识别HPV16阳性肿瘤细胞的单克隆抗体及其应用
阅读：302发布：2020-05-12
专利汇可以提供识别HPV16阳性肿瘤细胞的单克隆抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种识别HPV16阳性 宫颈 上皮癌细胞的单克隆 抗体 及其应用，该抗体能够高特异性地检测 肿瘤 细胞中的 宫颈癌 生物 标志HPV16E7蛋白，从而能够区分癌变的宫颈上皮细胞和宫颈异常或非癌变宫颈上皮细胞，为医生准确诊断HPV感染所导致的癌症带来依据，可有效降低高级别宫颈病变的漏诊率，为临床医师对患者诊疗提供充分的时间与依据，改善前期宫颈 疾病 检测和早期干预。同时，也可以减少和避免不必要的 阴道 镜检查。，下面是识别HPV16阳性肿瘤细胞的单克隆抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有一重链可变区和一轻链可变区，其中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:4所示的CDR1，
SEQ ID NO.:6所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:8所示的CDR3；
并且，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:12所示的CDR1'，
SEQ ID NO.:14所示的CDR2'，和
SEQ ID NO.:16所示的CDR3'。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链具有所述的重链可变区和重链恒定区。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.:18所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1或4所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链具有所述的轻链可变区和轻链恒定区。
6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为特异性抗HPV16的抗体。
7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、鼠源抗体、兔源抗体或人源化抗体。
8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为能够特异性结合HPV18 E7蛋白和HPV16 E7蛋白的单克隆抗体。
9.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体不与其它HPV亚型结合或者与其它HPV亚型的亲和力较低。
10.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体还具有以下特性：
(3)能够结合HPV16 E7的空间构象的蛋白特异性结合。
11.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
12.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的抗体；或
(2)如权利要求11所述的重组蛋白。
13.如权利要求12所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.:3、
5、7、9、11、13、15、或17、所示的序列。
14.一种载体，其特征在于，它含有权利要求12所述的多核苷酸。
15.如权利要求14所述的载体，其特征在于，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒。
16.如权利要求15所述的载体，其特征在于，哺乳动物细胞病毒是腺病毒或逆转录病毒。
17.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求14所述的载体或基因组中整合有权利要求12所述的多核苷酸。
18.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物。
19.如权利要求18所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记物是放射性核素；
所述药物是毒素、细胞因子或酶。
20.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、或如权利要求18或19所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
21.如权利要求20所述药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂型。
22.如权利要求20所述药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物。
23.如权利要求1所述的抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、或如权利要求18或19所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中HPV16和/或HPV18 E7蛋白；
(2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV16和/或HPV 18E7蛋白；
(3)检测表达HPV16和/或HPV18 E7蛋白的肿瘤细胞；
所述药剂用于治疗或预防表达HPV16和/或HPV 18E7蛋白的肿瘤。
24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述样品中含有HPV16和/或HPV18 E7蛋白。
25.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是泌尿生殖系统的肿瘤，呼吸道系统的肿瘤或消化道系统的肿瘤。
26.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是宫颈癌、子宫内膜癌、阴茎癌、黑色素瘤或头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、乳腺癌、大肠癌、或肾上腺肿瘤。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述肺癌是小细胞肺癌。
28.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述大肠癌是结直肠癌。
29.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述“泌尿生殖系统的肿瘤”是宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌或阴茎癌。
30.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
31.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述检测为细胞免疫化学
(Immunocytochemistry staning，ICC)检测，或免疫组化(Immunohistochemistry IHC)检测。
32.一种非诊断性的检测样品中HPV E7蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与权利要求1所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E7蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法为细胞免疫化学
(Immunocytochemistry staning，ICC)检测方法，或免疫组化(Immunohistochemistry IHC)检测方法,或whole cel l(全细胞)ELISA检测方法，cell lysate(细胞裂解物)ELISA检测方法。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述HPV E7蛋白包括HPV16和/或HPV18 E7蛋白。
36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将样品与两种针对HPV E7蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPV E7蛋白的抗体中的至少一种为权利要求1所述的抗体。
37.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是权利要求1所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。
38.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述在步骤(1)中，将样品与权利要求1所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗权利要求1所述抗体的第三抗体，并且在步骤(2)中检测“抗原-权利要求1所述抗体-第三抗体”复合物的形成。
