技术领域
[0001] 本
发明属于细菌纤维素制备技术领域，具体涉及一种高效产细菌纤维素的培养基及细菌纤维素的生产方法。
背景技术
[0002] 由
微生物生物合成的细菌纤维素，与从
植物或海藻中产生的纤维素相比较，其具有超精细的网状结构、高
弹性模量、高拉伸强度、良好的亲
水性和优良的
生物相容性，并且拥有良好的
生物可降解性等独特性质。生产细菌纤维素的培养基，一般以
葡萄糖、蛋白胨和多种无机盐为主要原料，使得菌株的培养成本昂贵且细菌纤维素生产效率底下，从而限制了细菌纤维素的大规模生产及其应用。所以，降低细菌纤维素规模生产的成本、提高相关菌株生产细菌纤维素的效率，是该新型
生物材料推广应用的关键所在。
发明内容
[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效产细菌纤维素的培养基及细菌纤维素的生产方法。
[0004] 为实现上述目的，本案
发明人经过长期研究和大量实践，得以提供本发明技术方案，具体实施过程如下：
[0005] 1.一种高效产细菌纤维素的培养基，通过以下步骤制备获得：
[0006] 1)制备培养基基液：将湿
酒糟加入到米曲汁中浸泡，离心，过滤，即得米曲汁酒糟培养基基液；
[0007] 2)添加营养物：向米曲汁酒糟培养基基液中加入水，调节糖度，再加入补充氮源、
磷酸二氢
钾、
硫酸镁、硫酸亚
铁、
柠檬酸和甘油，并调节pH值为5.0～7.0，得米曲汁酒糟
发酵液，即为生产细菌纤维素的培养基。
[0008] 优选的，所述步骤1)中，米曲汁的制备方法为：将酒曲加入到熟米饭中，混匀，
压实，中间搭窝，用湿纱布罩住，在35～40℃条件下发酵，然后加入开水，在30～35℃条件下，静置，过滤，最后挤出米饭中的米曲汁，即得；所述酒曲与熟米饭的重量配比为1:20。
[0009] 优选的，所述酒曲与熟米饭混匀，压实，中间搭窝，用湿纱布罩住后，置于
培养箱中，设定发酵
温度为37℃，发酵时间为24h。
[0010] 优选的，所述加入开水的温度为80～90℃，然后置于30℃的培养箱中，静置2h。
[0011] 优选的，所述过滤之后，采用两层纱布挤出米饭中的米曲汁。
[0012] 优选的，所述步骤1)中，
湿酒糟为
酿造白酒后的副产物。
[0013] 优选的，所述步骤1)中，湿酒糟在米曲汁中的重量百分含量为1～5％。
[0014] 所述步骤2)中，向米曲汁酒糟培养基基液中加入水，以调节米曲汁酒糟培养基基液的糖度在2.0～10.0BX°之间。其中，米曲汁酒糟培养基基液的糖度可直接加水进行调节，所用水为纯水。
[0015] 优选的，所述步骤2)中，向米曲汁酒糟培养基基液中加入水，以调节米曲汁酒糟培养基基液的糖度为2.0～6.0BX°。
[0016] 优选的，所述步骤2)中，向米曲汁酒糟培养基基液中加入水，以调节米曲汁酒糟培养基基液的糖度为4.0BX°。
[0017] 优选的，所述步骤1)中，离心的转速为7000rpm。
[0018] 优选的，所述步骤2)中，补充氮源为硫酸铵、
酵母浸出物和蛋白胨中的一种或两种。
[0019] 优选的，所述补充氮源为酵母浸出物。
[0020] 优选的，所述步骤2)中，以
质量体积百分比计，每毫升米曲汁酒糟发酵液中，即生产细菌纤维素的培养基中含：0.2～2.3％补充氮源、0.5～1.5％磷酸二氢钾、0.1～0.3％
硫酸镁、0.01～0.03％硫酸亚铁、0.01～0.03％柠檬酸和1～1.5％甘油。
[0021] 优选的，所述步骤2)中，以质量体积百分比计，每毫升米曲汁酒糟发酵液中，即生产细菌纤维素的培养基中含：1.3％补充氮源、0.5％磷酸二氢钾、0.25％硫酸镁、0.03％硫酸亚铁、0.03％柠檬酸和1.5％甘油。
[0022] 优选的，所述步骤2)中，采用氢
