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一种 酵母高密度增殖 酒糟多肽糖蜜培养剂及制备方法

阅读：725发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于微生物培养技术领域，更具体地涉及一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂及其制备方法。所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂包括红曲黄酒加工副产物制备的的酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖 10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L，调节pH值到4.5±0.2，以此培养剂培养酵母菌，可使酿酒酵母的菌量达到1×108cfu/mL以上。与传统糖蜜培养基培养的酿酒酵母的菌量5×106-1×107cfu/mL相比，酵母菌的菌量提高了1个数量级以上。采用本技术方案制备的酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂生产酿酒酵母具有低成本、高密度的优点，生产每千克菌量达1.0×1010cfu/g鲜酵母可使成本降低80％以上。，下面是一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂及制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂，其特征在于，按质量浓度计，包括：
酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L，所述酒糟多肽为红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:8-12进行混合后经酶解得到的。
2.一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备糖蜜培养基：将糖蜜用蒸馏水进行第一次稀释，调节第一pH值，搅拌加热，保温，冷却，离心，取上清液进行第二次稀释，调节第二pH值，灭菌，得到所述糖蜜培养基；
制备酒糟多肽：将红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:8-12进行混合，调节第三pH值，进行第一酶解，煮沸灭酶，得到所述酒糟多肽；
制备大米糖化液：将米饭与蒸馏水进行混合，第二酶解，煮沸灭酶，得到所述大米糖化液；
制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂：按质量浓度计，取所述酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L进行混合，调节pH值到4.5±0.2，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备酒糟多肽步骤中，所述第一酶解采用混合酶，按照酶的活性含量计，所述混合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶
70-240U/g。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:10进行混合，调节第三pH值为6.0，酶解温度50℃，酶解2-4h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备大米糖化液步骤中，所述第二酶解用的酶为ɑ-淀粉酶和糖化酶，所述ɑ-淀粉酶的用量为50-100U/g，糖化酶的用量为
400-700U/g。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ɑ-淀粉酶的用量为70U/g，糖化酶的用量为560U/g。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二酶解为将重量比为1:5的米饭与蒸馏水混合后在65℃下酶解2-4h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备糖蜜培养基步骤中，所述第一次稀释为将糖蜜用蒸馏水搅拌稀释至可溶性固形物为45-50％，调节第一pH值为用柠檬酸调节pH值至3.5-3.8，搅拌加热至90℃保温10min，冷却后离心取上清液，所述第二次稀释为将上清液稀释至可溶性固形物10％，调节第二pH值为用10％NaOH溶液调节pH值至4.3-4.7，
115℃灭菌20min。

说明书全文

一种酵母高密度增殖 酒糟多肽糖蜜培养剂及制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物培养技术领域，更具体地涉及一种酵母高密度增殖多肽糖蜜培养剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为最早被人类利用的微生物，其营养成分十分丰富，含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素、微量元素及生理活性物质等，酵母品种好坏直接决定所酿黄酒品质的优劣。

[0003] 目前，酿酒酵母的生产方法有以下几种：一是继续沿袭酵母的传统发酵工艺，将糊化后的淀粉糖化，然后继续水解成酵母易于利用的单糖，再接种入酵母菌，使其在适宜温度下进行发酵；二是采用糖蜜替代传统培养基作为酵母菌生产原料，在糖蜜中添加多种酵母生长所必须的维生素，如生物素、泛酸盐、肌醇、硫胺素等,以利于促进酵母生长和提高酵母质量，由于废糖蜜价格较低廉，利用糖蜜作为培养基还能够降低培养成本；三是高密度培养技术(High Cell Density Culture，HCDC)即利用一定的培养方式和发酵设备，使菌体的发酵密度较普通发酵的有一定提高，以此来提高菌体特定代谢产物的比生产率。