39.如权利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述第一抗体、所述第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、或荧光素标记。
41.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法为细胞免疫化学
(Immunocytochemistry staning，ICC)检测方法，或免疫组化(Immunohistochemistry IHC)检测方法。
42.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有权利要求1所述的抗体或权利要求18或19所述的免疫偶联物。
43.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有权利要求1所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗权利要求1所述的抗体的二抗；和/或(3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；
或者，
所述试剂盒含有权利要求42所述的检测板。
44.一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求17所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或权利要求
11所述的重组蛋白。
识别HPV16阳性肿瘤细胞的单克隆抗体及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 子宫颈癌是第二位常见女性恶性肿瘤,全球每年大约有50万女性被诊断为宫颈癌，其中超过半数的女性因此而死亡。1976年德国科学家Harald Zur Hausen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。2008年Harald zur Hausen因证明了HPV病毒是导致宫颈癌的病原体而获得了诺贝尔生理医学奖。大量研究发现,人乳头瘤病毒HPV不仅是导致宫颈癌的元凶，同时还可以引起多种其它肿瘤,包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。作为目前唯一病因明确的癌症，宫颈癌是唯一可以通过早期筛查、早期发现、彻底防治的癌症。
[0003] 80％女性一生中都会感染HPV病毒，通常病毒在1-2年内会自然清除，仅25％左右会发生癌前病变。宫颈癌早期症状并不明显，发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期。从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。据统计，约20％的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30％将会进一步转为为恶性肿瘤。因此，HPV感染导致的癌前病变的早期诊断是降低宫颈癌等相关疾病死亡率和减少宫颈癌治疗开支的重要突破口。2012年美国癌症学会(ACS)、美国阴道镜检查与宫颈病理学会(ASCCP)和美国临床病理学会(ASCP)建议，宫颈癌筛查的最佳策略是既能识别可能进展为浸润癌的癌前病变，又能避免对未必会有恶性进展的一过性HPV感染及其相应良性病变的探查和不必要治疗。
[0004] 目前，临床上常用的宫颈癌筛查方法共有四种：传统巴氏涂片(Pap)、醋酸碘涂抹试验(VIA/VILI)、液基细胞学检测(LBC)和人乳头瘤状病毒核酸检测(HPV DNA)。液基细胞学检测(LBC)采用TBS报告系统：包括正常细胞学涂片；良性细胞学改变；鳞状上皮细胞异常；腺体细胞异常；来源于子宫外的其他恶性肿瘤。其中鳞状上皮异常又分为：意义未明的不典型鳞状上皮细胞(ASC-US)；不典型鳞状细胞，不除外高度鳞状上皮内病变(ASC-H)；低度鳞状上皮内病变(LSIL)；高度鳞状上皮内病变(HSIL)以及鳞癌(SCC)。目前市场上广泛使用的液基细胞学检测有美国Hologic的TCT( Cytologic Test)，BD公司的LCT(BD SurePathTM)和国产广州安必平公司的LBP。但使用细胞学方法检测CIN2及更高级别病变时的敏感性较低，细胞学对于癌前病变不具有非常好的特异性，实验室间的结果差异大，且筛查间隔频繁，至少每2-3年就要进行检测。2015年美国癌症协会(ACS)最新发布的指南推荐初筛采用人乳头状瘤病毒(HPV)检测，但对我国卫生资源缺乏的地区，这种技术没有实际应用条件，且HPV DNA检测也无法区分HPV是瞬时感染或是持续感染。加上我国缺乏有资质的细胞学医生，因此我国宫颈癌筛查和早诊早治的工作还有很长的路要走。
[0005] 已证实宫颈癌和高危型的HPV如HPV16，18型的感染之间的强关联性。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，包括6个早期开放读码框架、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要。Ziegent(2003)等研究已证实HPV E6、E7基因具有细胞转化功能,是潜在的癌基因,编码HPV E6、E7蛋白为癌蛋白,在体外能转化小鼠上皮细胞,也能使人类上皮细胞发生永生化,而且HPV E6、E7蛋白的持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表达蛋白E6和E7在宫颈癌的发生中起着重要作用。癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组内，随着E6和E7蛋白表达控制的缺失，在高度宫颈非典型增生和宫颈癌病人的上皮细胞内持续表达E6和E7蛋白。E7是肿瘤原性蛋白，且具有较强的抗原性，能够使肿瘤抑癌基因pRb失活，最终引起细胞生长失控，导致细胞永生化而发生癌变。这使得E7可作为高度宫颈损伤和宫颈癌检测的一个肿瘤标志物。
[0006] 目前临床免疫组化检测HPV感染主要是采用HPV L1和其他一些辅助生物标志，如p16INK4A，Ki67,hTERT等(Valentina F，Renzo B，Serena B，et al.Detection of HPV E7Oncoviral protein in cervical lesions by a new antibody.Appl immunohistochem Mol Morphol,2013,21(4):341-350)。临床HPV检测没有合适的抗体主要有三个原因：1，HPV蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要高度亲和力的抗体进行检测；2，HPV病毒在现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3，E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应，另外使制备得到的抗体往往与其他的HPV蛋白存在交叉反应，对E7蛋白不具有特异性。
[0007] 因此，需要提供一种用于诊断高度子宫颈病变的方法，该方法不依赖于常规的Pap涂片检查和针对高危HPV感染的分子检测或者与其一起联用。该方法应当能够特异性地鉴定存在于所有患者群体中的高度子宫颈病变，尤其能够对细胞学检测被分类为LSIL或CIN II、而实际上是高度病变的病例或者有发展为高度病变的重大可能性的病例进行分流。因此本领域需要这样的特异的、可靠的诊断方法，该方法能够检测高度子宫颈疾病以及能够区分HPV持续感染导致的组织破坏和不被当作临床疾病的病症例如早期HPV感染和轻度发育异常。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种能够识别HPV16阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。
[0009] 在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
[0010] SEQ ID NO.:4所示的CDR1，
[0011] SEQ ID NO.:6所示的CDR2，和
[0012] SEQ ID NO.:8所示的CDR3。
[0013] 在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列。
[0014] 本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区，和
[0015] 重链恒定区。
[0016] 在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源。
[0017] 本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
[0018] SEQ ID NO.:12所示的CDR1'，
[0019] SEQ ID NO.:14所示的CDR2'，和
[0020] SEQ ID NO.:16所示的CDR3'。
[0021] 在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.:18所示的氨基酸序列。
