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一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用

阅读：621发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用，属于微生物病毒领域。本发明血清4型的Ⅰ群禽腺病毒命名为CPHB03株，保藏编号为CCTCC NO：V201651。CPHB03株灭活后加入佐剂乳化，制备成疫苗免疫鸡，能够预防血清4型的Ⅰ群禽腺病毒引发的疫病。CPHB03株对鸡具有致病力，毒力强，可作为Ⅰ群禽腺病毒疫苗效力检验的攻毒毒株。本发明血清4型的Ⅰ群禽腺病毒HB03株在生产疫苗、防控疫病方面具有重要应用价值。，下面是一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒(Aviadenovirus)毒株，其特征在于：保藏编号为CCTCC NO：V201651。
2.权利要求1所述的毒株作为Ⅰ群禽腺病毒疫苗效力检验时的攻毒用毒株的应用。
3.权利要求1所述的毒株在制备Ⅰ群禽腺病毒疫苗中的应用。
4.一种Ⅰ群禽腺病毒疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的毒株。

说明书全文

一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物病毒领域，具体涉及一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用。

背景技术

[0002] Ⅰ群禽腺病毒属于腺病毒科、禽腺病毒属。Ⅰ群禽腺病毒，代表株为致死鸡胚孤儿病毒。它们享有一种共同的群特异性抗原，其中从鸡分离的有12个血清型(FAV1-12)，火鸡两个血清型(TAV1-2)，鹅三个血清型(GAV1-3)和鸭1个血清型。Ⅰ群禽腺病毒可引起禽类不同程度的疫病，且各血清型之间交叉保护效果不佳。

[0003] 近年不断有报道，血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒力增强，在国内多地爆发疫病，造成严重的经济损失。2015年湖北也有多个养鸡场鸡群发病，部分鸡只急性死亡。剖检发现，心包积水、肝脏质脆变色、肾脏肿大、腺胃网状出血。通过病毒分离鉴定、病毒基因组测序分析、动物回归试验等实验证明该病是由血清4型的Ⅰ群禽腺病毒所引起。但国内尚无预防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，也无预防血清4型的Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗。Ⅰ群禽腺病毒疫苗的研制均处在临床阶段或实验室阶段。获得生产特性优良的疫苗毒株，并尽早研发出用于预防血清4型Ⅰ群禽腺病毒的疫苗是有效防控疫病的关键。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用。

[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0006] 一种血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株，本发明将其命名为CPHB03株，CPHB03株于2016年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为Ⅰ群禽腺病毒CPHB03Aviadenovirus CPHB03，保藏号为CCTCC NO：V201651。

[0007] 所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株毒力强，可作为Ⅰ群禽腺病毒疫苗效力检验时的攻毒用强毒使用。

[0008] 所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株可用于制备I群禽腺病毒疫苗。

[0009] 一种Ⅰ群禽腺病毒疫苗，包含所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株。

[0010] 综上，本发明的血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株可作为疫苗生产毒株和疫苗检验毒株生产疫苗、防控疫病。

[0011] 本发明具有的优点和有益效果：本发明将血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株灭活后与矿物油佐剂混合乳化制成灭活疫苗，免疫易感动物(鸡)，免疫后21日，血清中和抗体效价几何平均值10000左右。免疫后21日攻毒，免疫组死亡率、排毒率显著低于空白鸡攻毒组。血清学研究、攻毒保护研究的结果显示，CPHB03株制备的疫苗能够使易感动物产生较高效价的中和抗体、能抵御本病的致死性攻击，能明显降低感染后的排毒率。附图说明

[0012] 图1是血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的遗传进化分析结果图。

[0013] 图2是血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的同源性分析结果图。

具体实施方式

[0014] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0015] 实施例1血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的分离、培养与鉴定

