。 如实施例3所述，用单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体形式的接种体接种鹰 嘴豆，但在本例中，使用实施例8所述的蛭石为载体，而非直接使用从培养皿获 得的接种体。在各组中，记录5个月的植物生长期间种子发芽率、死亡率(死亡的 种子、根高度矮化、叶子飘落、根脱色(decolourisating))、植株高度、荚数量以及 种子干重的数据。结果列在表8中。

                        表8 观测结果 处理 未接种(对照) 接种 相对于对照的增加％ B-30486 种子发芽率(％) 82  93  13.41 种子死亡率(％) 87  31 -64.36 植株高度(cm) 29  37  27.58 荚/植株数量 39  48 23.07 种子干重/100粒种子(g) 17  20 18.78 B-30487 种子发芽率(％) 71 82 15.49 种子死亡率(％) 87 38 -56.32 植株高度(cm) 29 34 17.24 荚/植株数量 39 43 10.25 种子干重/100粒种子(g) 17 19 12.73 B-30488 种子发芽率(％) 82 100 21.95 种子死亡率(％) 87 28 -67.8 植株高度(cm) 29 41 41.37 荚/植株数量 39 52 33.33 种子干重/100粒种子(g) 17 20 21.95 B-30486+B-30487+B-30488(聚生体) 种子发芽率(％) 82  100 21.95 种子死亡率(％) 87  10 -88.5 植株高度(cm) 29  43 48.27 荚/植株数量 39  61 56.41 种子干重/100粒种子(g) 17  23 39.5

从表8列出的结果可以看出，接种的植物与未接种的对照相比，种子死亡率 较低、种子发芽率、植株高度、荚数量以及种子干重都较好。在接种的植物中， 聚生体在种子死亡率较低、种子发芽率较好、植株高度、荚的数量以及种子干重 方面获得最好的结果。

实施例10

在温室使用鹰嘴豆测试单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体形式的植物生长促进 作用

以4个不同组别进行单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌 NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体形式的促进植 物生长作用的试验，每组使用30粒鹰嘴豆种子，分为处理种子和未处理种子(对 照)。如实施例9所述，使用蛭石作为载体，用单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、 枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体 形式的接种体接种鹰嘴豆。在各组中，记录5个月的植物生长期间种子发芽率、 植株高度、荚数量以及种子干重的数据。结果列在表9中。

                           表9 观测结果 处理 未接种(对照) 接种 相对于对照的增加％ B-30486 种子发芽率(％) 82 100 21.95 植株高度(cm) 29 38 31.03 荚/植株数量 39 53 35.89 种子干重/100粒种子(g) 17 21 27.88 B-30487 种子发芽率(％) 82 92 12.19 植株高度(cm) 29 39 34.48 荚/植株数量 39 46 17.95 种子干重/100粒种子(g) 17 20 18.78 B-30488 种子发芽率(％) 82 100 21.95 植株高度(cm) 29 44 51.72 荚/植株数量 39 59 51.28 种子干重/100粒种子(g) 17 23 40.0 B-30486+B-30487+B-30488(聚生体) 种子发芽率(％) 82 100 21.95 植株高度(cm) 29 46 58.62 荚/植株数量 39 64 64.10 种子干重/100粒种子(g) 17 25 48.48

从表9列出的结果可以看出，接种的植物与未几种的对照相比，在种子发芽 率、植株高度、荚数量以及种子干重方面都较好。在接种的植物当中，聚生体在 种子死亡率较低、种子发芽率较好、植株高度、荚的数量以及种子干重方面获得 最好的结果。

实施例11

温室中缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞 杆菌NRRL B-30488的聚生体形式对各种植物的植物生长促进作用