[0022] 本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区，和
[0023] 轻链恒定区。
[0024] 在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源。
[0025] 本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
[0026] (1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
[0027] (2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
[0028] 在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
[0029] 在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV16的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV16 E7蛋白的抗体。较佳地，所述抗体还具有特异性抗HPV18 E7蛋白的功能。
[0030] 在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人兔嵌合抗体)、鼠源抗体、兔源抗体或人源化抗体。
[0031] 在另一优选例中，
[0032] 所述“HPV18 E7蛋白”可以为野生型HPV18 E7蛋白，也可以为野生型HPV18E7蛋白的衍生蛋白。所述“HPV16 E7蛋白”可以为野生型HPV16 E7蛋白，也可以为野生型HPV16 E7蛋白的衍生蛋白。
[0033] 在另一优选例中，所述抗体为能够特异性结合HPV18 E7蛋白和HPV16 E7蛋白的单克隆抗体。
[0034] 在另一优选例中，所述抗体不与其它HPV亚型结合或者与其它HPV亚型的亲和力较低。
[0035] 在另一优选例中，所述抗体还具有以下特性：
[0036] (3)能够结合HPV16 E7的空间构象的蛋白特异性结合。
[0037] 本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
[0038] (i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及
[0039] (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0040] 在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
[0041] 在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HPV；优选地，特异性抗HPV16；更优选地，特异性抗HPV16 E7蛋白。较佳地，所述重组蛋白还特异性抗HPV18E7蛋白。
[0042] 本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
[0043] (1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或
[0044] (2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
[0045] 在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.:3、5、7、9、11、13、15、或17、所示的序列。
[0046] 本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明第七方面所述的多核苷酸。
[0048] 本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
[0049] 本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
[0050] (a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；和
[0051] (b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
[0052] 在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0053] 本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，它含有：
[0054] (i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及[0055] (ii)药学上可接受的载体。
[0056] 在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
[0057] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴茎癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
[0058] 本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
[0059] 所述试剂、检测板或试剂盒用于：
[0060] (1)检测样品中HPV16和/或HPV18 E7蛋白；和/或
[0061] (2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV16和/或HPV18 E7蛋白；和/或
[0062] (3)检测表达HPV16和/或HPV18 E7蛋白的肿瘤细胞；和/或
[0063] 所述药剂用于治疗或预防表达HPV16和/或HPV18 E7蛋白的肿瘤。
[0064] 在另一优选例中，所述样品中含有HPV16和/或HPV18 E7蛋白。
[0065] 在另一优选例中，所述肿瘤包括：泌尿生殖系统的肿瘤，呼吸道系统的肿瘤，消化道系统的肿瘤，包括：宫颈癌、子宫内膜癌、阴茎癌、小细胞肺癌、黑色素瘤或头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
[0066] 在另一优选例中，所述“泌尿生殖系统的肿瘤”包括：宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌或阴茎癌。
[0067] 在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
[0068] 在另一优选例中，所述检测为细胞免疫化学(Immunocytochemistry staning，ICC)检测，或免疫组化(Immunohistochemistry IHC)检测。
[0069] 本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中HPV E7蛋白的方法，所述方法包括步骤：
[0070] (1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；
[0071] (2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E7蛋白。
[0072] 在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。
[0073] 在另一优选例中，所述HPV E7蛋白包括HPV16和/或HPV18 E7蛋白。
[0074] 在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对HPV E7蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPV E7蛋白的抗体中的至少一种为本发明第五方面所述的抗体。
[0075] 在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。
[0076] 在另一优选例中，所述在步骤(1)中，将样品与本发明第五方面所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗所述第一抗体的第三抗体，并且在步骤(2)中检测“抗原-第一抗体-第三抗体”复合物的形成。
[0077] 在另一优选例中，所述第一抗体、所述第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记。
[0079] 在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。
[0080] 在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。
[0081] 在另一优选例中，所述方法为细胞免疫化学(Immunocytochemistry staning，ICC)检测方法，或免疫组化(Immunohistochemistry IHC)检测方法。
[0082] 本发明的第十四方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的免疫偶联物。
