技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，尤其涉及一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法。
背景技术
[0002] 新型冠状病毒
肺炎（“Novel coronavirus pneumonia”，简称“NCP”）为2019新型冠状病毒（COVID-19）感染引起的急性
呼吸道传染病。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。由于新型冠状病毒传播途径包括直接传播、
气溶胶传播和
接触传播，因此具有较强的传染性，再加上其较长时间的潜伏期，因此给防疫工作带来了巨大的挑战。
[0003] NCP是一种单链的RNA病毒，它本身并不存在RNA病毒翻译所需的核糖体体系，只有进入宿主细胞后，利用宿主的RNA翻译体系以病毒基因组RNA为翻译模板进行蛋白翻译，其中就包括一个具有多重RNA复制酶功能域的RNA聚合酶，进而是应用这个酶完成负链亚基因组RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成，从而进行病毒基因组RNA的复制，之后与病毒结构蛋白进行组装后释放并侵染其他细胞。由此可见病毒RNA的入侵是病毒进行感染的首要步骤。本
试剂盒针对NCP的病毒RNA进行检测以实现对NCP感染情况进行检测
跟踪，同时也可以对
预后患者是否康复进行评估。
[0004] 前确诊新冠肺炎的手段是采用逆转病毒RNA后再进行
荧光定量PCR法针对病毒基因的核酸检测，根据目前临床实际使用情况表明现有的核酸检测存在较多的假阴性，给疫情防控带来很大的隐患，其假阴性的原因可能由于其采用病毒RNA逆转成cDNA后，进行实时荧光检测时检测灵敏度不够，从而导致其检测下限较高，检测结果存在部分误差。另外，对于新型冠状病毒（COVID-19）目前还采用胶体金检测方法，其是根据IgM、IgG类
抗体是人体感染新冠病毒后产生的免疫防御蛋白，IgG是感染14天后出现的抗体，产生后持续存在，可以作为既往感染的指标，此法检测的IgG在感染后持续存在导致不能很准确的对预后患者的感染情况进行有效评估和精确健康阶段检测。
发明内容
[0005] 本发明目的是为了克服
现有技术的不足，包括现有荧光定量PCR法核酸检测存在较多的假阴性以及胶体金法检测无法准确的预后患者的感染情况进行评估的问题，而提供一种特异性强、结果准确、假阴性概率低，同时可以对患者感染前期到后期各个阶段进行监测的可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法。
[0006] 为便于对本技术方案中涉及到的专业用语的理解，现将其
整理如下：COVID-19为新型冠状病毒型号命名。
[0007] SSB是指单链结合蛋白(英文全称Single-Stranded DNA-Binding Protein,SSB)在DNA复制、重组和修复中起着重要作用。
[0008] cDNA是指具有与某RNA链呈互补
碱基序列的DNA。
[0009] QPCR是英文全名Real-time Quantitative PCR Detecting System的简称，是指实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
[0010] 引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。
[0011] 脱
氧核糖核苷酸是由一分子的含氮的碱基,一分子的脱氧核糖,一分子的
磷酸构成的，其中核糖的5'位有个磷酸,为磷酸端,3'位是-OH（羟基）,是羟基端，DNA能够连接就是前一个脱氧核糖核苷酸的羟基端与后一个的磷酸端相连。
[0012] mRNA的3'端有一段多聚腺苷酸(即polyA)尾巴，长20～300个腺苷酸。该尾巴与mRNA由细胞核向
细胞质的移动有关，也与mRNA的
半衰期有关。研究发现，polyA的长短与mRNA寿命呈正相关’刚合成的mRNA寿命较长，“老”的mRNA寿命较短；转录第一步合成的mRNA是不成熟的,需要在5‘端加上磷酸集团的帽子,主要是为后面的翻译的识别和起始有关的,在3‘端加上polyA(多聚A)的尾巴,防止合成的mRNA被降解掉,所以对mRNA 的
稳定性有着非常重要的意义,另外还有内含子的剪切等等,才可以称为成熟 mRNA。
[0013] poly是指多聚腺嘌呤核糖核苷酸。
[0014] Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链，仅产生所需要的cDNA，用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。
[0015] phi29 DNA聚合酶是从Bacillus subtilis
噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶。具有3'到5'外切酶校读能
力，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性。
[0016] Ct值的其中C代表Cycle，t代表threshold，具体是指每个反应管内的荧光
信号到达设定的域值时所经历的循环数。
[0017] p值是指统计学中通俗理解为拒绝原假设要冒的