[0004] 红曲黄酒是福建特产，黄酒生产的主要副产物是黄酒糟，它是发酵酒醪经压榨、分离去酒液后的留下的固形物。红曲黄酒在生产过程中能产生20-30％的酒糟，以此推算，每年可产生2.5万吨以上的红曲黄酒糟。红曲黄酒糟干基中含有20-40％的蛋白质、20-30％的粗淀粉、10％左右的纤维素及少量的糖分、糊精、灰分等物质，其热能比较低，含有不溶性物质多，难以直接利用，一般酒厂只作为普通的饲料低价出售或作为垃圾直接丢弃，利用率很低。这不仅污染生态环境，也造成酒糟中大量的可利用资源成为废物。因此，将黄酒糟开发为优质的可食用添加剂，可极大的提高产品的附加值，具有很好的经济和社会效益。为此，迫切需要有一种能将红曲黄酒糟资源更好、更高效率进行利用的新途径，避免酒糟资源的浪费，实现资源节约型、环境友好型社会。

[0005] 采用糖蜜作为生产原料，往往需要额外添加碳源、氮源、无机盐等对其进行营养强化，已公开的酿酒酵母培养基配方中主要添加的是葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾等常见碳、氮源及无机盐。传统的发酵工艺具有菌体生物量较低、操作过程不可控、培养结果不稳定的缺陷。关于酿酒酵母的高密度培养技术，国内外也已有较多报道，大多集中在培养基和培养条件的改变，同时通过改变酵母发酵过程中的通气量、二氧化碳释放量等参数来达到酵母的高密度培养，但尚未见通过流加酒糟多肽和大米糖化液液实现高密度培养的研究报道。

[0006] 在实现本发明的过程中，发明人发现酿酒酵母采用糖蜜等常规培养基进行增殖培养的菌量不高，通常都在5×106～1×107cfu/mL。因此需强化糖蜜培养基的营养结构，补充能促进酿酒酵母快速生长的营养强化因子，筛选适宜培养基，辅以科学合适的高密度培养技术，达到提高酵母菌生物量的目的。

发明内容

[0007] 鉴于背景技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种酵母高密度增殖多肽糖蜜培养剂及其制备方法，该酵母高密度增殖多肽糖蜜培养剂的主要原料为被浪费的酿酒副产物——酒糟多肽，该酒糟多肽来源于红曲黄酒酿造副产物黄酒糟，该酒糟多肽作为酿酒酵母的生长促进因子，具备使酿酒酵母发酵密度显著升高的性能，并同时具备相对于现有的酿酒酵母高密度培养技术具有更加节能环保的特性。

[0008] 为实现上述目的，在本发明的第一方面，发明人提供了一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂，按质量浓度计，包括：

[0009] 酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L，所述酒糟多肽为红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:8-12进行混合后经酶解得到的。

[0010] 在本发明的第二方面，发明人提供了一种基于糖蜜的酒糟多肽酵母高密度增殖培养剂的制备方法，包括以下步骤：

[0011] 制备糖蜜培养基：将糖蜜用蒸馏水进行第一次稀释，调节第一pH值，搅拌加热，保温，冷却，离心，取上清液进行第二次稀释，调节第二pH值，灭菌，得到所述糖蜜培养基；

[0012] 制备酒糟多肽：将红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:8-12进行混合，调节第三pH值，进行第一酶解，煮沸灭酶，得到所述酒糟多肽；

[0013] 制备大米糖化液：将米饭与蒸馏水进行混合，第二酶解，煮沸灭酶，得到所述大米糖化液；

[0014] 制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂：按质量浓度计，取所述酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L进行混合，调节pH值到4.5±0.2，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0015] 区别于现有技术，上述技术方案至少具有以下有益效果：

[0016] 有效利用酿酒酵母的营养需求，以酒糟多肽配合大米糖化液和糖蜜培养基作为酿酒酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂，可使酿酒酵母的菌量达到1×108cfu/mL以上，与传统糖蜜培养基5×106～1×107cfu/mL相比，利用该培养基培养使酿酒酵母的发酵密度提高了一个数量级，具有低成本、高密度的优点。附图说明

[0017] 图1、碳源种类及浓度对酿酒酵母JH301生长的影响情况图；

[0018] 图2、氮源种类及浓度对酿酒酵母JH301生长的影响情况图；

[0019] 图3、无机盐种类及浓度对酿酒酵母JH301生长的影响情况图；

[0020] 图4、天然促进因子种类及浓度对酿酒酵母JH301生长的影响情况图。

具体实施方式

[0021] 下面详细说明本发明第一方面的酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂和本发明第二方面的酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂的制备方法。

