环糊精蛋白质药物偶联物
阅读：102发布：2020-05-12
专利汇可以提供环糊精蛋白质药物偶联物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于 治疗 疾病 和/或病症例如但不限于增殖性疾病的化合物、组合物、偶联物和方法。在某些实施方案，本发明提供了化合物、组合物和偶联物，其包括基于环糊精的连接体-有效负载及其 蛋白质 偶联物，和/或与其他 试剂 组合。通过将本发明所述的这些化合物、组合物和偶联物施用于特定靶细胞，从而减少了由于非特异性结合现象例如非靶细胞产生的 副作用 。，下面是环糊精蛋白质药物偶联物专利的具体信息内容。
1.化合物，或其药学上可接受的盐，其包含：结合剂，所述结合剂经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分连接。
2.根据权利要求1所述的化合物，其具有式(I)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
L是三价连接体；
CD是环糊精残基；
下标n是从1至30的整数，例如，下标n是从1至4的整数；和
PA是有效负载残基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有式(Ia)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
LL是三价连接体；
RG是活性连接体残基；
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；
下标n是从1至30的整数，例如，下标n是从1至4的整数；和
PA是有效负载。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其具有式(Ib)或(Ic)所示结构：
其中BA是结合剂；
LL是三价连接体；
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；
环A与所述三唑稠合，和环A选自由环烷基、环烯基、杂环烷基、和杂环烯基组成的组；
其中环烷基、环烯基、杂环烷基和杂环烯基均任选地被烷基、OH、或NRaRb取代，其中Ra和b
R各自为烷基或H；
n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数；
PA是有效负载；和
其区域异构体和立体异构体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物，其具有式(Ib1)或(Ib2)所示结构：
其中BA是结合剂；
LL是三价连接体；
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；
n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数；
PA是有效负载；和
其区域异构体和立体异构体。
6.根据权利要求1所述的化合物，其具有式(Ib3)、(Ib4)、(Ib5)、或(Ib6)所示结构：
7.根据权利要求1所述的化合物，其具有式(Ic1)所示结构：
8.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有式(Id)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
RG是活性基团残基；
SP1和SP2在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基，和其中SP1包含三价连接体；
AA1是包含氨基酸残基的三价连接体；
2
AA是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为环糊精残基，其中存在至少一个CD；
下标n是从1至30的整数，例如，下标n是从1至4的整数；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
9.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其具有式(Ie)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
RG在每种情况下，分别独立地为活性基团残基；
SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD是环糊精残基；
下标n是从1至30的整数，例如，下标n是从1至4的整数；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
10.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其具有式(Ie1)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
RG是活性基团残基；
SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD是环糊精残基；
下标n是从1至30的整数，例如，下标n是从1至4的整数；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
11.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其具有式(Ie2)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
RG是活性基团残基；
SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的
原子；
CD是环糊精残基；
下标n是从1至30的整数；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
12.根据权利要求1-8任一项所述的化合物，其具有式(If)所示结构：
其中：
BA是结合剂；
RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；
SP1、SP2和SP3在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的
原子；
CD是环糊精残基；
下标n是从1至30的整数，例如，下标n是从1至4的整数；
下标m是从0至5的整数；
下标q是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
13.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中CD在每种情况下，分别独立地选自由α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精组成的组。
14.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中CD在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：
其中所述 表示所述CD通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。
15.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中RG在每种情况下，分别独立地为点击化学残基。
16.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中RG在每种情况下，分别独立地包含三唑或稠合三唑。
17.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中RG在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：
其中所述
表示所述RG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。
18.根据权利要求8-17任一项所述的化合物，其中，
是选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物，其中：
各 分别为与所述结合剂连接的键；
各 分别为与所述有效负载连接的键；和
R9是–CH3、或–(CH2)3N(H)C(O)NH2。
19.根据权利要求8-17任一项所述的化合物，其包含选自由以下组成的组的基团：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物，其中：
各 分别为与所述结合剂连接的键；和
各 分别为与所述有效负载连接的键。
20.根据权利要求3所述的化合物，其中，
-LL-具有式(LL1)所示结构：
其中RAA1、RAA2和RAA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与-SP-RG-SP-CD连接，其中一个或两个SP可以不存在。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中RAA1是直接或间接与CD连接的赖氨酸侧链，和RAA2与RAA3分别是缬氨酸和瓜氨酸侧链或分别是缬氨酸和丙氨酸侧链。
22.根据权利要求8-12任一项所述的化合物，其中，
LL1是
23.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中所述间隔基团在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
24.根据权利要求8-12或23任一项所述的化合物，其中下标m、q或e中的任一个为4。
25.根据权利要求8-12任一项所述的化合物，其中下标p是1。
26.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中下标n是2至4。
27.根据权利要求1-26任一项所述的化合物，其中所述结合剂(BA)是抗体或其抗原结合片段。
28.根据权利要求1-26任一项所述的化合物，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合片段，其对选自由以下组成的组的抗原具有选择性：AXL，BAFFR，BCMA，BCR–列表组分(BCR–list components)，BDCA2，BDCA4，BTLA，BTNL2，BTNL3，BTNL8，BTNL9，C10orf54，CCR1，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CD11c，CD137，CD138，CD14，CD168，CD177，CD19，CD20，CD209，CD209L，CD22，CD226，CD248，CD25，CD27，CD274，CD276，CD28，CD30，CD300A，CD33，CD37，CD38，CD4，CD40，CD44，CD45，CD46，CD48，CD5，CD52，CD55，CD56，CD59，CD62E，CD68，CD69，CD70，CD74，CD79a，CD79b，CD8，CD80，CD86，CD90.2，CD96，CLEC12A，CLEC12B，CLEC7A，CLEC9A，CR1，CR3，CRTAM，CSF1R，CTLA4，CXCR1/2，CXCR4，CXCR5，DDR1，DDR2，DEC-205，DLL4，DR6，FAP，FCamR，FCMR，FcR's，Fire，GITR，HHLA2，HLA II类，HVEM，ICOSLG，IFNLR1，IL10R1，IL10R2，IL12R，IL13RA1，IL13RA2，IL15R，IL17RA，IL17RB，IL17RC，IL17RE，IL20R1，IL20R2，IL21R，IL22R1，IL22RA，IL23R，IL27R，IL29R，IL2Rg，IL31R，IL36R，IL3RA，IL4R，IL6R，IL5R，IL7R，IL9R，整合素(Integrins)，LAG3，LIFR，MAG/Siglec-4(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-4)，MMR，MSR1，NCR3LG1，NKG2D，NKp30，NKp46，PDCD1，PROKR1，PVR，PVRIG，PVRL2，PVRL3，RELT，SIGIRR，Siglec-1(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-1)，Siglec-10，Siglec-5，Siglec-6，Siglec-7，Siglec-8，Siglec-9，SIRPA，SLAMF7，TACI，TCR–列表组分/assoc(TCR-list components/assoc)，PTCRA，TCRb，CD3z，CD3，TEK，TGFBR1，TGFBR2，TGFBR3，TIGIT，TLR2，TLR4，TROY，TSLPR，TYRO，VLDLR，VSIG4，和VTCN1。
29.根据权利要求1-28任一项所述的化合物，其中PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷(taxane)，长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)，类固醇(steroid)，LXR调节剂，和其组合。
30.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
或其立体异构体形式、药学上可接受的盐，或其溶剂化物，其中Ab是抗体或其抗原结合片段；
PA是有效负载基团部分；和
n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数。
31.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
或其立体异构体形式、药学上可接受的盐，或其溶剂化物，其中Ab是抗体或其抗原结合片段。
32.药物组合物，其包含权利要求1-31任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
33.治疗有需要的患者的疾病或病症的方法，其包含向所述患者施用权利要求1-31任一项所述的化合物或权利要求32所述的组合物。
34.化合物，其包含活性连接体，所述活性连接体经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性连接体、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分连接。