[0016] 2015年湖北某养鸡场蛋鸡群发病、部分鸡只急性死亡。剖检发现，心包积水、肝脏质脆变色、肾脏肿大、腺胃网状出血。

[0017] 无菌取病死鸡的肝脏，用研钵将肝脏研碎，向其中加入灭菌生理盐水，混匀后样品移入15mL离心管，3000rpm离心10min，上清经0.22μm滤器过滤除菌，即为病毒液，备用。将上-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8述病毒液原倍、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 稀释度分别接种长势良好的原代鸡胚肝细胞，置于37℃培养120小时左右，冻收细胞病变达70％左右的最高稀释度的培养物，分装，标记为F1代病毒液，冷冻保存。

[0018] 将F1代病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释度分别接种长势良好的原代鸡胚肝细胞，置于37℃培养120小时左右，冻收细胞病变达70％左右的最高稀释度的培养物，分装，标记为F2代病毒液，冷冻保存。

[0019] 如上操作获得F3代。

[0020] 将F3代病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释度分别接种长势良好的原代鸡胚肝细胞，37℃孵育1小时，吸取、弃去病毒液，加入37℃的含1％琼脂糖的细胞维持液，待琼脂糖凝固后置于37℃、5％CO2培养箱培养120小时左右，10-7稀释度的细胞培养皿中有多个独立存在的可见噬斑，挑取其中一个独立的噬斑，即为F4代病毒，冻融后备用。

[0021] 将F4代病毒液按0.1％(V/V)接种长势良好的原代鸡胚肝细胞，置于37℃培养48小时左右，细胞病变达70％左右，冻收细胞培养物，分装，标记为F5代病毒液，冷冻保存。按《中国兽药典》中外源病毒检验方法检验F5代病毒液，结果显示，F5代病毒液无外源病毒污染，是纯净的病毒液。按此方法传代、放大培养，用于后续研究。

[0022] Hexon蛋白是禽腺病毒主要的抗原蛋白，含有型、组特异性抗原表位及中和抗原表位。编码Hexon蛋白的Hexon基因在亲缘关系较近的禽腺病毒中相对保守，可以用于确定禽腺病毒毒株在禽腺病毒的分类学位置并确定其与其他毒株的进化关系。设计特异性引物(表1)分段(A、B、C三段)测定Hexon基因序列，A、B、C三片段拼接后可获得Hexon全基因序列。提取F5代病毒DNA，用特异性引物(表1)进行PCR检测，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将PCR产物基因测序，并进行同源性分析和遗传进化分析。由结果(图1、2)可以看出，所分离病毒属于Ⅰ群禽腺病毒，与血清4型的Ⅰ群禽腺病毒同源性最接近，与其他型的Ⅰ群禽腺病毒同源性低。因此，鉴定所分离病毒为血清4型的Ⅰ群禽腺病毒，将其命名为CPHB03株。

[0023] 表1.特异性引物

[0024]

[0025] 血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株于2016年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为Ⅰ群禽腺病毒CPHB03Aviadenovirus CPHB03，保藏号为CCTCC NO：V201651。

[0026] 实施例2血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的毒力测定

[0027] 1、CPHB03株对鸡胚肝细胞的毒力(CPHB03株的病毒含量)

[0028] 制备鸡胚肝细胞铺96孔细胞培养板，37℃、5％CO2条件下培养24小时左右，弃去96孔细胞培养板内的细胞生长液。F5代CPHB03株病毒液用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9稀释病毒液接种96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度6个重复孔，置于37℃、5％CO2培养箱培养。接种后7天，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现细胞病变孔的数量，以Reed-Muench法计算被检样品病毒含量。CPHB03株F5代病毒含
8.0
量为10 TCID50/0.1mL。

[0029] 按照上述方法多次测定不同代次(F6代-F13代)的CPHB03株病毒含量，结果见表2。结果显示，CPHB03株病毒含量高，F5代到F13代的病毒含量在108.0TCID50/0.1mL到
109.2TCID50/0.1mL之间，明显高于现有技术已知的血清4型Ⅰ群禽腺病毒毒株。业内公知，以体液免疫为主的疫病，其疫苗中的抗原病毒含量是决定灭活疫苗保护效果的重要指标，据此，血清4型Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株应用于疫苗中更具有优势。

