聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法
阅读：800发布：2020-05-11
专利汇可以提供聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种聚乙二醇修饰 氧 化 石墨 烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合 支架 的制作方法，步骤如下：首先，取ICR小鼠全皮制成圆形脱细胞真皮基质(ADM)支架；其次，氧化 石墨烯 (GO)在EDC催化下，将6臂 氨 基聚乙二醇(PEG)接枝到GO上制成聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO‑PEG)；然后，将槲皮素(Que) 吸附 到GO‑PEG上，制得的GO‑PEG/Que交联到ADM支架表面；最后，制得一种聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质(ADM‑GO‑PEG/Que)的3D药物复合支架，将该复合支架移植到糖尿病 皮肤 伤口可达到传递药物及修复 伤口愈合 的效果。，下面是聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法专利的具体信息内容。
1.一种聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的制作方法包括下列步骤：
S1、取ICR小鼠全皮制成一定直径的圆形脱细胞真皮基质支架；
S2、氧化石墨烯在碱性条件下超声制得羧基化氧化石墨烯，在EDC催化下，将聚乙二醇接枝到羧基化氧化石墨烯上制成聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；
S3、再通过磁力搅拌将槲皮素吸附到聚乙二醇修饰的氧化石墨烯上；
S4、将制成的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合物交联到脱细胞真皮基质支架表面；
S5、制作得到基于聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的脱细胞真皮基质支架的制作过程如下：
选取12周龄的雄性ICR小鼠，以颈椎脱臼法处死，经脱毛，取小鼠背部皮肤，将取得的小鼠背部皮肤用PBS溶液浸泡清洗3遍，然后浸泡在0.25％的中性蛋白酶水溶液中，于4℃下保存48h且24h换一次液，以去除皮肤表皮组织，将去除表皮后的小鼠皮肤组织用PBS溶液冲洗
3遍，再浸泡在0.3％的Triton X-100与0.02％的EDTA的混合溶液中，于室温下摇床处理48h且每24h换液一次，以去除皮肤组织中的细胞成分；
将脱表皮和脱细胞后的皮肤真皮组织分别浸泡于50％、75％和100％浓度的乙醇溶液中30分钟进行梯度脱水，脱水后的皮肤真皮组织浸泡于氯仿中约20分钟静置至透明，以去除组织中的脂肪成分，用无水乙醇多次清洗组织至无气味，将无水乙醇清洗过的组织分别浸于75％乙醇、50％乙醇和双蒸水中30分钟还水，制得脱细胞真皮基质，然后用直径为7mm的圆形生物打孔器将脱细胞真皮基质裁剪成多个脱细胞真皮基质支架，并用PBS溶液冲洗3遍，然后浸泡在70％的乙醇中于4℃下浸泡1星期除菌；
将已除去细菌的脱细胞真皮基质支架转移至超净台，用无菌的PBS溶液冲洗5遍，然后浸泡在无菌的PBS溶液中，于4℃下封口保存。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的制作过程如下：
称取单层片状的氧化石墨烯30mg置于50mL离心管，加入30mL超纯水，用超声波细胞粉碎机超声分散1h，称取3.6g NaOH和3g氯乙酸固体加入到超声后的氧化石墨烯分散液中继续超声分散1h，得到浓度为1mg/mL的羧基化氧化石墨烯分散液，室温静置3h；
用100kDa离心超滤管离心，10000转，40分钟，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至羧基化氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.5mg/mL备用；
避光称取2mg EDC加入到5mL浓度为0.5mg/mL的羧基化氧化石墨烯分散液中，在超声波清洗仪中超声20分钟，然后滴加三乙胺调节PH值至弱碱性，即PH≈8.0，称取30mg聚乙二醇加入到活化羧基后的羧基化氧化石墨烯分散液中磁力搅拌过夜，用100kDa离心超滤管离心，14000r，1h，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.1mg/mL，4℃下封口保存；
采用紫外吸收分光光度计测浓度为0.1mg/mL的样品紫外吸收峰值，测定样品的Zeta电位和水合粒径采用Zeta电位仪在25℃，水分散液注入样品池，zeta电位和水合粒径值是至少三次连续测量的平均值，并将制得的样品用傅里叶变换红外光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值，拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素载药率和释药率的测试方法如下：
避光称取3.4mg槲皮素溶解于1mL无水乙醇中配成10mM的槲皮素溶液，将10mM槲皮素溶液分别与浓度为0.1mg/mL的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯混合成5种不同浓度梯度的5mL体系，同时设置对照组用浓度为0.1mg/mL的氧化石墨烯在同等条件下与10mM Que溶液分别混合，5mL混合体系中槲皮素的浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM、和500μM，室温下磁力搅拌过夜；
将各组混合溶液分装在2mL EP管中标记并离心，14000r，20分钟，分离出游离的槲皮素和未载药的载体的混合沉淀物，获得不同浓度的稳定分散在水中的GO-PEG/Que和GO/Que复合物；
将混合沉淀物溶解于5mL无水乙醇，用0.22μm的有机系滤器过滤除掉不能溶解于无水乙醇中的氧化石墨烯或聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；
过滤后的槲皮素溶液用微量紫外分光光度计在波长为370nm处测量紫外吸收值，同时测量槲皮素工作液做标准曲线，计算出每组游离槲皮素实际的浓度值，计算公式如下：
载药率(％)＝(W总药物-W游离)/W总药物×100％，
式中W总药物为最初槲皮素(Que)投放的质量，W游离为游离槲皮素(Que)的质量；
将上述制得的不同浓度的GO/Que或GO-PEG/Que分散液加入到100kDa的透析袋中透析，置于50mL装有释放介质的烧杯中，释放介质为PH＝5的醋酸缓冲液，同时设置对照组在同等条件下将上述透析袋置于50mL装有PH＝7.4的PBS的烧杯中，在室温下磁力搅拌；
在恒定搅拌条件下，释放槲皮素，并在不同时间点取出1ml释放液中进行测量，然后加入1ml新鲜释放介质，在相同的条件下采用超微量紫外分光光度计测量释放液中槲皮素的浓度，并用校准曲线定量；
将制得的样品测紫外吸收峰值、Zeta电位和水合粒径，并将制得的样品用傅里叶变换红外光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值，拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统，GO-PEG和GO-PEG/Que复合物的厚度和尺寸大小采用原子力显微镜观察。
5.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架的制备方法如下：
配置浓度为0.9％的生理盐水，经高压蒸汽灭菌后置于超净工作台紫外杀菌，将无菌保存的脱细胞真皮基质支架置于超净工作台紫外杀菌30分钟，佩戴灭菌手套进行无菌操作；
取出脱细胞真皮基质支架用灭菌超纯水和灭菌生理盐水冲洗三次，将润洗过的脱细胞真皮基质支架置于灭菌2mL EP管中，将浓度为0.1mg/mL的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合分散液用0.45μm滤器过滤，移液枪头取1.5mL到装有无菌脱细胞真皮基质支架的EP管中，适当震荡，封口胶封口，浸泡72h，并置于超净工作台紫外杀菌；
采用扫描电子显微镜分析支架形貌，采用双光子激光共聚焦显微镜采集支架荧光信号，拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。
6.根据权利要求1至5任一所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，
所述的氧化石墨烯为单层片状氧化石墨烯，片径：0.5-5μm，厚度:0.8-1.2nm；
所述的聚乙二醇为六臂聚乙二醇氨基，分子量为10000。
聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D
药物复合支架的制作方法
技术领域
背景技术
