在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法
阅读：414发布：2020-05-11
专利汇可以提供在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于缺 氧 性血睾屏障通透作用机制技术领域，公开了一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，建立低氧诱导C57BL/6和睾丸mTOR单基因敲除小鼠缺氧性血睾屏障通透模型，分离并收集mTOR基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持细胞系和小鼠支持细胞株，体外运用western blot、免疫细胞化学、qPCR等技术佐证mTOR对JAM-B调节作用的潜在分子机制。本发明明确缺氧抑制性活化的代谢平衡标记分子mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用及其对活化JAM-B的表达的分子机制，为 治疗 缺氧性血睾屏障通透提供理论依据和治疗策略。，下面是在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法专利的具体信息内容。
1.一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，使用睾丸特异性mTOR单基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠为对象；通过低氧诱导构建缺氧性血睾屏障通透模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM-B表达水平；
步骤二，运用mTOR阻断剂作为手段，将C57BL/6小鼠分为两组；一组行mTOR阻断剂处理；
另一组以生理盐水作为对照；比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及JAM-B的表达水平；
步骤三，分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细胞作为研究对象；体外低氧暴露下，运用westernblot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组支持细胞分泌JAM-B的能力，体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中，mTOR抑制支持细胞表达JAM-B的调节作用和分子机制；
步骤四，体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小管原代培养细胞系和小鼠支持细胞株TM4；比较两刺激组间JAM-B的表达水平；
步骤五，在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM-B的活化作用；
步骤六，在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR作用后，运用野生型小鼠作为研究对象，使用mTOR重组蛋白体内促进mTOR表达，分析比较mTOR对缺氧性血睾屏障通透潜在的效果。
2.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤五中，所述探寻mTOR对JAM-B的活化机制的方法为：
①qPCR和WB明确小鼠睾丸和支持细胞TFEB表达水平，通过激活HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM-B表达，佐证mTOR调节性诱导JAM-B是否依赖TFEB失活予以实现；
②通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF-1α活化程度显著高于对照组支持细胞，并且HIF-1α结合JAM-B转录启动子区缺氧反应元件的结果，实验佐证mTOR调节性诱导JAM-B表达是否依赖HIF-1α激活予以完成。
3.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用的方法包括：
(1)建立低氧诱导的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睾屏障通透模型：
20至25g雄性小鼠采用11.5％氧含量低氧处理，每组共20只小鼠；分别于0、15、30、60天后分析小鼠的血睾屏障及曲精小管病损指标，根据指标初步断定模型的建立是否成功；
(2)观察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化：
低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况，并于0、15、30、60天四个时相点将两组小鼠处死，分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织，ELISA检测两组小鼠不同时间点PI3K/Akt/mTOR途径指标Akt、RagA、Rhe B和mTORC1，观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、透射电镜下曲精小管、性腺病理改变和血睾屏障结构改变，包括组织坏死程度，支持细胞和生殖细胞凋亡；
(3)分析mTOR阻断剂在低氧诱导缺氧性血睾屏障通透中的作用：
将野生型小鼠分为两组，一组体内注射mTOR阻断剂，另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导，比较两组小鼠刺激0、15、30、60天四个时相点曲精小管和血睾屏障病损程度。
4.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述体外明确mTOR对JAM-B的调节作用的方法包括：
(1)分离野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持细胞：小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养、流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达、体外检测低氧诱导野生型及mTOR基因敲除小鼠原代细胞JAM-B的表达水平；
(2)体外检测低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系后JAM-B表达水平：分别用单独低氧和低氧+重组mTOR蛋白刺激细胞系，比较两刺激组细胞。
5.如权利要求4所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述体外检测低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系后JAM-B表达水平：分别用单独低氧和低氧+重组mTOR蛋白刺激细胞系，比较两刺激组细胞包括：
1)ELISA检测两刺激组细胞上清JAM-B表达水平；
2)qPCR检测两刺激组细胞内JAM-B mRNA的转录水平；
3)WB检测两刺激组细胞内JAM-B蛋白表达水平。
6.如权利要求4所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养方法为：将10只8周龄体重为
20-25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血处死，分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液5ml-8ml，轻柔小鼠睾丸部2-3min，无菌条件下，剪碎睾丸，用注射器抽取睾丸液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态，6h贴壁细胞即为支持细胞并换液。
7.如权利要求5所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达的方法为：
收集小鼠曲精小管支持细胞，将得到的细胞用anti-FcγR处理，4℃30分钟，封闭非特异性抗体结合位点，按照抗体使用说明书要求，加入适量的ATP与Trx荧光抗体于细胞悬液中，4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两遍，洗去多余抗体，最后用100ulPBS重悬，标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测，所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析。