[0022] 首先说明本发明第一方面所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂，按质量浓度计，包括：酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L，所述酒糟多肽为红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:8-12进行混合后经酶解得到的。

[0023] 本发明所指大米糖化液是将米饭用ɑ-淀粉酶、糖化酶水解后生成大量葡萄糖、麦芽糖与麦芽三糖等还原糖，可为酿酒酵母菌生长提供充足碳源，达到增殖的目的。由于红曲黄酒的酿造是以大米为原料，因此大米糖化液对从红曲黄酒中分离出的酿酒酵母菌的增殖效果更为显著。

[0024] 多肽是氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，也是蛋白质水解的中间产物。肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。红曲黄酒糟是红曲黄酒酿造主要的副产物，其干基总重量中含有20-40％的蛋白质、20-30％的粗淀粉、10％左右的纤维素及少量的糖分、糊精、灰分等物质。本发明所述酒糟多肽是红曲黄酒糟由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，除具备普通多肽上述的优点以外，还具备食用安全性高的特性，特别适用于微生物的增殖培养技术领域。通常，大部分菌株增殖因子都会考虑选择该菌株分离来源的原料，或以原料进行浸提、酶解等处理得到原料处理液。红曲黄酒糟为红曲黄酒发酵副产物，通常人们认为在红曲黄酒酿成时，其营养物质绝大部分都已经被菌株利用殆尽，红曲黄酒糟都是作为畜禽饲料添加物出售或是直接丢弃。在发现本发明的过程中，发明人通过大量的科学探索和比对，通过采用不同的酶组合将红曲黄酒糟的不溶性物质酶解转化为能促进酿酒酵母菌株吸收生长的适宜肽类。

[0025] 采用糖蜜在促进菌类培养时，往往需要额外添加碳源、氮源、无机盐等对其进行营养强化，葡萄糖为微生物培养常用的碳源供体，与酒糟多肽、大米糖化液组合成为酿酒酵母菌适宜利用的营养强化剂，这些物质均可弥补糖蜜培养基碳氮源的营养缺陷。发明人在本发明实现的过程中发现，糖含量不能过多也不能过少，过多的话对酿酒酵母的发酵增殖会产生抑制作用；但若糖含量添加过少，则碳营养源的供给不够充分会限制酿酒酵母的发酵。因此，额外添加的碳源、氮源需要满足一定的比例调配成最适的酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0026] 其次，说明本发明第二方面酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂的制备方法，包括以下步骤：

[0027] 制备糖蜜培养基：将糖蜜用蒸馏水进行第一次稀释，调节第一pH值，搅拌加热，保温，冷却，离心，取上清液进行第二次稀释，调节第二pH值，灭菌，得到所述糖蜜培养基；

[0028] 制备酒糟多肽：将红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:8-12进行混合，调节第三pH值，进行第一酶解，煮沸灭酶，得到所述酒糟多肽；

[0029] 制备大米糖化液：将米饭与蒸馏水进行混合，第二酶解，煮沸灭酶，得到所述大米糖化液；

[0030] 制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂：按质量浓度计，取所述酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L进行混合，调节pH值到4.5±0.2，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0031] 本发明中制备糖蜜培养基时用的糖蜜包括但不局限于白糖、红糖或蜂蜜糖加工生产得到的副产物，其种类没有特别限定。将糖蜜用蒸馏水搅拌稀释至可溶性固形物为45-50％，使用柠檬酸将第一pH值调节至3.5-3.8，搅拌加热至90℃保温10min，冷却后离心取上清液。将上清液稀释至可溶性固形物10％，用10％NaOH溶液调节第二pH值至4.3-4.7，115℃灭菌20min，得到所述糖蜜培养基。

[0032] 制备糖蜜培养基、制备酒糟多肽和制备大米糖化液这三个步骤在具体操作中，并没有必然的先后顺序之分，可以同时进行，也可以分别先后进行，上述排列不应理解为时间的先后，实际上，上述三个步骤可以视具体操作需要调整先后顺序进行。

[0033] 菌类的高密度发酵培养，培养结果评价的单位是干细胞重/升(DCW/L)。在微生物的高密度培养过程中，培养基及培养条件占有很重要的地位。培养基与特定产物产量系数和比生长速率之间存在直接联系，高浓度的培养基成分对菌体有一定的抑制作用；培养条件则与发酵过程中不同菌体的生理生化特性有关，二者均是高密度培养过程中优化的必要途径。