[0083] 在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。
[0085] 本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
[0086] (1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或[0087] (2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗；和/或[0088] (3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；
[0089] 或者，
[0090] 所述试剂盒含有本发明第十四面所述的检测板。
[0091] 在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。
[0092] 在另一优选例中，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。
[0093] 本发明的第十六方面，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：
[0094] (a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；
[0095] (b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
[0097] 图1 为HPV16 E7单链抗体(scFv)与蛋白和/或多肽结合ELISA检测结果图。结果根据结合性质将抗体分为四组。筛选的4个单链抗体以His-HPV16E7为抗原时，scFv001的检测的效价最高。
[0098] 图2 为HPV16 E7兔单克隆抗体活性ELISA检测结果。RAB-001，RAB-020，RAB-034，RAB-133能够高亲和力的特异性结合His-HPV16 E7重组蛋白，且与带His标签的无关蛋白不结合。
[0099] 图3 为HPV16 E7兔单克隆抗体效价ELISA检测结果。结果RAB-001抗体效价优于其他抗体。
[0100] 图4 为HPV16 E7兔单克隆抗体抗原结合特异性ELISA检测结果。RAB-001和RAB-034能够特异的结合His-HPV16 E7和His-HPV18 E7重组蛋白，RAB-020和RAB-133仅能够特异的结合His-HPV16 E7重组蛋白。
[0101] 图5 为HPV16 E7单抗结合抗原表位氨基酸序列区域ELISA检测结果。图5A为HPV16 E7氨基酸序列示意图，图5B为ELISA检测结果图。
[0102] 图6 为HPV16 E7单抗免疫细胞化学染色检测结果图。图6A为RAB-001对CaSki和C-33A细胞染色结果；图6B为RAB-034对CaSki和C-33A细胞染色结果；图6C为RAB-020对CaSki和C-33A细胞染色结果；图6D为RAB-133对CaSki和C-33A细胞染色结果。单克隆抗体RAB-001和RAB-034与CaSki细胞均有特异性染色反应，而与C-33A细胞无染色。单克隆抗体RAB-020和RAB-133与CaSki细胞均有染色反应，但与C-33A细胞也存在强的非特异性染色。
[0103] 图7 为HPV16 E7单抗RAB-001免疫细胞化学染色法检测表达HPV E7的肿瘤细胞株检测结果图。A为CaSki细胞染色结果,B为C-33A细胞染色结果，C为HeLa细胞染色结果，D为Siha细胞染色结果,单克隆抗体RAB-001与CaSki、HeLa和Siha细胞均有强的染色反应，而与C-33A细胞无染色。
[0104] 图8 为液基薄片技术固定的宫颈癌细胞株检测结果。新柏氏细胞固定液处理的CaSki和C-33A细胞采用HPV16 E7特异性单克隆抗体RAB-001和RAB-034的免疫细胞化学染色结果如图8所示。两种细胞混合后，HPV16 E7单抗RAB-001，RAB-034均能够使占细胞总数约20％的CaSki染色(黑色箭头处)，而阴性细胞C-33A无染色。
[0105] 图9 为中性福尔马林固定的宫颈癌细胞株检测结果。固定的Caski和C-33A细胞采用HPV16 E7特异性单克隆抗体RAB-001的免疫细胞化学染色结果如图9所示。两种细胞混合后，HPV16 E7单抗RAB-001能够使占细胞总数约50％的CaSki染色(黑色箭头处)，而阴性细胞C-33A无染色。
[0106] 图10 为来源于临床病例的宫颈上皮脱落细胞，经液基细胞固定液处理后，采用HPV16 E7特异性单克隆抗体RAB-001和RAB-034的免疫细胞化学染色结果图。图10A显示了RAB-001染色结果；图10B显示了RAB-034染色结果。结果表明HPV16 E7特异性单克隆抗体RAB-001和RAB-034均能在HPV16感染阳性，且病理阳性的细胞制片样本中染出棕色细胞。经病理科细胞学医生做盲法复审阅片，对染色细胞进行形态学判读，结果染色细胞中均有异型细胞(黑色箭头处)。但RAB-034对样本中极少部分的人子宫颈上皮非癌变细胞存在非特异性染色，或呈现背景染色过高，因此抗体RAB－034在识别人子宫颈上皮癌或癌前病变组织细胞的特异性上不如RAB-001性能好。
具体实施方式
[0107] 本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，获得一株抗HPV E7单克隆抗体RAB-001，实验结果表明，该针对HPV E7蛋白的单克隆抗体，亲和力强,能够特异地结合细胞中的HPV16 E7蛋白，并同时结合HPV18 E7蛋白。因此该抗体不仅能够用于检测高危型HPV16 E7蛋白，还能够用于检测高危型HPV18 E7蛋白。进一步研究表表明，该抗体还可用于临床液基细胞样本的检测。本发明还提供了检测和/或鉴定HPV16/18 E7蛋白的方法，该方法稳定性好，检测灵敏度极高。本发明还提供了包含上述抗体的试剂盒以及检测板。
[0108] 具体地，本发明采用重组His-HPV16 E7融合蛋白免疫日本大耳白兔，使用His-HPV16 E7和另一种His标记无关蛋白作为筛选检测抗原，获得B淋巴细胞，用于构建噬菌体总抗体库。通过噬菌体展示来制备特异性抗体技术在本领域是熟知的。将筛选获得的阳性抗体株Fv基因导入到真核表达系统中，表达兔源全长抗体，在ELISA检测中呈特异性的结合HPV E7融合蛋白。
[0109] 除了ELISA结合重组蛋白抗原的鉴定，阳性单克隆抗体进一步经过抗原结合表位分析，抗原亚型交叉反应分析，亲和力结合鉴定，免疫细胞化学染色(Immunocytochemistry ICC)。通过以上鉴定试验,2株抗体克隆株RAB-001和RAB-34通过了检验要求，显示了蛋白分子水平、细胞水平特异性结合高危型HPV E7癌蛋白的功能。
[0110] 为筛选出具有临床检验价值的抗体试剂，该两株单克隆抗体又进一步用于液基细胞固定液固定的宫颈癌细胞株和液基薄片技术固定的临床宫颈上皮脱落细胞的检测试验。最终获得了一株能够特异性识别HPV E7阳性宫颈上皮细胞的单克隆抗体RAB-001。基于该抗体的特异性开发了能够识别宫颈上皮癌变细胞或癌前病变细胞的方法，这些方法能够用于辅助细胞形态学或HPV分子检测与鉴别诊断。
[0111] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16 E7蛋白的氨基酸序列如下：
[0112] HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO.:1)。
[0113] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18 E7蛋白的氨基酸序列如下：
[0114] MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID NO.:2)。
[0115] 如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0116] 如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0117] 脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
[0118] 如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，本文中的兔单克隆抗体是通过噬菌体文库筛选后通过分子生物的方法构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，将该载体转入真核表达系统，培养后收取细胞上清而获得，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
[0119] 本发明还包括具有所述的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
[0120] 如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的HPV16 E7蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0121] 本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0122] 如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