8.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述体外佐证mTOR对JAM-B调节作用的分子机理具体包括：
(1)比较低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠不同时间点小鼠睾丸曲精小管组织中TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号活化程度：用低氧分别对mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导，在0h，24h，48h时间点处死小鼠后分离小鼠睾丸曲精小管组织，WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化程度，筛选出缺氧性血睾屏障通透发病中mTOR下游信号通路具体活化的信号途径，进而从体内明确mTOR下游效应分子TFEB和P70S6K1对HIF-1α的调节作用；
(2)检测低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持细胞的TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号活化程度：分离mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞，并用低氧对其进行诱导，比较低氧曝露两组细胞后不同时间点细胞TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化水平；
(3)比较低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号表达水平：分别用单独低氧或联合重组mTOR蛋白刺激细胞系，比较两刺激组细胞不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号途径的活化情况；
(4)评价低氧诱导缺氧性血睾屏障通透模型中，TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路阻断剂对JAM-B产生的影响：选取精母细胞系作为研究对象，ELISA、WB实验比较低氧、mTOR单抗、低氧+mTOR单抗、低氧+mTOR单抗+TFEB、低氧+mTOR单抗+HIF-1α刺激组刺激细胞后，细胞产生JAM-B的能力。
9.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述体内分析重组mTOR蛋白激活JAM-B表达对缺氧性血睾屏障通透可能的治疗效果包括：在明确mTOR激活JAM-B表达的分子基础上，拟进一步采用野生型小鼠作为对象，将其分为两组，一组通过尾静脉注射的方式注射重组mTOR蛋白，另一组用IgG作为对照，而后对两组小鼠进行低氧诱导。
10.如权利要求9所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，其特征在于，进一步包括：
(1)比较两组小鼠在低氧诱导后睾丸曲精小管和血睾屏障病损状况：
分别在两组小鼠低氧诱导后的0h，24h，48h处死小鼠，分离其睾丸组织，石蜡包埋并切片，H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度，免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及透射电镜下睾丸曲精小管和血睾屏障病理改变，包括组织坏死程度，支持细胞和生殖细胞凋亡；
(2)观察两组小鼠低氧诱导后JAM-B表达情况：
在低氧诱导两组小鼠的0h，24h，48h处死小鼠，分别收集性腺、睾丸组织，qPCR及免疫组化分析两组小鼠睾丸组织中JAM-B的表达情况，比较其曲精小管中JAM-B的水平，明确重组单抗mTOR是否存在治疗作用，进一步佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。
在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于缺氧性血睾屏障通透作用机制技术领域，尤其涉及一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法。
背景技术
[0002] 目前，最接近的现有技术：近年来移居青藏铁路沿线的人口越来越多，高原缺氧(乏氧性缺氧)环境对男性移居者生殖功能有显著负面影响，大量关于人类与大鼠精子生成数量减少现象已有报道。以上资料只是表明缺氧引起缺氧性精子生成减少(hypoxic spermatogenesis reduction,HSR)，但具体机制并不清楚。支持细胞之间血睾屏障(Blood-Testis-Barrier,BTB)是精子生成的重要屏障，其中紧密连接(Tight junction,TJ)分子通过及时的拆卸和重组，确保精母细胞通过BTB进入曲精小管腔，所以，如何维持血睾屏障TJ完整是精子生成顺利进行的关键。在前期我们模拟海拔5000米低氧曝露小鼠60天，发现小鼠睾丸曲精小管中支持细胞BTB通透性显著增加(hypoxic blood-testis-barrier permeability,HBTBP)，进一步发现血睾屏障TJ分子mRNA与蛋白表达显著下降，1％氧含量培养小鼠支持细胞48小时，发现小鼠支持细胞电阻显著降低，TJ分子转移至胞浆，且蛋白表达明显降低。因此，低氧通过抑制小鼠TJ分子进而诱导血睾屏障通透，但是低氧抑制紧密连接分子的确切机制尚不清楚。
[0003] 缺氧抑制紧密连接的机制在炎性肠病、酒精性脂肪肝、食管炎和缺血性脑卒中广泛报道，其机制包括细胞内吞和降解紧密连接蛋白、紧密连接蛋白表达减少。但是缺氧抑制支持细胞紧密连接的机制尚不明确，查阅文献也未见报道。我们前期研究发现缺氧抑制睾丸和支持细胞mTORC1(mechanistic Target Of Rapamycin complex 1)表达。mTORC1是细胞对外环境应激(如饥饿)作出反应并控制合成与分解代谢平衡的关键分子。在营养充足条件下，氨基酸激活Rheb-GTP，然后活化mTORC1。同时，氨基酸激活的RagA/B招募mTORC1聚集于溶酶体膜上。因此，以上两个途径共同激活mTORC1。激活后的mTORC1磷酸化TFEB(Transcription factor EB,碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录家族成员)，磷酸化的TFEB不能结合CLEAR(Coordinated lysosomal expression and regulation,溶酶体合成相关基因的转录启动区)元件。因此，溶酶体合成受限，最终导致内吞的胞外蛋白和胞膜上的紧密连接蛋白一起不能被溶酶体降解。饥饿条件下，mTOR从溶酶体膜上易位至胞浆并处于失活状态。去磷酸化的TFEB结合CLEAR元件并诱导溶酶体合成，充足的溶酶体降解内吞的紧密连接蛋白并产生细胞所需的氨基酸。以上资料只是表明mTORC1从溶酶体膜上解离，酶活性降低，而非mTORC1表达减少。
[0004] 众所周知，HIF-1α(Hypoxia inducible factor)是细胞适应缺氧的关键介质，在缺氧细胞中普遍表达，以芳基烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)异二聚体形式存在；在正常氧含量下，脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylases,PHD)使用分子氧作为底物使HIF-1α的脯氨酸残基羟基化，羟基化的HIF-1α被范希佩尔林肿瘤抑制物(Von Hippel-Lindau tumor suppressor,VHL)识别和降解。大多数条件下，缺氧诱导HIF-1α表达。但是在一些特殊细胞类型和缺氧程度较重的细胞中，HIF-1α表达是降低的；例如1％氧含量曝露食管上皮细胞48小时后HIF-1α显著减少；0.5％氧含量曝露星形胶质细胞24小时后HIF-1α降低；本发明研究发现1％氧含量暴露支持细胞48小时后HIF-1α表达显著下降；提示HIF-1α上游可能存在调控分子。相对于mTOR/HIF-1α途径参与肿瘤、炎症、神经退行性病变、肺动脉高压和慢性肾衰竭疾病发生的广泛报道，有关其在血睾屏障中的功能报道还很少。一是缺氧特别是高原低氧引起的血睾屏障通透报道很少，大家关注的也少；二是疾病模型特殊，相比缺血性脑卒中、炎性肠病、食管炎等疾病中血脑屏障通透和血管上皮细胞紧密连接缺失，高原低氧引起的血睾屏障通透很少报道。