[0002] 聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)，具有高度的稳定性和优异的生物相容性，作为一种新型的载体，近几年在科学界已经吸引了越来越多的关注。GO-PEG首次报道于2008年，Dai Hongjie课题组将石墨氧化，然后在强碱条件下将氧化石墨烯(GO)的羧基活化，再将具有6臂氨基的聚乙二醇(PEG)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化下接枝到GO上，获得了一种尺寸小于50nm的2D纳米载体。GO-PEG具有超高的药物吸附能力，可以通过π-π堆垛将喜树碱衍生物(SN38)、阿霉素(DOX)等抗癌药物吸附在GO-PEG表面。GO-PEG在生理盐水和血清中能稳定存在，并具有良好的水溶性可用于难溶性药物的增溶，同时，形成的形成GO-PEG/药物复合物具有良好的生物相容性，通过胞吞作用进入细胞在溶酶体中释放药物，释放的GO-PEG载体没有明显的细胞毒性，通过胞吐机制排到细胞外。因此，GO-PEG可作为理想的药物载体用于临床医学。
[0003] 槲皮素(Que)，一种天然的黄酮类化合物，毒副作用小，在许多不同的领域引起了广泛的关注，包括其抗氧化活性、抗病毒活性、抗癌活性、抗糖尿病并发症、抗炎、抗溃疡、降血压和降血脂等作用。近年的研究还发现槲皮素可诱导干细胞分化为成脂细胞和成骨细胞，为干细胞组织工程提供了理论基础。然而，槲皮素几乎不溶于水和低生物利用度极大限制了其临床应用。常见的槲皮素给药方式如纳米脂质载体法，但其载药能力有限，药物突释、药物储存泄露等现象普遍存在。为了克服这一难题，必须开发一种物理和化学双向调控的，更高效的的给药系统。
[0004] 脱细胞真皮基质(ADM)是用物理、化学等方法将动物或人类皮肤去除全部的表皮层和真皮层的细胞后获得的含胶原成分的细胞外基质网状薄片，广泛应用于临床治疗如面部美容、整形外科、口腔、耳鼻喉科及尿道修复等等。ADM具有很多优点：首先，ADM去除了细胞成分，失去了Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原的主要免疫活性，保留的主要成分有胶原、弹性原、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基质，因此无明显免疫原性。其次，ADM保留有天然的3D胶原纤维网络结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质能发挥真皮模板的作用，为组织细胞附着、再生提供一个良好的支架结构。此外，ADM植入损伤机体可以与外界形成物理屏障，减少伤口收缩，引导成纤维细胞和胶原生长，有效预防疤痕的形成，防止局部组织粘连以及病理性增生。最后，ADM具有一定的组织特异性，特定器官来源的胞外基质能成功应用于其对应的器官，组织引导器官的再生。研究发现，ADM移植糖尿病皮肤创面不仅能够为细胞增殖、迁移及吸附提供良好的生长代谢立体框架，亦可作为组织工程新型载体材料。
发明内容
[0006] 本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
[0007] 一种聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，所述的制作方法包括下列步骤：
[0008] S1、取ICR小鼠全皮制成一定直径的圆形脱细胞真皮基质支架；
[0009] S2、氧化石墨烯在碱性条件下超声制得羧基化氧化石墨烯，在EDC催化下，将聚乙二醇接枝到羧基化氧化石墨烯上制成聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；
[0010] S3、再通过磁力搅拌将槲皮素吸附到聚乙二醇修饰的氧化石墨烯上；
[0011] S4、将制成的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合物交联到脱细胞真皮基质支架表面；
[0012] S5、制作得到基于聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架。
[0013] 进一步地，所述的脱细胞真皮基质支架的制作过程如下：
[0014] 选取12周龄的雄性ICR小鼠，以颈椎脱臼法处死，经脱毛，取小鼠背部皮肤，将取得的小鼠背部皮肤用PBS溶液浸泡清洗3遍，然后浸泡在0.25％的中性蛋白酶水溶液中，于4℃下保存48h且24h换一次液，以去除皮肤表皮组织。将去除表皮后的小鼠皮肤组织用PBS溶液冲洗3遍，再浸泡在0.3％的Triton X-100与0.02％的EDTA的混合溶液中，于室温下摇床处理48h且每24h换液一次，以去除皮肤组织中的细胞成分；
[0015] 将脱表皮和脱细胞后的皮肤真皮组织分别浸泡于50％、75％和100％浓度的乙醇溶液中30分钟进行梯度脱水，脱水后的皮肤真皮组织浸泡于氯仿中约20分钟静置至透明，以去除组织中的脂肪成分，用无水乙醇多次清洗组织至无气味，将无水乙醇清洗过的组织分别浸于75％乙醇、50％乙醇和双蒸水中30分钟还水，制得脱细胞真皮基质。然后用直径为7mm的圆形生物打孔器将脱细胞真皮基质裁剪成多个脱细胞真皮基质支架，并用PBS溶液冲洗3遍，然后浸泡在70％的乙醇中于4℃下浸泡1星期除菌；
[0016] 将已除去细菌的脱细胞真皮基质支架转移至超净台，用无菌的PBS溶液冲洗5遍，然后浸泡在无菌的PBS溶液中，于4℃下封口保存。
[0017] 进一步地，所述的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的制作过程如下：
[0018] 称取单层片状的氧化石墨烯30mg置于50mL离心管，加入30mL超纯水，用超声波细胞粉碎机超声分散1h，称取3.6g NaOH和3g氯乙酸固体加入到超声后的氧化石墨烯分散液中继续超声分散1h，得到浓度为1mg/mL的羧基化氧化石墨烯分散液，室温静置3h；
[0019] 用100kDa离心超滤管离心，10000转，40分钟，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至羧基化氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.5mg/mL备用；
[0020] 避光称取2mg EDC加入到5mL浓度为0.5mg/mL的羧基化氧化石墨烯分散液中，在超声波清洗仪中超声20分钟，然后滴加三乙胺调节PH值至弱碱性，即PH≈8.0，称取30mg聚乙二醇加入到活化羧基后的羧基化氧化石墨烯分散液中磁力搅拌过夜，用100kDa离心超滤管离心，14000r，1h，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.1mg/mL，4℃下封口保存；
[0021] 采用紫外吸收分光光度计测浓度为0.1mg/mL的样品紫外吸收峰值，测定样品的Zeta电位和水合粒径采用Zeta电位仪在25℃，水分散液注入样品池，zeta电位和水合粒径值是至少三次连续测量的平均值，并将制得的样品用傅里叶变换红外光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值，拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。
[0022] 进一步地，所述的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素载药率和释药率的测试方法如下：
[0023] 避光称取3.4mg槲皮素溶解于1mL无水乙醇中配成10mM的槲皮素溶液，将10mM槲皮素溶液分别与浓度为0.1mg/mL的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯混合成5种不同浓度梯度的5mL体系，同时设置对照组用浓度为0.1mg/mL的氧化石墨烯在同等条件下与10mM Que溶液分别混合，5mL混合体系中槲皮素的浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM、和500μM，室温下磁力搅拌过夜；
[0024] 将各组混合溶液分装在2mL EP管中标记并离心，14000r，20分钟，分离出游离的槲皮素和未载药的载体的混合沉淀物，获得不同浓度的稳定分散在水中的GO-PEG/Que和GO/Que复合物；
[0025] 将混合沉淀物溶解于5mL无水乙醇，用0.22μm的有机系滤器过滤除掉不能溶解于无水乙醇中的氧化石墨烯或聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；
[0026] 过滤后的槲皮素溶液用微量紫外分光光度计在波长为370nm处测量紫外吸收值，同时测量槲皮素工作液做标准曲线，计算出每组游离槲皮素实际的浓度值，计算公式如下：
[0027] 载药率(％)＝(W总药物-W游离)/W总药物×100％，
[0028] 式中W总药物为最初槲皮素(Que)投放的质量，W游离为游离槲皮素(Que)的质量；
[0029] 将上述制得的不同浓度的GO/Que或GO-PEG/Que分散液加入到100kDa的透析袋中透析，置于50mL装有释放介质的烧杯中，释放介质为PH＝5的醋酸缓冲液，同时设置对照组在同等条件下将上述透析袋置于50mL装有PH＝7.4的PBS的烧杯中，在室温下磁力搅拌；
[0030] 在恒定搅拌条件下，释放槲皮素，并在不同时间点取出1ml释放液中进行测量，然后加入1ml新鲜释放介质，在相同的条件下采用超微量紫外分光光度计测量释放液中槲皮素的浓度，并用校准曲线定量；
[0031] 将制得的样品测紫外吸收峰值、Zeta电位和水合粒径，并将制得的样品用傅里叶变换红外光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值，拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统，GO-PEG和GO-PEG/Que复合物的厚度和尺寸大小采用原子力显微镜观察。