[0123] 本发明采用常规方法对单克隆抗体RAB-001进行测序，获得了其序列信息，序列信息记载如下。
[0124] 如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,CDR)”可互换使用。
[0125] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括以下三个互补决定区CDR：
[0126] CDR1，其氨基酸序列为GSDISSYA(SEQ ID NO.:4)，其编码核苷酸序列为，ggatccgacatcagtagctatgca(SEQ ID NO.:3)；
[0127] CDR2，其氨基酸序列为ISNSGNT(SEQ ID NO.:6)，其编码核苷酸序列为，attagtaatagtggtaataca(SEQ ID NO.:5)；
[0128] CDR3，其氨基酸序列为GAISGTPI(SEQ ID NO.:8)，其编码核苷酸序列为，accagaggagcaatatctgggactcccatc(SEQ ID NO.:7)。
[0129] 在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：
[0130] QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDISSYAISWVRQAPGKGLEWIGSISNSGNTYYASWAKGRFTIAKTSTTVTLKMTSLTTADTATYFCTRGAISGTPIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.:10)；
[0131] 其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
[0132] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源、人源或兔源。
[0133] 如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
[0134] 在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
[0135] CDR1'，其氨基酸序列为QSVYDNNW(SEQ ID NO.:12)，其编码核苷酸序列为，cagagtgtttatgataacaactgg(SEQ ID NO.:11)；
[0136] CDR2'，其氨基酸序列为SVS(SEQ ID NO.:14)，其编码核苷酸序列为，tctgtatcc(SEQ ID NO.:13)
[0137] CDR3'，其氨基酸序列为AGGFSGNIYT(SEQ ID NO.:16)，其编码核苷酸序列为，gcaggcggttttagtggtaatatttatact(SEQ ID NO.:15)
[0138] 在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：
[0139] DPMLTQTASSVSAAVGGTVTISCQSSQSVYDNNWLGWYQQKPGQPPKLLIYSVSTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGGFSGNIYTFGGGTNVEIK(SEQ ID NO.:18)，
[0140] 其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.:17所示。
[0141] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源、人源或兔源。
[0142] 在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HPV16 E7蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:10的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:18的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
[0143] 在另一优选例中，所述的抗体为抗HPV16 E7蛋白的兔或人兔嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
[0144] 本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
[0145] 一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
[0146] 本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
[0147] 本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0148] 如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0149] 本发明抗体指具有HPV16 E7蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
[0150] 该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0151] 本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0152] 在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
[0153] 表A
[0154]最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
[0155]Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
[0156] 本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:3、5、7、9、11、13、15、17所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:3、5、7、9、11、13、15、17所示的编码区序列有差别的核酸序列。
[0157] 编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0158] 术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0159] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:10和/或SEQ ID NO.:20所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0160] 本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
[0161] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
[0162] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0163] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0164] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
[0165] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
[0166] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0167] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0168] 本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0169] 用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
[0170] 可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0171] 本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0172] 本发明的药物组合物可直接用于结合HPV16 E7蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0173] 本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0174] 使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0175] 单克隆抗体的制备