如实施例8所述，制备种子并用缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆 菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对其接种，测试该聚 生体在温室中对各种植物的植物生长促进作用。温室中使用未细菌化(对照)的和 细菌化(处理)的种子进行试验，分4个不同的组进行，每组16粒种子，这些种子 是玉米、咖啡黄葵、丝瓜、番茄和黄瓜的种子。在各组中，记录21天大的种子的 植物干重数据。温室中缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对各种植物的植物生长促进作用结果列 在表10中。

                         表10 测试植物                 干重(mg/株) 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 1.玉米 67.5 80 18.51 2.咖啡黄葵 20 35 75.0 3.丝瓜 76 110 44.73 4.番茄 2 5 150.0 5.黄瓜 25 110 340.0

表10数据证明了温室中由缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体引起的玉米、咖啡黄葵、丝瓜、 番茄和黄瓜的干重的可变的植物生长促进响应。从这些结果可以看出，细菌化的 种子的干重比未细菌化的种子的干重平均高18-340％。

实施例12

缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌 NRRL B-30488的聚生体抗鹰嘴豆植物致病性真菌的生物控制活性的田间试验

在Banaras Hindu大学(Varanasi)、Chandra Shekhar Azad农业技术大学(Kanpur) 以及印度农业研究所(新德里)的农场中连年受到尖镰孢严重传染的Radhey鹰嘴豆 的土地上进行缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓 病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体抗鹰嘴豆植物致病性真菌的田间生物控制活 性测试。如实施例8所述繁殖细菌菌株。所有的试验都在2000年10月播种，生 长5个月后，即在2001年3月收获。播种时田间土壤的湿度为25-30％，农作物 能获得充足的水分。在播种后没有使用机械化的培育手段。各试验在随机的田块 中进行。在田块中每种处理进行6组重复试验，每田块有3排，每排4米长，排 与排之间间隔30厘米。在发芽10天后，每排以50粒种子间苗播种。对于未细菌 化(对照)的以及经缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和 缓病芽胞杆菌NRRL B-30488(Log 8cfu/ml)的聚生体细菌化的鹰嘴豆种子，所有 的结果都从中间一排收集，作为保护排的邻近两排除外。数值取每组有10株的六 组平行试验的平均值，而干重则为从每组有10株的6组平行试验中随机选出100 粒种子的平均值。

                      表11 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的中间％ 地点：Varanasi 种子存活(％) 55 73 33.69 植株高度(厘米) 41 57 38.05 荚/植株数量 65 79 20.39 100粒种子的重量 17 20 19.87 产量/块(g) 410 725 76.83 地点：Kanpur 种子存活(％) 40 83 105.19 植株高度(厘米) 47 62 32.2 荚/植株数量 62 94 51.61 100粒种子的重量 16 20 24.68 产量/块(g) 345 870 152.17 地点：新德里 种子存活(％) 47 87 85.11 植株高度(厘米) 47 57 21.27 荚/植株数量 44 104 136.36 100粒种子的重量 45 19 26.49 产量/块(g) 450 900 100.0

从表11可以看出，与对照的种子相比，在所有的地方，经缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 细菌化的鹰嘴豆种子改进了植物的性能，在种子存活％、植株高度、荚/植株数量、 100粒种子重量以及产量/块方面都有所提高。

实施例13

单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞 杆菌NRRL B-30488以及它们的聚生体在木炭载体上的生存

根据下述步骤，在10℃，在6个月的时间内，测试单独的3种缓病芽胞杆菌 NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以 及它们的聚生体在木炭载体上的生存。3种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽 胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株分别在液体生长培养 基NB上生长。培养物在含有1.5升NB培养基的2升烧瓶中生长，在30℃，在 以180rpm摇动的Innova 4230型致冷摇床(New Brunswick Scientific，美国)上培育 2天。2天后，将600毫升培养物加到有1kg无菌木炭的可高压灭菌处理的塑料袋 中，获得湿度约为30％的产物。将各自为Log 8.5cfu/ml的三种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株以1∶ 1∶1的比例混合，制得它们的聚生体。在30℃培育密封的袋子2天，使该生物接 种剂制品固化。固化后，在10℃贮存密封的袋子，定期取出等分试样进行存活测 试。在NA平板上采用标准的连续稀释方法测试产物的存活力。