35.根据权利要求34所述的化合物，其具有式(II)所示结构：
其中：
RG'是活性基团；
L是三价连接体；
CD是环糊精残基；和
PA是有效负载残基。
36.根据权利要求34或35所述的化合物，其具有式(IIa)所示结构：
其中：
RG'是活性基团；
RG是活性连接体残基；
LL是三价连接体；
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；和
PA是有效负载。
37.根据权利要求34-36任一项所述的化合物，其具有式(IIb)或(IIc)所示结构：
其中：
RG'是活性基团；
LL是三价连接体；
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；
环A与所述三唑稠合，和环A选自由环烷基、环烯基、环炔基、杂环烷基、杂环烯基、和杂环炔基组成的组；
其中环烷基、环烯基、环炔基、杂环烷基、杂环烯基和杂环炔基均任选地被烷基、OH、或NRaRb取代，其中Ra和Rb各自为烷基或H；
PA是有效负载；和
其区域异构体、立体异构体、和混合物。
38.根据权利要求34-36任一项所述的化合物，其具有式(IIb1)或(IIb2)所示结构：
其中，RG'是活性基团；
LL是三价连接体；
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；
PA是有效负载；和
其区域异构体、立体异构体、和混合物。
39.根据权利要求36所述的化合物，其具有式(IIb3)、(IIb4)、(IIb5)、或(IIb6)所示结构：
其中下标e是从0至4的整数。
40.根据权利要求36所述的化合物，其具有式(IIc1)所示结构：
41.根据权利要求34或35所述的化合物，其具有式(IId)所示结构：
其中：
RG'是活性基团残基；
SP1和SP2在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基；
AA1是包含氨基酸残基的三价连接体；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为环糊精残基，其中存在至少一个CD；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
42.根据权利要求34-37任一项所述的化合物，其具有式(IIe)所示结构：
其中：
RG'是活性基团；
RG在每种情况下，分别独立地为活性基团残基；
SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD是环糊精残基；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
43.根据权利要求34-37任一项所述的化合物，其具有式(IIe1)所示结构：
其中：
RG'是活性基团；
2
SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的
原子；
CD是环糊精残基；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
44.根据权利要求34-37任一项所述的化合物，其具有式(IIe2)所示结构：
其中：
RG'是活性基团；
SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；
2
AA是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD是环糊精残基；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；和
PA是有效负载基团部分。
45.根据权利要求34-42任一项所述的化合物，其具有式(IIf)所示结构：
其中：
RG'是活性基团残基；
RG是活性基团残基；
1 2 3
SP、SP和SP在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基；
AA2是二肽残基；
PEG是聚乙二醇残基；
PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子；
CD是环糊精残基；
下标m是从0至5的整数；
下标p是0或1；
下标q是从0至5的整数；和
PA是有效负载基团部分。
46.根据权利要求34-45任一项所述的化合物，其中CD在每种情况下，分别独立地选自由α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精组成的组。
47.根据权利要求34-45任一项所述的化合物，其中CD在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：
其中所述 表示所述CD通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。
48.根据权利要求34-45任一项所述的化合物，其中RG'在每种情况下，分别独立地为点击化学活性基团。
49.根据权利要求34-45任一项所述的化合物，其中RG'在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：
其中，所述 表示所述RG'通过其与所述通
式中相邻基团连接的原子。
50.根据权利要求41-50任一项所述的化合物，其中，
是选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物，其中：
各 分别为与所述结合剂连接的键；
各 分别为与所述有效负载连接的键；和
R9是–CH3、或–(CH2)3N(H)C(O)NH2。
51.根据权利要求41-50任一项所述的化合物，其包含选自由以下组成的组的基团：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物，其中：
各 分别为与所述有效负载连接的键。
52.根据权利要求36-40任一项所述的化合物，其中，
-LL-具有以下通式所示结构：
其中RAA1、RAA2和RAA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与-SP-RG-SP-CD连接。
53.根据权利要求53所述的化合物，其中RAA1是直接或间接与CD连接的赖氨酸侧链，和RAA2与RAA3分别是缬氨酸和瓜氨酸侧链或分别是缬氨酸和丙氨酸侧链。
54.根据权利要求41-45任一项所述的化合物，其中，
-AA2-是
55.根据权利要求36-45任一项所述的化合物，其中所述间隔基团在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
56.根据权利要求41-45任一项所述的化合物，其中下标m或q中的任一个为4。
57.根据权利要求41-45任一项所述的化合物，其中下标p是1。
58.根据权利要求34-52任一项所述的化合物，其中PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷(taxane)，和长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)。
59.根据权利要求34所述的化合物，其中所述化合物是：
或其立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物。
60.制备权利要求1所述化合物的方法，其包含以下步骤：在适于在结合剂和化合物之间形成键的条件下，使所述结合剂与权利要求34-60所述的化合物接触。
61.连接体-有效负载，其包含与连接体连接的权利要求34-60任一项所述的化合物。
62.连接体-有效负载，其包含与前述权利要求所述化合物的氧原子或伯氮原子或仲氮原子连接的权利要求34-60任一项所述的化合物。
63.抗体-药物-偶联物，其包含与抗体或其抗原结合片段连接的前述权利要求任一项所述的化合物或连接体-有效负载。
64.治疗受试者增殖性疾病、代谢性疾病、炎症或神经退行性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的权利要求1-33任一项所述的化合物或药物组合物。
65.治疗受试者的疾病、病症或病况的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的权利要求1-33任一项所述的化合物或药物组合物。
66.治疗受试者增殖性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的权利要求
1-33任一项所述的化合物或药物组合物。
67.治疗受试者代谢性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的权利要求
1-33任一项所述的化合物或药物组合物。
68.治疗受试者炎症的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的权利要求1-33任一项所述的化合物或药物组合物。
69.治疗受试者神经退行性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的权利要求1-33任一项所述的化合物或药物组合物。
环糊精蛋白质药物偶联物
相关申请的交叉引用
[0002] 本发明提供了新颖的包含环糊精的蛋白质-药物偶联物，以及用于治疗多种疾病、病症和病况的方法，包括施用含所述环糊精的蛋白质-药物偶联物。本发明还阐述了制备含环糊精的蛋白质-药物偶联物的方法。
发明背景
[0004] 许多有效负载(即，药物)的亲脂性质可不利地影响ADC的性能，以至于所述有效负载未能有效地递送至靶细胞。通过在连接体上附加极性基团来调节ADC性能可减少偶联过程中的聚集，并改善ADC的理化性质，从而改善药物动力学(PK)和ADC的治疗指数(参见例如，Nature Biotechnology,2015,33,733–735)。调节接连体以改变最终代谢物的极性或电荷，可改善对多药耐药性(MDR)细胞的活性，因为有效负载可更好地保留在细胞内(参见例如，Cancer Res；70(6)March 15,2010,p2528)。连接体上的化学基团部分(例如，聚乙二醇(PEG)、糖或硫酸基团)不仅影响偶联效率和ADC的生成便利性，而且经常作为代谢物的一部分保留，从而影响ADC的活性和安全性。已采用各种策略来改善ADC(参见例如，Bioconjugate Chem.,2008,19(10),pp 1960–1963)。
[0005] 环糊精(CD)是可生物降解的可溶性膳食纤维和食品成分，并且还用作药物载体。其安全性已被记录在案。CD比PEG更易溶，并且像磺酸酯一样不带电荷，这使得它们在加工过程中易于处理。此外，由于葡萄糖单元是通过α-1,4键端对端进行共价连接，因此每个单元均应具有相同的化学性质，并且还应形成独特的亲水性外表面和疏水性内核。
[0006] 亲脂性有效负载的低生物利用度会加剧ADC治疗的治疗窗口。包含环糊精的蛋白质偶联物例如ADC的开发将使得改善生物靶标的调节，改善生物利用度和改善治疗窗口，特别是当亲脂性有效负载包含在ADC中时。因此，持续需要使用环糊精蛋白质药物偶联物中的试剂来有效治疗例如疾病的方法。发明摘要
[0007] 本发明提供了可用于治疗，例如用于治疗疾病、病症和病况，包括但不限于代谢性疾病、增殖性疾病以及其他疾病和病症的化合物。
[0008] 在一个实施方案，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：蛋白质，所述蛋白质经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体分别直接或间接连接至各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分。
[0009] 在一个实施方案，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：结合剂，所述结合剂经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体分别直接或间接连接至各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分。
[0010] 在另一实施方案，本发明提供了化合物，其包括：活性基团，所述活性基团经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体分别直接或间接连接至各个所述活性基团、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分。
[0012] 在另一实施方案，本发明提供了治疗有需要的患者的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明所述的化合物。
[0013] 在另一实施方案，本发明提供了制备抗体-药物偶联物的方法，其包括以下步骤：在适于在结合剂和连接体-有效负载化合物之间形成键的条件下，使所述结合剂与本发明所述的连接体-有效负载化合物接触。
附图简要说明
附图简要说明
[0014] 图1A示出了三种不同类型的有效负载化合物。
[0015] 图1B示出了用于制备有效负载化合物1h或1i的合成方法。
[0016] 图1C示出了用于制备有效负载化合物1d的合成方法。
[0017] 图2示出了用于制备中间体化合物5a-c的合成方法。
[0018] 图3示出了用于制备中间体化合物6b的合成方法。
[0019] 图4示出了用于制备中间体化合物7a和7b的合成方法。
[0020] 图5示出了描述由2a制备化合物3(3e、3f和3g)的方法A的一般合成方法。
[0021] 图6示出了描述由化合物2制备化合物3以及由化合物3制备化合物8的方法B的一般合成方法。
[0022] 图7示出了描述制备化合物9a-L的方法C的一般合成方法。
[0023] 图8示出了描述制备连接体-有效负载的方法D的一般合成方法。
[0024] 图9示出了描述制备连接体-有效负载的方法的一般合成方法。
[0025] 图10示出了描述制备实施例38中的连接体-有效负载的方法的一般合成方法。
[0026] 图11示出了描述制备实施例39中的连接体-有效负载的方法的一般合成方法。
[0027] 图12示出了实施例49的溶解度图。
[0028] 图13示出了通过迈克尔加成进行偶联的一般合成方法。
[0029] 图14示出了由Ab-Ex49表示的经由[2+3]点击反应的ADC偶联的一般合成方法。