[0032] 进一步地，所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架的制备方法如下：
[0034] 取出脱细胞真皮基质支架用灭菌超纯水和灭菌生理盐水冲洗三次，将润洗过的脱细胞真皮基质支架置于灭菌2mL EP管中，将浓度为0.1mg/mL的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合分散液用0.45μm滤器过滤，移液枪头取1.5mL到装有无菌脱细胞真皮基质支架的EP管中，适当震荡，封口胶封口，浸泡72h，并置于超净工作台紫外杀菌；
[0036] 进一步地，所述的氧化石墨烯为单层片状氧化石墨烯，片径：0.5-5μm，厚度:0.8-1.2nm；所述的聚乙二醇为六臂聚乙二醇氨基，分子量为10000。
[0037] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0038] 1、GO-PEG/Que有效的提高了Que水溶性，高效的载药率以及在不同PH条件下对药物释放的调控，为Que临床应用提供了理论依据。
[0039] 2、ADM-GO-PEG/Que治疗方法能够有效促进糖尿病难愈伤口的闭合，并在一定程度上减轻炎症反应。
[0040] 3、ADM-GO-PEG/Que疗法能够有效促进支架胶原的降解与利用以及新生胶原的分泌，愈合伤口组织切片中的胶原含量明显加厚。
[0041] 4、ADM-GO-PEG/Que疗法能够有效促进伤口组织血管的新生，且新生的血管增厚，直径更大，血管内具更多的红细胞，说明ADM-GO-PEG/Que治疗组新生的血管具有更完善的生物学功能。附图说明
[0042] 图1(a)是制作脱细胞真皮基质(ADM)支架示意图；
[0043] 图1(b)是制作聚乙二醇氧化石墨烯(GO-PEG)示意图；
[0044] 图1(c)是制作聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)示意图；
[0045] 图1(d)是制作脱细胞真皮基质(ADM)支架交联聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)示意图；
[0046] 图1(e)是制成的脱细胞真皮基质交联聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)的3D药物复合支架示意图；
[0047] 图2(a)是GO及GO衍生物在水、PBS和DMEM中的稳定性表征图；
[0048] 图2(b)是Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的紫外吸收波长测定结果图；
[0049] 图2(c)是Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的傅里叶红外光谱测定结果图；
[0050] 图2(d)是GO及GO衍生物，Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的Zeta电位测定结果图；
[0051] 图2(e)是GO及GO衍生物和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的水合粒径测定结果图；
[0052] 图2(f)是GO及GO衍生物的拉曼光谱测定结果图；
[0053] 图2(g)是Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的拉曼光谱测定结果图；
[0054] 图3(a)是不同初始浓度的Que在370nm处紫外吸收值的标准曲线图；
[0055] 图3(b)是GO和GO-PEG载不同初始浓度的槲皮素对应的载药率统计图；
[0056] 图3(c)是GO/Que和GO-PEG/Que在PH＝5的醋酸溶液中不同时间点的释药率统计图；
[0057] 图3(d)是GO/Que和GO-PEG/Que在PH＝7.4的PBS溶液中不同时间点的释药率统计图；
[0058] 图3(e)是GO-PEG在原子力显微镜下的形貌图；
[0059] 图3(f)是GO-PEG/Que在原子力显微镜下的形貌图；
[0060] 图4(a)是ADM支架的照片和电镜图；
[0061] 图4(b)是ADM-GO-PEG/Que复合支架照片和电镜图；
[0062] 图4(c)是ADM支架的激光共聚焦二次谐波信号的3D图像；
[0063] 图4(d)是ADM-GO-PEG/Que复合支架的激光共聚焦二次谐波信号的3D图像；
[0064] 图4(e)是ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que的拉曼光谱测定结果图；
[0065] 图5(a)是ICR小鼠注射STZ后血糖均值测定结果图；
[0066] 图5(b)是ICR小鼠注射STZ后体重均值测定结果图；
[0067] 图5(c)是糖尿病小鼠分别移植ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que后第1、3、7和14天的伤口愈合形态图片；
[0068] 图5(d)是糖尿病小鼠分别移植ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que后第1、3、7和14天的伤口愈合率统计图；
[0069] 图5(e)是糖尿病小鼠分别移植ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que后第3、7和14天的伤口Masson染色图；
[0070] 图6是本发明公开的3D药物复合支架的制作方法的流程步骤图。
具体实施方式
[0071] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0072] 实施例一
[0073] 一种聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架用于糖尿病皮肤伤口修复的方法，包括如下步骤：
[0074] 首先，取ICR小鼠全皮制成圆形脱细胞真皮基质(ADM)支架；
[0075] 其次，氧化石墨烯(GO)在EDC催化下，将6臂氨基聚乙二醇(PEG)接枝到GO上制成聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)；
[0076] 然后，将槲皮素(Que)吸附到GO-PEG上，制得的GO-PEG/Que交联到ADM支架表面；
[0077] 最后，制得一种聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质(ADM-GO-PEG/Que)的3D药物复合支架，将该复合支架移植到糖尿病皮肤伤口可达到传递药物及修复伤口愈合的效果。
[0078] 其中，ADM为脱细胞真皮基质，ADM支架的制作过程如下：
[0079] 选取12周龄的雄性ICR小鼠，以颈椎脱臼法处死，经脱毛，取小鼠背部皮肤。将取得的小鼠背部皮肤用PBS溶液浸泡清洗3遍，然后浸泡在0.25％的中性蛋白酶水溶液中，于4℃下保存48h且24h换一次液，以去除皮肤表皮组织。将去除表皮后的小鼠皮肤组织用PBS溶液冲洗3遍，再浸泡在0.3％的TritonX-100与0.02％的EDTA的混合溶液中，于室温下摇床处理48h且每24h换液一次，以去除皮肤组织中的细胞成分。将脱表皮和脱细胞后的皮肤真皮组织分别浸泡于50％、75％和100％浓度的乙醇溶液中30分钟进行梯度脱水。脱水后的皮肤真皮组织浸泡于氯仿中约20分钟静置至透明，以去除组织中的脂肪成分，用无水乙醇多次清洗组织至无气味。将无水乙醇清洗过的组织分别浸于75％乙醇、50％乙醇和双蒸水中30分钟还水，制得脱细胞真皮基质(ADM)。然后用直径为7mm的圆形生物打孔器将ADM裁剪成多个ADM支架，并用PBS溶液冲洗3遍，然后浸泡在70％的乙醇中于4℃下浸泡1星期除菌。将已除去细菌的ADM支架转移至超净台，用无菌的PBS溶液冲洗5遍，然后浸泡在无菌的PBS溶液中，于4℃下封口保存。
[0080] 其中，PBS溶液为PH＝7.3、0.1mol/L的PBS溶液；
[0081] 其中，Triton X-100为曲拉通X-100；
[0082] 其中，EDTA为乙二胺四乙酸。
[0083] 其中，GO-PEG为聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；GO-PEG的制作过程如下：