表12显示在10℃，在6个月内，3种单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、 枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株以及它们的聚 生体在木炭载体上收集后的存活。

                               表12   月数                        Log cfu/g木炭 B-30486 B-30487 B-30488 B-0486+B-30487+B-30488(聚生体) 0 8.4 8.8 8.4 8.5 1 9.2 9.5 9.6 9.2 2 9.1 9.1 9.5 9.6 4 8.7 8.4 8.9 8.7 6 7.1 7.6 7.5 7.8

如表12所示，3种单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488菌株以及它们的聚生体在10℃在木炭上 长期贮存时，都显示出良好的生存率。在贮存6个月后，还存在大约Log 7cfu/g。 这些数据表明，木炭是一种用于以后要接种到种子、植物或土壤的菌株的优异的 载体材料，虽然与蛭石相比还是差些。但是，作为一种载体材料，木炭的成本比 蛭石少8倍。因此，木炭的较低成本使得它在作为大规模商业使用的载体方面非 常具有吸引力。

实施例14 使用糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂的酒糟水作为载体，以商业规模制备缓病芽 胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B- 30488的聚生体

进行下列步骤，使用糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂的酒糟水作为载体以商 业规模制备缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病 芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体。

用水以1∶5的比例稀释单独的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌 NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488在糖蜜中生长的培养物。使培养 物在含有1.5升的用水以1∶5的比例稀释的糖蜜的2升烧瓶中生长，在以180rpm 摇动的Innova 4230型致冷摇床(New Brunswick Scientific，美国)，在30℃培育3 天。生长3天后，用各自约Log 9cfu/ml的三种缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯 草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488以1∶1∶1的比例混 合，制得它们的聚生体。进一步用水以1∶10的比例将由此获得的3种细菌菌株 的聚生体稀释，使其含有大约Log 8-9cfu/ml的菌株。细菌在糖蜜中生长使得这 种方法在经济上非常可行。

将用石灰和二氧化硫净化甘蔗汁时获得的约300吨刚亚硫酸化的压滤泥浆铺 放在水泥地板上，铺成宽2.5米，高1.5米，长150米的堆料。在将上述制得的约 600升的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞 杆菌NRRL B-30488的聚生体加入之前，先人工或采用气垫式耕种机搅拌这些压 滤泥浆，并将其搅匀，然后加入聚生体，即每吨压滤泥浆2升聚生体，然后再次 混合。在2-3天内，堆料的温度上升到70-75℃。之后，每天搅拌堆料两次，每天 向堆料喷洒酒糟水，保持湿度为55-65％，如此持续40天。约40次喷洒后，停 止喷洒酒糟水，有规律地翻转堆料3-5天，以将发酵产物的湿度减少到约30％。 通常在45天后，堆料的温度降低到40-45℃。此阶段的产物完全发酵，已可使用 和包装。

为了监测堆料发酵期间芽胞杆菌菌株的存在，在含100μg利福平的NA平板 上分离缓病芽胞杆菌NRRL B-30488R的自发的利福平抗性(Rif)菌株衍生物。选出 与野生型缓病芽胞杆菌NRRL B-30488在含有100μg利福平的琼脂平板上的菌落 大小可比的自发缓病芽胞杆菌NRRL B-30488R菌株，用于进一步的研究。在发 酵过程中，使用含有100μg利福平/ml(足以抑制其它细菌在未灭菌的压滤泥浆和 酒糟水中生长的量)的琼脂平板从堆料中回收缓病芽胞杆菌NRRL B-30488R菌 株。在第45天的发酵产物中，测得缓病芽胞杆菌NRRL B-30488R菌株以Log 8cfu/g 的量存在，表明了缓病芽胞杆菌NRRL B-30488R菌株在发酵过程中的生存、复 制和连续存在。 实施例15