[0005] mTOR/HIF-1α途径调控的靶基因涉及血管生成、糖酵解、葡萄糖转运、肿瘤转移、细胞生长。近年来，有关HIF-1α调控Claudin、Occludin和ZO-1(均为紧密连接分子)的研究均已报道。连接黏附分子(junctional adhesion molecule,JAM)属于免疫球蛋白超家族成员，JAM家族成员包括了JAM-A和JAM-B，其中JAM-A与精子尾形成有关，JAM-A缺失会引起精子运动能力下降；JAM-B是精母细胞通过BTB-支持细胞顶端特化区域(Apical ectoplasmic specialization,AES)进入曲精小管腔的关键紧密连接分子，JAM-B缺失会出现大量精母细胞凋亡，JAM-B的及时拆卸/重组对于精母细胞顺利迁移至关重要。
[0006] 综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中针对缺氧能够引起缺氧性精子生成减少(hypoxic spermatogenesis reduction,HSR)的具体机制并不清楚，缺氧性精子生成减少的发病原因不明，mTOR在其中作用的相关文献也未见报道。
[0007] 解决上述技术问题的难度：mTOR基因敲除小鼠繁殖力低，需要经过长时间培育才能达到足够数量的mTOR敲除小鼠开展实验。
[0008] 解决上述技术问题的意义：将给高原居住以及急进高原的男性人群提供生殖保障。从支持细胞的角度来改善低氧引起的精子生成减少，是低氧引起精子生成减少发病机制的延续。
发明内容
[0009] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法。
[0010] 本发明是这样实现的，一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] 步骤一，结合临床缺氧曝露下睾丸mTOR下调的结果，使用睾丸特异性mTOR单基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象。通过低氧诱导构建缺氧性血睾屏障通透模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM-B表达水平，初步了解mTOR对缺氧性血睾屏障通透模型的影响。
[0012] 步骤二，运用mTOR阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组。一组行mTOR阻断剂处理；另一组以生理盐水作为对照；比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及JAM-B的表达水平，进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用。
[0013] 步骤三，分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细胞作为研究对象。体外低氧暴露下，运用westernblot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组支持细胞分泌JAM-B的能力，体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中，mTOR抑制支持细胞表达JAM-B的调节作用和分子机制。
[0014] 步骤四，体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小管原代培养细胞系和小鼠支持细胞株TM4；比较两刺激组间JAM-B的表达水平，进一步深入明确mTOR对JAM-B的调节作用。
[0015] 步骤五，在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM-B的活化作用后，进一步探寻其可能活化机制。
[0016] 步骤六，在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR作用后，运用野生型小鼠作为研究对象，使用mTOR重组蛋白体内促进mTOR表达，分析比较mTOR对缺氧性血睾屏障通透潜在的治疗意义和可能的治疗效果。
[0017] 进一步，步骤五中，所述探寻mTOR对JAM-B的活化机制的方法为：
[0018] 一方面，qPCR和WB明确小鼠睾丸和支持细胞TFEB表达水平，进一步通过激活HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM-B表达，从而佐证mTOR调节性诱导JAM-B是否依赖TFEB失活予以实现；另一方面，通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF-1α活化程度显著高于对照组支持细胞，并且HIF-1α结合JAM-B转录启动子区缺氧反应元件的结果，实验佐证mTOR调节性诱导JAM-B表达是否依赖HIF-1α激活予以完成。
[0019] 进一步，所述明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用的方法包括：
[0020] (1)建立低氧诱导的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睾屏障通透模型：
[0021] mTOR基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小组从南方模式生物科技有限公司定制。野生型对照(WT)小鼠(C57BL/6)购买自第三军医大学实验动物研究中心。20至25g(6至8周龄)雄性小鼠低氧处理(采用11.5％氧含量)，每组共20只小鼠。分别于0、15、30、60天后分析小鼠的血睾屏障及曲精小管病损指标，根据这些指标初步断定模型的建立是否成功。
[0022] (2)观察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化：
[0023] 低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况，并于0、15、30、60天四个时相点将两组小鼠处死，分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织，ELISA检测两组小鼠不同时间点PI3K/Akt/mTOR途径指标(Akt、RagA、RheB和mTORC1)，观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、透射电镜下曲精小管、性腺病理改变和血睾屏障结构改变，包括组织坏死程度，支持细胞和生殖细胞凋亡等。
[0024] (3)分析mTOR阻断剂在低氧诱导缺氧性血睾屏障通透中的作用：
[0025] 将野生型小鼠分为两组，一组体内注射mTOR阻断剂，另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导，比较两组小鼠刺激0、15、30、60天四个时相点曲精小管和血睾屏障病损程度。
[0026] 进一步，所述体外明确mTOR对JAM-B的调节作用的方法包括：
[0027] (Ⅰ)分离野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持细胞：小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养、流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达、体外检测低氧诱导野生型及mTOR基因敲除小鼠原代细胞JAM-B的表达水平。
[0028] (Ⅱ)体外检测低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系(支持细胞)后JAM-B表达水平：分别用单独低氧和低氧+重组mTOR蛋白刺激细胞系(支持细胞)，比较两刺激组细胞：
[0029] 1)ELISA检测两刺激组细胞上清JAM-B表达水平；
[0030] 2)qPCR检测两刺激组细胞内JAM-BmRNA的转录水平；
[0031] 3)WB检测两刺激组细胞内JAM-B蛋白表达水平。
[0032] 进一步，步骤(Ⅰ)中，所述小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养方法为：
[0033] 将10只8周龄体重约为20-25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血处死，分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液5ml-8ml，轻柔小鼠睾丸部2-3min，无菌条件下，剪碎睾丸，用注射器抽取睾丸液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态，6h贴壁细胞即为支持细胞并换液。