[0034] 作为本发明进一步优选的方案，在所述制备酒糟多肽步骤中，所述第一酶解采用混合酶，按照酶的活性含量计，所述混合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶70-240U/g。

[0035] 作为本发明进一步优选的方案，所述红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:10进行混合，调节第三pH值为6.0，酶解温度50℃，酶解2-4h。

[0036] 作为本发明进一步优选的方案，在所述制备大米糖化液步骤中，所述第二酶解用的酶为ɑ-淀粉酶和糖化酶，所述ɑ-淀粉酶的用量为50-100U/g，糖化酶的用量为400-700U/g；更进一步优选地，所述ɑ-淀粉酶的用量为70U/g，糖化酶的用量为560U/g。

[0037] 更加优选地，所述第二酶解为将重量比为1:5的米饭与蒸馏水混合后在65℃下酶解2-4h。

[0038] 特别优选地，本发明中所述制备糖蜜培养基步骤中，所述第一次稀释为将糖蜜用蒸馏水搅拌稀释至可溶性固形物为45-50％，调节第一pH值为用柠檬酸调节pH值至3.5-3.8，搅拌加热至90℃保温10min，冷却后离心取上清液，所述第二次稀释为将上清液稀释至可溶性固形物10％，调节第二pH值为用10％NaOH溶液调节pH值至4.3-4.7，115℃灭菌
20min。

[0039] 为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。应理解，具体实施例只是列举了优选的实施方式，但并非用于限制本发明的保护范围。

[0040] 本发明中所采用的酿酒酵母菌株JH301(Saccharomyces cerevisiae JH301)于2015年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015226，适用于红曲黄酒酿造。

[0041] 本发明中所采用的酿酒酵母JJ4(Saccharomyces cerevisiae JJ4)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018219，保藏日期为2018年4月19日，适用于红曲黄酒酿造。

[0042] 本发明采用的酿酒酵母JP2(Saccharomyces cerevisiae JP2)，于2010年9月1日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2010214，适用于果酒酿造。

[0043] 本发明采用的酿酒酵母J4(Saccharomyces cerevisiae J4)，于2010年9月1日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2010215，适用于果酒酿造。

[0044] 本发明中所采用的红曲黄酒糟、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶及其他碳源、氮源及无机盐等营养源均来自市售食品级添加剂。

[0045] 菌体生物量(简称菌量)检测方法为GB4789.15-2016《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》(平板菌落计数法)。具体方法如下：

[0046] 将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算-1出样品中的含菌数，以CFU·mL 计数。

[0047] 实施例1

[0048] 评估用本技术方案所提供的酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂对不同酿酒酵母菌发酵密度的影响，实验方法均为：

[0049] 制备糖蜜培养基：将红糖蜜(在不同的具体实施例中，红糖蜜可以用白糖蜜或蜂蜜等进行替换)用蒸馏水搅拌稀释至可溶性固形物为45-50％，使用柠檬酸第一pH值调节至3.5-3.8，搅拌加热至90℃保温10min，冷却后离心取上清液。将上清液稀释至可溶性固形物
10％，用10％NaOH溶液调节第二pH值至4.3-4.7，115℃灭菌20min，得到所述糖蜜培养基。

[0050] 菌种活化：将上述四种酿酒酵母接入100g/L所述糖蜜培养基，于30℃培养24h，备用。

[0051] 制备酒糟多肽：以重量比为1:10称取红曲黄酒糟和水进行搅拌混合，在已设定温度60℃的水浴锅内保温一段时间，煮沸10min，调整pH值6.0，参照表1中不同的酶及加入量数据，加酶，于温度50℃下水解3h，灭酶后以转速10000r/min离心15min，收集上清液，得到所述酒糟多肽。

[0052] 制备大米糖化液：按重量比例为1:5称取米饭与水进行混合，按淀粉酶、糖化酶用量分别为每g米饭70U、560U添加α-淀粉酶和糖化酶，于温度65℃下酶解2h，冷却，备用。酶解后大米糖化液的基质固形物30％、总酸0.23g/L、pH值6.0。