[0176] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)，噬菌体展示技术或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
[0177] 代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
[0178] 对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal
Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
[0179] 由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
[0180] 噬菌体展示技术是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，从而使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
[0181] 本发明提供了一种针对HPV E7蛋白的单克隆抗体，特别是针对HPV16 E7蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用噬菌体展示技术进行筛选，重组DNA方法组建真核表达系统来表达抗体，再将分泌于培养基中的抗体经亲和层析柱(Protein A-Sephrose)进行纯化。
[0182] 方法和样本
[0183] 本发明涉及用于在以细胞和/或组织样本检测宫颈癌的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测在所述样本中HPV癌蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。
[0184] 本发明可以用于HPV感染相关癌症中HPV癌蛋白的检测，其中HPV感染相关的癌症例如宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。
[0185] 根据本发明，使用HPV癌蛋白分子标记可以支持或甚至取代细胞学和/或组织学检测方法。在特殊病例中，蛋白分子标记可以被用作诊断工具而不需要进一步的基于细胞的形态检测的支持。本发明所采用的生物标记是HPV癌蛋白，该生物标记来源于病毒，因为组织中病毒存在的标记特性不会发生在未感染的人组织中，因此对HPV感染的样本的检测具有特异性。
[0186] 本发明中所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
[0187] 本发明中使用的样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。细胞或组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可以获得保存介质(福尔马林、Cytyc“PreservCyt”或Tripath Imaging“Cytorich”等)。合适的细胞保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。
[0188] 试剂盒
[0190] 本发明进一步设计用于检测高危型HPV E7癌蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括识别高危型HPV E7癌蛋白的抗体，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV E7抗体，更优选是抗HPV16 E7单克隆抗体。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0191] 本发明进一步设计开发用于对来自宫颈脱落细胞样本的HPV感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本中的高危型HPV E7癌蛋白，其中保存样本的细胞保存液可以是诸如液基细胞检测法中的细胞保存液。将细胞固定在合适的细胞保存液中，并且被用于开发在基于非细胞形态分析基础上的对样本的HPV感染相关肿瘤进行检测的检测试剂盒和体外诊断装置。
[0192] 本发明的目的之一在于提供一种检测HPV16 E7蛋白表达的方法，并且所述的方法可用于检测HPV感染相关癌症特别是宫颈癌的检测。
[0193] 本发明的发明人等制作了针对人乳头瘤病毒HPV16 E7蛋白质的单克隆抗体RAB-001并研究其反应性。使用此抗HPV16 E7单克隆抗体RAB-001对不表达HPV的宫颈癌细胞株C-33A及表达HPV16 E7的人宫颈癌细胞系CaSki和表达HPV18 E7的人宫颈癌细胞株HeLa以及同时表达HPV16/18 E7的人宫颈癌细胞系Siha进行免疫细胞化学染色，结果发现：RAB-
001与不表达HPV蛋白的C-33A细胞无反应，与表达HPV16 E7的阳性细胞CaSki，HPV18 E7的阳性细胞HeLa及同时表达HPV16/18 E7的阳性细胞Siha均有较强染色反应。
001与不表达HPV蛋白的C-33A细胞无反应，与表达HPV16 E7的阳性细胞CaSki，HPV18 E7的阳性细胞HeLa及同时表达HPV16/18 E7的阳性细胞Siha均有较强染色反应。
[0194] 本发明的发明人等使用所制作的抗HPV16 E7单抗RAB-001对醇类(TCT-新柏氏固定液)或醛类(福尔马林固定液)固定的混合宫颈癌细胞系进行免疫细胞化学染色。当CaSki细胞和C-33A细胞按比例(1:1)混合后，通过检测肿瘤细胞内部的HPV16 E7，RAB-001可特异性地检测出阳性肿瘤细胞的存在，并且两种固定液对阳性和阴性结果的判断无影响。
[0195] 进而，本发明的发明人等使用所制作的抗HPV16 E7单抗RAB-01对液基细胞固定液中保存的宫颈脱落细胞进行免疫细胞化学染色。结果表明RAB-01能够识别宫颈脱落细胞中的异型细胞并使之明显染色，而与正常宫颈脱落细胞不结合。根据该发现结果，本发明的发明人完成了本发明。
[0196] 也就是说，本发明的方法是检测肿瘤标记物的方法，其特征在于：包括检测样本中的HPV16 E7的步骤。
[0197] 在本发明的方法中，所述检测样本优先是从检体采集的脱落细胞、或该组织的培养物或该组织的切片，也可以是由从检体采集的组织或该组织的培养物所制备的悬浮细胞。另外，所述细胞优选的是宫颈脱落细胞。
[0198] 本发明的方法中，所述检体优选是宫颈上皮损伤有可能患宫颈病变的患者，也可以是宫颈已经发生病变的患者。
[0199] 所述HPV16 E7优选是HPV16 E7蛋白质或其片段。在此情况时，检测所述的HPV16 E7的步骤优选是使用HPV16 E7的免疫细胞化学染色分析。所使用的抗HPV16 E7抗体优选是抗HPV16 E7单克隆抗体。
[0200] 所述方法免疫检测所采用的来自HPV16 E7癌基因表达的蛋白作为HPV16相关的恶性或恶变前细胞发生的可靠指标。本发明最有用的方面之一是在对子宫颈癌、鳞状上皮细胞损伤和腺癌及与致癌HPV16感染相关的任何上皮细胞异常的诊断中的应用，所示的致癌HPV16感染包括中空细胞病；角化过度症；包括上皮内瘤形成或上皮内病变的癌前期病症；高度发育不良；和侵染性或恶性癌症。除宫颈癌外，对HPV16 E7的检测对检测膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤也是有用的。
[0202] 本发明的试剂盒是用以检测肿瘤标记物的试剂盒，其特征在于具有抗HPV16 E7单克隆抗体。本发明的试剂盒优先是还具有用以检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV16 E7抗体，更优选是抗HPV16 E7单克隆抗体，尤其优选是通过噬菌体展示和重组DNA技术，获得用于真核表达系统的抗HPV16 E7单克隆抗体基因重组表达载体。由真核表达系统产生的抗HPV16 E7兔单克隆抗体或是与该抗HPV16 E7兔单克隆抗体具同等的结合活性的单克隆抗体。
[0203] 本发明提供了一种方法通过检测细胞内源的HPV16 E7蛋白，区分不含HPV DNA的肿瘤细胞。并且当细胞在临床广泛采用液基细胞固定液或中性福尔马林固定液中固定后仍能准确的检测出阳性细胞，从而能够在癌症演变的早期作出诊断，为及时治疗提供依据。
[0204] 进一步，本发明还提供一种采用该检测方法所形成的检测试剂盒。
[0205] 本发明的主要优点在于：
[0206] (1)本发明提供的针对HPV16 E7蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。
[0207] (2)本发明提供的针对HPV16 E7蛋白的抗体能够特异性的与HPV16 E7蛋白进行结合，并与HPV18 E7蛋白有交叉反应的结合，因此该抗体不仅能够用于检测HPV16 E7蛋白，还能够用于检测HPV18 E7蛋白。
[0208] (3)本发明提供的检测HPV E7蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性好，检测灵敏度极高。
[0209] (4)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期诊断和大规模的病人筛查，并可用于监测复发病人。
[0210] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0211] 实施例1