使用糖厂碳化压滤泥浆作为载体以商业规模制备缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、 枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体

使用发酵糖厂碳化压滤泥浆作为载体，用于商业规模制备缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的方法如实施例14所述，但是用水代替酒糟水，以维持发酵过程中的湿度。

实施例16

使用蛭石、木炭、发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水以及糖厂碳化压滤 泥浆作为载体，在温室中的植物上进行缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞 杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体促进植物生长活性 的对比分析

在温室中，使用以蛭石、木炭、发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水 以及糖厂碳化压滤泥浆作为载体的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌 NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体制备和接种种子，测试 温室中缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞 杆菌NRRL B-30488的聚生体对各种植物的植物生长促进作用，如上述各实施例 8、13、14和15所述。温室中使用未细菌化(对照)的和细菌化(处理)的种子进行 试验，分4个不同的组进行，每组16粒种子，这些种子是玉米、咖啡黄葵、丝瓜、 番茄和黄瓜的种子。在各组中，记录21天大的种子的植物干重数据。温室中使用 蛭石、木炭、发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水以及糖厂碳化压滤泥浆 作为载体的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病 芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对各种植物的植物生长促进作用结果列在表13 中。

                      表13     植株                干重(mg)/植株 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 载体：蛭石 1.咖啡黄葵 28 47 67.85 2.黄瓜 30 95 216.67 3.玉米 61 74 21.31 4.普通小麦 15 26 53.33 5.大豆 47 73 55.32 6.豌豆 57 85 49.12 7.凤仙花 1 12 200.0 载体：木炭 1.咖啡黄葵 31 50 61.23 2.黄瓜 34 94 176.4 3.玉米 65 83 27.63 4.普通小麦 17 26 52.94 5.大豆 42 72 71.42 6.豌豆 52 83 59.62 7.凤仙花 4 9 125.0 载体：发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水 1.咖啡黄葵 25 38 52.0 2.黄瓜 28 56 100.0 3.玉米 57 70 22.81 4.普通小麦 13 20 53.84 5.大豆 40 69 72.5 6.豌豆 49 76 55.1 7.凤仙花 5 10 100.0 载体：发酵糖厂碳化压滤泥浆 1.咖啡黄葵 36 54 50.0 2.黄瓜 33 63 90.90 3.玉米 52 66 26.92 4.普通小麦 12 20 66.62 5.大豆 42 71 69.05 6.豌豆 48 74 54.17 7.凤仙花 4 10 150.0

表13中的数据表明了在温室中由缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆 菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体引起的对不同植物的 干重的可变的植物生长促进响应。从这些结果可以看出，预非细菌化种子相比， 使用蛭石、木炭、发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水以及糖厂碳化压滤 泥浆作为载体，咖啡黄葵、黄瓜、玉米、普通小麦、大豆、豌豆、凤仙花的细菌 化种子的干重高21-150％。

实施例17 使用蛭石为载体，进行缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体抗甘蔗植物致病性真菌的生物控制活性 的田间试验

所有的田间试验的田块大小为9.0×3.5米，每个处理有4排，共进行3组平 行试验。

使用品种Cos 95255蔗糖进行田间试验，在种植季节将蔗糖直接播种到含有 缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体的蛭石上，饱和度达20％。

使病原体串珠镰孢和镰形刺盘孢真菌分别在NB上生长，制备它们在液体培 养基中的接种体，用于两个培养物试验。单独将串珠镰孢和镰形刺盘孢的琼脂块(5 毫米直径)接种到含有100毫升NB的250毫升锥形烧瓶中。烧瓶在30℃静止培育 10天。用无菌的0.85％Milli Q盐水(MQW)稀释接种体，得到Log 5-6个孢子/毫 升的孢子浓度。在播种前，将甘蔗种浸到由串珠镰孢和镰形刺盘孢制得的接种体 中30分钟。在种植甘蔗前，还使用该接种体使各排湿透。还在前一年发生枯萎病 高达95％的田块中进行试验。