[0053] 制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂：按质量浓度计，取所述酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L进行混合，调节pH值到4.5±0.2，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0054] 发酵：将活化后的酿酒酵母种子液以5％接种量接种入装有高度糖蜜培养基的发酵罐内，培养18-24h。

[0055] 实施例2

[0056] 添加大米糖化液对酿酒酵母生长的影响

[0057] 以酿酒酵母JH301、酿酒酵母JJ4、酿酒酵母JP2和酿酒酵母J4为研究对象，在糖蜜培养基中添加不同量的淀粉酶、糖化酶制备的大米糖化液，发酵24h后，检测发酵液菌量，以单独的糖蜜培养基(不添加大米糖化液)为对照组(CK)，考察大米糖化液的添加对酿酒酵母生长的影响。添加不同制备方式得到的大米糖化液以及对照组的试验设计见表1，经相同培养条件培养酿酒酵母的结果见表2。结果表明，处理1-4得到的4种酿酒酵母菌量显著高于对照组CK(显著水平P>0.05)，说明添加大米糖化液可显著促进酿酒酵母的生长。

[0058] 表1大米糖化液制备方式(单位：U/g)

[0059]

[0060] 表2大米糖化液制备方式对酿酒酵母生长效果的影响(单位：CFU·mL-1)[0061]

[0062]

[0063] 注：*表示与对照组CK的差异达显著水平(P<0.05)。

[0064] 实施例3

[0065] 添加酒糟多肽对酿酒酵母生长的影响

[0066] 以酿酒酵母JH301、酿酒酵母JJ4、酿酒酵母JP2和酿酒酵母J4为研究对象，在糖蜜培养基中添加不同量蛋白酶制备的酒糟多肽，发酵24h后，检测发酵液菌量，以单独的糖蜜培养基(不添加酒糟多肽)为对照组(CK)，研究不同酒糟多肽的添加对酿酒酵母生长的影响。添加不同制备方式得到的酒糟多肽以及对照组的试验设计见表3，经相同培养条件培养酿酒酵母的结果见表4。结果表明，处理5-8的4种酿酒酵母菌量显著高于对照组CK(显著水平P>0.05)，说明添加酒糟多肽可显著促进酿酒酵母的生长。

[0067] 表3不同酒糟多肽制备方式(单位：U/g)

[0068]

[0069] 表4不同酒糟多肽制备方式对酿酒酵母生长效果的影响(单位：CFU·mL-1)[0070]

[0071]

[0072] 注：*表示与对照组CK的差异达显著水平(P<0.05)。

[0073] 实施例4

[0074] 碳源、氮源、天然促进因子及无机盐种类对酿酒酵母生长的影响

[0075] 实验方法具体为：

[0076] (1)按体积分数为2％的接种量接入活化后的酿酒酵母菌种，30℃培养箱静止培养18h后测定活菌量测定OD600值，以CK(单独只加糖蜜培养基)的OD600增值为对照，筛选对菌量有显著促进的增殖因子。

[0077] (2)选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、海藻糖、棉籽糖作为碳源，添加量分别为10、30、50、70、90g/L；

[0078] 氮源：蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、铵水、牛肉膏的添加量分别为5、10、20、30、40、50g/L；

[0079] 无机盐：硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的添加量分别为0.5、1.0、3.0、5.0、7.0g/L；

[0080] 天然产物促进因子：大米糖化液、大豆多糖、酒糟多肽、菊粉、大蒜汁的添加量分别为10、30、50、70、90g/L。

[0081] (3)进行单因素试验，按体积分数2％的接种量接入活化后的菌种，静止培养18h后测定OD600值，以CK(单独只加糖蜜培养基)的OD600增值为对照，筛选对菌量有显著促进的增殖因子，进行均匀试验，各营养源对酿酒酵母JH301生长影响情况请参见图1-4。

[0082] (4)单因素试验结果：促进酿酒酵母JH301生长的适宜碳源为葡萄糖、海藻糖、棉籽糖；适宜氮源为胰蛋白胨；无机盐为磷酸二氢钾；天然促进因子为酒糟多肽、大豆多糖和大米糖化液。