氧化钠溶液或
盐酸溶液调节pH值。
[0023] 优选的，所述氢氧化钠溶液或盐
酸溶液的浓度为1mol/L。
[0024] 其中，酒糟是生产白酒后的副产物，是发酵醪经
压榨、分离酒液后的固形物，含有酿酒原料的多种固有成分。酒糟中富含
蛋白质、脂肪等营养成分，又因为酿酒过程中酵母菌的繁殖，使得酒糟增加了大量的菌体蛋白和维生素，所以酒糟的营养十分丰富，可用来作为氮源的主要原料，达到减低成本和避免环境污染的目的。
[0025] 米曲汁是将米饭蒸好后，放入瓷盘或木盘内，冷却后，接种米曲霉进行培养，待制成嫩曲后，加水进行
糖化，过滤，滤汁，即得米曲汁。大米制成的米曲汁具有益气、生津、活血、散结、消肿等功效，同时大米中含
碳水化合物约75％左右，并含有丰富的B族维生素等，为细菌的生长提供了营养条件，因此可以利用米曲汁为主要碳源。
[0026] 2.一种高效产细菌纤维素的培养基制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
[0027] S1、制备细菌纤维素：将米曲汁酒糟发酵液即生产细菌纤维素的培养基进行高温高压灭菌，然后将细菌纤维素的生产菌株按1～5％的接种量，接种于浅盘培养基中，在25～30℃条件下，静置发酵培养，即得细菌纤维素膜；所述细菌纤维素的生产菌株为木醋杆菌菌株；
[0028] S2、处理并收集细菌纤维素：将S1所得细菌纤维素膜洗涤、浸泡、煮沸、再水洗和干燥，即得细菌纤维素成品。
[0029] 优选的，所述S1中，灭菌采用高压锅，灭菌温度为120～125℃。
[0030] 优选的，所述S1中，生产菌株的接种量为2％。其中，接种过程中，需在超净
工作台上进行，以防止其他细菌感染。
[0031] 优选的，所述S1中，静置培养采用在28℃的培养箱中培养，培养时间为5-7d。
[0032] 优选的，所述S2中，煮沸分三步：第一步，将洗涤、浸泡后的细菌纤维素膜用清水煮沸；第二步，用氢氧化钠溶液将清水煮沸后的细菌纤维素继续煮沸；第三步：再用清水将细菌纤维素重复煮沸两次，即可。其中，用氢氧化钠溶液进行煮沸时，需持续至细菌纤维素膜转变成白色半透明状后才煮沸结束，目的在于去除细菌纤维素膜中的色素杂质及残留的培养基营养物质；用清水煮沸两次的目的在于将氢氧化钠溶液洗脱完全。
[0033] 优选的，所述S2中，用水洗涤并浸泡，浸泡的时间为1d。
[0034] 优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L。
[0035] 优选的，所述S2中，干燥过程为：将细菌纤维素膜平铺在玻璃板上，用另一玻璃压紧并固定好，然后置于80℃烘干箱中，完全烘干。
[0036] 本发明的有益效果在于：
[0037] 1)本发明的高效产细菌纤维素的培养基，以价格低廉、制取简单且来源广泛的米曲汁作为主要碳源，以富含
淀粉、蛋白质和18种
氨基酸的酒糟作为主要氮源，与其它无机-有机营养物质混合后，配制成为新型的高效专用生产细菌纤维素的培养基，向培养基中接种产细菌纤维素的菌株后于浅盘培养基中进行发酵培养，即可高效率产细菌纤维素，其生产细菌纤维素的产量干重可达17g/L，具有生产成本低，细菌纤维素产量高的优点，适用于细菌纤维素的规模化生产，具有优良的实际应用价值和发展前景；
[0038] 2)本发明的高效产细菌纤维素的新型专用培养基所用的酒糟，是白酒酿制过程中的副产物，在一般环境中易腐败变质，如不及时处理，常常会产生严重的环境污染。目前，酒糟的处置除丢弃外，主要是用作
饲料原料和/或直接焚烧，不仅附加值不高，还会造成二次污染。本发明以酒糟作为主要氮源用于培养细菌纤维素生产菌株，既可以减轻对环境的污染，又降低了细菌纤维素的生产成本，提高了酒糟的综合利用价值，对我国的资源开发和环境保护具有十分重要的意义。