[0084] 称取单层片状的氧化石墨烯(GO)30mg置于50mL离心管，加入30mL超纯水，用超声波细胞粉碎机超声分散1h。称取3.6g NaOH和3g氯乙酸固体加入到超声后的氧化石墨烯(GO)分散液中继续超声分散1h，得到羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)分散液(1mg/mL)，室温静置3h。用100kDa离心超滤管离心，10000转，40分钟，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.5mg/mL备用。避光称取2mg EDC加入到5mL羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)分散液(0.5mg/mL)中，在超声波清洗仪中超声20分钟，然后滴加三乙胺调节PH值至弱碱性(PH≈8.0)，称取30mg聚乙二醇(PEG)加入到活化羧基后的羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)分散液中磁力搅拌过夜，用100kDa离心超滤管离心，14000r，1h，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.1mg/mL，4℃下封口保存。采用紫外吸收分光光度计测样品(0.1mg/mL)紫外吸收峰值。测定样品(0.1mg/mL)的Zeta电位和水合粒径采用Zeta电位仪在25℃，水分散液注入样品池，zeta电位和水合粒径值是至少三次连续测量的平均值。此外，将制得的样品用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值。拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。
[0085] 其中，氧化石墨烯(GO)为单层片状氧化石墨烯，片径：0.5-5μm，厚度:0.8-1.2nm；
[0086] 其中，聚乙二醇(PEG)为六臂聚乙二醇氨基(6ARM-PEG-NH2)，分子量为10000；
[0087] 其中，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
[0088] 其中，聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)载药率和释药率的测试方法如下：
[0089] 避光称取3.4mg槲皮素(Que)溶解于1mL无水乙醇中配成10mM的槲皮素(Que)溶液，将10mM槲皮素(Que)溶液分别与聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)(0.1mg/mL)混合成5种不同浓度梯度的5mL体系，同时设置对照组用氧化石墨烯(GO)(0.1mg/mL)在同等条件下与10mM Que溶液分别混合。5mL混合体系中槲皮素(Que)的浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM、和500μM，室温下磁力搅拌过夜。将各组混合溶液分装在2mL EP管中标记并离心，
14000r，20分钟，分离出游离的槲皮素(Que)和未载药的载体的混合沉淀物，获得不同浓度的稳定分散在水中的GO-PEG/Que和GO/Que复合物。将混合沉淀物溶解于5mL无水乙醇，用
0.22μm的有机系滤器过滤除掉不能溶解于无水乙醇中的氧化石墨烯(GO)或聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)。过滤后的槲皮素(Que)溶液用微量紫外分光光度计在波长为370nm处测量紫外吸收值，同时测量槲皮素(Que)工作液做标准曲线，计算出每组游离槲皮素(Que)实际的浓度值。计算公式如下：
14000r，20分钟，分离出游离的槲皮素(Que)和未载药的载体的混合沉淀物，获得不同浓度的稳定分散在水中的GO-PEG/Que和GO/Que复合物。将混合沉淀物溶解于5mL无水乙醇，用
0.22μm的有机系滤器过滤除掉不能溶解于无水乙醇中的氧化石墨烯(GO)或聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)。过滤后的槲皮素(Que)溶液用微量紫外分光光度计在波长为370nm处测量紫外吸收值，同时测量槲皮素(Que)工作液做标准曲线，计算出每组游离槲皮素(Que)实际的浓度值。计算公式如下：
[0090] 载药率(％)＝(W总药物-W游离)/W总药物×100％，
[0091] 式中W总药物为最初槲皮素(Que)投放的质量，W游离为游离槲皮素(Que)的质量。
[0092] 将上述制得的不同浓度的GO/Que或GO-PEG/Que分散液加入到100kDa的透析袋中透析，置于50mL装有释放介质的烧杯中，释放介质为醋酸缓冲液(PH＝5)，同时设置对照组在同等条件下将上述透析袋置于50mL装有PBS(PH＝7.4)的烧杯中，在室温下磁力搅拌。一旦透析袋放入烧杯，药物释放就开始了。在恒定搅拌条件下，释放槲皮素(Que)，并在不同时间点取出1ml释放液中进行测量，然后加入1ml新鲜释放介质。在相同的条件下采用超微量紫外分光光度计测量释放液中槲皮素(Que)的浓度，并用校准曲线定量。将制得的样品在与上述GO-PEG的制作步骤中同等条件下测样品紫外吸收峰值、Zeta电位和水合粒径。此外，将制得的样品用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值。拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。GO-PEG和GO-PEG/Que复合物的厚度和尺寸大小采用原子力显微镜观察。
[0093] 其中，Que为槲皮素，为二水合物(C15H10O7·2H2O)，其分子量为338.27；
[0094] 其中，GO/Que为氧化石墨烯载槲皮素；
[0095] 其中，GO-PEG/Que为聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素。
[0096] 其中，ADM-GO-PEG/Que为聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架，其制备方法如下：
[0097] 配置浓度为0.9％的生理盐水，经高压蒸汽灭菌后置于超净工作台紫外杀菌。将无菌保存的脱细胞真皮基质(ADM)支架置于超净工作台紫外杀菌30分钟，佩戴灭菌手套进行无菌操作。取出ADM支架用灭菌超纯水和灭菌生理盐水冲洗三次，将润洗过的ADM支架置于灭菌2mL EP管中。将聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)复合分散液(0.1mg/mL)用0.45μm滤器过滤，移液枪头取1.5mL到装有无菌ADM的EP管中，适当震荡，封口胶封口，浸泡72h，并置于超净工作台紫外杀菌。采用扫描电子显微镜分析支架形貌。采用双光子激光共聚焦显微镜采集支架荧光信号。拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。
[0098] 其中，ADM-GO/Que为脱细胞真皮基质交联氧化石墨烯载槲皮素复合支架；
[0099] 其中，ADM-GO-PEG/Que为脱细胞真皮基质交联聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素复合支架。
[0100] ADM-GO-PEG/Que为聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架制作完成后，植入糖尿病小鼠皮肤伤口。
[0101] 取健康、12周龄、体重36g左右的雄性ICR小鼠先用普通饲料适应性喂养5天，然后改用高脂高糖饲料进行诱导性的喂养。高脂高糖饲料诱导性喂养4周后，在空腹状态下(禁食12h，自由饮水)腹腔注射STZ(即将STZ溶解于0.1mol/L、PH4.2的柠檬酸钠缓冲液，并用一次性滤菌器过滤除菌)，连续3天且浓度依次为80mg/kg,70mg/kg和60mg/kg的剂量。第3次注射48h后尾静脉取血测小鼠的空腹血糖，空腹血糖稳定在11.1mol/L以上，同时伴有明显的多食、多饮、体重减轻症状的，可视作糖尿病小鼠造模成功。为了防止脱毛过程中皮肤的损伤影响实验结果，在制造创面的前1天对糖尿病小鼠进行背部脱毛。首先用水合氯醛溶液(400mg/kg)腹腔注射麻醉处理，待小鼠完全麻醉后，将小鼠固定在鼠台上，用打孔器在小鼠背部标记出7mm的圆形区域，然后用眼科剪对选定的圆形区域全皮层切除，建立糖尿病小鼠背部全皮层损伤模型。将糖尿病小鼠全皮层损伤模型随机分为3组：ADM-GO-PEG/Que治疗组、ADM-GO/Que治疗组和ADM对照组。对于ADM-GO-PEG/Que治疗组，具体操作是将上述制备的浸泡负载GO-PEG/Que的ADM接近表皮一面朝外移植到糖尿病小鼠创面部位，即溶有GO-PEG/Que药物的一面朝向小鼠的肌肉层，用无菌滤纸将渗出的液体吸拭掉。ADM治疗组小鼠的处理方法是将无菌的ADM支架移植到小鼠的创面部位，将支架平铺在伤口部位，避免支架卷曲。对空白对照组用无菌生理盐水擦拭糖尿病小鼠的创面部位。最后用Comfeel敷料覆盖在各组小鼠处理后的伤口部位，使伤口湿度合适，防止伤口感染或小鼠自身抓咬。在预期的愈合时间点将实验小鼠麻醉处死，获取伤口部位的皮肤组织，用10％的中性福尔马林溶液固定，然后将固定后的组织样品进行石蜡切片(5μm)，石蜡切片脱蜡还水后进行Masson染色观察。
[0102] 本发明的基本原理如图1所示：
[0103] 图1(a)是制作脱细胞真皮基质(ADM)支架示意图，ICR小鼠脱臼处死后，脱毛取背部全皮层皮肤。经过脱细胞处理后剩一层富含胶原纤维的细胞外基质，剪裁成直径为7mm的圆形ADM支架。ADM支架大小与糖尿病小鼠创口大小相等，为进一步制作ADM交联的药物复合支架及研究复合支架在糖尿病伤口愈合的作用提供高效、便捷的基础材料。
[0104] 图1(b)是制作聚乙二醇氧化石墨烯(GO-PEG)示意图，GO在强碱条件下形成羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)，在EDC催化下将聚乙二醇(PEG)的氨基接枝到GO-COOH的活化羧基上，形成聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(GO-PEG)。