[0083] (a)碳源对酿酒酵母生长的影响

[0084] 由图1可见，随着培养基中碳源质量浓度的增加，添加海藻糖、棉籽糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖的增殖培养基OD600值均呈现先升高后降低的趋势；半乳糖的培养基OD600增值逐渐降低的趋势。添加30g/L葡萄糖、70g/L海藻糖，棉籽糖的处理OD600增值差异不显著，但与其它处理OD600增值均达极显著水平，结果表明，促进酿酒酵母生长的适宜碳源为葡萄糖、海藻糖、棉籽糖。

[0085] (b)氮源对酿酒酵母生长的影响

[0086] 由图2可知以胰蛋白胨作为氮源培养基时，培养18h后酵母的OD600值最高可达到0.64，与CK的OD600增值相比，差异达极显著。添加氨水、硝酸钾、硫酸镁的氮源培养基OD600增值呈逐渐降低的趋势。添加牛肉膏的培养基不同浓度之间OD600增值差异不显著。因此胰蛋白胨为酿酒酵母JH301的适宜氮源。

[0087] (c)无机盐对酿酒酵母生长的影响

[0088] 由图3可知，当培养基中添加无机盐0.5g/L氯化钾，1g/L硫酸镁，3g/L磷酸氢二钾，5g/L磷酸二氢钾时，18h后酵母菌的OD600增值最大。其中磷酸二氢钾OD600增值与CK的OD600增值相比，差异达极显著。因此选择无机盐中的磷酸二氢钾进行后续试验。

[0089] (d)天然促进因子对酿酒酵母生长的影响

[0090] 由图4可知，酒糟多肽对酿酒酵母的增殖作为最为显著，大米糖化液与大豆多糖次之。添加量为50g/L时酒糟多肽，大豆多糖与大米糖化液的OD600增值最高，分别为0.64，0.55，0.51，与CK的OD600增值相比，差异达极显著。因此选择酒糟多肽、大豆多糖和大米糖化液进行后续试验。

[0091] (5)优化试验根据单因素试验结果，选择磷酸二氢钾、胰蛋白胨、海藻糖、葡萄糖、棉籽糖、酒糟多肽、大豆多糖和大米糖化液为促进因子对培养基组分进行优化，按表5方案配制培养基。

[0092] (6)优化试验结果

[0093] 优化试验的结果参见表5。

[0094] 表5优化试验结果

[0095]

[0096] 结果表明，添加促进因子的处理菌量均可较CK提高1个数量级以上，差异均达显著水平。初步优选后的培养基组合为：酒糟多肽10-30g/L、大米糖化液25-50g/L、大豆多糖10-20g/L、棉籽糖10-20g/L、葡萄糖10-20g/L、海藻糖10-20g/L、胰蛋白胨10-35g/L、磷酸二氢钾1.5-4.0g/L和糖蜜培养基100g/L，调节培养基pH值为4.5。

[0097] 实施例5

[0098] 经济成本优化初步优选后的培养基建议添加量组合磷酸二氢钾4.0g/L、胰蛋白胨20g/L、海藻糖15g/L、葡萄糖15g/L、棉籽糖15g/L、酒糟多肽20g/L、大豆多糖20g/L、大米糖化液40g/L，其余为糖蜜100g/L。据调查，相关食品添加剂的市场售价为大豆多糖45元/
500g、棉籽糖69元/500g、葡萄糖3.5元/500g、海藻糖29元/500g、胰蛋白胨40元/500g、磷酸二氢钾50元/500g、糖蜜10元/500g、碱性蛋白酶39元/500g、中性蛋白酶45元/500g、木瓜蛋白酶45元/500g、ɑ-淀粉酶18元/500g、糖化酶18元/500g。对培养基的经济成本进行测算，结果见表7。其中，酒糟多肽制备过程红曲黄酒糟与蒸馏水的料液比为1:10，蛋白酶总添加量为1g/L，成本测算表见表8；大米糖化液制备过程料液比为1:5，成本测算表见表9；糖蜜制备过程100mL原糖蜜经稀释、柠檬酸酸化、煮沸、冷却离心后得到上清液约100mL，此时的可溶性固形物为50％，稀释5倍即为10％糖蜜。结果表明，胰蛋白胨、海藻糖、棉籽糖、大豆多糖的成本为糖蜜的2-5倍，因此在实际应用中，最终确定的最优培养基组合为：酒糟多肽15-30g/L、大米糖化液25-50g/L、葡萄糖10-20g/L和糖蜜培养基50-120g/L，建议添加量的成本仅为
0.63元/L培养基。以建议添加量的培养基可生产酵母菌菌量1.0×108cfu/mL，与传统糖蜜培养基可生产菌量1.0×107cfu/mL相比，生产每kg菌量达1.0×1010cfu/g鲜酵母可降低成本84.25％，即降低成本337元/kg。