附图说明
[0039] 图1为本发明细菌纤维素培养基中湿酒糟量对细菌纤维素干重产量的影响；
[0040] 图2为本发明细菌纤维素培养基中糖度对细菌纤维素干重产量的影响；
[0041] 图3为本发明细菌纤维素培养基中pH值对细菌纤维素干重产量的影响；
[0042] 图4本发明细菌纤维素培养基中氮源类型对细菌纤维素干重产量的影响；
[0043] 图5为本发明细菌纤维素培养基中磷酸二氢钾对细菌纤维素干重产量的影响；
[0044] 图6为本发明细菌纤维素培养基中菌株接种量对细菌纤维素干重产量的影响。
具体实施方式
[0045] 下面通过具体
实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0046] 实施例1
[0047] 本实施例高效产细菌纤维素培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0048] 1)制备米曲汁：将100g酒曲加入到2000g米饭中，混匀，压实，中间搭窝，用湿纱布罩住，置于培养箱中，在37℃条件下发酵24h，然后加入2L的85～90℃的开水，置于培养箱中，在30℃条件下，静置2h，过滤，最后用两层纱布挤出米饭中的米曲汁，即得；
[0049] 2)制备培养基基液：以湿酒糟添加的重量百分含量为3％加入到米曲汁中进行浸泡，离心，过滤，即得米曲汁酒糟培养基基液；
[0050] 3)添加营养物：向米曲汁酒糟培养基基液中加入水，调节其糖度为4.0BX°，然后取200mL糖度为4.0BX°的米曲汁酒糟培养基基液，以质量体积百分比计，每毫升米曲汁酒糟发酵液，即生产细菌纤维素的培养基中含：1.3％酵母浸出物、0.5％磷酸二氢钾、0.25％硫酸镁、0.03％硫酸亚铁、0.03％柠檬酸和1.5％甘油，并调节pH值为6.0～6.5，得米曲汁酒糟发酵液，即为生产细菌纤维素的培养基。
[0051] 将米曲汁酒糟发酵液即生产细菌纤维素的培养基制备细菌纤维素的方法为：
[0052] S1、制备细菌纤维素：将生产细菌纤维素的培养基置于高压灭菌锅中，在121℃条件下灭菌20min，在超净工作台上按2％的接种量，接种木醋杆菌菌株于培养基中，然后置于28℃培养箱中静置培养5-7d，即得细菌纤维素膜；
[0053] S2、处理并收集细菌纤维素：将所得细菌纤维素膜用清水洗净并浸泡1d，然后用清水煮沸一次，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液煮沸细菌纤维素膜至白色半透明状，最后再用清水重复煮沸两次，用蒸馏水清洗干净后，平铺在玻璃板上，并用另一玻璃板压紧并固定，置于80℃烘箱中完全干燥，即得。
[0054] 将本实施例1制得的细菌纤维素烘干后称重，并计算产量，结果为每升米曲汁酒糟发酵液即每升生产细菌纤维素的培养基能生产细菌纤维素的干重为17g。
[0055] 实施例2
[0056] 本实施例中，除了步骤2)中，湿酒糟的添加量替换为1％、2％、4％或5％；以外，其余均条件与实施例1相同。
[0057] 将本实施例2制得的细菌纤维素烘干后称量，并计算产量，结果如图1所述。
[0058] 从图1分析可知，随着湿酒糟的添加量的增加，细菌纤维素的产量也随着升高，当湿酒糟的添加量达到3％时，产量不再增加，到达平衡，实验结果表明，当米曲汁中湿酒糟所加的量为3％。细菌纤维素产量最高。
[0059] 实施例3
[0060] 本实施例中，除了步骤3)中，米曲汁酒糟培养基基液的糖度调节为2.0BX°、6.0BX°、8.0BX°或10.0BX°以外，其余条件均与实施例1相同。
[0061] 将本实施例3制得的细菌纤维素烘干后称量，并计算产量，结果如图2所述。