第一个甘蔗试验使用罐(9英寸直径)，2000年8月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Rozagaon，Faizabad)使用聚生体进行。生长3个月后，将罐中的植物转移到 田间。在2001年8月记录感染植物的数量、植株高度、分蘖数量以及甘蔗围长。 测试结果列在表14中。 表14 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的直径％ 真菌：串珠镰孢 死亡率(％) 30 0 n.a.* 植株高度(厘米) 161.8 181.4 12.11 分蘖数量/株 3.0 6.4 106.4 甘蔗围长(厘米) 5.8 8.1 39.66 真菌：镰形刺盘孢 死亡率(％) 80 0 n.a. 植株高度(厘米) 152 162 6.57 分蘖数量/株 4.6 6.6 43.47 甘蔗围长(厘米) 5.5 7.8 34.48

*ni.a.＝不适用

表14中的结果清楚证明，与未接种的对照相比，使用以蛭石为载体的缓病 芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体接种的处理组，使甘蔗枯萎病和红杆真菌(red rot fungi)受到有效 的生物控制，其分蘖数量、植株高度以及甘蔗围长都有增加。

实施例18 使用蛭石为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体在Rozagaon对甘蔗的植物生长促进作 用的田间测试

在种植季节，将甘蔗块直接播种到含有实施例8制得的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的蛭石上，进行甘蔗的田间试验。2000年8月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Rozagaon) 进行甘蔗试验。在植物生长9个月后，即2001年12月记录甘蔗的分蘖数量、植 株高度、围长、可压榨的茎以及茎产量。使用品种Cos-95255甘蔗在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Rozagaon)进行田间试验。使用蛭石作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B- 30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对 甘蔗的植物生长促进作用的田间试验测试结果列在表15中。

                         表15     观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 分蘖数量/株 6.2 11.0 77.42 植株高度(厘米) 200 246 23.0 甘蔗的围长 9.1 11.24 23.52 可压榨的茎 5 8 60.0 甘蔗产量/块(kg) 128 229 78.9

表15的结果清楚表明，与未接种的对照相比，使用蛭石为载体，缓病芽胞 杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488 的聚生体接种的甘蔗在分蘖数量、植株高度、围长、可压榨的分蘖数量以及甘蔗 产量方面有增加。

实施例19 使用蛭石作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体在Dhampur对甘蔗的植物生长促进作 用的田间试验

在种植季节，将甘蔗块直接播种到含有实施例8制得的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的蛭石上，进行甘蔗的田间试验。2000年11月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur Bijnour)进行甘蔗试验。在植物生长13个月后，即2001年12月记录甘蔗的分蘖 数量、植株高度、甘蔗围长。使用品种Cos-95255甘蔗进行田间试验。使用蛭石 作为载体的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病 芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对甘蔗的植物促进作用的田间试验测试结果列 在表16中。

                         表16 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 分蘖数量/株 6.0 8.4 40.0 植株高度(厘米) 220 251 14.09 甘蔗的围长 7.2 9.4 30.56 可压榨的茎 4 9 125.0 甘蔗产量/块(kg) 128 217 69.53

表16的结果清楚表明，与未接种的对照相比，使用蛭石为载体，缓病芽胞 杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488 的聚生体接种的甘蔗在分蘖数量、植株高度、围长、可压榨的分蘖数量以及甘蔗 产量方面有增加。

实施例20 使用木炭作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对甘蔗的植物生长促进作用的田间试验

在种植季节，将甘蔗块直接播种到含有实施例13制得的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的蛭石上，进行甘蔗的田间试验。2001年4月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur) 进行甘蔗试验。在植物生长10个月后，即2001年12月记录甘蔗的分蘖数量、植 株高度、可压榨的茎和甘蔗产量。使用品种Cos-89003甘蔗在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur)进行田间试验。使用木炭作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、 枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对甘蔗的 植物促进作用的田间试验测试结果列在表17中。