[0105] 图1(c)是制作聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)示意图，Que与GO-PEG通过磁力搅拌，分子间形成π-π堆垛作用制得GO-PEG/Que复合物。
[0106] 图1(d)是制作脱细胞真皮基质(ADM)支架交联聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)示意图，ADM分别浸泡于装有GO-PEG/Que复合分散液EP管中，GO-PEG/Que纳米复合物通过分子运动与ADM交联成3D药物复合支架。在这项研究中，首次利用聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素与脱细胞真皮基质制成3D药物复合支架。
[0107] 图1(e)是制成的脱细胞真皮基质交联聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素(GO-PEG/Que)的3D药物复合支架示意图，GO-PEG/Que纳米复合物吸附在胶原纤维间隙中，并形成疏松多孔的3D药物复合支架结构。
[0108] 图2(a)是GO及GO衍生物在水、PBS和DMEM中的稳定性表征图，GO-PEG和GO/Que在PBS和DMEM中具有高度的稳定性，这个特点使GO-PEG在生理条件下更好的运载Que，并提高了Que的水溶性与稳定性。然而GO、GO-COOH和GO/Que不具有这样的特点，在高速离心下，在PBS出现少量沉淀，在DMEM中完全沉淀。
[0109] 图2(b)是Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的紫外吸收波长测定结果图，Que的紫外吸收波长有I带和II带分别位于370nm和260nm处。而通过GO或GO-PEG负载之后，Que的I带裂解为3条带，是因为GO或GO-PEG均能通过π-π堆垛将Que吸附在其表面，引起了Que的B环结构的变化所致。
[0110] 图2(c)是Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的傅里叶红外光谱测定结果图，通过红外光谱检测分析可知，GO-PEG分别在～2850cm-1(C-H)、1650～1700cm-1(NH-CO)和1100～1500cm-1(C-O)处出现3个特征峰，进一步证明了PEG的氨基成功与GO-COOH的羧基共价连接-1
形成了酰胺键。GO和GO-PEG在载上Que之后，850cm 的配位键出现红移，GO-PEG/Que与GO/Que的红外光谱相比较，可以看出GO-PEG/Que负载的Que波峰更明显，说明GO-PEG与Que形成复合物载药效率更高。
形成了酰胺键。GO和GO-PEG在载上Que之后，850cm 的配位键出现红移，GO-PEG/Que与GO/Que的红外光谱相比较，可以看出GO-PEG/Que负载的Que波峰更明显，说明GO-PEG与Que形成复合物载药效率更高。
[0111] 图2(d)是GO及GO衍生物，Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的Zeta电位测定结果图，Zeta电位结果表明GO由于羧基的存在带负电荷，GO-COOH的负电荷更多，但接枝PEG后负电荷明显减少。Que由于含有酸性酚羟基带少量负电荷，GO和GO-PEG负载Que之后，负电荷均增多。
[0112] 图2(e)是GO及GO衍生物和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的水合粒径测定结果图，通过比较水合粒径大小，GO-PEG水合粒径最小，负载Que之后的分散性更好。反之，GO拥有较大的水合粒径，负载Que之后水合粒径最大，分散性减弱。
[0113] 图2(f)是GO及GO衍生物的拉曼光谱测定结果图，GO，GO-COOH和GO-PEG在1338和1587cm-1处为石墨烯的两个特征峰：D峰和G峰。D峰和G峰分别来源于κ点声子的A1g对称的呼吸振动模式对应的sp3杂化碳和E2g声子的一阶散射对应的sp2杂化碳。GO-COOH的Raman光谱也出现了分别位于1341和1583cm-1处的D峰和G峰，然而GO-COOH具有更高的D/G强度比(I(D/
2
G))。这个改变表明在GO羧基化的过程中，sp区域的平均尺寸变小，且在石墨晶格中存在过多的缺陷。也可以解释为新生成的石墨区域尺寸比羧基化之前GO中对应的尺寸小，但是数量却更多。与GO-COOH相比，这种无序结构和缺陷也反应在GO-PEG中D峰的红移和G峰的蓝移上。D峰的红移可能与PEG接枝到GO上有关。G带的位置随着样品的不同而变化，这是根据样品中层数的不同而变化的，因此G峰的蓝移可能由固体样品中层数的减少而引起的。
2
G))。这个改变表明在GO羧基化的过程中，sp区域的平均尺寸变小，且在石墨晶格中存在过多的缺陷。也可以解释为新生成的石墨区域尺寸比羧基化之前GO中对应的尺寸小，但是数量却更多。与GO-COOH相比，这种无序结构和缺陷也反应在GO-PEG中D峰的红移和G峰的蓝移上。D峰的红移可能与PEG接枝到GO上有关。G带的位置随着样品的不同而变化，这是根据样品中层数的不同而变化的，因此G峰的蓝移可能由固体样品中层数的减少而引起的。
[0114] 图2(g)是Que和GO及GO-PEG载槲皮素复合物的拉曼光谱测定结果图，在槲皮素的拉曼光谱中，位于522、604、648和840cm-1处的峰，主要对应于槲皮素分子中环A、B、C环中的面内变形和伸缩振动模式。GO/Que的拉曼峰位于817cm-1的谱带显著增强，GO-PEG/Que位于823cm-1处的谱带中等程度增强。这个代表面内振动模式的峰出现增强的现象说明Que在GO或GO-PEG表面是以垂直方式吸附的。此外,位于1496cm-1处的弱峰为B环中CH的面内弯曲振动形式，这个振动模式增强，是由于B环与C环之间仅有一C-C单键相连,当吸附到GO或GO-PEG表面上时,分子的共平面性很容易被破坏,但是这条谱带的增强说明B环依然与A环和C环处于同一平面,没有受到B环中新形成的醌式结构的干扰。
[0115] 图3(a)是不同初始浓度的Que在370nm处紫外吸收值的标准曲线图，随着Que浓度增加，紫外吸收强度呈线性增强。
[0116] 图3(b)是GO和GO-PEG载不同初始浓度的槲皮素对应的载药率统计图，GO和GO-PEG负载不同浓度的Que，载药率随着Que浓度的增加而增加，在500μM处GO-PEG/Que载药率达到98.44±0.09％，而GO/Que的最大载药率为93.44±0.11％。
[0117] 图3(c)是GO/Que和GO-PEG/Que在PH＝5的醋酸溶液中不同时间点的释药率统计图，分析可知，在PH＝5的酸性条件下，24h之后，GO-PEG/Que相对于GO/Que释放Que更多，72h后GO-PEG/Que释药率可达到52.75±1.2％，而GO/Que释药率为39.36±1.72％。
[0118] 图3(d)是GO/Que和GO-PEG/Que在PH＝7.4的PBS溶液中不同时间点的释药率统计图，当PH＝7.4的生理条件下，GO/Que释药率在36h之后显著增强，在72h后达到17.9±0.6％，而GO-PEG/Que释药率保持相对稳定，最大释药率为9.58±1.0％。GO-PEG/Que在不同的PH条件下所表现的释药差异，进一步说明了在生理条件下GO-PEG/Que能稳定存在，当进入到酸性条件，释药更快更高效，GO-PEG在不同的条件下能有效的调控药物的释放，是优选的药物载体。
[0119] 图3(e)是GO-PEG在原子力显微镜下的形貌图，GO-PEG呈片层结构，单层结构厚度大约在0.6-1nm间，由于范德华力作用使GO-PEG分散不均匀，堆垛形成双层结构，厚度为2nm。GO-PEG的尺寸大约约为0.2-0.5μm之间，展示了超高的表面积比。
[0120] 图3(f)是GO-PEG/Que在原子力显微镜下的形貌图，单片层聚乙二醇修饰的氧化石墨烯负载槲皮素后形成的GO-PEG/Que复合物厚度大约在3-4nm间，尺寸大小约为0.5-1μm之间。进一步证明了GO-PEG能通过π-π堆垛将Que吸附在其表面，且GO-PEG具有超小的表面积，在药物传递和药物释放中呈现优异的效果。
[0121] 图4(a)是ADM支架的照片和电镜图，从图中看出，ADM支架自然状态下呈白色，电镜扫描显示ADM由分布均匀的纤维网状结构组成，胶原纤维成网状排列。在扫描电镜高倍视野下，ADM保留了天然的3D胶原纤维网络结构，ADM支架的纤维间交错排列呈大小不等的空隙。ADM实质为细胞外基质，其主要成分中含的胶原能发挥真皮模板的作用，为组织细胞附着、再生提供一个良好的支架结构。
[0122] 图4(b)是ADM-GO-PEG/Que复合支架照片和电镜图，ADM-GO-PEG/Que复合支架颜色变深，电镜扫描显示保留了ADM支架的优点并呈现出疏松多孔结构，在高倍镜下，GO-PEG/Que在胶原支架间交织形成一层特殊的片层结构，这种特殊的结构使支架间孔径更疏松，不仅有利于药物的传递，更有利于药物的释放和细胞的附着以及向支架内部迁移生长。
[0123] 图4(c)是ADM支架的激光共聚焦二次谐波信号的3D图像，3种支架未经过任何染色和其他处理的情况下，调节双光子激光共聚焦显微镜激发波长(638nm)，成功地激发出了胶原蛋白支架的二次谐波信号，并发出红色荧光。