[0034] 进一步，步骤(Ⅰ)中，所述流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达的方法为：
[0035] 收集小鼠曲精小管支持细胞，将得到的细胞用anti-FcγR处理，4℃30分钟，封闭非特异性抗体结合位点，按照抗体使用说明书要求，加入适量的ATP与Trx(支持细胞标志)荧光抗体于细胞悬液中，4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两遍，洗去多余抗体，最后用100ulPBS重悬，标记好的细胞用FACSCantoII流式细胞仪检测，所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析。
[0036] 进一步，所述体外佐证mTOR对JAM-B调节作用的分子机理具体包括：
[0038] 用低氧分别对mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导，在0h，24h，48h时间点处死小鼠后分离小鼠睾丸曲精小管组织，WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化程度，筛选出缺氧性血睾屏障通透发病中mTOR下游信号通路具体活化的信号途径，进而从体内明确mTOR下游效应分子TFEB和P70S6K1对HIF-1α的调节作用。
[0039] (2)检测低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持细胞的TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号活化程度
[0040] 参照实验方法中第二部分第1节中的曲精小管支持细胞的分离方法分离mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞，并用低氧对其进行诱导，比较低氧曝露两组细胞后不同时间点细胞TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化水平。
[0041] (3)比较低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系(精母细胞)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号表达水平
[0042] 分别用单独低氧或联合重组mTOR蛋白刺激细胞系(支持细胞)，比较两刺激组细胞不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号途径的活化情况。
[0043] (4)评价低氧诱导缺氧性血睾屏障通透模型中，TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路阻断剂对JAM-B产生的影响
[0044] 选取精母细胞系作为研究对象，ELISA、WB实验比较低氧、mTOR单抗、低氧+mTOR单抗、低氧+mTOR单抗+TFEB(各信号通路阻断剂)、低氧+mTOR单抗+HIF-1α(各信号通路阻断剂)刺激组刺激细胞后，细胞产生JAM-B的能力
[0045] 进一步，所述体内分析重组mTOR蛋白激活JAM-B表达对缺氧性血睾屏障通透可能的治疗效果具体包括：在明确mTOR激活JAM-B表达的分子基础上，拟进一步采用野生型小鼠作为研究对象，将其分为两组，一组通过尾静脉注射的方式注射重组mTOR蛋白，另一组用IgG作为对照，而后对两组小鼠进行低氧诱导：
[0046] (1)比较两组小鼠在低氧诱导后睾丸曲精小管和血睾屏障病损状况：
[0047] 分别在两组小鼠低氧诱导后的0h，24h，48h处死小鼠，分离其睾丸组织，石蜡包埋并切片，H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度，免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及透射电镜下睾丸曲精小管和血睾屏障病理改变，包括组织坏死程度，支持细胞和生殖细胞凋亡等。
[0048] (2)观察两组小鼠低氧诱导后JAM-B表达情况：
[0049] 在低氧诱导两组小鼠的0h，24h，48h处死小鼠，分别收集性腺、睾丸组织，qPCR及免疫组化分析两组小鼠睾丸组织中JAM-B的表达情况，比较其曲精小管中JAM-B的水平，明确重组单抗mTOR是否存在治疗作用，进一步佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。
[0050] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明预实验证明缺氧暴露下，小鼠睾丸mTOR表达降低，且血睾屏障通透性增加，表明缺氧抑制mTORC1的表达在HBTBP发生中起着十分关键作用。在此基础上，本发明检测发现缺氧诱导了巨胞饮-溶酶体系统。所以研究将焦点汇聚在mTORC1对巨胞饮调控研究上。综上，缺氧抑制的m TOR表达可能也通过TFEB介导的溶酶体合成来激活巨胞饮-溶酶体系统，继而降解溶酶体包裹的紧密连接蛋白。
[0051] 本发明发现MHY1485(mTOR特异性激动剂)处理支持细胞能激活HIF-1α，上述结果提示支持细胞可能出现m TOR/HIF-1α途径，但是m TOR/HIF-1α途径并未在动物体内验证。
[0052] 与此同时，本发明利用CHIP技术发现HIF-1α可以结合到JAM-B基因启动子上，提示在缺氧性血睾屏障通透中，HIF-1α与JAM-B可能存在调控机制。课题组前期已报道精母细胞是缺氧性精子生成减少过程中最敏感的生精细胞，那么JAM-B内吞增加或者表达减少均会导致精母细胞凋亡。因此拟假设，低氧抑制m TORC1表达后；一方面，m TORC1表达减少激活巨胞饮-溶酶体系统降解JAM-B；另一方面，m TORC1表达减少后，HIF-1α/JAM-B途径受限，因此，JAM-B表达降低；两方面共同作用促进了支持细胞紧密连接缺失，加重缺氧性血睾屏障通透疾病的程度。
[0053] 本发明提供的一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，明确了缺氧抑制性活化的代谢平衡标记分子mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用及其对活化JAM-B的表达的分子机制，为治疗缺氧性血睾屏障通透提供必要的理论依据和新的治疗策略。
[0054] 迄今为止，缺氧性精子生成减少的发病原因不明，mTOR在其中作用的相关文献也未见报道，通过低氧诱导的mTOR基因敲除小鼠及野生型小鼠这一缺氧性血睾屏障通透模型，将有助于进一步研究其在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用和调节机制。
[0055] 目前睾丸扭转和自身免疫性睾丸炎的研究中，JAM-B作为紧密连接蛋白参与发病已经清楚，但在缺氧性血睾屏障通透中没有相关文献及实验证实其具体作用，也不知晓其具体调节机制。在本发明的预实验中已经佐证：在低氧诱导的缺氧性血睾屏障通透小鼠模型中，mTOR基因敲除小鼠血睾屏障病损程度较对照组严重，提示mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。了解明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用及机制有助于对此疾病深入的了解，并为未来治疗此疾病提供更安全更有效的治疗途径和手段。附图说明
[0057] 图2是本发明实施例提供的技术路线示意图。
[0058] 图3是本发明实施例提供的低氧诱导血睾屏障通透示意图；
[0059] 图中：A.伊文斯蓝渗出；B.透射电镜观察睾丸曲精小管支持细胞紧密连接超微结构(放大倍数×3700)。
[0060] 图4是本发明实施例提供的低氧抑制紧密连接相关分子m RNA和蛋白表达示意图；
[0061] 图中：A.Western blot检测对照组与11.5％氧含量+60d组睾丸组织Claudin-5、Occludin、JAM-B蛋白水平；B.qPCR检测对照组与11.5％氧含量+60d组睾丸组织Claudin-5、Occludin、JAM-BmRNA水平。
[0062] 图5是本发明实施例提供的TM4细胞曝露于21％氧含量和1％氧含量48h后的跨细胞电阻变化示意图，＊p<0.05vs.21％O2.n＝6per group。