                          表17 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 分蘖数量/株 7.2 10.8 50.0 植株高度(厘米) 255 289 13.33 甘蔗的围长 9.2 10.8 17.33 可压榨的茎 5 9 80.0 甘蔗产量/块(kg) 162 208 28.29

表17的结果清楚表明，与未接种的对照相比，使用木炭为载体，缓病芽胞 杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488 的聚生体接种的甘蔗在分蘖数量、植株高度、围长、可压榨的分蘖数量以及甘蔗 产量方面有增加。

实施例21 使用发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生 体在Dhampur对甘蔗的植物生长促进作用的田间试验

在种植季节，将甘蔗块直接播种到含有实施例14制得的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水载体上，进行甘蔗的田间试验。2001 年5月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur Bijnour)进行甘蔗试验。在植物生长 10个月后，即2001年12月记录甘蔗的分蘖数量、植株高度、甘蔗围长、可压榨 节数和甘蔗产量。使用品种Cos-89003甘蔗在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur) 进行田间试验。使用发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水作为载体，缓病 芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对甘蔗的植物促进作用的田间试验测试结果列在表18中。

                         表18 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 分蘖数量/株 6.2 14 125.8 植株高度(厘米) 248 285 14.91 甘蔗的围长 6.4 11.2 75.0 可压榨的茎 6 11 83.3 甘蔗产量/块(kg) 164 237 44.51

表18的结果清楚表明，与未接种的对照相比，使用发酵糖厂亚硫酸化压滤 泥浆和酿酒厂酒糟水作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体接种的甘蔗在分蘖数量、植株 高度、围长、可压榨的分蘖数量以及甘蔗产量方面有增加。

实施例22

使用发酵糖厂碳化压滤泥浆作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞 杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体在Dhampur对甘 蔗的植物生长促进作用的田间试验

在种植季节，将甘蔗块直接播种到含有实施例14制得的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水载体上，进行甘蔗的田间试验。2001 年5月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur Bijnour)进行甘蔗试验。在植物生长 10个月后，即2001年12月记录甘蔗的分蘖数量、植株高度、甘蔗围长、可压榨 节数和甘蔗产量。使用品种Cos-89003甘蔗在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur) 进行田间试验。使用发酵糖厂碳化压滤泥浆作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B- 30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体对 甘蔗的植物促进作用的田间试验测试结果列在表19中。

                          表19 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 分蘖数量/株 6.2 16 158.0 植株高度(厘米) 248 313 26.2 甘蔗的围长 6.4 12.0 87.5 可压榨的茎 6 11.8 96.0 甘蔗产量/块(kg) 164 256 56.0

表19的结果清楚表明，与未接种的对照相比，使用发酵糖厂碳化压滤泥浆 作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病 芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体接种的甘蔗在分蘖数量、植株高度、围长、可 压榨的分蘖数量以及甘蔗产量方面有增加。

实施例23

使用发酵糖厂碳化压滤泥浆作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞 杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体在Rozagaon对甘 蔗的植物生长促进作用的田间试验

在种植季节，将甘蔗块直接播种到含有实施例15制得的缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体 的发酵糖厂亚硫酸化压滤泥浆和酿酒厂酒糟水载体上，进行甘蔗的田间试验。2001 年5月在Dhampur Sugar Mills Ltd.(Dhampur Bijnour)进行甘蔗的田间试验。在植 物生长8个月后，即2001年12月记录甘蔗的分蘖数量、植株高度、甘蔗围长、 可压榨节数和甘蔗产量。使用品种Cos-96258甘蔗在Dhampur Sugar Mills Ltd. (Dhampur)进行田间试验。使用发酵糖厂碳化压滤泥浆作为载体，缓病芽胞杆菌 NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488的 聚生体对甘蔗的植物促进作用的田间试验测试结果列在表20中。