[0030] 表2.各代次CPHB03株病毒含量表

[0031] 代次病毒含量(TCID50/0.1mL)F6代 108.0
F7代 108.5
F8代 108.0
F9代 109.2
F10代 109.0
F11代 109.2
8.5
F12代 10
F13代 109.0

[0032] 2、CPHB03株对易感动物(鸡)的毒力

[0033] 将108.0TCID50/0.1mL、106.0TCID50/0.1mL、104.0TCID50/0.1mL、102.0TCID50/0.1mL的CPHB03株分别肌肉注射接种42日龄SPF鸡10只，每只0.2mL。观察记录发病情况。攻毒后第1、3、5、7、10日，采集喉头、泄殖腔棉拭子，检测喉头、泄殖腔排毒情况。

[0034] 试验鸡攻毒后2-5日出现发病的临床症状，表现为精神沉郁、羽毛逆立，发病后1-2日部分鸡只死亡，不死的鸡逐渐康复；各组死亡率分别为8/10、6/10、5/10、6/10；剖检死亡鸡可见典型的心包积水、肝脏质脆变色、肾脏肿大、腺胃网状出血。攻毒后10日内排毒率10/10。该结果表明，CPHB03株毒力较强，可作为疫苗效力检验时的攻毒用强毒使用。

[0035] 实施例3血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的免疫原性评价

[0036] 向病毒含量为107.5TCID50/0.1mL的CPHB03株病毒液中加入终浓度0.1％(v/v)的甲醛溶液，37℃灭活24小时。取0.5mL灭活后的抗原接种培养了16-24小时的鸡胚肝细胞，作为F1代；F1代培养72小时如无细胞病变再接种培养了24小时的鸡胚肝细胞，作为F2代；F2代培养168小时未见细胞病变说明为被检抗原灭活完全。灭活的抗原中加入吐温80使吐温80占总体积的4％，混匀即为水相；白油中加入司本80和硬脂酸铝，使司本80占总体积的6％、硬脂酸铝与白油的质量体积比为1.5％，混合加热溶解，灭菌后即为油相。水相:油相(体积比)＝1:2的比例以剪切机高速剪切，使成为油乳剂疫苗。

[0037] 取21日龄SPF鸡40只，随机分为4组，每组10只，1、3组颈部皮下注射疫苗，每只0.3mL，2、4组为不免疫对照组。接种后第21日，检测免疫鸡血清中和抗体效价，血清中和抗体效价几何平均值10000左右(表3)。“几何平均值10000左右”是一次免疫能够获得的较高的抗体效价，从而反映CPHB03株毒株具有较好的免疫原性。

[0038] 表3.血清中和抗体效价

[0039] 中和抗体效价(log10) 平均值±标准差1组 4.4、4.4、3.6、4.0、4.5、4.0、4.5、3.5、4.4、3.6 4.1±0.4
3组 4.0、4.5、4.4、4.0、3.6、3.4、4.25、4.0、5.4、4.5 4.2±0.6

[0040] 接种后第21日，1、2组鸡肌肉注射CPHB03株病毒液106.0TCID50/0.1mL，每只0.2mL；3、4组鸡肌肉注射CPHB03株病毒液102.0TCID50/0.1mL，每只0.2mL。观察14日，攻毒后第1、3、
5、7、10日，采集喉头、泄殖腔棉拭子，检测喉头、泄殖腔排毒情况。死亡、排毒情况见表4。结果说明，CPHB03株制备的疫苗能够使易感动物产生较高效价的中和抗体、能抵御本病的致死性攻击，能明显降低感染后的排毒率。

[0041] 表4.死亡、排毒情况

[0042] 组别死亡比例攻毒后第5日排毒比例攻毒后10日内排毒比例1 0/10 1/10 1/10
2 5/10 9/10 10/10
3 0/10 1/10 1/10
4 5/10 10/10 10/10

[0043] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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