[0063] 图6是本发明实施例提供的免疫荧光染色并分别观察21％氧含量+48h组与1％氧含量+48h组TM4细胞紧密连接分子Claudin-5、Occludin、JAM-B分布及荧光强度示意图。
[0064] 图7是本发明实施例提供的低氧抑制TM4细胞紧密连接相关分子Claudin-5、Occludin、JAM-B蛋白表达示意图。
[0065] 图8是本发明实施例提供的低氧抑制睾丸和支持细胞mTORC1表达示意图；
[0066] 图中：A.WB法检测海拔5000米曝露60天组小鼠睾丸mTOR；B.WB法检测21％氧含量+48h组和1％氧含量+48h组TM4细胞mTOR、RagA、RheB、AMPK和TSC2；C.平原对照组和海拔5000米曝露60天的mTORKO组小鼠睾丸伊文斯蓝渗出。
[0067] 图9是本发明实施例提供的低氧诱导支持细胞巨胞饮介导的胞吞示意图；
[0068] 图中：A.WB法检测21％氧含量+48h组和1％氧含量+48h组TM4细胞Caveolin-1和α-adaptin；B.酶标法检测TM4细胞中Fdx70摄取；C.1μg/μl吖啶橙检测21％氧含量+48h组和1％氧含量+48h组TM4细胞溶酶体；D.21％氧含量+48h组和1％氧含量+48h组TM4细胞溶酶体占比。
[0069] 图10是本发明实施例提供的低氧抑制TM4细胞m TOR/HIF-1α途径示意图；
[0070] 图中：A.WB检测21％氧含量+6h、21％氧含量+12h、21％氧含量+24h、21％氧含量+48h、1％氧含量+6h、1％氧含量+12h、1％氧含量+24h、1％氧含量+48h组支持细胞HIF-1α；
B.WB检测21％氧含量+48h和1％氧含量+48h组支持细胞m TOR效应分子p-m TOR、p-4EBP1和p-P70S6K1；C.WB检测1％氧含量+48h和1％氧含量曝露48h+MHY1485(mTOR特异性激动剂)组支持细胞p-mTOR和HIF-1α表达。
B.WB检测21％氧含量+48h和1％氧含量+48h组支持细胞m TOR效应分子p-m TOR、p-4EBP1和p-P70S6K1；C.WB检测1％氧含量+48h和1％氧含量曝露48h+MHY1485(mTOR特异性激动剂)组支持细胞p-mTOR和HIF-1α表达。
[0071] 图11是本发明实施例提供的JAM-B是缺氧下支持细胞中HIF-1α的靶基因示意图；
[0072] 图中：A.Chip技术检测21％O2+48h组和1％O2+48h组TM4细胞中HIF-1α和JAM-B启动子区缺氧反应元件(Hypoxia responsive element,HRE)结合能力；B.JASPAR网站预测HIF-1α与JAM-B转录启动子区结合。
具体实施方式
[0073] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0074] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0075] 如图1所示，本发明实施例提供的一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法包括以下步骤：
[0076] S101：结合临床缺氧曝露下睾丸mTOR下调的结果，使用睾丸特异性mTOR单基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象。通过低氧诱导构建缺氧性血睾屏障通透模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM-B表达水平，初步了解mTOR对缺氧性血睾屏障通透模型的影响。
[0077] S102：运用mTOR阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组。一组行mTOR阻断剂处理；另一组以生理盐水作为对照；比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及JAM-B的表达水平，进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用。
[0078] S103：分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细胞作为研究对象。体外低氧暴露下，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组支持细胞分泌JAM-B的能力，体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中，mTOR抑制支持细胞表达JAM-B的调节作用和分子机制。
[0079] S104：体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小管原代培养细胞系和小鼠支持细胞株TM4；比较两刺激组间JAM-B的表达水平，进一步深入明确mTOR对JAM-B的调节作用。
[0080] S105：在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM-B的活化作用后，进一步探寻其可能活化机制。
[0081] S106：在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR作用后，运用野生型小鼠作为研究对象，使用mTOR重组蛋白体内促进mTOR表达，分析比较mTOR对缺氧性血睾屏障通透潜在的治疗意义和可能的治疗效果。
[0082] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0083] 缺氧性血睾屏障通透(HBTBP)是以支持细胞紧密连接缺失、曲精小管结构破损、生精上皮脱落为特征的综合病症。文献报道细胞内吞和紧密连接分子表达减少是紧密连接缺失的两个重要机制。对其研究时本发明发现HBTBP小鼠睾丸中，mTOR表达较对照组降低，且mTOR敲除小鼠血睾屏障通透性较对照组增加，表明阻断mTOR致使更高程度紧密连接缺失及JAM-B(连接黏附分子2)减少。WB结果提示特异性激活支持细胞mTOR能够激活HIF-1α，但还未在HBTBP模型中得到验证。所以本研究拟推测：缺氧抑制mTOR表达后，一方面激活巨胞饮并内吞降解掉JAM-B；另一方面，通过HIF-1α/JAM-B途径抑制JAM-B表达，以上两方面促使紧密连接缺失，导致血睾屏障通透。
[0084] 为了验证此假设，本研究拟通过如下实验进行：(1)结合缺氧曝露下睾丸mTOR下调的结果，使用睾丸特异性mTOR单基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象。通过低氧诱导构建缺氧性血睾屏障通透模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM-B表达水平，初步了解mTOR对缺氧性血睾屏障通透模型的影响。(2)运用mTOR阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组。一组行mTOR阻断剂处理；另一组以生理盐水作为对照；比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及JAM-B的表达水平，进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用。(3)分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细胞作为研究对象。体外低氧暴露下，运用western blot、免疫细胞化学、q PCR技术，比较刺激后两组支持细胞分泌JAM-B的能力。体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中，mTOR抑制支持细胞表达JAM-B的调节作用和分子机制。(4)体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小管原代培养细胞系和小鼠支持细胞株TM4；比较两刺激组间JAM-B的表达水平，进一步深入明确mTOR对JAM-B的调节作用。(5)在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM-B的活化作用后，进一步探寻其可能活化机制。一方面，qPCR和WB明确小鼠睾丸和支持细胞TFEB表达水平，进一步通过激活HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM-B表达，从而佐证mTOR调节性诱导JAM-B是否依赖TFEB失活予以实现；另一方面，通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF-1α活化程度显著高于对照组支持细胞，并且HIF-1α结合JAM-B转录启动子区缺氧反应元件的结果，实验佐证mTOR调节性诱导JAM-B表达是否依赖HIF-1α激活予以完成。(6)运用野生型小鼠作为研究对象，mTOR重组蛋白作为研究手段，体内促进mTOR表达；分析比较mTOR对缺氧性血睾屏障通透潜在的治疗意义和可能的治疗效果。