                            表20 观测结果 处理 未接种的对照 接种 相对于对照的增加％ 分蘖数量/株 6 13 116.6 植株高度(厘米) 230 265 15.22 甘蔗的围长 7.2 9.5 31.94 可压榨的茎 5 11 120.0 甘蔗产量/块(kg) 182  280  53.85

表20的结果清楚表明，与未接种的对照相比，使用发酵糖厂碳化压滤泥浆 作为载体，缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病 芽胞杆菌NRRL B-30488的聚生体接种的甘蔗在分蘖数量、植株高度、围长、可 压榨的分蘖数量以及甘蔗产量方面有增加。

实施例24

杀虫剂对缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽 胞杆菌NRRL B-30488生长的影响的对比分析

筛选缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487和缓病芽 胞杆菌NRRL B-30488细菌菌株，评估杀虫剂对它们的生长的影响，具体如下： 使用含有40毫升培养基的锥形烧瓶(150毫升)评估杀虫剂对肉汤中的细菌菌株的 生长的影响，该培养基中接种了细菌菌株(100μl接种体，约Log 6cfu/ml)，进行 三组试验。计算在NB中，在30℃，在杀虫剂的存在下，上述菌株分别生长1天 后菌株的细胞数量(Log cfu/ml)，根据所建议的剂量使用杀虫剂。杀虫剂对这些菌 株的生长的影响列在表20中。没有任何杀虫剂接种的成批培养物作为对照。在30 ℃，在以180rpm摇动的Innova 4230型冷冻培养摇床(New Brunswick Scientific， 美国)上培育烧瓶1天。

                                 表21 杀虫剂 (活性成分) Log cfu/ml 建议的剂量 B-30486 B-30487 B-30488 对照 0  7 9 7 杀真菌剂 代森锰锌(Mancozeb)75％WP* 3g/L 2 2 NG** 王铜50％WP 6g/L 5 2 3 百菊清(Chlorothalonil)75％WP 3g/L NG 2 NG 克啉菌(Tridemorph)80％EC*** 2ml/L 5 6 NG 三唑酮(Triadimefon)50％WP 4g/L 5 6 5 多菌灵(Carbendazim)50％WP 4g/L 8 10 10 萎锈灵(Carboxin)75％WP 4g/L 5 3 NG 甲霜灵(Metalaxyl)8％+(代森锰锌 (Mancozeb)64％WP 2g/L 10 10 10 甲基托布津(Thiophanate-Methyl) 70％WP 3g/L 5 9 8 杀昆虫剂 久效磷(Monocrotophos)36％ SL**** 1ml/L 3 10 5 乐果(Dimethoate)30％EC 2ml/L 4 7 5 石风吸磷(Oxydemeton-methyl) 25％EC 2ml/L 7 9 7 溴氰菊酯(Deltamethrin)2.8％EC 2ml/L 10 10 10 硫丹(Endosulfan)35％EC 2ml/L 6 7 5 螨净(Dicofol)18.5％EC 2.7ml/L NG 5 3 毒死蜱(Chlorpyriphos)20％EC 2.5ml/L 3 5 3

WP*＝可弄湿的粉末；**NG＝未生长；***EC＝乳化的浓缩物；****SL＝ 可溶的液体。

表21的结果证明了杀虫剂对缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌 NRRL B-30487和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488生长的可变的反应。在所测试的 各种杀虫剂中，多菌灵50％W.P.、甲霜灵8％+代森锰锌64％WP和溴氧菊酯 2.8％EC最适合用于缓病芽胞杆菌NRRL B-30486、枯草芽胞杆菌NRRL B-30487 和缓病芽胞杆菌NRRL B-30488。

应理解，前面的详细描述仅仅是阐述性的，在不偏离本发明的精神和范围的 情况下，可对本发明作出修改和变动。