风险程度，值越小，就表示风险越小，P值就是当原假设为真时，比所得到的样本观察结果更极端的结果出现的概率。
[0018] 为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案。
[0019] 一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法，具体包括如下步骤：步骤S1：将适量核酸提取液作为待测样品与逆转反应体系混合进行逆转反应，逆转反应体系包括RNA逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，使得具有3’末端polyA的RNA在逆转录酶和oligo（dT）的帮助下逆转录成具有poly（T）的cDNA；
步骤S2：同时对逆转后的cDNA进行RPA反应一段时间以进一步放大，采用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列，引物在
定位到同源序列后发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白结合防止进一步替换；
步骤S3：对所述步骤S2中扩增后的目标产物，其中R为荧光基团，Q为淬灭基团，当Q与R靠近时探针不发光，热变性将DNA双链进行分离，
退火时引物与单链DNA结合；
步骤S4：DNA聚合酶随后与引物和单链RNA组成的双链结合，在延伸
温度下进行DNA聚合酶启动延伸，DNA聚合酶具有外切酶活性，当其延伸至探针荧光端时将荧光基团及探针核苷酸
切除，这样就使得荧光基团与淬灭基团分离；
步骤S5：对放大后的产物与QPCR体系混合，于QPCR仪上进行链式反应，分别依次进行变性再退火最后延伸的链式循环反应；
步骤S6：通过检测设备收集检测荧
光信号强度对目的
片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。
[0020] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中的引物采用寡核苷酸引物。
[0021] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中双链DNA是指引物与模板cDNA结合后双链。
[0022] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S6中检测设备是采用qPCRmix进行荧光PCR检测的。
[0023] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中逆转后的cDNA进行RPA反应持续时间设定为十五分钟。
[0024] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S5中的链式循环反应次数选择范围为三十五至四十次。
[0025] 作为本发明的进一步改进，所述链置换DNA聚合酶采用具有高连续合成及链置换能力且具有3'-5'外切酶活性的Phi29链置换DNA聚合酶。
[0026] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中的模板分子扩增产物的级别为五到十倍的数量级。
[0027] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S2的模板分子扩增还可以采用环介导等温扩增、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶 DNA等温扩增技术和链替代扩增中的任一种。
[0028] 由于上述技术方案的运用，本发明的技术方案带来的有益技术效果：本发明可以显著提高COVID-19核酸检测的灵敏度，同时本法生产的产品可用于患者确诊及患者预后是否感情情况的评估与判定，由于本发明采用RPA方法进行等温扩增，可以在普通逆转
基础上进行5-10数量级的信号放大，这极大的扩大了核酸检测的灵敏度，同时在增加灵敏度的基础上并不额外正常反应时长，逆转-RPA反应在37℃反应10-15分钟即可用于荧光检测；本发明直接对病毒的RNA进行检测，可以直接反映
病毒感染情况，而不受体内免疫相关抗体的影响，这一点明显优于胶体金方法；本发明的等温扩增的过程，这一过程将经过逆转的cDNA的信号扩大了5-10数量级，极大的提高了病毒核酸检测的灵敏度，同时本发明在增加等温扩增的过程中并没有延长逆转录的时间；本技术方案经过信号扩大的产物对qPCR的检测提供了更多的模板，这样可以有效地减少模糊样本的检测，可有效提高检测准确度、灵敏性。
附图说明
[0029] 附图1为本发明RNA逆转录过程示意图。
[0030] 附图2为本发明RPA反应过程示意图。
[0031] 附图3为本发明qPCR反应过程示意图。
[0032] 附图4为本发明与市场已有试剂盒对相同阴参和阳参检测的qPCR结果对比示意图。
具体实施方式