[0212] 1. 人乳头瘤病毒HPV16 E7兔单抗制备
[0213] 1.1 单链抗体(scFv)的筛选
[0214] 采用His-HPV16 E7重组蛋白免疫兔子，用His-HPV16 E7重组蛋白和His不相关蛋白进行效价检测。分离兔子B淋巴细胞获得免疫球蛋白基因。将B细胞的全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌体抗体库。构建的噬菌体抗体库采用重组蛋白His-HPV16 E7进行淘选。经过三轮淘选的富集作用；测定噬菌体滴度；噬菌斑扩增；DNA测序；ELISA检测筛选到的靶分子结合肽。其中ELISA检测筛选选用重组蛋白His-HPV16 E7，并用His不相关蛋白设置阴性对照(N)，Anti-6×His抗体设置包被His抗原阳性对照(P)，同时设置空白对照(包被抗原直接加入酶标二抗)。His-HPV16 E70.1μg/ml包板，His不相关蛋白5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，室温作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入待测抗体5μg/ml。37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再分别加入抗Flag-HRP二抗(Sigma A8592)(1:10000)，Anti-6×His(Abcam ab1187)(1:10000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。ELISA筛选结果以待检抗体对重组蛋白His-HPV16 E7反应OD值大于2的为阳性，并进行复检。筛选获得8株单链抗体：scFv001，scFv016，scFv017，scFv020，scFv023，scFv034，scFv133，scFv139。
[0215] 初步鉴定该8株scFv的结合的表位氨基酸序列区域。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用重组蛋白和多肽，其中重组蛋白为His-HPV16 E7；多肽分别为HPV16 E7-1(氨基酸序列SEQ ID NO.:19PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE)，HPV16 E7-27(氨基酸序列SEQ ID NO.:20 LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAH)，HPV16 E7-5(氨基酸序列SEQ ID NO.:21 KCDSTLRLCVQSTHVDIRTLE)，His-Vac(氨基酸序列SEQ ID NO.:22DEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIV)，His18 E7-1(氨基酸序列SEQ ID NO.:23SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRH)。并根据scFv与氨基酸序列结合能力的不同对该8株scFv进行分组。结果见图1：该8株scFv被分成四组，其中scFv001为单独一组，scFv016、scFv023，scFv034和scFv139为一组，scFv017和scFv020为一组，scFc133为单独一组。每组各选取一株scFv进行全长兔单抗表达：分别选取scFv001，scFv020，scFv034，scFv133。
[0216] 1.2 兔单克隆抗体的生产
[0217] 生产兔单克隆抗体的真核体外表达技术在本领域是熟知的。首先根据兔抗体基因库Fc序列，结合上面选取的Fv抗体基因，构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，共构建四个真核表达载体。表达载体通过脂质体瞬转HEK293F细胞，72小时后收取培养上清，并对培养上清经亲和层析柱(Protein A-Sephrose)进行纯化。共获得四株兔单克隆抗体，分别为：RAB-01，RAB-020，RAB-034和RAB-133。
[0218] 1.3 阳性兔单克隆抗体的检测
[0219] 检测时，采用间接ELISA筛选：抗原选用His-HPV16 E7融合蛋白。并用His不相关蛋白设置待检抗体阴性对照(N)，Anti-6×His抗体设置包被His抗原阳性对照(P)，同时设置空白对照(包被抗原直接加入酶标二抗)。His-HPV16E7融合蛋白0.1,1,5μg/ml包板，His不相关蛋白5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入待测抗体0.1μg/ml，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:20000)，Anti-6×His(Abcam ab1187)(1:10000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。ELISA筛选结果以待检抗体对0.1μg/ml包被抗原的反应OD值大于1，同时与His不相关蛋白的交叉反应OD值小于0.1的为阳性，并进行复检。结果见图2：RAB-001，RAB-020，RAB-034，RAB-133均能与His-HPV16 E7结合而不与His不相关蛋白结合，即均为阳性抗体株。
[0220] 2. 单克隆抗体的鉴定
[0221] 2.1 ELISA检测兔单克隆抗体效价
[0222] 融合蛋白His-HPV16E7 0.5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV16E7单抗RAB-001，RAB-020，RAB-034，RAB-133，初始浓度为1μg/ml，倍比稀释，共11个浓度梯度，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:20000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止，OD450nm处读数。结果见图3：当采用His-HPV16E7为抗原时，单克隆抗体RAB-001的效价要优于其他单克隆抗体。
[0223] 2.2 ELISA检测anti-HPV16 E7兔单克隆抗体特异性及交叉反应：
[0224] 抗原分别选用His-HPV18 E7和His-HPV16 E7融合蛋白，并选用Anti-6×His抗体设置包被His抗原阳性对照(P)，同时设置空白对照(包被抗原直接加入酶标二抗)。0.5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，分别加入anti-HPV16 E7兔单抗RAB-001，RAB-020，RAB-034，RAB-133(1μg/ml)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:20000)，Anti-
6×His(Abcam ab1187)(1:10000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止，OD450nm处读数。结果见图4：RAB-001和RAB-034都能够同时结合HPV16 E7和HPV18 E7重组蛋白，RAB-020和RAB-133为特异性的结合HPV16 E7重组蛋白。
6×His(Abcam ab1187)(1:10000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止，OD450nm处读数。结果见图4：RAB-001和RAB-034都能够同时结合HPV16 E7和HPV18 E7重组蛋白，RAB-020和RAB-133为特异性的结合HPV16 E7重组蛋白。
[0225] 2.3 Anti-HPV16 E7兔单克隆抗体的抗原结合表位分析
[0226] 鉴定单克隆抗体在HPV16 E7抗原蛋白中的表位氨基酸序列区域。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用多肽或重组蛋白，其中多肽分别为His-Vac,HPV16 E7-1,HPV16 E7-5,HPV16 E7-27；重组蛋白为His-HPV16 E7蛋白抗原。重组蛋白抗原0.5μg/ml包板，多肽抗原2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV16 E7单抗RAB-001，RAB-020，RAB-034，RAB-133(1μg/ml)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:20000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止，OD450nm处读数。结果见图5：RAB-001和RAB-034只能够结合重组蛋白His-HPV16 E7，因此初步推测RAB-001和RAB-034是识别重组蛋白HPV16 E7的空间构象。RAB-020和RAB-133为特异性结合HPV16 E7的结合表位为5-34位氨基酸。
[0227] 2.4 兔单克隆抗体免疫细胞化学染色法检测表达HPV16 E7的宫颈癌细胞系：