[0124] 图4(d)是ADM-GO-PEG/Que复合支架的激光共聚焦二次谐波信号的3D图像，在同等条件下激发出了ADM-GO-PEG/Que复合支架的二次谐波信号，说明ADM-GO-PEG/Que复合支架完整的保留了ADM的胶原蛋白结构。通过与ADM对比发现，ADM-GO-PEG/Que复合支架具有更为疏松的孔径供细胞附着，且ADM-GO-PEG/Que支架可作为药物传递系统，是细胞生长最为理想的药物复合支架，为促进糖尿病皮肤伤口愈合提供了理论基础。
[0125] 图4(e)是ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que的拉曼光谱测定结果图，ADM支架显著的拉曼特征峰分别位于857cm-1(脯氨酸的C–C振动)，880cm-1(羟脯氨酸的C–C振动),923cm-1(脯氨酸的C–C伸缩),和939cm-1(碳骨架的C–C振动)。拉曼特征峰位于1248和1280cm-1与Amide III的N–H振动模式有关。拉曼特征峰位于1444cm-1展示了显著的CH2峰.其他拉曼峰1640和1673cm-1(amide I的C＝O伸缩振动)也是ADM支架的特征峰。ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que由于表面覆盖了一层纳米复合物，拉曼光谱受到了明显的影响，结果更趋近于GO/Que和GO-PEG/Que的变化趋势，与之前所述相似。
[0126] 图5(a)是ICR小鼠注射STZ后血糖均值测定结果图，从图中看出，采用STZ小剂量空腹注射联合高脂高糖饲料喂养复制糖尿病小鼠模型的方法，注射STZ后血糖显著增高，当血糖≥11mmol/L，视为糖尿病小鼠模型造模成功。
[0127] 图5(b)是ICR小鼠注射STZ后体重均值测定结果图，注射STZ后的前一周体重变化不明显，但一周后体重急剧下降，并伴随多饮、多尿的现象。
[0128] 图5(c)是糖尿病小鼠分别移植ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que后第1、3、7和14天的伤口愈合形态图片，对模型小鼠背部皮肤全皮层切除，复制7mm损伤创面模型。将造模成功的糖尿病小鼠分成ADM对照组、ADM-GO/Que治疗组和ADM-GO-PEG/Que治疗组，分别进行相应处理。拍照记录治疗1、3、7和14天的小鼠伤口愈合形态。
[0129] 图5(d)是糖尿病小鼠分别移植ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que后第1、3、7和14天的伤口愈合率统计图。治疗3天后的伤口愈合率无显著差异，但7天后ADM-GO-PEG/Que显著高于另外两组，14天后的创面愈合率，三组分别为77.14±0.66％、83.68±0.43％、87.34±0.6％，可见ADM-GO-PEG/Que的结合治疗显著提高了糖尿病创面的创面愈合率。
[0130] 图5(e)是糖尿病小鼠分别移植ADM、ADM-GO/Que和ADM-GO-PEG/Que后第3、7和14天的伤口Masson染色图。从图中可以看出，治疗3天后，在伤口下的3种胶原支架清晰可见，有新生血管的出现。治疗7天后，3种胶原支架均促进了周围正常组织细胞的胶原增生，而ADM-GO-PEG/Que治疗组的伤口边缘明显更加平滑，并伴随血管数量的增加。治疗14天后，ADM治疗组血管数量虽然增多，但血管直径仍然小于另外两组。ADM-GO/Que治疗组血管明显增厚，伤口边缘趋于平滑。ADM-GO-PEG/Que治疗组的血管壁增厚且直径显著增大，形成了成熟的血管，血管内具更多的红细胞。并且出现了毛囊结构，标志着伤口趋于完全愈合。
[0131] 图6是本发明公开的3D药物复合支架的制作方法的流程步骤图。
[0132] 实施例二
[0133] (1)ADM的制作
[0134] 12周龄的雄性ICR小鼠购于广东省医学实验动物中心。中性蛋白酶购于北京奥博星生物技术有限责任公司(中国，北京)，称取0.25g粉末溶解于100mL PBS配置成0.25％中性蛋白酶溶液。曲拉通X-100(Triton X-100)和乙二胺四乙酸(EDTA)均从天津市福晨化学试剂厂(中国，天津)购买，28.2mL Triton X-100与72.8mL PBS混合，置37-40℃水浴2～3h，使其充分溶解混匀配置成30％Triton X-100溶液，然后取1mL 30％Triton X-100加入到99mL PBS溶液中配置成0.3％Triton X-100溶液；称取0.02g EDTA固体粉末溶解于100mL PBS溶液中，配置成0.02％EDTA溶液。无水乙醇和氯仿均从上海麦克林生化科技有限公司(中国，上海)购买。脱毛膏(薇婷)从屈臣氏个人护理店购买(中国，广州)。选取6只12周龄的雄性ICR小鼠，以颈椎脱臼法处死，经脱毛，取小鼠背部皮肤。将取得的小鼠背部皮肤用PBS溶液浸泡清洗3遍，然后浸泡在0.25％的中性蛋白酶水溶液中，于4℃下保存48h且24h换一次液，以去除皮肤表皮组织。将去除表皮后的小鼠皮肤组织用PBS溶液冲洗3遍，再浸泡在
0.3％的Triton X-100与0.02％EDTA的混合溶液中，于室温下摇床处理48h且每24h换液一次，以去除皮肤组织中的细胞成分。将脱表皮和脱细胞后的皮肤真皮组织分别浸泡于50％、
75％和100％浓度的乙醇溶液中30分钟进行梯度脱水。脱水后的皮肤真皮组织浸泡于氯仿中约20分钟静置至透明，以去除组织中的脂肪成分，用无水乙醇多次清洗组织至无气味。将无水乙醇清洗过的组织分别浸于75％乙醇、50％乙醇和双蒸水中30分钟还水，制得脱细胞真皮基质(ADM)。然后用直径为7mm的圆形生物打孔器将ADM裁剪成多个ADM支架，并用PBS溶液冲洗3遍，然后浸泡在70％的乙醇中于4℃下浸泡1星期除菌。将已除去细菌的ADM支架转移至超净台，用无菌的PBS溶液冲洗5遍，然后浸泡在无菌的PBS溶液中，于4℃下封口保存。
0.3％的Triton X-100与0.02％EDTA的混合溶液中，于室温下摇床处理48h且每24h换液一次，以去除皮肤组织中的细胞成分。将脱表皮和脱细胞后的皮肤真皮组织分别浸泡于50％、
75％和100％浓度的乙醇溶液中30分钟进行梯度脱水。脱水后的皮肤真皮组织浸泡于氯仿中约20分钟静置至透明，以去除组织中的脂肪成分，用无水乙醇多次清洗组织至无气味。将无水乙醇清洗过的组织分别浸于75％乙醇、50％乙醇和双蒸水中30分钟还水，制得脱细胞真皮基质(ADM)。然后用直径为7mm的圆形生物打孔器将ADM裁剪成多个ADM支架，并用PBS溶液冲洗3遍，然后浸泡在70％的乙醇中于4℃下浸泡1星期除菌。将已除去细菌的ADM支架转移至超净台，用无菌的PBS溶液冲洗5遍，然后浸泡在无菌的PBS溶液中，于4℃下封口保存。
[0135] (2)GO-PEG的制作
[0136] 氧化石墨烯片购于江苏先丰纳米材料科技(中国，南京)。超纯水取自Milli-Q Integral超纯水仪(默克密理博，法国)。超声波细胞粉碎机(型号scientz-ⅡD)购自宁波新芝生物科技股份有限公司(中国，宁波)，选用φ6mm变幅杆，超声功率调节为600W，温度25℃，时间设置连续超声4秒间隙2秒。NaOH、氯乙酸和三乙胺均从上海麦克林生化科技有限公司(中国，上海)购买。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)从Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)购买。超声波清洗仪(型号SDS-1006/15)从深圳市旭达超声设备有限公司(中国，深圳)购买。磁力搅拌器(型号B15-3)购自上海司乐仪器有限公司(中国，上海)。离心超滤管(型号MCP100C41，PALL，美国)从深圳品锐生物科技有限公司购买。六臂氨基聚乙二醇(6ARM-PEG-NH2，10000kDa)从上海金畔生物科技有限公司(中国，上海)购买。槲皮素从上海麦克林生化科技有限公司(中国，上海)购买。称取氧化石墨烯片30mg置于50mL离心管，加入30mL超纯水，用超声波细胞粉碎机超声分散1h。称取3.6g NaOH和3g氯乙酸固体加入到超声后的氧化石墨烯分散液中继续超声分散1h，得到羧基化氧化石墨烯分散液(1mg/mL)，室温静置3h。用100kDa离心超滤管离心，10000转，40分钟，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至羧基化氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至
0.5mg/mL备用。避光称取2mg EDC加入到5mL羧基化氧化石墨烯分散液(0.5mg/mL)中，在超声波清洗仪中超声20分钟，然后滴加三乙胺调节PH值至弱碱性(PH≈8.0)，称取30mg聚乙二醇加入到活化羧基后的羧基化氧化石墨烯分散液中磁力搅拌过夜，用100kDa离心超滤管离心，14000r，1h，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.1mg/mL静置3h后测紫外吸收值。称取3.4mg槲皮素溶解到1mL无水乙醇中制成槲皮素母液(10μM)，移液枪取500μL加入到5mL聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液(0.1mg/mL)中磁力搅拌(转速1000/分钟)过夜，用100kDa离心超滤管离心，