[0099] 表7优化培养基成本测算表

[0100]

[0101] 表8酒糟多肽原液成本测算表

[0102]

[0103] 表9大米糖化液原液成本测算表

[0104]

[0105] 实施例6

[0106] 一种酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂的制备方法

[0107] 一种酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂的制备方法，包括以下步骤：制备糖蜜培养基：将糖蜜用蒸馏水进行第一次稀释，调节第一pH值至3.5，搅拌加热至90℃保温10min，冷却，离心，取上清液进行第二次稀释至可溶性固形物10％，用10％NaOH溶液调节第二pH值至4.3，115℃灭菌20min，得到所述糖蜜培养基；

[0108] 制备酒糟多肽：在不同的具体实施方式中，将所述红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为1:10进行混合，调节第三pH值为6.0，采用包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶70-240U/g的混合酶进行酶解，酶解温度50℃，酶解2-4h；

[0109] 制备大米糖化液：将重量比为1:5的米饭与蒸馏水混合后在65℃下用ɑ-淀粉酶和糖化酶，所述ɑ-淀粉酶的用量为70U/g，糖化酶的用量为560U/g酶解2-4h，煮沸灭酶，得到所述大米糖化液；

[0110] 制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂：按质量浓度计，在不同的具体实施方式中，取所述酒糟多肽23.5g/L、大米糖化液45g/L、葡萄糖14g/L和糖蜜培养基100g/L进行混合，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0111] 实施例7

[0112] 一种酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂的制备方法

[0113] 以与实施例6相同的制备方法制备酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂，不同之处在于，制备糖蜜培养基步骤中，调节第一pH值至3.8，用10％NaOH溶液调节第二pH值至4.5，得到所述糖蜜培养基；制备酒糟多肽步骤中，将所述红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为
1:8进行混合；制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂中，按质量浓度计，将所述酒糟多肽15g/L、大米糖化液25g/L、葡萄糖10g/L和糖蜜培养基50g/L进行混合，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0114] 实施例8

[0115] 一种酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂的制备方法

[0116] 以与实施例6相同的制备方法制备酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂，不同之处在于，制备糖蜜培养基步骤中，调节第一pH值至3.6，用10％NaOH溶液调节第二pH值至4.7，得到所述糖蜜培养基；制备酒糟多肽步骤中，将所述红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为
1:12进行混合；制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂中，按质量浓度计，将所述酒糟多肽30g/L、大米糖化液48g/L、葡萄糖19.5g/L和糖蜜培养基118.5g/L进行混合，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0117] 实施例9

[0118] 一种酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂的制备方法

[0119] 以与实施例6相同的制备方法制备酵母高密度增殖酒精多肽糖蜜培养剂，不同之处在于，制备糖蜜培养基步骤中，调节第一pH值至3.7，用10％NaOH溶液调节第二pH值至4.6，得到所述糖蜜培养基；制备酒糟多肽步骤中，将所述红曲黄酒糟与蒸馏水按重量比为
1:11进行混合；制备酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂中，按质量浓度计，将所述酒糟多肽18g/L、大米糖化液30g/L、葡萄糖15g/L和糖蜜培养基90g/L进行混合，得到所述酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂。

[0120] 实施例6-9的试验结果见表10，结果表明，试验内的各处理均可使糖蜜培养基的菌量增加1个数量级以上。

[0121] 表10优化培养基对酿酒酵母生长效果的影响

[0122]

[0123]

[0124] 注：*表示与对照组CK的差异达显著水平(P<0.05)。

[0125] 需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

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一种酵母高密度增殖酒糟多肽糖蜜培养剂及制备方法

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