[0031] 图16示出了抗Her2 Ab、抗Her2–PEG3–N3和抗Her2-Ex49的体积排除色谱(SEC)。
[0032] 图17示出了实施例72中测试的某些化合物的细胞活力％对Log10[M]的曲线图。
[0033] 图18以相对光单位(RLU)对Log10[M]的曲线图示出了具有和不具有环糊精连接体的LXR激动剂ADC的生物活性。
[0034] 图19以相对光单位(RLU)对Log10[M]的曲线图示出了具有和不具有环糊精连接体的LXR激动剂ADC的生物活性。
[0035] 图20示出了在本发明所述方法中可代替D-Lys使用的试剂。本发明具体实施方式
[0037] 当提及本发明提供的化合物时，除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本发明提供的术语存在多个定义的情况下，除非另有说明，否则以所述这些定义为准。
[0038] 本发明使用的“烷基”是指一价且饱和的烃基基团部分。烷基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的，即环烷基。烷基包括但不限于具有1-20个碳原子，即C1-20烷基；1-12个碳原子，即C1-12烷基；1-8个碳原子，即C1-8烷基；1-6个碳原子，即C1-6烷基；和1-3个碳原子，即C1-3烷基的那些基团。烷基基团部分的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基基团部分、己基基团部分、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。戊基基团部分包括但不限于正戊基和异戊基。己基基团部分包括但不限于正己基。
[0039] 本发明使用的“亚烷基”是指二价烷基基团。除非另有说明，否则亚烷基包括但不限于1-20个碳原子。亚烷基基团任选地如本发明所述被烷基取代。在一些实施方案，亚烷基是未取代的。
[0041] 本发明使用的“卤代烷基”是指如上所定义的烷基，其中所述烷基包括至少一个选自卤素例如氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)的取代基。卤代烷基的实例包括但不限于，-CF3、-CH2CF3、–CCl2F和–CCl3。
[0042] 本发明使用的“烯基”是指包含至少两个碳原子和一个或多个非芳族碳-碳双键的一价烃基基团部分。烯基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的。烯基包括但不限于具有2-20个碳原子，即C2-20烯基；2-12个碳原子，即C2-12烯基；2-8个碳原子，即C2-8烯基；2-6个碳原子，即C2-6烯基；和2-4个碳原子，即C2-4烯基的那些基团。烯基基团部分的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。
[0043] 本发明使用的“炔基”是指包含至少两个碳原子和一个或多个碳-碳三键的一价烃基基团部分。炔基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的。炔基包括但不限于具有2-20个碳原子，即C2-20炔基；2-12个碳原子，即C2-12炔基；2-8个碳原子，即C2-8炔基；2-6个碳原子，即C2-6炔基；和2-4个碳原子，即C2-4炔基的那些基团。炔基基团部分的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。
[0044] 本发明使用的“烷氧基”是指一价且饱和的烃基基团部分，其中所述烃包括与氧原子连接的单键，和其中所述自由基位于氧原子上，例如乙氧基CH3CH2–O·。烷氧基取代基与它们通过所述烷氧基取代基的氧原子取代的化合物连接。烷氧基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的，即环烷氧基。烷氧基包括但不限于具有1-20个碳原子，即C1-20烷氧基；1-12个碳原子，即C1-12烷氧基；1-8个碳原子，即C1-8烷氧基；1-6个碳原子，即C1-6烷氧基；和
1-3个碳原子，即C1-3烷氧基的那些。烷氧基基团部分的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基基团部分、己氧基基团部分、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基和环己氧基。
1-3个碳原子，即C1-3烷氧基的那些。烷氧基基团部分的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基基团部分、己氧基基团部分、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基和环己氧基。
[0045] 本发明使用的“卤代烷氧基”是指如上所定义的烷氧基，其中所述烷氧基包括至少一个选自卤素例如F、Cl、Br或I的取代基。
[0046] 本发明使用的“芳基”是指一价基团部分，其是芳族化合物的原子团，其中所述环原子均是碳原子。芳基是任选取代的，且可以是单环或多环的，例如双环或三环。芳基基团部分的实例包括但不限于具有6至20个环碳原子，即C6-20芳基；6至15个环碳原子，即C6-15芳基，和6至10个环碳原子，即C6-10芳基的那些。芳基基团部分的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基和芘基。
[0047] 本发明使用的“芳基烷基”是指烷基化合物原子团的一价基团部分，其中所述烷基化合物被芳香族取代基取代，即，所述芳香族化合物包括与烷基基团连接的单键，和其中所述自由基位于所述烷基基团上。芳基烷基基团通过所述烷基基团与所示的化学结构连接。芳基烷基可以由以下结构表示，例如，
其中B是芳族基团
部分，例如苯基。芳基烷基是任选取代的，即所述芳基基团和/或所述烷基基团，可以如本发明所述的那样被取代。芳基烷基的实例包括但不限于苄基。
其中B是芳族基团
部分，例如苯基。芳基烷基是任选取代的，即所述芳基基团和/或所述烷基基团，可以如本发明所述的那样被取代。芳基烷基的实例包括但不限于苄基。
[0048] 本发明使用的“烷基芳基”是指芳基化合物原子团的一价基团部分，其中所述芳基化合物被烷基取代基取代，即，所述芳基化合物包括与烷基基团连接的单键，其中所述自由基位于所述芳基基团上。烷基芳基基团通过所述芳基基团与所示的化学结构连接。烷基芳基可以由以下结构表示，例如，其中B是芳族基团部
分，例如苯基。烷基芳基是任选取代的，即所述芳基基团和/或所述烷基基团，可以如本发明所述的那样被取代。烷基芳基的实例包括但不限于甲苯甲酰基。
分，例如苯基。烷基芳基是任选取代的，即所述芳基基团和/或所述烷基基团，可以如本发明所述的那样被取代。烷基芳基的实例包括但不限于甲苯甲酰基。
[0049] 本发明使用的“芳氧基/芳基氧基”是指芳族化合物原子团的一价基团部分，其中所述环原子均是碳原子，和其中所述环被氧基取代，即所述芳族化合物包括与氧原子连接的单键，和其中所述自由基位于氧原子上，例如苯氧基 芳氧基取代基与它们通过此氧原子取代的化合物连接。芳氧基是任选取代的。芳氧基包括但不限于具有6至20个环碳原子，即C6-20芳氧基；6至15个环碳原子，即C6-15芳氧基，和6至10个环碳原子，即C6-10芳氧基的那些基团。芳氧基基团部分的实例包括但不限于苯氧基、萘氧基和蒽氧基。
[0050] 本发明使用的“RaRbN-芳基氧基”是指芳族化合物原子团的一价基团部分，其中所述环原子均是碳原子，和其中所述环被至少一个RaRbN-取代基和至少一个氧基取代，即所述芳族化合物包括与RaRbN-取代基连接的单键和与氧原子连接的单键，其中所述自由基位于氧原子上，例如 RaRbN-芳基氧基取代基与它们通过此氧原子取代的化合物连a b a b
接。RRN-芳基氧基是任选取代的。RRN-芳基氧基包括但不限于具有6至20个环碳原子，例如，C6-20(RaRbN)n-芳基氧基，6至15个环碳原子，例如，C6-15(RaRbN)n-芳基氧基，和6至10个环碳原子，例如，C6-10(RaRbN)n-芳基氧基的那些，其中n表示RaRbN–取代基的数目。RaRbN-芳基氧基基团部分的实例包括但不限于4–(二甲基氨基)–苯氧基，
接。RRN-芳基氧基是任选取代的。RRN-芳基氧基包括但不限于具有6至20个环碳原子，例如，C6-20(RaRbN)n-芳基氧基，6至15个环碳原子，例如，C6-15(RaRbN)n-芳基氧基，和6至10个环碳原子，例如，C6-10(RaRbN)n-芳基氧基的那些，其中n表示RaRbN–取代基的数目。RaRbN-芳基氧基基团部分的实例包括但不限于4–(二甲基氨基)–苯氧基，
[0051] 本发明使用的“亚芳基”是指芳族化合物的二价基团部分，其中所述环原子仅为碳原子。亚芳基是任选取代的，且可以是单环或多环的，例如双环或三环。亚芳基基团部分的实例包括但不限于具有6至20个环碳原子，即C6-20亚芳基；6至15个环碳原子，即C6-15亚芳基；和6至10个环碳原子，即C6-10亚芳基的那些。
[0052] 本发明使用的“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的烷基。本发明使用的“杂烯基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的烯基。本发明使用的“杂炔基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的炔基。合适的杂原子包括但不限于氮、氧和硫原子。杂烷基是任选取代的。杂烷基基团部分的实例包括但不限于氨基烷基、磺酰基烷基、亚磺酰基烷基。杂烷基基团部分的实例还包括但不限于甲氨基、甲磺酰基和甲基亚磺酰基。
[0053] 本发明使用的“杂芳基”是指芳族化合物原子团的一价基团部分，其中所述环原子包含碳原子和至少一个氧、硫、氮或磷原子。杂芳基基团部分的实例包括但不限于具有5至20个环原子，5至15个环原子，和5至10个环原子的那些。
[0054] 本发明使用的“亚杂芳基”是指其中所述芳环的一个或多个环原子被氧、硫、氮或磷原子替换的亚芳基。亚杂芳基是任选取代的。
[0055] “杂环烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的环烷基。合适的杂原子包括但不限于氮、氧和硫原子。杂环烷基是任选取代的。杂环烷基基团部分的实例包括但不限于吗啉基、哌啶基、四氢吡喃基、吡咯烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、二氧杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基、氧杂环戊烷基或硫杂环戊烷基。
[0056] 本发明使用的“路易斯酸”是指接受孤对电子的分子或离子。本发明所述方法中使用的路易斯酸是质子以外的那些。路易斯酸包括但不限于非金属酸类，金属酸类，硬路易斯酸类和软路易斯酸类。路易斯酸包括但不限于铝、硼、铁、锡、钛、镁、铜、锑、磷、银、镱、钪、镍和锌的路易斯酸类。示例性的路易斯酸包括但不限于：AlBr3，AlCl3，BCl3，三氯化硼甲基硫化物，BF3，三氟化硼甲基醚络合物，三氟化硼甲基硫化物，三氟化硼四氢呋喃，二环己基硼三氟甲烷磺酸盐，溴化铁(III)，氯化铁(III)，氯化锡(IV)，氯化钛(IV)，异丙醇钛(IV)，Cu(OTf)2，CuCl2，CuBr2，氯化锌，烷基铝卤化物类(RnAlX3-n，其中R是烃基，X是卤化物，和下标n是从0至3的整数)，Zn(OTf)2，ZnCl2，Yb(OTf)3，Sc(OTf)3，MgBr2，NiCl2，Sn(OTf)2，Ni(OTf)2，和Mg(OTf)2。
[0057] 本发明使用的“含N的杂环烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替代，和其中至少一个杂原子是氮原子的环烷基。合适的杂原子除氮原子之外，还包括但不限于氧原子和硫原子。含N的杂环烷基是任选取代的。含N的杂环烷基基团部分的实例包括但不限于吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、或噻唑烷基。
[0058] 本发明使用的“任选取代的”，当用于描述基团部分，例如任选取代的烷基时，是指此基团部分任选地与一个或多个取代基连接。此类取代基的实例包括但不限于卤素，氰基，硝基，任选取代的卤代烷基，叠氮基，环氧基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂环烷基，其中RA、RB和RC在每次出现时，分别独立地为氢原子、烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳基、或杂环烷基，或RA和RB同与它们连接的原子一起形成饱和或不饱和的碳环，其中所述环是任选取代的，和其中一个或多个环原子任选地被杂原子替代。在某些实施方案，当基团部分任选地被任选取代的杂芳基、任选取代的杂环烷基或任选取代的饱和或不饱和碳环取代时，所述任选取代的杂芳基、任选取代的杂环烷基或任选取代的饱和或不饱和碳环上的取代基，如果它们被取代，则不被进一步任选地被另外的取代基取代的取代基取代。在一些实施方案，当本发明所述的基团任选地被取代时，除非另有说明，与所述基团连接的取代基是未被取代的。
[0059] 本发明使用的“结合剂”是指能够与给定结合配偶体(例如抗原)特异性结合的任何分子，例如蛋白质。
[0060] 本发明使用的“连接体”是指将所述结合剂与本发明所述的一个或多个化合物，例如，本发明所述的有效负载化合物和环糊精基团，共价连接的二价、三价、或多价基团部分。