10000转，20分钟，弃黄色沉淀物(未载上的槲皮素)，获得聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合分散液。采用紫外吸收分光光度计(型号UV-3200S，Mapada，中国，上海)测样品(0.1mg/mL)紫外吸收峰值。测定样品(0.1mg/mL)的Zeta电位和水合粒径采用Zeta电位仪(型号Nano-ZS90，Malvern，英国)在25℃，水分散液注入样品池，zeta电位和水合粒径值是至少三次连续测量的平均值。此外，将制得的样品放置于-80℃，2h后转移至冷冻干燥机(型号VaCo2，Zirbus，德国)中干燥24h后在研钵中研磨成细粉末与干燥的溴化钾粉末混合均匀，装入模具，在压片机上压制成片，用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪(型号Nicolet
6700，美国)检测样品基团的红外光谱吸收值，检测波长范围为650-4000cm-1。拉曼光谱的采集则选用雷尼绍Invia型激光共焦显微拉曼光谱系统(WiRE 3.2)，配有一台785nm半导体激光器，拉曼光谱仪的分辨率为1cm-1，检测激光波长为514.5nm。
0.5mg/mL备用。避光称取2mg EDC加入到5mL羧基化氧化石墨烯分散液(0.5mg/mL)中，在超声波清洗仪中超声20分钟，然后滴加三乙胺调节PH值至弱碱性(PH≈8.0)，称取30mg聚乙二醇加入到活化羧基后的羧基化氧化石墨烯分散液中磁力搅拌过夜，用100kDa离心超滤管离心，14000r，1h，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.1mg/mL静置3h后测紫外吸收值。称取3.4mg槲皮素溶解到1mL无水乙醇中制成槲皮素母液(10μM)，移液枪取500μL加入到5mL聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液(0.1mg/mL)中磁力搅拌(转速1000/分钟)过夜，用100kDa离心超滤管离心，
10000转，20分钟，弃黄色沉淀物(未载上的槲皮素)，获得聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合分散液。采用紫外吸收分光光度计(型号UV-3200S，Mapada，中国，上海)测样品(0.1mg/mL)紫外吸收峰值。测定样品(0.1mg/mL)的Zeta电位和水合粒径采用Zeta电位仪(型号Nano-ZS90，Malvern，英国)在25℃，水分散液注入样品池，zeta电位和水合粒径值是至少三次连续测量的平均值。此外，将制得的样品放置于-80℃，2h后转移至冷冻干燥机(型号VaCo2，Zirbus，德国)中干燥24h后在研钵中研磨成细粉末与干燥的溴化钾粉末混合均匀，装入模具，在压片机上压制成片，用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪(型号Nicolet
6700，美国)检测样品基团的红外光谱吸收值，检测波长范围为650-4000cm-1。拉曼光谱的采集则选用雷尼绍Invia型激光共焦显微拉曼光谱系统(WiRE 3.2)，配有一台785nm半导体激光器，拉曼光谱仪的分辨率为1cm-1，检测激光波长为514.5nm。
[0137] (3)GO-PEG/Que载药率和释药率的测试
[0138] 0.22μm的有机系滤器(型号Millex-GV，PVDF，33mm，密理博)和2mL EP管(型号MCT-200-C，爱思进)均从广州德为生物科技有限公司(中国，广州)购买。透析袋(型号MD34MM，MW：100000，Viskase，美国)购自深圳品锐生物科技有限公司(中国，深圳)。超微量分光光度计(NanoDrop ND-1000)从NanoDrop公司购买(美国)。避光称取3.4mgQue溶解到1mL无水乙醇中配成10mM的Que溶液，将10mM Que溶液分别与GO-PEG(0.1mg/mL)混合成5种不同浓度梯度的5mL体系，同时设置对照组用GO(0.1mg/mL)在同等条件下与10mM Que溶液分别混合。
5mL混合体系中Que终浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM、和500μM，室温下磁力搅拌过夜。将各组混合溶液分装在2mL EP管中标记并离心，14000r，20分钟，分离出黄色(未吸附的Que)和黑色(未载Que的GO或GO-PEG)沉淀混合物，获得不同浓度的稳定分散在水中的GO-PEG/Que和GO/Que复合物。将黄色和黑色沉淀混合物溶解于5mL无水乙醇，用0.22μm的有机系滤器过滤除掉不能溶解于无水乙醇中的GO或GO/PEG。过滤后的Que溶液用微量紫外分光光度计在波长为370nm处测量紫外吸收值，同时测量Que工作液做标准曲线，计算出每组游离Que实际的浓度值。计算公式如下：
5mL混合体系中Que终浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM、和500μM，室温下磁力搅拌过夜。将各组混合溶液分装在2mL EP管中标记并离心，14000r，20分钟，分离出黄色(未吸附的Que)和黑色(未载Que的GO或GO-PEG)沉淀混合物，获得不同浓度的稳定分散在水中的GO-PEG/Que和GO/Que复合物。将黄色和黑色沉淀混合物溶解于5mL无水乙醇，用0.22μm的有机系滤器过滤除掉不能溶解于无水乙醇中的GO或GO/PEG。过滤后的Que溶液用微量紫外分光光度计在波长为370nm处测量紫外吸收值，同时测量Que工作液做标准曲线，计算出每组游离Que实际的浓度值。计算公式如下：
[0139] 载药率(％)＝(W总药物-W游离)/W总药物×100％，
[0140] 式中W总药物为最初Que投放的质量，W游离为游离Que的质量。
[0141] 将上述制得的不同浓度的GO/Que或GO-PEG/Que分散液加入到100kDa的透析袋中透析，置于50mL装有释放介质的烧杯中，释放介质为醋酸缓冲液(PH＝5)，同时设置对照组在同等条件下将上述透析袋置于50mL装有PBS(PH＝7.4)的烧杯中，在室温下磁力搅拌。一旦透析袋放入烧杯，药物释放就开始了。在恒定搅拌条件下，释放Que，并在不同时间点(2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h，48h，72h)取出1ml释放液中进行测量，然后加入1ml新鲜释放介质。在相同的条件下采用超微量紫外分光光度计(型号NanoDrop ND-1000，美国)测量释放液中Que的浓度，并用校准曲线定量。将制得的样品并在与步骤(1)同等条件下测样品紫外吸收峰值、Zeta电位和水合粒径。此外，将制得的样品放置于-80℃，2h后转移至冷冻干燥机(型号VaCo2，Zirbus，德国)中干燥24h后在研钵中研磨成细粉末与干燥的溴化钾粉末混合均匀，装入模具，在压片机上压制成片，用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪(型号Nicolet6700，美国)检测样品基团的红外光谱吸收值，检测波长范围为650-4000cm-1。拉曼光谱的采集则选用雷尼绍Invia型激光共焦显微拉曼光谱系统(WiRE 3.2)，配有一台785nm-1
半导体激光器，拉曼光谱仪的分辨率为1cm ，检测激光波长为785nm。GO-PEG和GO-PEG/Que复合物的厚度和尺寸大小采用原子力显微镜(型号MFP-3D-S，美国)观察，检测样品浓度为
20μg/mL，滴加10μL样品于云母片上，室温下干燥。
半导体激光器，拉曼光谱仪的分辨率为1cm ，检测激光波长为785nm。GO-PEG和GO-PEG/Que复合物的厚度和尺寸大小采用原子力显微镜(型号MFP-3D-S，美国)观察，检测样品浓度为
20μg/mL，滴加10μL样品于云母片上，室温下干燥。
[0142] (4)ADM-GO-PEG/Que药物复合支架的制备
[0143] 立式电热压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50SⅡ)和超净工作台(SW-CJ-2FD)均从上海博迅有限公司(中国，上海)购买。双重纯水蒸馏器(SZ-Ⅱ)购自上海嘉鹏科技有限公司(中国，上海)。称取0.9g氯化钠固体溶解于100mL双蒸水中，配置成浓度为0.9％的生理盐水，经高压蒸汽灭菌后置于超净工作台紫外杀菌。将无菌保存的脱细胞真皮基质(ADM)支架置于超净工作台紫外杀菌30分钟，佩戴灭菌手套进行无菌操作。取出ADM用灭菌超纯水和灭菌生理盐水冲洗三次，将润洗过的ADM置于灭菌2mL EP管中。将步骤(2)中制备好的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合分散液(0.1mg/mL)用0.45μm滤器过滤，移液枪头取1.5mL到装有无菌ADM的EP管中，适当震荡，封口胶封口，浸泡72h，并置于超净工作台紫外杀菌。将制备的ADM和药物复合支架浸泡在2.5％戊二醛溶液中4℃固定24h。然后分别浸泡在30％、50％、75％、90％、100％浓度的乙醇中梯度脱水(每个浓度中振荡浸泡5分钟)，将初步脱水的ADM支架振荡浸泡在乙酸异戊酯中两次，每次5分钟。完全脱水的ADM和药物复合支架样品进行二氧化碳临界点干燥2h，然后切成约长5mm×宽3mm的小条状，在每一片条状的ADM和药物复合支架的表面喷涂30nm金层作导电处理。采用扫描电子显微镜(SEM,Zeiss Ultra 55，卡尔·蔡司，耶拿，德国)分析ADM和药物复合支架形貌。SEM最佳的成像参数是加速电压(EHT)为5kV，工作距离(WD)为6.1mm，放大倍数为5万倍。采用双光子激光共聚焦显微镜(型号DCM3D，徕卡，德国)采集ADM和药物复合支架荧光信号，扫描模式为xyz，扫描速度为400Hz，放大倍数为40倍，激发波长为638nm。拉曼光谱的采集则选用雷尼绍Invia型激光共焦显微-1