[0085] 综上，本研究将明确缺氧抑制性活化的代谢平衡标记分子mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用及其对活化JAM-B的表达的分子机制，为治疗缺氧性血睾屏障通透提供必要的理论依据和新的治疗策略。具体研究内容如下：
[0086] (一)研究方案
[0087] 1、研究目标、内容及问题
[0088] 1.1研究目标
[0089] 1)结合临床缺氧曝露下睾丸mTOR下调的结果，使用mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象，通过低氧的诱导构建缺氧性血睾屏障通透模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况，JAM-B表达水平，初步了解mTOR在缺氧性血睾屏障通透模型中的作用；
[0090] 2)运用mTOR阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组，一组行mTOR阻断剂处理，另一组以生理盐水作为对照，比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及JAM-B的表达水平，进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用；
[0091] 3)分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细胞作为研究对象，低氧体外刺激，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组支持细胞分泌JAM-B的能力，体外佐证缺氧性精子生成减少模型中，mTOR诱导支持细胞表达JAM-B的调节作用和分子机制；
[0092] 4)体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，比较两刺激组间JAM-B的表达水平，进一步深入明确mTOR对JAM-B的调节作用；
[0093] 5)在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM-B的活化作用后，进一步探寻其可能活化机制。一方面，qPCR和WB明确小鼠睾丸和支持细胞TFEB表达水平，进一步通过激活HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM-B表达，从而佐证mTOR调节性诱导JAM-B是否依赖TFEB失活予以实现；另一方面，通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF-1α活化程度显著高于对照组支持细胞，并且HIF-1α结合JAM-B转录启动子区缺氧反应元件的结果，实验佐证mTOR调节性诱导JAM-B表达是依赖HIF-1α活化予以完成；
[0094] 6)在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR作用后，使用mTOR重组蛋白体内促进mTOR表达，分析比较mTOR对缺氧性血睾屏障通透的治疗意义和可能的治疗效果。
[0095] 1.2研究内容
[0096] 1)现象研究
[0097] 建立低氧诱导C57BL/6和睾丸mTOR单基因敲除小鼠缺氧性血睾屏障通透模型，观察野生型小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化及mTOR阻断剂在缺氧性血睾屏障通透中的作用；
[0098] 2)机制研究
[0099] 分离并收集mTOR基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持细胞系和小鼠支持细胞株，低氧体外刺激，分析并比较培养上清的JAM-B水平；低氧单独或联合mTOR刺激小鼠曲精小管原代支持细胞系和小鼠支持细胞株，比较不同刺激组细胞上清JAM-B的表达水平；结合CHIP结果，体外运用westernblot、免疫细胞化学、qPCR等技术佐证缺氧性血睾屏障通透模型中，mTOR对JAM-B调节作用的潜在分子机制；
[0100] 3)治疗研究
[0101] 在明确缺氧性血睾屏障通透中mTOR调节机制的基础上，运用mTOR重组蛋白，体内佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中可能的治疗效应。
[0102] 1.3拟解决关键问题
[0103] 1.3.1关键理论问题：
[0104] 1)mTOR在缺氧性血睾屏障通透中诱导JAM-B表达，减轻疾病发生进展的作用及机制；
[0105] 2)佐证缺氧性血睾屏障通透中mTOR的重要作用，明确mTOR重组蛋白的治疗意义。
[0106] 1.3.2关键技术问题：
[0107] 1)mTOR单基因敲除小鼠及缺氧性血睾屏障通透模型的建立；
[0108] 2)mTOR单基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持细胞的分离及培养；
[0109] 3)westernblot、免疫细胞化学、qPCR等技术的应用。
[0110] 2、拟采取的研究方案及可行性分析
[0111] 2.1技术路线(如图2所示)
[0112] 2.2实验方案
[0114] 第一部分：明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用
[0115] 1.1建立低氧诱导的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睾屏障通透模型mTOR基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小组从南方模式生物科技有限公司定制。野生型对照(WT)小鼠(C57BL/6)购买自第三军医大学实验动物研究中心。20至25g(6至8周龄)
[0116] 雄性小鼠低氧处理(采用11.5％氧含量)，每组共20只小鼠。分别于0、15、30、60天后分析小鼠的血睾屏障及曲精小管病损指标，根据这些指标初步断定模型的建立是否成功。
[0117] 1.3观察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化
[0118] 低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况，并于0、15、30、60天四个时相点将两组小鼠处死，分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织，ELISA检测两组小鼠不同时间点PI3K/Akt/mTOR途径指标(Akt、RagA、RheB和mTORC1)，观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、透射电镜下曲精小管、性腺病理改变和血睾屏障结构改变，包括组织坏死程度，支持细胞和生殖细胞凋亡等。
[0119] 1.4分析mTOR阻断剂在低氧诱导缺氧性血睾屏障通透中的作用
[0120] 将野生型小鼠分为两组，一组体内注射mTOR阻断剂，另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导，比较两组小鼠刺激0、15、30、60天四个时相点曲精小管和血睾屏障病损程度。
[0121] 第二部分：体外明确mTOR对JAM-B的调节作用
[0122] 2.1分离野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持细胞：
[0123] 2.1.1小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养
[0124] 将10只8周龄体重约为20-25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血处死，分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液5ml-8ml，轻柔小鼠睾丸部2-3min，无菌条件下，剪碎睾丸，用注射器抽取睾丸液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态，6h贴壁细胞即为支持细胞并换液。