[0061] 本发明使用的“酰胺合成条件”是指适于促进形成酰胺，譬如，通过羧酸、活化的羧酸、或酰卤与胺进行反应的反应条件。在一些实施例，“酰胺合成条件”是指适于在羧酸和胺之间促进形成酰胺键的反应条件。在所述这些实施例的一些中，所述羧酸首先在活化羧酸与胺反应形成酰胺之前转化为活化羧酸。实现酰胺形成的适宜条件包括，但不限于，利用试剂来实现羧酸与胺之间反应的那些，包括但不限于，二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、(苯并三氮唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、(7-偶氮苯并三氮唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBrOP)、O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟硼酸盐(TBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三氮唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、2-氯-1,3-二甲基咪唑鎓六氟磷酸盐(CIP)、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)、和羰二咪唑(CDI)。在一些实施例，首先将羧酸转化为活化的羧酸酯，然后与胺反应形成酰胺键。在一些实施方案，羧酸与试剂反应。所述试剂通过使羧酸去质子来活化羧酸，然后由于去质子化的羧酸亲核进攻到质子化试剂上，从而与去质子化的羧酸形成产物复合物。对于某些羧酸，相较羧酸转化成活化酯之前，所述活化羧酸酯更容易受到胺的亲核进攻。此举导致酰胺键形成。因此，所述羧酸被描述为活化的。示例性试剂包括DCC和DIC。
[0062] 本发明使用的“位置异构体”、“区域异构体”或“区域异构体的混合物”是指得自用合适的炔烃处理的合适的叠氮化物(例如，-N3或PEG-N3衍生抗体)的1,3-环加成产物或应变促进的炔烃-叠氮化物环加成产物(SPAAC)(也称为点击反应)。在某些实施方案，例如，所述区域异构体和区域异构体的混合物的特征在于如下所示的点击反应产物：在某些实施方案，可在生成产物的合成方法中使用一种以上的合适的叠氮化物和一种
以上的合适的炔烃，其中每对叠氮化物-炔烃可参与一个或多个独立的点击反应以生成区域异构的点击反应产物的混合物。例如，技术人员将认识到，第一合适的叠氮化物可独立地与第一合适的炔烃反应，第二合适的叠氮化物可在生成产物的途中独立地与第二合适的炔烃反应，从而生成四种可能的点击反应区域异构体或所述四种可能的点击反应区域异构体的混合物。
以上的合适的炔烃，其中每对叠氮化物-炔烃可参与一个或多个独立的点击反应以生成区域异构的点击反应产物的混合物。例如，技术人员将认识到，第一合适的叠氮化物可独立地与第一合适的炔烃反应，第二合适的叠氮化物可在生成产物的途中独立地与第二合适的炔烃反应，从而生成四种可能的点击反应区域异构体或所述四种可能的点击反应区域异构体的混合物。
[0063] 本发明使用的术语“残基”是指化合物内化学反应后保留的化学基团部分。例如，术语“氨基酸残基”或“N-烷基氨基酸残基”是指氨基酸或N-烷基氨基酸与合适的偶联配偶体进行酰胺偶联或肽偶联的产物；其中，例如，在氨基酸或N-烷基氨基酸的酰胺偶联或肽偶联之后将水分子排出，从而得到氨基酸残基或N-烷基氨基酸残基掺入其中的产物。
[0064] 本发明使用的“治疗有效量”是指足以在患者治疗或控制疾病或病症，或延迟或最小化与疾病或病症相关的一种或多种症状时，提供治疗益处的(化合物的)量。
[0065] 某些基团、分子/基团部分、取代基、和原子被描述为具有与键相交的波浪线，以指示所述基团、分子/基团部分、取代基、原子通过其进行连接的原子。譬如，被丙基基团取代的苯基基团可表示为：具有下述结构：
本发明使用的，通过环原子之间的键连接到环状基团(例如，芳环、杂芳
环、稠环、和饱和或不饱和环烷基或杂环烷基)的取代基的图示说明意在表示，除非另有说明，环状基团可根据本发明所阐述的技术或即时公开的涉及本领域已知的技术，在环状基团的任何环位置或稠环基团的任何环上被取代基取代。譬如，所述基团
其中下标q是从0至4的整数，和其中取代基R1的位置一般性地描述，
即不直接连接至键合线结构的任何顶点，即特定的环碳原子，包括以下，其中取代基R1与特定环碳原子连接的基团的非限制性实例：
本发明使用的，通过环原子之间的键连接到环状基团(例如，芳环、杂芳
环、稠环、和饱和或不饱和环烷基或杂环烷基)的取代基的图示说明意在表示，除非另有说明，环状基团可根据本发明所阐述的技术或即时公开的涉及本领域已知的技术，在环状基团的任何环位置或稠环基团的任何环上被取代基取代。譬如，所述基团
其中下标q是从0至4的整数，和其中取代基R1的位置一般性地描述，
即不直接连接至键合线结构的任何顶点，即特定的环碳原子，包括以下，其中取代基R1与特定环碳原子连接的基团的非限制性实例：
[0066] 本发明使用的短语“活性(反应性)连接体”是指包含活性(反应性)基团和间隔基团的一价基团，如 所示，其中RG'是活性基团，SP是间隔基团。如本发明所述，活性(反应性)连接体可包含一个以上活性(反应性)基团和一个以上间隔基团。所述间隔基团是将活性(反应性)基团桥接至另一个基团(例如有效负载)的任何二价或三价基团部分。所述活性连接体(RL)与同它们连接的有效负载一起，组成可用作制备本发明所述抗体偶联物的合成前体的中间体(“连接体-有效负载”)。所述活性连接体包含活性基团(RG')，其是与另一基团(例如，本发明所述的抗体、经修饰的抗体、或其抗原结合片段、或环糊精基团)的活性部分反应的官能团或基团部分。由所述活性基团与所述抗体、经修饰的抗体或其抗原结合片段反应产生的基团部分与所述连接基团一起，组成本发明所述的偶联物的“结合剂连接体”(“BL”)部分。在某些实施方案，所述“活性基团”是与抗体或其抗原结合片段的半胱氨酸或赖氨酸残基反应的官能团或基团部分(例如，马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)。在某些实施方案，所述“活性基团”是能够进行点击化学反应(参见，例如
clickchemistry,HuisgenProc.Chem.Soc.1961,Wang etal.J.Am.Chem.Soc.2003,
andAgardetal.J.Am.Chem.Soc.2004)的官能团或基团部分。在所述点击化学反应的一些实施方案中，所述活性基团是能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔烃。此类合适的活性基团包括但不限于应变炔烃类，例如适用于应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC)的那些，环炔烃类，例如环辛炔类、苯并环化的炔烃类、和在没有铜催化剂的情况下能够与炔烃类化合物进行1,3-环加成反应的炔烃类。合适的炔烃类还包括但不限于二苯并氮杂环辛炔或 (DI BAC) ，例如 二苯并环辛炔 或
(DIBO)，例如 二芳基氮杂环辛炔酮或
(BARAC)，例如 二氟化环辛炔或 (DIFO)，
或 (DIFO2)，或 (DIFO3)，
(DIMAC)， (ALO)， (NOFO)，
(OCT)，和 (MOFO)，取代的例如氟化炔烃类，氮杂环炔烃类，二环
[6.1.0]壬炔或 (BCN，其中R是烷基、烷氧基、或酰基)，和其衍生物类，例如
特别有用的炔烃类包括
clickchemistry,HuisgenProc.Chem.Soc.1961,Wang etal.J.Am.Chem.Soc.2003,
andAgardetal.J.Am.Chem.Soc.2004)的官能团或基团部分。在所述点击化学反应的一些实施方案中，所述活性基团是能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔烃。此类合适的活性基团包括但不限于应变炔烃类，例如适用于应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC)的那些，环炔烃类，例如环辛炔类、苯并环化的炔烃类、和在没有铜催化剂的情况下能够与炔烃类化合物进行1,3-环加成反应的炔烃类。合适的炔烃类还包括但不限于二苯并氮杂环辛炔或 (DI BAC) ，例如 二苯并环辛炔 或
(DIBO)，例如 二芳基氮杂环辛炔酮或
(BARAC)，例如 二氟化环辛炔或 (DIFO)，
或 (DIFO2)，或 (DIFO3)，
(DIMAC)， (ALO)， (NOFO)，
(OCT)，和 (MOFO)，取代的例如氟化炔烃类，氮杂环炔烃类，二环
[6.1.0]壬炔或 (BCN，其中R是烷基、烷氧基、或酰基)，和其衍生物类，例如
特别有用的炔烃类包括
[0067] 包含此类活性基团的连接体-有效负载可用于偶联已用叠氮基官能化的抗体。此类官能化抗体包括用叠氮基-聚乙二醇基团官能化的抗体。在某些实施方案，此类官能化抗体通过在转谷氨酰胺酶的存在下，用带有氨基基团和叠氮基的化合物处理具有至少一个谷氨酰胺残基(例如Gln295、Asn297Gln、和/或Gln55)的抗体，从而衍生得到。
[0068] 在一些实施例，在生物偶联反应中所使用的炔类化合物对于Cu(I)点击化学偶联反应是有用的。在一些实施例，在偶联反应中所使用的炔类化合物在CBT反应中与1,2-氨基硫醇反应。在一些实施例，在逆电子需求狄尔斯-阿尔德(Diels Alder)反应中，所使用的炔烃为BCN、BCN的衍生物、或反式环辛烯(TCO)。例如，参见J.Am.Chem.Soc.；(Article),2012,134(6),2950-2953。
[0069] 在一些实施例，所述活性基团是炔烃，例如 其可通过点击化学与叠氮化物(例如 )反应，以形成点击化学产物，例如
在一些实施例，所述基团与经修饰的抗体或其抗原结合片段上的叠氮化物反应。在一些实施例，所述活性基团是炔烃，例如 其可通过点击化学与叠氮化物(例如
)反应，以形成点击化学产物，例如 在一些实施例，所述活性基
团是炔烃，例如 其可通过点击化学与叠氮化物(例如 )反应，以形成点
击化学产物，例如 在一些实施例，所述活性基团是官能团，例如
其与抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应，与其形成键，例如
其中Ab是指抗体或其抗原结合片段，S是指半胱氨酸残基上的S原子，所述官
能团通过此半胱氨酸残基上的S原子与Ab结合。在一些实施例，所述活性基团是官能团，例如 其与抗体或其抗原结合片段上的赖氨酸残基反应，与其形成键，例如
其中Ab是指抗体或其抗原结合片段，NH是指赖氨酸侧链残基上的NH原子，所述
官能团通过此赖氨酸侧链残基上的NH原子与Ab结合。
在一些实施例，所述基团与经修饰的抗体或其抗原结合片段上的叠氮化物反应。在一些实施例，所述活性基团是炔烃，例如 其可通过点击化学与叠氮化物(例如
)反应，以形成点击化学产物，例如 在一些实施例，所述活性基
团是炔烃，例如 其可通过点击化学与叠氮化物(例如 )反应，以形成点
击化学产物，例如 在一些实施例，所述活性基团是官能团，例如
其与抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应，与其形成键，例如
其中Ab是指抗体或其抗原结合片段，S是指半胱氨酸残基上的S原子，所述官
能团通过此半胱氨酸残基上的S原子与Ab结合。在一些实施例，所述活性基团是官能团，例如 其与抗体或其抗原结合片段上的赖氨酸残基反应，与其形成键，例如
其中Ab是指抗体或其抗原结合片段，NH是指赖氨酸侧链残基上的NH原子，所述
官能团通过此赖氨酸侧链残基上的NH原子与Ab结合。
[0070] 本发明使用的短语“结合剂连接体”、或“BL”是指使结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与本发明所述的有效负载化合物(例如，MMAE，双八氢菲羧酰胺类化合物)、以及任选地与一个或多个侧链化合物连接、结合或键合的任何二价、三价、或多价基团或基团部分。通常，本发明所述的抗体偶联物的合适的结合剂连接体是足以稳定以利用抗体的循环半衰期，并且同时能够在抗原介导的偶联物内化后释放其有效负载的那些。连接体可以是可切割的或不可切割的。可切割的连接体是内化后由细胞内代谢切割的连接体，例如通过水解、还原或酶促反应进行切割。不可切割的连接体是通过内化后抗体的溶酶体降解来释放附接的有效负载的连接体。合适的连接体包括但不限于酸不稳定连接体，水解不稳定连接体，酶促可切割连接体，还原不稳定连接体，自降解(self-immolative)连接体和不可切割连接体。合适的连接体还包括但不限于肽类，葡糖苷酸类，琥珀酰亚胺-硫醚类，聚乙二醇(PEG)单元类，腙类，ε-己酰单元类，二肽单元类，缬氨酸-瓜氨酸单元类，和对氨基苄基(PAB)单元类。在一些实施方案，所述结合剂连接体(BL)包含通过活性连接体(RL)的活性基团(RG)与结合剂(例如，抗体、经修饰的抗体、或其抗原结合片段)的活性部分进行反应形成的基团部分。
[0071] 在一些实施例，所述BL包含以下基团部分： 其中 是与所述结合剂连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分： 其中 是与所述
结合剂连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分： 其中 是与所述结
合剂连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分： 其中 是与所述抗体或
其抗原结合片段的所述半胱氨酸连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分：
其中 是与所述抗体或其抗原结合片段的所述赖氨酸连接的键。
化合物和有效负载
结合剂连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分： 其中 是与所述结
合剂连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分： 其中 是与所述抗体或
其抗原结合片段的所述半胱氨酸连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分：
其中 是与所述抗体或其抗原结合片段的所述赖氨酸连接的键。
化合物和有效负载
[0072] 在一些实施例，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：结合剂，所述结合剂经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体分别直接或间接连接至各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分。
[0073] 在一些其他实施例，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：蛋白质，所述蛋白质经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分，其中所述共价连接体分别直接或间接连接至各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分。