[0228] 表达HPV16 E7蛋白的宫颈癌细胞株CaSki细胞，在此用作高度子宫颈病变状态中的E7蛋白过表达的肿瘤细胞模型(阳性对照)。不含HPV DNA的宫颈癌细胞株C-33A细胞，在此作为阴性对照。用兔单克隆抗体RAB-001，RAB-020，RAB-034，RAB-133分别对这两种细胞进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：
[0229] CaSki，C-33A细胞分别种植于置于24孔细胞培养板中的盖玻片上，37℃，5％CO2培养24h，弃除培养基后PBS小心润洗两次，甩干；采用4％多聚甲醛固定液室温固定30min；为防止非特异性背景染色，不允许在染色过程中使盖玻片变干。加入0.3％Triton X-100(in PBS)室温使细胞膜通透15分钟；为了使内源过氧化物酶失活加入3％H2O2/PBS室温处理5min，甩干；加入PBS洗液洗5min，甩干；加入10％FBS/PBST封闭液封闭1h，甩干；分别加入兔单克隆抗体RAB-001(10,8,4,2μg/ml)，RAB-020(10,8,4,2μg/ml)，RAB-034(10,8,4,2μg/ml)，RAB-133(10,8,4,2μg/ml)，4℃孵育过夜；加入PBST洗液洗5次，每次5min，甩干；加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:1000)二抗37℃孵育1h；加入PBST洗液洗5次，每次5min，甩干；加入DAB显色液(北京中杉金桥ZLI-9017),室温反应，显微镜下密切观察染色结果，蒸馏水洗涤终止反应。显微镜下观察结果并记录。
[0230] 结果见图6，显微镜下检测显示：HPV16 E7单克隆抗体RAB-001(8μg/ml)和RAB-034(10μg/ml)与表达HPV16 E7蛋白的宫颈癌细胞株CaSki有特异性免疫化学染色反应，而与不表达HPV蛋白的宫颈癌细胞株C-33A无染色反应。但RAB-020和RAB-133与表达HPV16 E7蛋白的宫颈癌细胞株CaSki有免疫化学染色反应，同时与不表达HPV蛋白的宫颈癌细胞株C-33A也有同等强度的免疫化学染色反应。即仅RAB-001和RAB-034两株兔单克隆抗体能特异的识别细胞内源的HPV16 E7蛋白。
[0231] 2.5 兔单克隆抗体免疫细胞化学染色法检测表达HPV18 E7的宫颈癌细胞系[0232] 选择表达HPV18 E7蛋白的宫颈癌细胞株HeLa细胞，同时表达HPV16/18 E7蛋白的宫颈癌细胞株Siha细胞。同时选用CaSki细胞作为阳性对照，及C-33A细胞作为阴性对照。用亲和力高的单克隆抗体RAB-001分别对这四种细胞进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：
[0233] 分别收集CaSki，HeLa，Siha和C-33A细胞，并种植于poly-L-Lysine处理过的盖玻片上。其他实验步骤参照实施例1-2.4。
[0234] 结果见图7，显微镜下检测显示：HPV16 E7单克隆抗体RAB-001与表达HPV16 E7蛋白和/或HPV18 E7的宫颈癌细胞株CaSki，HeLa和Siha有强的免疫化学染色反应，而与不表达HPV蛋白的宫颈癌细胞株C-33A无染色反应。与之前的ELISA检测结果一致，即RAB-001与HPV16/18 E7都具有强的结合能力，并能够特异的识别细胞内源的HPV16/18 E7蛋白。
[0235] 实施例2 使用免疫细胞化学染色法进行液基细胞固定液处理的肿瘤细胞内生物标志物过表达的检测
[0236] 分别离心收集对数生长期的CaSki细胞和C-33A细胞，将Caski细胞与C-33A细胞以1:1比例混合，种植于poly-L-Lysine处理过的盖玻片上，37℃，5％CO2培养24h。弃除培养基后PBS小心润洗两次。将盖玻片取出，采用液基细胞固定液(Hologic，Preserv
Solution)固定液固定数日。临用前将盖玻片置于99％乙醇中处理10min～1h，过夜风干。
Solution)固定液固定数日。临用前将盖玻片置于99％乙醇中处理10min～1h，过夜风干。
[0237] 将风干的肿瘤细胞盖玻片置于50％乙醇中处理10min后，转移到去离子水中处理至少30s。为防止非特异性背景染色，不允许在染色过程中使盖玻片变干。将去离子水处理过的细胞载玻片置于Tris-EDTA(pH 9.0)修复液中，95～99℃热修复10min后，连同修复液一起室温复温20min；甩干，加入PBST洗液洗5min；甩干，为了使内源过氧化物酶失活加入3％H2O2/PBS室温处理10min；甩干，加入PBST洗液洗5min；甩干，加入10％FBS/PBST)封闭液室温封闭1h；甩干，分别加入兔单克隆抗体RAB-001(15μg/ml)，RAB-034(10μg/ml)，4℃孵育过夜；加入PBST洗液洗5次，每次5min；甩干，加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:1000)二抗37℃孵育1h；加入PBST洗液洗5次，每次5min；甩干，加入DAB显色液(北京中杉金桥ZLI-
9017)，室温反应，显微镜下密切观察染色结果，蒸馏水洗涤终止反应。显微镜下观察结果并记录。
9017)，室温反应，显微镜下密切观察染色结果，蒸馏水洗涤终止反应。显微镜下观察结果并记录。
[0238] 显微镜下检测如图8显示：HPV16 E7特异性兔单克隆抗体RAB-001和RAB-034仅与表达HPV16 E7蛋白的宫颈癌细胞株CaSki有强的免疫化学染色反应，而与不含HPV DNA的宫颈癌细胞株C-33A无免疫学染色反应。因此，当肿瘤细胞采用液基细胞固定液短期固定后，HPV16 E7兔单抗RAB-001和RAB-034仍能特异性的检测出表达HPV16 E7内源蛋白的宫颈癌细胞。由于临床上目前广泛使用液基细胞检测技术，能够提供剩余的细胞样本供其他HPV感染分析，因此该方法可进一步开发用于临床HPV16 E7持续感染导致的相关恶性肿瘤的检测。
[0239] 实施例3 使用免疫细胞化学染色法进行中性福尔马林固定的肿瘤细胞内生物标志物过表达的检测
[0240] 离心分别收集CaSki和C-33A细胞于PBS中，并将CaSki细胞与C-33A细胞以1:1比例混合，涂抹于载玻片上，并立即放入10％中性福尔马林中固定30min。再转移至99％乙醇中处理10min～1h，其他实验步骤参照实施例2。
[0241] 结果见图9，显微镜下检测显示：当肿瘤细胞采用10％中性福尔马林固定液固定后，HPV16 E7单抗RAB-001能特异性的检测出表达HPV16 E7蛋白的宫颈癌细胞。实验优选细胞样本固定后用乙醇脱水并风干，样本保存数周后仍不影响单克隆抗体对阳性细胞和阴性细胞的检测结果，因此该方法为RAB-001应用于临床HPV16 E7持续感染导致的相关恶性肿瘤的检测提供了更多的方法选择。
[0242] 实施例4 兔单克隆抗体使用免疫细胞化学染色法进行液基细胞临床样本的检测[0243] 样本选择：实验组A采用经过HPV分型检测HPV16感染阳性，液基细胞学检测(Hologic， Cytologic Test)报告为HSIL，且病理阳性的液基细胞学检测病例剩余细胞样本。实验组B采用HPV感染阴性，且液基细胞学检测(Hologic，Cytologic Test)报告阴性的临床病例剩余细胞样本。临床采集的宫颈脱落细胞保存在固定液(Hologic，Preserv Solution)中不超过6个月，细胞样本制片时遵循ThinPrep T2000制片仪(Hologic)说明进行操作。制片后细胞载玻片立即放入99％乙醇中处理10min～1h，其他操作参照实施例2。DAB显色，蒸馏水洗涤后，再加入苏木素染色液(碧云天C0107)染色30s-1min，浸自来水中冲洗约10min，梯度脱水后，中性树胶封片，显微镜下观察结果并记录。
[0244] 显微镜下检测如图10显示：HPV16 E7特异性单克隆抗体RAB-001和RAB-034均能在实验组A临床病例细胞压片样本中染出棕色细胞，但RAB-034对TCT检查报告阴性的临床样本中细胞膜和质有轻微的非特异性染色，而RAB-001处理的TCT检查报告阴性样本的背景则比较干净，因此RAB-001对液基细胞学保存的临床样本的特异性好于RAB-034。经病理学专家做盲法复审阅片，对染色细胞进行形态学判读，结果染色细胞中均有异型细胞，说明HPV16E7特异性单克隆抗体RAB-001对临床HPV16 E7持续感染导致的相关恶性肿瘤的检测有一定的应用价值，可用于检测由高危HPV病毒感染导致的细胞转化及癌变情况，为宫颈癌及癌前病变的早期诊断提供客观、准确的检测信息。
[0245] 讨论：
[0246] 本发明人采用上述方法制备HPV16 E7单克隆抗体，选用四株兔单链抗体基因进行兔抗全长基因的真核系统表达，并对表达的全长兔单抗进行筛选，最终选出亲和力最高、能识别液基细胞固定液和/或临床广泛使用的福尔马林固定的肿瘤细胞内源HPV16 E7蛋白，同时背景最低的单克隆抗体RAB-001。本研究表明RAB-001能够通过结合宫颈癌相关高危型HPV E7蛋白而有效的识别液基细胞检测临床样本中宫颈癌变细胞(异形细胞)，因此相比与目前细胞形态学检测，采用RAB-001进行细胞免疫化学染色能够使检测结果更为直观，可有效降低高度宫颈病变(HSIL)及有高危HPV感染的低度病变(LSIL)的患者的漏诊率，为临床医师对患者诊疗提供充分的时间与依据，改善前期宫颈疾病检测和早期干预，减少和避免不必要的阴道镜检查。
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