[0125] 2.1.2流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达
[0126] 按照上述方法收集小鼠曲精小管支持细胞，将得到的细胞用anti-FcγR处理，4℃30分钟，封闭非特异性抗体结合位点，按照抗体使用说明书要求，加入适量的ATP与Trx(支持细胞标志)荧光抗体于细胞悬液中，4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两遍，洗去多余抗体，最后用100ulPBS重悬，标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测，所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析。
[0127] 2.1.3体外检测低氧诱导野生型及mTOR基因敲除小鼠原代细胞JAM-B的表达水平[0128] 用低氧刺激两组小鼠的曲精小管支持细胞，分别于0h，24h，48h：
[0129] (1)ELISA检测培养上清中JAM-B的表达水平；
[0130] (2)qPCR检测低氧刺激细胞后，细胞内JAM-BmRNA的转录水平；
[0131] (3)WB检测刺激后细胞JAM-B蛋白表达水平
[0132] 2.2.体外检测低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系(支持细胞)后JAM-B表达水平[0133] 分别用单独低氧和低氧+重组mTOR蛋白刺激细胞系(支持细胞)，比较两刺激组细胞：
[0134] (1)ELISA检测两刺激组细胞上清JAM-B表达水平
[0135] (2)qPCR检测两刺激组细胞内JAM-B mRNA的转录水平；
[0136] (3)WB检测两刺激组细胞内JAM-B蛋白表达水平
[0137] 第三部分：体外佐证mTOR对JAM-B调节作用的分子机理
[0138] 3.1比较低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠不同时间点小鼠睾丸曲精小管组织中TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号活化程度
[0139] 用低氧分别对mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导，在0h，24h，48h时间点处死小鼠后分离小鼠睾丸曲精小管组织，WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化程度，筛选出缺氧性血睾屏障通透发病中mTOR下游信号通路具体活化的信号途径，进而从体内明确mTOR下游效应分子TFEB和P70S6K1对HIF-1α的调节作用。
[0140] 3.2.检测低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持细胞的TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号活化程度
[0141] 参照实验方法中第二部分第1节中的曲精小管支持细胞的分离方法分离mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞，并用低氧对其进行诱导，比较低氧曝露两组细胞后不同时间点细胞TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化水平。
[0142] 3.3.比较低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系(精母细胞)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号表达水平
[0143] 分别用单独低氧或联合重组mTOR蛋白刺激细胞系(支持细胞)，比较两刺激组细胞不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号途径的活化情况。
[0144] 3.4评价低氧诱导缺氧性血睾屏障通透模型中，TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号通路阻断剂对JAM-B产生的影响
[0145] 选取精母细胞系作为研究对象，ELISA、WB实验比较低氧、mTOR单抗、低氧+mTOR单抗、低氧+mTOR单抗+TFEB(各信号通路阻断剂)、低氧+mTOR单抗+HIF-1α(各信号通路阻断剂)刺激组刺激细胞后，细胞产生JAM-B的能力
[0146] 第四部分：体内分析重组mTOR蛋白激活JAM-B表达对缺氧性血睾屏障通透可能的治疗效果
[0147] 在明确mTOR激活JAM-B表达的分子基础上，拟进一步采用野生型小鼠作为研究对象，将其分为两组，一组通过尾静脉注射的方式注射重组mTOR蛋白，另一组用IgG作为对照，而后对两组小鼠进行低氧诱导：
[0148] 4.1比较两组小鼠在低氧诱导后睾丸曲精小管和血睾屏障病损状况
[0149] 分别在两组小鼠低氧诱导后的0h，24h，48h处死小鼠，分离其睾丸组织，石蜡包埋并切片，H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度，免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及透射电镜下睾丸曲精小管和血睾屏障病理改变，包括组织坏死程度，支持细胞和生殖细胞凋亡等。
[0150] 4.2观察两组小鼠低氧诱导后JAM-B表达情况
[0151] 在低氧诱导两组小鼠的0h，24h，48h处死小鼠，分别收集性腺、睾丸组织，qPCR及免疫组化分析两组小鼠睾丸组织中JAM-B的表达情况，比较其曲精小管中JAM-B的水平，明确重组单抗mTOR是否存在治疗作用，进一步佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。
[0152] 3、可行性分析
[0153] 3.1理论上的可行性：
[0154] 缺氧性血睾屏障通透(如睾丸扭转和自身免疫性睾丸炎)是一种伴随紧密连接缺失的疾病，大量文献报道并佐证新型紧密连接蛋白JAM-B的突变与此疾病的进展密切相关，体内激活或活化JAM-B后能够明显维持小鼠缺氧性血睾屏障完整，降低附睾曲精小管病损程度，提示JAM-B在睾丸扭转和自身免疫性睾丸炎的重要地位，mTOR为丝氨酸/苏氨酸激酶，它极有可能也参与缺氧性血睾屏障通透的发生。我们的预实验证实缺氧性血睾屏障通透小鼠睾丸mTOR较正常对照组显著降低，mTOR基因敲除小鼠曲精小管组织损伤程度显著高于野生型小鼠，提示mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用，因此运用重组的mTOR单抗有可能延缓HBTBP的病理进程；同时，WB结果提示低氧曝露小鼠睾丸P70S6K1/HIF-1α信号途径的活化程度明显低于对照组小鼠，提示mTOR对HIF-1α的调节作用，而在之前我们的研究中发现在缺氧性血睾屏障通透中，HIF-1α结合JAM-B转录启动子区缺氧反应元件，所以我们有理由相信缺氧性血睾屏障通透中抑制性活化mTOR可能通过阻抑P70S6K1/HIF-1α信号通路的活化减少JAM-B表达，进而达到恶化生殖的作用，这一设想在理论层面上可行，理应获得预期结果。
[0155] 3.2技术上的可行性：
[0156] 1、我们前期在低氧诱导的小鼠血睾屏障通透模型中已经证实抑制性激活的P70S6K1/HIF-1α信号途径能结合下游紧密连接蛋白JAM-B启动子并减少其表达，影响疾病进程，那么在同为缺氧性血睾屏障通透病人中或许也存在此调控机制，此外我们前期的结果也证实低氧诱导缺氧性血睾屏障通透小鼠睾丸mTOR显著低于对照组小鼠，mTOR基因敲除小鼠血睾屏障通透性显
[0157] 2、项目申请者熟悉缺氧性血睾屏障通透中TFEB和P70S6K1/HIF-1α信号途径的活化和对JAM-B的调节机制，课题所需的病理生理学和分子生物学技术又是本研究所常用的技术及方法，尤其在小鼠曲精小管支持细胞的分离培养等关键实验技术上较为熟练，与此同时本项目立足现有的工作基础，立题依据充分，课题组人员组成既有从事生殖低下研究的人员，又有长期从事分子生物学的实验室研究及技术人员，还有长期从事病理研究的技术人员。既有博士、硕士，又有各种技术人员，人员搭配合理，能保证研究顺利完成。
[0158] 4、本项目的特色与创新之处；
[0159] 1)迄今为止，缺氧性精子生成减少的发病原因不明，mTOR在其中作用的相关文献也未见报道，通过低氧诱导的mTOR基因敲除小鼠及野生型小鼠这一缺氧性血睾屏障通透模型，将有助于我们进一步研究其在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用和调节机制。