[0074] 如本发明所示，在一些实施例，所述结合剂直接连接至共价连接体，例如赖氨酸氨基酸。这意味着所述结合剂与所述赖氨酸氨基酸共价连接体相距一个键位置。在所述这些实例的一些中，所述共价连接体还直接连接至有效负载基团部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、类固醇、或本发明所述的任何有效负载)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体也还接连接至所述环糊精基团部分。这意味着所述共价连接体与环糊精(例如本发明所述的环糊精)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。
[0075] 在其他实施例，所述结合剂间接连接至共价连接体。这意味着所述结合剂与共价连接体相距一个以上的键位置。这也意味着所述结合剂通过另一基团部分与所述共价连接体连接。例如，所述结合剂可连接至马来酰亚胺基团，所述马来酰亚胺基团连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团连接至所述共价连接体。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至有效负载基团部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、或类固醇、或本发明所述的任何有效负载)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述有效负载连接。例如，所述共价连接体可连接至二肽，例如但不限于Val-Ala或Val-Cit，其可连接至PAB，所述PAB可连接至所述有效负载。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至环糊精基团部分。这意味着所述共价连接体与环糊精(例如本发明所述的环糊精)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述环糊精连接。例如，所述共价连接体可连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团可连接至活性基团，所述活性基团可连接至所述环糊精。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。
[0076] 在一个实施例，本发明所述化合物具有式(I)所示结构：
在式(I)中，BA是结合剂，L是三价连接体，CD是环糊精残基，下标n是从1至30的整数，和PA是有效负载残基。在一些实施例，可存在一个以上的三价连接体L。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
在式(I)中，BA是结合剂，L是三价连接体，CD是环糊精残基，下标n是从1至30的整数，和PA是有效负载残基。在一些实施例，可存在一个以上的三价连接体L。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0077] 在一些实施例，式(I)所示化合物是式(Ia)的化合物：在式(Ia)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，RG是活性连接体残基，SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团，下标n是从1至30的整数；和PA是有效负载。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0078] 在一些实施例，式(I)所示化合物是式(Ib)或(Ic)的化合物：在式(Ib)或(Ic)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团，环A与所述三唑稠合，并且环A选自由环烷基、环烯基、杂环烷基、和杂环烯基组成的组；其中环烷基、环烯基、杂环烷基和杂环烯基均任选地被烷基、OH、或NRaRb取代，其中Ra和Rb各自为烷基或H，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。在一些实施例，环A是任选取代的环烷基。在一些实施例，环A是任选取代的环烯基。在一些实施例，环A是任选取代的环炔基。在一些实施例，环A是任选取代的杂环烷基。在一些实施例，环A是任选取代的杂环炔基。在一些实施例，式(Ib)或(Ic)的化合物包括式(Ib)或(Ic)所示化合物的区域异构体、立体异构体及其混合物。
[0079] 在一些实施例，式(I)所示化合物是式(Ib)的化合物。在所述这些实施例的某些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib1)、(Ib2)、(Ib3)、(Ib4)、(Ib5)、或(Ib6)的化合物。在所述这些实施例的一些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib1)的化合物：在式(Ib1)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ib1)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0080] 在所述这些实施例的一些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib2)的化合物：在式(Ib2)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ib2)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0081] 在所述这些实施例的一些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib3)的化合物：在式(Ib3)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ib3)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0082] 在所述这些实施例的一些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib4)的化合物：在式(Ib4)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ib4)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于三唑键)、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0083] 在所述这些实施例的一些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib5)的化合物：在式(Ib5)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，e是从0至4的整数，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ib5)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0084] 在所述这些实施例的一些中，式(Ib)所示化合物是式(Ib6)的化合物：在式(Ib6)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，e是从0至4的整数，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ib6)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0085] 在一些实施例，式(I)所示化合物是式(Ic)的化合物。在所述这些实施例的一些中，式(Ic)所示化合物是式(Ic1)的化合物：在式(Ic1)中，BA是结合剂，LL是三价连接体，n是从1至30的整数，和PA是有效负载。式(Ic1)的化合物还包括其区域异构体、立体异构体、和混合物。在某些实施方案，n是从1至4的整数。在某些实施方案，n是4。在某些实施方案，n是2。在某些实施方案，n是1。在某些实施方案，n是3。
[0086] 在一些实施例，本发明所述化合物具有式(Id)所示结构：在式(Id)中，BA是结合剂；RG是活性基团残基；SP1和SP2在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基，和其中SP1包含三价连接体；AA1是包含氨基酸残基的
2
三价连接体；AA 是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是 其中所述 表
示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；CD在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为环糊精残基，其中存在至少一个CD；下标n是从1至30的整数；下标m是从
0至5的整数；下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或
5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA1或AA2中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA1是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA1是赖氨酸。在某些实施方案，所述AA1是赖
2
氨酸或赖氨酸的衍生物。在某些实施方案，所述AA是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA1-AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实
1 2 1 2
施方案，所述AA -AA是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA-AA是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA1-AA2是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA1-AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述赖氨酸是L-赖氨酸。在某些实施方案，所述赖氨酸是D-赖氨酸。在一些实施例，SP1在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP2在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
2
三价连接体；AA 是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是 其中所述 表
示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；CD在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为环糊精残基，其中存在至少一个CD；下标n是从1至30的整数；下标m是从
0至5的整数；下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或
5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA1或AA2中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA1是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA1是赖氨酸。在某些实施方案，所述AA1是赖
2
氨酸或赖氨酸的衍生物。在某些实施方案，所述AA是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA1-AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实
1 2 1 2
施方案，所述AA -AA是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA-AA是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA1-AA2是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA1-AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述赖氨酸是L-赖氨酸。在某些实施方案，所述赖氨酸是D-赖氨酸。在一些实施例，SP1在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP2在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
[0087] 在式(Id)的一些情况下，CD是具有以下结构式的经修饰的CD基团：其中RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；SP3在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为选自由以下组成的组的间隔基团：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数；q
1 1
是从0至5的整数，和 表示所述经修饰的CD基团通过其与SP或AA连接的原子。
1 1
是从0至5的整数，和 表示所述经修饰的CD基团通过其与SP或AA连接的原子。
[0088] 在一些实施例，本发明所述化合物具有式(Ie)所示结构：2
在式(Ie)中，BA是结合剂；RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；SP 在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；AA2是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连
接的原子；CD是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或1；