拉曼光谱系统(WiRE 3.2)，配有一台785nm半导体激光器，拉曼光谱仪的分辨率为1cm ，检测激光波长为785nm。
拉曼光谱系统(WiRE 3.2)，配有一台785nm半导体激光器，拉曼光谱仪的分辨率为1cm ，检测激光波长为785nm。
[0144] (5)药物复合支架植入糖尿病小鼠皮肤伤口
[0145] 高脂高糖饲料购于南方医科大学动物实验中心，高脂高糖饲料含45％的脂肪，35％的碳氧化物，以及20％的蛋白质，是用于模拟制造糖尿病胰岛素抵抗的特殊饲料。链脲佐菌素(STZ)从Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)购买，避光称取STZ固体粉末溶解于0.1mol/L、PH4.5的柠檬酸钠缓冲液(A液：2.1g柠檬酸溶解于100mL双蒸水；B液：
2.94g柠檬酸钠溶解于100mL双蒸水。A液和B液以1:1的比例混合均匀，现配现用)，并用一次性滤菌器过滤除菌。随机选取9只ICR小鼠用苦味酸(适量苦味酸固体溶解于无水乙醇中)标记后平均分为3组，注射STZ前称重并记录。连续3天诱导糖尿病模型，每只小鼠按照80mg/kg，70mg/kg，60mg/kg的顺序腹腔注射STZ。1mL注射器从广州市齐云生物技术有限公司(中国，广州)购买。ONE TOUCH血糖仪(Horizon)和随手测型血糖试纸(Ultra-HC)均购于强生医疗器材有限公司(中国，广州)。氯醛购于广州德为生物科技公司(中国，广州)，称取5g氯醛固体溶解于100ml0.9％生理盐水中配置成5％水合氯醛溶液。生物打孔器(7mm)从Harris公司(华盛顿，美国)购买。无菌滤纸购于广州德为生物科技公司(中国，广州)，剪裁成5cm×
5cm大小备用。Comfeel敷料购于深圳健安医药公司(中国，深圳)，剪裁成直径为8mm的圆形。
取健康、12周龄、体重36g左右的雄性ICR小鼠先用普通饲料适应性喂养5天，然后改用高脂高糖饲料进行诱导性的喂养。高脂高糖饲料诱导性喂养4周后，在空腹状态下(禁食12h，自由饮水)腹腔注射STZ(即将STZ溶解于0.1mol/L、PH4.2的柠檬酸钠缓冲液，并用一次性滤菌器过滤除菌)，连续3天且浓度依次为80mg/kg,70mg/kg和60mg/kg的剂量。第3次注射48h后尾静脉取血测小鼠的空腹血糖，空腹血糖稳定在11.1mol/L以上，同时伴有明显的多食、多饮、体重减轻症状的，可视作糖尿病小鼠造模成功。为了防止脱毛过程中皮肤的损伤影响实验结果，在制造创面的前1天对糖尿病小鼠进行背部脱毛。首先用水合氯醛溶液(400mg/kg)腹腔注射麻醉处理，待小鼠完全麻醉后，将小鼠固定在鼠台上，用打孔器在小鼠背部标记出
7mm的圆形区域，然后用眼科剪对选定的圆形区域全皮层切除，建立糖尿病小鼠背部全皮层损伤模型。将糖尿病小鼠全皮层损伤模型随机分为3组：ADM-GO-PEG/Que治疗组、ADM-GO/Que治疗组和ADM对照组。对于ADM-GO-PEG/Que治疗组，具体操作是将上述制备的浸泡负载GO-PEG/Que的ADM接近表皮一面朝外移植到糖尿病小鼠创面部位，即溶有GO-PEG/Que药物的一面朝向小鼠的肌肉层，用无菌滤纸将渗出的液体吸拭掉。ADM治疗组小鼠的处理方法是将无菌的ADM支架移植到小鼠的创面部位，将支架平铺在伤口部位，避免支架卷曲。对空白对照组用无菌生理盐水擦拭糖尿病小鼠的创面部位。最后用Comfeel敷料覆盖在各组小鼠处理后的伤口部位，使伤口湿度合适，防止伤口感染或小鼠自身抓咬。分别在1天，3天，7天，
14天进行白光拍照观察伤口愈合情况。在预期的愈合时间点将实验小鼠麻醉处死，获取伤口部位的皮肤组织，用10％的中性福尔马林溶液固定，然后将固定后的组织样品进行石蜡切片(5μm)，石蜡切片脱蜡还水后进行Masson染色：组织固定于Bouin氏液或Zenker氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋，切片脱蜡至水。天青石蓝液染2-3分钟，流水稍洗。Mayer苏木素液染2-3分钟，流水稍洗。1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟。丽春红酸性品红液染5-10分钟，蒸馏水稍冲洗。1％磷钼酸水溶液处理约5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝液或绿液复染5分钟。1％冰醋酸处理1分钟，95％乙醇脱水多次。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
2.94g柠檬酸钠溶解于100mL双蒸水。A液和B液以1:1的比例混合均匀，现配现用)，并用一次性滤菌器过滤除菌。随机选取9只ICR小鼠用苦味酸(适量苦味酸固体溶解于无水乙醇中)标记后平均分为3组，注射STZ前称重并记录。连续3天诱导糖尿病模型，每只小鼠按照80mg/kg，70mg/kg，60mg/kg的顺序腹腔注射STZ。1mL注射器从广州市齐云生物技术有限公司(中国，广州)购买。ONE TOUCH血糖仪(Horizon)和随手测型血糖试纸(Ultra-HC)均购于强生医疗器材有限公司(中国，广州)。氯醛购于广州德为生物科技公司(中国，广州)，称取5g氯醛固体溶解于100ml0.9％生理盐水中配置成5％水合氯醛溶液。生物打孔器(7mm)从Harris公司(华盛顿，美国)购买。无菌滤纸购于广州德为生物科技公司(中国，广州)，剪裁成5cm×
5cm大小备用。Comfeel敷料购于深圳健安医药公司(中国，深圳)，剪裁成直径为8mm的圆形。
取健康、12周龄、体重36g左右的雄性ICR小鼠先用普通饲料适应性喂养5天，然后改用高脂高糖饲料进行诱导性的喂养。高脂高糖饲料诱导性喂养4周后，在空腹状态下(禁食12h，自由饮水)腹腔注射STZ(即将STZ溶解于0.1mol/L、PH4.2的柠檬酸钠缓冲液，并用一次性滤菌器过滤除菌)，连续3天且浓度依次为80mg/kg,70mg/kg和60mg/kg的剂量。第3次注射48h后尾静脉取血测小鼠的空腹血糖，空腹血糖稳定在11.1mol/L以上，同时伴有明显的多食、多饮、体重减轻症状的，可视作糖尿病小鼠造模成功。为了防止脱毛过程中皮肤的损伤影响实验结果，在制造创面的前1天对糖尿病小鼠进行背部脱毛。首先用水合氯醛溶液(400mg/kg)腹腔注射麻醉处理，待小鼠完全麻醉后，将小鼠固定在鼠台上，用打孔器在小鼠背部标记出
7mm的圆形区域，然后用眼科剪对选定的圆形区域全皮层切除，建立糖尿病小鼠背部全皮层损伤模型。将糖尿病小鼠全皮层损伤模型随机分为3组：ADM-GO-PEG/Que治疗组、ADM-GO/Que治疗组和ADM对照组。对于ADM-GO-PEG/Que治疗组，具体操作是将上述制备的浸泡负载GO-PEG/Que的ADM接近表皮一面朝外移植到糖尿病小鼠创面部位，即溶有GO-PEG/Que药物的一面朝向小鼠的肌肉层，用无菌滤纸将渗出的液体吸拭掉。ADM治疗组小鼠的处理方法是将无菌的ADM支架移植到小鼠的创面部位，将支架平铺在伤口部位，避免支架卷曲。对空白对照组用无菌生理盐水擦拭糖尿病小鼠的创面部位。最后用Comfeel敷料覆盖在各组小鼠处理后的伤口部位，使伤口湿度合适，防止伤口感染或小鼠自身抓咬。分别在1天，3天，7天，
14天进行白光拍照观察伤口愈合情况。在预期的愈合时间点将实验小鼠麻醉处死，获取伤口部位的皮肤组织，用10％的中性福尔马林溶液固定，然后将固定后的组织样品进行石蜡切片(5μm)，石蜡切片脱蜡还水后进行Masson染色：组织固定于Bouin氏液或Zenker氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋，切片脱蜡至水。天青石蓝液染2-3分钟，流水稍洗。Mayer苏木素液染2-3分钟，流水稍洗。1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟。丽春红酸性品红液染5-10分钟，蒸馏水稍冲洗。1％磷钼酸水溶液处理约5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝液或绿液复染5分钟。1％冰醋酸处理1分钟，95％乙醇脱水多次。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[0146] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 基于气体吸收和相位调制的微波光子滤波器 | 2020-05-08 | 962 |
| 纳米材料复合物的加工方法及在双酚A检测中的应用 | 2020-05-08 | 284 |
| 基于氧化石墨烯增敏的光纤马赫-曾德尔干涉湿度传感器 | 2020-05-08 | 286 |
| 一种基于聚偏氟乙烯（PVDF）压电薄膜的结构健康监测装置及方法 | 2020-05-08 | 896 |
| 一种超灵敏检测磺胺噻唑的电化学传感器及其检测方法 | 2020-05-11 | 295 |
| 微孔膜截留集聚微球的免疫微孔杯、微孔板条及其检测方法 | 2020-05-08 | 604 |
| 使用相对积分参数的拉曼信号位置校正 | 2020-05-08 | 300 |
| 一种苯丙素类化合物及其制备方法 | 2020-05-08 | 37 |
| 改进型的浮球式液位计 | 2020-05-08 | 459 |
| アレイ基板、液晶表示パネル及び液晶表示装置 | 2020-05-08 | 79 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