[0160] 2)目前睾丸扭转和自身免疫性睾丸炎的研究中，JAM-B作为紧密连接蛋白参与发病已经清楚，但在缺氧性血睾屏障通透中没有相关文献及实验证实其具体作用，也不知晓其具体调节机制。在我们的预实验中已经佐证：在低氧诱导的缺氧性血睾屏障通透小鼠模型中，mTOR基因敲除小鼠血睾屏障病损程度较对照组严重，提示mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。了解明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用及机制有助于我们对此疾病深入的了解，并为未来治疗此疾病提供更安全更有效的治疗途径和手段。
[0161] (二)研究基础与工作条件
[0162] 1、研究基础
[0163] 1.1课题组工作积累
[0164] 1.1.1缺氧病理生理学研究
[0165] 课题组单位为第三军医大学高原军事医学系病理生理学与高原病理学教研室，是教育部重点实验室、军队重点实验室。进行长达60余年的缺氧(高原)病理生理学研究，对缺氧病理生理学有较深入的了解，承担并圆满完成了国家、军队、重庆市多项缺氧方面的课题。获得“高原病发病机制和防治措施研究”国家科学技术进步一等奖在内的各种奖项。
[0166] 1.1.2低氧诱导精母细胞凋亡的研究
[0167] 本课题组2000年以来，一直从事缺氧生殖方面的研究，在缺氧对男性生殖功能的影响，特别是生精上皮细胞脱落、精母细胞凋亡方面进行了研究。并发表“Hypobaric hypoxia causes deleterious effects on spermatogenesis in rats”，并提出高原低氧对生精细胞的影响主要集中在精母细胞上，为理解高原男性生殖功能低下的发病机制奠定了基础。自噬在缺氧诱导精母细胞凋亡中的作用机制一直是申请者所重点关注的研究领域，部分文献综述已以第一作者身份被本领域知名期刊Biology of reproduction(IF＝3.47)发表，申请者围绕低氧诱导精母细胞凋亡的机制和凋亡与自噬的串扰先后发表两篇论著，先后发表于Journal of cellular physiology(IF＝4.1)和Reproduction(IF＝
3.06)，本项目是本课题组前期研究工作的继续深入。
3.06)，本项目是本课题组前期研究工作的继续深入。
[0168] 1.2本项目前期实验结果
[0169] ①低氧诱导血睾屏障(Blood-testis-barrier,BTB)通透性增加
[0170] 以伊文斯蓝渗出作为白蛋白渗出的标志物，定量测定BTB的通透性，与对照组比较，海拔5000米低氧曝露15天组小鼠睾丸血睾屏障中伊文斯蓝标记物明显增多，且血睾屏障通透程度呈时间依赖性；与对照组比较，海拔5000米低氧曝露30天组小鼠血睾屏障紧密连接结构松散，细胞间隙增大；与对照组比较，海拔5000米低氧曝露60天组小鼠支持细胞紧密连接相关分子Claudin-5、Occludin、JAM-B的mRNA水平和蛋白表达均显著降低(p<0.05)(Yinetal.未发表)。低氧诱导血睾屏障通透如图3所示，低氧抑制紧密连接相关分子m RNA和蛋白表达如图4所示。
[0171] ②低氧抑制小鼠支持细胞系TM4紧密连接分子表达
[0172] 与21％氧含量+48h组支持细胞比较，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞电阻显著降低(p<0.05)，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞膜上的紧密连接相关分子Claudin-5、Occludin、JAM-B荧光强度下降，且分布位置转移至胞浆；与21％氧含量+48h组支持细胞比较，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞紧密连接相关分子Claudin-5、Occludin、JAM-B的m RNA水平和蛋白表达均显著降低(p<0.05)(Yinetal.未发表)。TM4细胞曝露于21％氧含量和1％氧含量48h后的跨细胞电阻变化如图5所示，免疫荧光染色并分别观察21％氧含量+48h组与1％氧含量+48h组TM4细胞紧密连接分子Claudin-5、Occludin、JAM-B分布及荧光强度如图6所示，低氧抑制TM4细胞紧密连接相关分子Claudin-5、Occludin、JAM-B蛋白表达如图7所示。
[0173] ③低氧抑制睾丸和支持细胞m TORC1表达(如图8所示)
[0174] 与对照组比较，海拔5000米低氧曝露60天组小鼠睾丸m TOR表达显著减少(p<0.05)；与21％氧含量+48h组支持细胞比较，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞m TOR、Rag A和Rhe B表达显著下降(p<0.05)，AMPK和TSC2表达显著上调(p<0.05)；与平原对照组小鼠比较，m TOR KO组小鼠睾丸血睾屏障中伊文斯蓝标记物明显增多(p<0.05)(Yin et al.未发表)。
[0175] ④低氧诱导支持细胞巨胞饮-溶酶体系统
[0176] 与21％氧含量+48h组支持细胞比较，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞70kDa Texas Red Dextran(Fdx70，巨胞饮标记物)摄取显著增加(p<0.05)，网格蛋白介导的内吞标记分子α-adaptin和Caveolar介导的内吞标记分子caveolin-1表达无变化；与21％氧含量+48h组支持细胞相比，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞溶酶体显著上升(p<0.05)(Yinetal.未发表)。低氧诱导支持细胞巨胞饮介导的胞吞如图9所示。
[0177] ⑤低氧抑制支持细胞m TOR/HIF-1α途径
[0178] 与21％氧浓度+48h组支持细胞比较，1％氧含量+48h组小鼠TM4细胞HIF-1α表达显著减少(p<0.05)，mTOR效应分子p-4EBP1和p-P70S6K1表达显著下降；与1％氧含量+48h组支持细胞比较，1％氧含量曝露48h+MHY1485(m TOR特异性激动剂)组TM4细胞p-mTOR和HIF-1α表达均显著上升(p<0.05)(Yin et al.未发表)。低氧抑制TM4细胞m TOR/HIF-1α途径如图10所示。
[0179] ⑥JAM-B是缺氧下支持细胞中HIF-1α的靶基因(如图11所示)
[0180] 与IgG组比较，21％O2+48h组支持细胞中HIF-1α明显富集到JAM-B启动子区缺氧反应元件上(p<0.05)(Yinetal.未发表)。
[0181] 2、实验条件
[0182] 1.试剂及细胞：所需试剂、VHA基因敲除小鼠及小鼠精母细胞均有市售。
[0183] 2.已具备本实验研究所需的所有实验技术
[0184] 1)细胞培养技术、分子生物学实验技术已为本室所熟悉。
[0185] 2)本室长期从事缺氧对男性生殖功能的影响，特别是生精上皮细胞脱落、精母细胞凋亡方面的研究，熟悉高原缺氧的研究现状，对低氧环境的模拟等有丰富的经验。
[0186] 3)本室拥有设备完善的常氧及低氧细胞培养室、分子生物学实验室，具备完成所需的实验设备，本实验所需的部分实验设备还可由本校中心仪器室和友邻科室提供。
[0187] 3.主要仪器及实验平台：
[0188] 1)本研究室一直致力于高原医学研究，为教育部重点实验室。拥有总面积约2000m2的实验室，完善的细胞培养室，操作方便的缺氧操作小室。拥有多种先进仪器；CO2培养箱、低氧细胞培养箱、超低温高速离心机、-80oC冰箱、荧光显微镜、凝胶成像系统、冰冻切片机、低温高速离心机、超声细胞破碎仪、实时定量PCR扩增仪、紫外透射观察仪及照相装置、杂交炉、电泳仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪、万分之一电子天平及高精度pH计等实验室常规设备，拥有先进的全天候不间断低氧缺氧舱群。
[0189] 2)我校中心实验室可提供使用的仪器有：激光共聚焦、FACSart plus流式细胞仪，TECBUSA-6803型真彩色微机图像分析系统等。
[0190] 3)目前我校有全军分子免疫学开放实验室及防原医学国家重点实验室，其仪器设备先进、技术力量强，可供使用。本课题所需仪器均可得到保证。
[0191] 4)本实验室有国外多名留学人员和实验室建立密切联系，对于国内难以获得的实验材料，同意给予帮助。
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