和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或5。在一些实施例，下标m是
0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA1或AA2中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方
2 2
案，所述AA是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施例，SP2在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：
C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
在式(Ie)中，BA是结合剂；RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；SP 在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；AA2是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连
接的原子；CD是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或1；
和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或5。在一些实施例，下标m是
0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA1或AA2中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方
2 2
案，所述AA是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施例，SP2在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：
C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
[0089] 在一些实施例，式(Ie)所示化合物是式(Ie1)的化合物：在式(Ie1)中，BA是结合剂；RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；AA2是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团
连接的原子；CD是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或
1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA2包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方
2 2
案，所述AA 是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。
连接的原子；CD是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或
1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA2包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方
2 2
案，所述AA 是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。
[0090] 在一些实施例，式(Ie)所示化合物是式(Ie2)的化合物：在式(Ie2)中，BA是结合剂；RG是活性连接体残基；SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；AA2是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是
其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；CD
是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA2包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。
其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；CD
是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0、1、2、3、4或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，AA2包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。
[0091] 在一些实施例，本发明所述化合物具有式(If)所示结构：在式(If)中，BA是结合剂；RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；SP1、SP2和SP3在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基；AA2是二肽残基；PEG是聚乙二醇残基；PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相
邻基团连接的原子；CD是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或1，下标q是从0至5的整数；和PA是有效负载基团部分。在式(If)的一些实施例中，SP1不存在，和SP2在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，AA2包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。
邻基团连接的原子；CD是环糊精残基；下标n是从1至30的整数；下标m是从0至5的整数；下标p是0或1，下标q是从0至5的整数；和PA是有效负载基团部分。在式(If)的一些实施例中，SP1不存在，和SP2在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，AA2包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA2是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。
[0092] 在一些实施例，包括前述任一实施例，式(I)所示化合物包含至少一个CD基团。在具体实施例中，式(I)所示化合物是本发明所述的式(Ie)、式(Ie1)或式(Ie2)的化合物，并且包含一个CD基团。在另一具体实施例中，式(I)所示化合物是本发明所述的式(If)的化合物并且包含一个CD基团。
[0093] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地为环糊精。在一些实施例，所述CD是α-环糊精。在一些实施例，所述CD是β-环糊精。在一些实施例，所述CD是γ-环糊精。在任何这些实施例中，所述α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精是任选取代的。
[0094] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自由α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精组成的组。在一些实施例，所述CD是α-环糊精。在一些实施例，所述CD是β-环糊精。在一些实施例，所述CD是γ-环糊精。
[0095] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自：其中所述 表示所述CD通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在某些实施例，
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
[0096] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自：在一些实施例，所述CD是
在一些实施例，所述CD是 在一些实
施例，所述CD是 在一些实施例，所述CD是
在一些实施例，所述CD是 在一些实施例，所述CD是
在一些实施例，所述CD是 在一些实
施例，所述CD是 在一些实施例，所述CD是
在一些实施例，所述CD是 在一些实施例，所述CD是
[0097] 在一些实施例，包括前述任一实施例，RG在每种情况下，分别独立地为点击化学残基。在一些实施例，包括前述任一实施例，RG在每种情况下，分别独立地包含三唑或稠合三唑。
[0098] 在一些实施例，包括前述任一实施例，RG在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：其中所述 表示所述RG通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子。在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所
述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例
的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一
些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，
RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情
况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在
每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情
况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分
别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立
地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施
例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，
RG在每种情况下，分别独立地为
的原子。在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所
述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例
的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一
些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，
RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情
况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在
每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情
况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分
别独立地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立
地为 在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施
例的一些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的一些中，
RG在每种情况下，分别独立地为
[0099] 在一些实施例，包括前述任一实施例，式(I)所示化合物包含基团其选自由以下组成的组：
其中 表示与结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)连接的键，和其中R9是–CH3、或–
(CH2)3N(H)C(O)NH2。 表示与环糊精连接的键。 表示与有效负载连接的键。在某些实施例，R9是–CH3。在某些实施例，R9是–(CH2)3N(H)C(O)NH2。在所述这些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段可直接或间接连接至与 连接的基团。在一些实施例，其中所述抗体或其抗原结合片段间接连接至与 连接的基团。在一些实施例，其中所述抗体或其抗原结合片段间接连接至与 连接的基团，其中 是 其中下标x是从1至4的
整数。在一些实施例，下标x是1。在一些实施例，下标x是2。在一些实施例，下标x是3。在一些实施例，下标x是4。在本发明中，Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所示PEG基团，即 与所述Ab上的谷氨酰胺连接。在本段落中描述的一些实施例中，以及在本发
明其他实施方案中描述的一些实施例中，所述连接体中的赖氨酸侧链来自L-赖氨酸或D-赖氨酸。在本段落中描述的一些实施例中，以及在本发明其他实施方案中描述的一些实施例中，所述连接体中的赖氨酸侧链的立体化学是(R)构型。在本段落中描述的一些实施例中，以及在本发明其他实施方案中描述的一些实施例中，所述连接体中的赖氨酸侧链的立体化学是(S)构型。
其中 表示与结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)连接的键，和其中R9是–CH3、或–
(CH2)3N(H)C(O)NH2。 表示与环糊精连接的键。 表示与有效负载连接的键。在某些实施例，R9是–CH3。在某些实施例，R9是–(CH2)3N(H)C(O)NH2。在所述这些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段可直接或间接连接至与 连接的基团。在一些实施例，其中所述抗体或其抗原结合片段间接连接至与 连接的基团。在一些实施例，其中所述抗体或其抗原结合片段间接连接至与 连接的基团，其中 是 其中下标x是从1至4的