[0033] 下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0034] 一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法，具体包括如下步骤：步骤S1：将适量核酸提取液作为待测样品与逆转反应体系混合进行逆转反应，逆转反应体系包括RNA逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，使得具有3’末端polyA的RNA在逆转录酶和oligo（dT）的帮助下逆转录成具有poly（T）的cDNA；步骤S2：同时对逆转后的cDNA进行RPA反应一段时间以进一步放大，采用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列，引物在定位到同源序列后发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白结合防止进一步替换；步骤S3：对所述步骤S2中扩增后的目标产物，其中R为荧光基团，Q为淬灭基团，当Q与R靠近时探针不发光，热变性将DNA双链进行分离，退火时引物与单链DNA结合；步骤S4：DNA聚合酶随后与引物和单链RNA组成的双链结合，在延伸温度下进行DNA聚合酶启动延伸，DNA聚合酶具有外切酶活性，当其延伸至探针荧光端时将荧光基团及探针核苷酸切除，这样就使得荧光基团与淬灭基团分离；步骤S5：对放大后的产物与QPCR体系混合，于QPCR仪上进行链式反应，分别依次进行变性再退火最后延伸的链式循环反应；步骤S6：通过检测设备收集检测荧光信号强度对目的片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。
[0035] 所述步骤S2中的引物采用寡核苷酸引物；所述步骤S2中双链DNA是指引物与模板cDNA结合后双链；所述步骤S6中检测设备是采用qPCRmix进行荧光PCR检测的；所述步骤S2中逆转后的cDNA进行RPA反应持续时间设定为十五分钟；所述步骤S5中的链式循环反应次数选择范围为三十五至四十次；所述链置换DNA聚合酶采用具有高连续合成及链置换能力且具有3'-5'外切酶活性的Phi29链置换DNA聚合酶；所述步骤S2中的模板分子扩增产物的级别为五到十倍的数量级。
[0036] 现列举如下检测实例进一步说明，首先按如下表对生物产品溶液配置混合进行逆转及RPA扩增反应，具体包括如下：。
[0037] 将上述反应体系物进行混匀后，于37℃环境恒温反应15分钟，后置于
冰上降温。
[0038] 然后进行qPCR反应及结果检测：取10μL的qPCR
混合液、1μL的引物、1μL的cDNA和8μL的
水，先在95℃温度环境下混合反应5 min；然后 95℃再反应5s，最后60℃反应20s（荧光检测阶段），如此进行链式循环反应四十次，最后在72℃温度下保持5 min；然后通过检测设备收集检测荧光信号强度对目的片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。
[0039] 检测数据结果的分析判定，按如下指标进行:当Ct值≤35则认定为新冠状病毒（2019-nCoV）病毒为阳性；当Ct值为无数值或Ct值＞38，且阳性标准对照品检测结果为阳性，此次结果判断为新冠状病毒（2019-nCoV）核酸为阴性；如果待测样本35＜Ct值≤38，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测。
[0040] 为说明本发明检测的准确性及稳定情况，现采用对比方式对本发明检测效果进行验证，将本发明试剂盒与市场已有试剂盒对相同阴参和阳参进行检测的qPCR结果，结果对比详见附图4。
[0041] 如附图4所示，曲线1为市场购买的核酸试剂盒检测的阳参样品结果；曲线2为本发明试剂盒检测的相同的阳参样品结果；曲线3为市场购买的核酸试剂盒检测的阴参样品结果（重复三次）；曲线4为本发明试剂盒检测的相同的阴参样品结果（重复三次）；附图4中的横坐标表示检测的Ct数，纵坐标表示检测的荧光强度。
[0042] 检测时间对于病患确认影响也很大，在本发明反应体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件，整个过程进行得非常快，一般可在十五分钟之内获得可检出水平的扩增产物，本技术方案RPA扩增的基础体系含有DNA扩增所需的所有试剂，只需准备好引物和模板就行将上述混合物在37℃反应15分钟，将病毒RNA逆转成cDNA。
[0043] 因此从检测所需时间进行对比分析，利用本发明试剂盒与市场已有核酸检测试剂盒对相同的阳参和阴参样品进行检测；其中本发明试剂盒依次采用本技术方案设定步骤方法进行，检测操作总耗时将近1小时，而市场已有试剂盒总耗时也将近1小时，可见两种试剂盒在操作时间上大致相当。
[0044] 市场传统核酸检测试剂盒与本发明的进行检测统计及计算结果如下表： 。
[0045] 从上述曲线图及统计结果中可以看出，对于阴参，两种试剂盒均检测不到信号且没有的读数（曲线结果附图4中曲线3和曲线4中圆圈标注处及结果统计表），显示出两者对阴参均有良好的检测能力；对于阳参样品，本发明试剂盒相对于市场购买的核酸试剂盒ct值更小（图4中曲线1和曲线2以及结果统计表）；可见，在取相同的荧光强度，本发明试剂盒可以在更短的循环内达到荧光值，而市场已有的试剂盒则要过7-8个循环，本发明试剂盒的灵敏度高于市场已有试剂盒180余倍，且经统计具有显著差异，其中P值<0.001为显著差异。
[0046] 从以上结果可以看出，对于相同的样本检测，两试剂盒的操作时间无显著差别，但是本发明试剂盒的灵敏度远远高于市场已有试剂盒，可以大大提高对新型病毒RNA的检测准确性；同时在临床检测上可以进一步减少普通核酸检测试剂盒造成的不确定样本和假阴性样本的检出。
[0047] 以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