[0062] 从图2中分析可知，随着培养基基液中糖度的升高，细菌纤维素的产量也随之增加；而当培养基基液中糖度到达一定程度时，细菌纤维素产量则不再增加。实验结果表明，细菌纤维素的产量受培养基基液中糖度的影响，糖度2.0-6.0BX°之间时细菌纤维素的产量较高且在糖度为4.0BX°时细菌纤维素的产量最高。
[0063] 实施例4
[0064] 本实施例中，除了步骤3)中，pH值调节为5.0、5.5、6.0、6.5或7.0以外，其余条件均与实施例1相同。
[0065] 将本实施例4制得的细菌纤维素烘干后称量，并计算产量，结果如图3所述。
[0066] 从图3中分析可知，当pH值在5～6之间时，细菌纤维素的干重呈上升趋势，但趋势不明显，当pH值在6.5～7之间时呈下降趋势，综合实验结果表明细菌纤维素的产量受pH值影响，且在pH值6-6.5之间时，细菌纤维素的产量效果最好。
[0067] 实施例5
[0068] 本实施例中，除了步骤3)中，1.3％酵母浸出物替换为不加补充氮源、1.3％硫酸铵、1.3％的质量比例为1:1的蛋白胨和酵母浸出物的混合物或者1.3％的质量比例为1:1的硫酸铵和酵母浸出物的混合物以外，其余条件均与实施例1相同。
[0069] 将本实施例5制得的细菌纤维素烘干后称量，并计算产量，结果如图4所述。
[0070] 图4中，不加补充氮源对应氮源类型1，1.3％硫酸铵对应氮源类型2，1.3％酵母浸出物对应氮源类型3，1.3％的质量比例为1:1的蛋白胨和酵母浸出物的混合物对应氮源类型4，1.3％的质量比例为1:1的硫酸铵和酵母浸出物的混合物对应氮源类型5。从图4中的实验结果表明，米曲汁酒糟培养基基液中也含有氮源，有机氮比无机氮提供的氮源更利于木醋杆菌对葡萄糖的吸收，当只添加1.3％的酵母浸出物时，对细菌纤维素产量影响最大且细菌纤维素的产量最高。
[0071] 实施例6
[0072] 本实施例中，除了步骤3)中，0.5％的磷酸二氢钾替换为0.7％、1.0％、1.25％、或1.5％以外，其余条件均与实施例1相同。
[0073] 将本实施例6制得的细菌纤维素烘干后称量，并计算产量，结果如图5所述。
[0074] 从图5中分析可知，米曲汁酒糟培养基基液中，磷酸二氢钾的添加量对细菌纤维素产量的总体影响不大，但当添加量在0.5％～1.0％之间时，细菌纤维素的产量稍有增加，当磷酸二氢钾的添加量在1.0％～1.5％之间时，细菌纤维素的产量明显成下降趋势，综合考虑，以磷酸二氢钾的添加量为0.5％时，效果最佳。
[0075] 实施例7
[0076] 本实施例中，除了S1中，木醋杆菌菌株的接种量替换为4％、6％、8％和10％以外，其余条件均与实施例1相同。
[0077] 将本实施例7制得的细菌纤维素烘干后称量，并计算产量，结果如图6所述。
[0078] 从图6中分析可知，木醋杆菌菌株的接种量对细菌纤维素产量的影响作用不大。
[0079] 综上所述，本发明的高效产细菌纤维素的培养基，以价格低廉、制作简单、且来源广泛的米曲汁和生产白酒的副产物—酒糟为原料，明显降低了生产成本。而且，本发明所述高效产细菌纤维素的培养基中所用的酒糟，是白酒酿制过程中的副产物，在一般环境中易腐败变质，如不及时处理，常常会产生严重的环境污染。因此，以酒糟作为氮源，既可以减轻对环境的污染，又实现了酒糟的综合利用价值，对我国的资源开发和环境保护具有十分重要的意义。
[0080] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。
本技术领域的技术人员在本发明
基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以
权利要求书为准。