整数。在一些实施例，下标x是1。在一些实施例，下标x是2。在一些实施例，下标x是3。在一些实施例，下标x是4。在本发明中，Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所示PEG基团，即 与所述Ab上的谷氨酰胺连接。在本段落中描述的一些实施例中，以及在本发
明其他实施方案中描述的一些实施例中，所述连接体中的赖氨酸侧链来自L-赖氨酸或D-赖氨酸。在本段落中描述的一些实施例中，以及在本发明其他实施方案中描述的一些实施例中，所述连接体中的赖氨酸侧链的立体化学是(R)构型。在本段落中描述的一些实施例中，以及在本发明其他实施方案中描述的一些实施例中，所述连接体中的赖氨酸侧链的立体化学是(S)构型。
[0100] 在一些实施例，包含前述任一实施例，式(I)所示化合物包含基团其选自由以下组成的组：
[0101] 在所述这些实施例中还包括其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体形式，其区域异构体或区域异构体的混合物，其中各 分别是与所述结合剂连接的键；各 分别是与所述有效负载连接的键；和R9是–CH3、或–(CH2)3N(H)C(O)NH2。在某些实施例，R9是–CH3。在某些实施例，R9是–(CH2)3N(H)C(O)NH2。在一些实施例，包括前述任一实施例，是 在一些实施例，包括
前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一 些实 施例 ，包括 前述 任一实 施例 ，
是 在一些
实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施
例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实
施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是 在
一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一 些实 施例 ，包括 前述 任一实 施例 ，
是 在一些
实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施
例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实
施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是 在
一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
在一些实施例，包括前述任一实施例， 是
在一些实施例，包括前述任一实施例，
是
[0102] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地为环糊精。在一些实施例，所述CD是α-环糊精。在一些实施例，所述CD是β-环糊精。在一些实施例，所述CD是γ-环糊精。在任一所述这些实施例中，所述α-环糊精、β-环糊精、或γ-环糊精是任选取代的。
[0103] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自由α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精组成的组。在一些实施例，CD是α-环糊精。在一些实施例，CD是β-环糊精。在一些实施例，CD是γ-环糊精。
[0104] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自：其中所述 表示所述CD通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在某些实施例，
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
[0105] 在一些实施例，包括前述任一实施例，式(I)所示化合物包含选自以下的基团：在所述这些实施例中还包含其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式，其区域异构体或区域异构体的混合物，其中各 分别是与所述结合剂连接的键；和各 分别
是与所述有效负载连接的键。
是与所述有效负载连接的键。
[0106] 在一些实施例，包括前述任一实施例，-LL-具有式(LL1)所示结构：在式(LL1)中，RAA1、RAA2和RAA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与-SP-RG-SP-CD连接。在一些实施例，可以不存在SP。在一些实施例，存在SP。在一些实施例，在式(LL1)中，RAA1、RAA2和RAA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与-RG-CD连接。在一些实施例，RAA1是赖氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，RAA1是L-赖氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，RAA1是D-赖氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，RAA2是缬氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，RAA3是丙氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，RAA3是瓜氨酸氨基酸侧链。在某些实施例，RAA1是直接或间接与CD连接的赖氨酸氨基酸侧链，以及RAA2和RAA3分别独立地为缬氨酸和丙氨酸氨基酸侧链。在某些实施例，RAA1是直接或间接与CD连接的赖氨酸氨基酸侧链，以及RAA2和RAA3分别独立地为缬氨酸和瓜氨酸氨基酸侧链。
[0107] 在一些实施例，LL包含 在一些实施例，LL包含
[0108] 在一些实施例，LL包含 在一些实施例，LL包含
[0109] 在一些实施例，SP、SP1、SP2、或其组合是间隔基团。在一些实施例，SP在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP1在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP2在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
[0110] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q或e是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是1。
[0111] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q或e是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是2。
[0112] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q或e是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是3。
[0113] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q或e是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是4。
[0114] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标p是1。
[0115] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是2-4。
[0116] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是2。
[0117] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是3。
[0118] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是4。
[0119] 在一些实施例，包括前述任一实施例，结合剂(BA)选自任何多肽。多肽的实例包括但不限于，天然多肽类和非天然多肽类。多肽的实例包括但不限于，由经遗传修饰的生物体产生的那些。
[0120] 本发明的多肽包括但不限于，受体类、蛋白质类、酶类、结合剂类、乳肽类、核糖体肽类、非核糖体肽类、蛋白胨类、和肽片段类。本发明的多肽包括但不限于，抗菌肽类、速激肽类、血管活性肠肽类、胰多肽相关肽类、阿片肽类、和降钙素肽类。本发明中包括的其他肽类包括但不限于B型利钠肽(BNP)、乳三肽类、神经肽类、脂肽类、蛋白酶类、或激素类。
[0121] 多肽进一步包括但不限于，包含连接在一起的两个或两个以上氨基酸的短氨基酸链。多肽包括但不限于，分别具有连接在一起的2、3或4个氨基酸的二肽类(Val-Cit)、三肽类、和四肽类(例如Val-Gly-Ser-Ala)。多肽包括含5个或更多个氨基酸的较长链。多肽包括含50个或更多个氨基酸(例如蛋白质类)的长链。在一些实施例，本发明的多肽选自二肽类、三肽类、四肽类、五肽类、六肽类、七肽类、八肽类、九肽类、十肽类、十一肽类、和二十肽类。
[0122] 多肽包括蛋白质类。在一些实施例，所述蛋白质仅包括天然氨基酸类。在一些实施例，所述蛋白质还包括非天然氨基酸类。
[0123] 在一些实施例，包括前述任一实施例，所述结合剂(BA)是抗体或其抗原结合片段。在某些实施例，所述结合剂是抗体或其抗原结合片段，其对选自由以下组成的组的抗原具有选择性：AXL，BAFFR，BCMA，BCR–列表组分(BCR–list components)，BDCA2，BDCA4，BTLA，BTNL2，BTNL3，BTNL8，BTNL9，C10orf54，CCR1，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CD11c，CD137，CD138，CD14，CD168，CD177，CD19，CD20，CD209，CD209L，CD22，CD226，CD248，CD25，CD27，CD274，CD276，CD28，CD30，CD300A，CD33，CD37，CD38，CD4，CD40，CD44，CD45，CD46，CD48，CD5，CD52，CD55，CD56，CD59，CD62E，CD68，CD69，CD70，CD74，CD79a，CD79b，CD8，CD80，CD86，CD90.2，CD96，CLEC12A，CLEC12B，CLEC7A，CLEC9A，CR1，CR3，CRTAM，CSF1R，CTLA4，CXCR1/2，CXCR4，CXCR5，DDR1，DDR2，DEC-205，DLL4，DR6，FAP，FCamR，FCMR，FcR's，Fire，GITR，HHLA2，HLA II类，HVEM，ICOSLG，IFNLR1，IL10R1，IL10R2，IL12R，IL13RA1，IL13RA2，IL15R，IL17RA，IL17RB，IL17RC，IL17RE，IL20R1，IL20R2，IL21R，IL22R1，IL22RA，IL23R，IL27R，IL29R，IL2Rg，IL31R，IL36R，IL3RA，IL4R，IL6R，IL5R，IL7R，IL9R，整合素(Integrins)，LAG3，LIFR，MAG/Siglec-4(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-4)，MMR，MSR1，NCR3LG1，NKG2D，NKp30，NKp46，PDCD1，PROKR1，PVR，PVRIG，PVRL2，PVRL3，RELT，SIGIRR，Siglec-1(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-1)，Siglec-10，Siglec-5，Siglec-
6，Siglec-7，Siglec-8，Siglec-9，SIRPA，SLAMF7，TACI，TCR–列表组分/assoc(TCR-listcomponents/assoc)，PTCRA，TCRb，CD3z，CD3，TEK，TGFBR1，TGFBR2，TGFBR3，TIGIT，TLR2，TLR4，TROY，TSLPR，TYRO，VLDLR，VSIG4，和VTCN1。
6，Siglec-7，Siglec-8，Siglec-9，SIRPA，SLAMF7，TACI，TCR–列表组分/assoc(TCR-listcomponents/assoc)，PTCRA，TCRb，CD3z，CD3，TEK，TGFBR1，TGFBR2，TGFBR3，TIGIT，TLR2，TLR4，TROY，TSLPR，TYRO，VLDLR，VSIG4，和VTCN1。
[0124] 在一些实施例，包括前述任一实施例，PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷(taxane)，长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)，类固醇(steroid)，和LXR调节剂。在一些情况下，PA是海兔毒素(dolastatin)。
在一些情况下，PA是奥瑞他汀(auristatin)。在一些情况下，PA是美登素类化合物
(maytansinoid)。在一些情况下，PA是植物生物碱类化合物(plant alkaloid)。在一些情况下，PA是紫杉烷(taxane)。在一些情况下，PA是长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)。
在一些情况下，PA是类固醇(steroid)。在一些情况下，PA是LXR调节剂。在一些情况下，LXR调节剂是LXR激动剂。在一些实施方案，LXR调节剂是LXR拮抗剂。其他合适的有效负载包括高度疏水的那些，例如由于其疏水性质而不适合于Ab偶联条件的那些，例如有效负载，如吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、SN38(7-乙基-10-羟基-羟基喜树碱)等。在某些实施方案，本发明提供了抗体-药物偶联物，其中PA是疏水的有效负载基团部分。
在一些情况下，PA是奥瑞他汀(auristatin)。在一些情况下，PA是美登素类化合物
(maytansinoid)。在一些情况下，PA是植物生物碱类化合物(plant alkaloid)。在一些情况下，PA是紫杉烷(taxane)。在一些情况下，PA是长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)。
在一些情况下，PA是类固醇(steroid)。在一些情况下，PA是LXR调节剂。在一些情况下，LXR调节剂是LXR激动剂。在一些实施方案，LXR调节剂是LXR拮抗剂。其他合适的有效负载包括高度疏水的那些，例如由于其疏水性质而不适合于Ab偶联条件的那些，例如有效负载，如吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、SN38(7-乙基-10-羟基-羟基喜树碱)等。在某些实施方案，本发明提供了抗体-药物偶联物，其中PA是疏水的有效负载基团部分。
[0125] 在一些实施例，PA是图1中任一个所示的任何化合物。
[0126] 在某些实施方案，PA是奥瑞他汀(auristatin)。在某些实施方案，PA是奥瑞他汀E(auristatin E)、奥瑞他汀F(auristatinF)、一甲基奥瑞他汀-D(MMAD)、一甲基奥瑞他汀-E(MMAE)、或一甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
[0127] 在某些实施方案，PA是美登素类化合物(maytansinoid)。所述美登素类化合物可以是技术人员认为合适的任何美登素类化合物有效负载。美登素类化合物有效负载公开在于2016年3月25日提交的、发明名称为“MAYTANSINOID DERIVATIVES,CONJUGATES THEREOF,AND METHODS OF USE”的美国非临时申请号15/081,759，其公开为美国专利申请公开号2016/0375147中，以及公开在于2017年1月24日提交的、发明名称为“MAYTANSINOID
DERIVATIVES,CONJUGATES THEREOF,AND METHODS OF USE”的美国非临时申请号15/414,
537，其公告为美国专利号9,950,076中，所述专利申请均通过引用并入本发明。在某些实施方案，PA是DM1、DM3、或DM4。在某些实施方案，PA是 在某些
实施方案，PA是 其中A任选地被亚芳基或亚杂芳基取代。
在某些实施方案，PA是 在特定实施方案，波浪线表示与LL连
接的键。
DERIVATIVES,CONJUGATES THEREOF,AND METHODS OF USE”的美国非临时申请号15/414,
537，其公告为美国专利号9,950,076中，所述专利申请均通过引用并入本发明。在某些实施方案，PA是DM1、DM3、或DM4。在某些实施方案，PA是 在某些
实施方案，PA是 其中A任选地被亚芳基或亚杂芳基取代。
在某些实施方案，PA是 在特定实施方案，波浪线表示与LL连
接的键。
[0128] 在某些实施方案，式(I)所示化合物中的有效负载是具有式(A)所示结构的糖皮质激素类化合物：或其药学上可接受的立体异构体、或衍生物，
其中：
R1和R2分别独立地为–H、烷基、烷基-C(O)-O–、–OH、或卤素；或R1和
R2一起形成
4
其中R是烷基、芳基、芳基烷基、或含N的杂环烷基，
其中所述烷基、芳基、芳基烷基和含N的杂环烷基在每种情况下，分别独立任选地被-
NRAaRAb取代；
R3是–OH、RZ-C(O)-X–、杂烷基、哌啶基、–NRAaRAb、-氧基芳基–NRAaRAb、或-Z-A'(RP)t；
5
R在每种情况下，分别独立地为–OH、卤素、烷基、或芳基烷基；
RZ是烷基；
X是O或NRAa；
Z是S、S(O)、S(O)2、SO2NRAa、O、C(O)NRAa、C(O)、或NRAa；
A'是芳基、芳基烷基、或杂芳基；
RP在每种情况下，分别独立地为卤素、任选取代的烷基、–OH、或-NRAaRAb；
RAa和RAb在每种情况下，分别独立地为–H、任选取代的烷基、或任选取代的芳基；
下标a是从0至19的整数；和
t是从1至3的整数；
条件是：
(1)(a)当R1是–OH时，或(b)当R1和R2一起形成 其中R4是C1-9烷基或
时，R3不为–OH，和
(2)R3不为
其中：
R1和R2分别独立地为–H、烷基、烷基-C(O)-O–、–OH、或卤素；或R1和
R2一起形成
4
其中R是烷基、芳基、芳基烷基、或含N的杂环烷基，
其中所述烷基、芳基、芳基烷基和含N的杂环烷基在每种情况下，分别独立任选地被-
NRAaRAb取代；
R3是–OH、RZ-C(O)-X–、杂烷基、哌啶基、–NRAaRAb、-氧基芳基–NRAaRAb、或-Z-A'(RP)t；
5
R在每种情况下，分别独立地为–OH、卤素、烷基、或芳基烷基；
RZ是烷基；
X是O或NRAa；
Z是S、S(O)、S(O)2、SO2NRAa、O、C(O)NRAa、C(O)、或NRAa；
A'是芳基、芳基烷基、或杂芳基；
RP在每种情况下，分别独立地为卤素、任选取代的烷基、–OH、或-NRAaRAb；
RAa和RAb在每种情况下，分别独立地为–H、任选取代的烷基、或任选取代的芳基；
下标a是从0至19的整数；和
t是从1至3的整数；
条件是：
(1)(a)当R1是–OH时，或(b)当R1和R2一起形成 其中R4是C1-9烷基或
时，R3不为–OH，和
(2)R3不为
[0129] 在一些实施方案，R3是NH2。在此类实施方案的一些中，R3是 其中表示R3通过其与式(I)中相邻基团连接的原子。
[0130] 在某些实施方案，PA是类固醇(steroid)。在某些实施方案，PA选自或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在根据任一式1110-1140的某些实施方案中，R3是-O-芳基、-NRAaRAb、-亚烷基-NRAaRAb、-X-亚芳基-Y-NRAaRAb、-X-亚杂芳基-Y-NRAaRAb、或含N的杂环烷基；其中X不存在，或X是-N-、-CH2-、或-O-；其中Y不存在，或Y是-
4 3 Aa Ab
CH2-；和R是烷基、芳基、烷基芳基、或芳基烷基。在某些实施方案，R是-O-亚芳基-NR R 、-O-亚杂芳基-NRAaRAb；其中芳基或杂芳基任选地被卤素、氘、羟基、或甲氧基取代。在某些实施方案，R3是-O-苯基-NRAaRAb、-O-亚杂芳基-NRAaRAb；其中苯基或杂芳基任选地被卤素或氘取代。在某些实施方案，R4是正丙基。在某些实施方案，RAa和RAb各自独立地为氢或烷基。在特Aa Ab
定实施方案，R 和R 中的任一个任选地被与LL连接的键取代。
在某些实施方案，PA是
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA是
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA
是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA
是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA
是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，
PA是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在此类实施方案
中，波浪线表示与LL连接的键。
4 3 Aa Ab
CH2-；和R是烷基、芳基、烷基芳基、或芳基烷基。在某些实施方案，R是-O-亚芳基-NR R 、-O-亚杂芳基-NRAaRAb；其中芳基或杂芳基任选地被卤素、氘、羟基、或甲氧基取代。在某些实施方案，R3是-O-苯基-NRAaRAb、-O-亚杂芳基-NRAaRAb；其中苯基或杂芳基任选地被卤素或氘取代。在某些实施方案，R4是正丙基。在某些实施方案，RAa和RAb各自独立地为氢或烷基。在特Aa Ab
定实施方案，R 和R 中的任一个任选地被与LL连接的键取代。
在某些实施方案，PA是
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA是
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA
是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA
是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA
是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，
PA是 或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在此类实施方案
中，波浪线表示与LL连接的键。
[0131] 本发明还提供了具有以下结构的式(A)的有效负载：或其药学上可接受的立体异构体。在某些实施方案，所述偶联物包含通过连接至所述
有效负载的伯胺或仲胺的残基的键与连接体连接的上述有效负载。类固醇有效负载公开在于2017年11月7日提交的、发明名称为“STEROIDS AND PROTEIN-CONJUGATES THEREOF”的美国非临时申请号15/806,197中，其通过引用并入本发明。
有效负载的伯胺或仲胺的残基的键与连接体连接的上述有效负载。类固醇有效负载公开在于2017年11月7日提交的、发明名称为“STEROIDS AND PROTEIN-CONJUGATES THEREOF”的美国非临时申请号15/806,197中，其通过引用并入本发明。
[0132] 在某些实施方案，PA是肝X受体(LXR)调节剂。在某些实施方案，PA具有式B所示结构：或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式，其中，
W是–CH2–、–N(H)–、或–O–；
RB1是–H、–OH、–NH2、烷基、或–OP(O)(OR6)2；
RB2是–H、–OH、–CH2NH2、RB3、RB4、RB5、或–O–RB5，其中RB1和RB2不同时为–H；
RB3是–N(R6)2；
RB4是–X–Y–Z；
X是选自由–O–和–N(H)–组成的组；
Y是选自由亚烷基、取代的亚烷基(包括但不限于氧代取代(即＝O))、亚杂烷基、和取代的亚杂烷基(包括但不限于氧代取代(即＝O))组成的组；
Z是选自由–OH和–NH2组成的组；
RB5是烷基、杂环烷基、或取代的杂环烷基，其中各杂环烷基或取代的杂环烷基包含选自N和O的1、2或3个杂原子，并包括至少一个–OH和–CH2OH取代基、或至少一个伯氮或仲氮，例如O-葡萄糖；
各R6，在每种情况下，分别独立地为–H、氨基酸残基、N-烷基氨基酸残基、肽、或烷基；和各R7分别独立地为卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–CN、O-葡萄糖、O-氨基酸残基、和O-PEGn，其中各下标n分别为从0至3的整数。在特定实施方案，RB1或RB2被与LL连接的键取代。在某些实施方案，PA选自：
在特定实施方案，波浪线表示与LL连接的键。
W是–CH2–、–N(H)–、或–O–；
RB1是–H、–OH、–NH2、烷基、或–OP(O)(OR6)2；
RB2是–H、–OH、–CH2NH2、RB3、RB4、RB5、或–O–RB5，其中RB1和RB2不同时为–H；
RB3是–N(R6)2；
RB4是–X–Y–Z；
X是选自由–O–和–N(H)–组成的组；
Y是选自由亚烷基、取代的亚烷基(包括但不限于氧代取代(即＝O))、亚杂烷基、和取代的亚杂烷基(包括但不限于氧代取代(即＝O))组成的组；
Z是选自由–OH和–NH2组成的组；
RB5是烷基、杂环烷基、或取代的杂环烷基，其中各杂环烷基或取代的杂环烷基包含选自N和O的1、2或3个杂原子，并包括至少一个–OH和–CH2OH取代基、或至少一个伯氮或仲氮，例如O-葡萄糖；
各R6，在每种情况下，分别独立地为–H、氨基酸残基、N-烷基氨基酸残基、肽、或烷基；和各R7分别独立地为卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–CN、O-葡萄糖、O-氨基酸残基、和O-PEGn，其中各下标n分别为从0至3的整数。在特定实施方案，RB1或RB2被与LL连接的键取代。在某些实施方案，PA选自：
在特定实施方案，波浪线表示与LL连接的键。
[0133] 在某些实施方案，式(B)所示有效负载是选自由以下组成的组：或其药学上可接受的立体异构体形式。在某些实施方案，所述偶联物包含通过连接至
所述有效负载的伯胺或仲胺的残基的键与连接体连接的上述有效负载。LXR调节剂有效负载公开在于2017年5月18日提交的、发明名称为“BIS-OCTAHYDROPHENANTHRENE
CARBOXAMIDES AND PROTEIN CONJUGATES THEREOF”的美国临时申请号62/508,327中，其通过引用并入本发明。
所述有效负载的伯胺或仲胺的残基的键与连接体连接的上述有效负载。LXR调节剂有效负载公开在于2017年5月18日提交的、发明名称为“BIS-OCTAHYDROPHENANTHRENE
CARBOXAMIDES AND PROTEIN CONJUGATES THEREOF”的美国临时申请号62/508,327中，其通过引用并入本发明。
[0134] 在本发明所示的实施方案的范围内还考虑了在于2015年9月4日提交的、发明名称为“BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES,CONJUGATES THEREOF,AND THERAPEUTIC USES”的美国非临时申请14/776,668，其公开为美国专利申请公开号2016/0030591，以及在于2016年2月23日提交的、发明名称为“PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING MACROLIDE DIASTEREOMERS,METHODS OF THEIR SYNTHESIS AND THERAPEUTIC USES”，其公开为美国专利申请公开号2016/0354482中公开的有效负载，上述披露的有效负载通过引用并入本发明。
[0135] 在一些实施例，式(I)所示化合物选自：或其区域异构体、立体异构体形式、药学上可接受的盐、溶剂化物、或其混合物，其中Ab是抗体或其抗原结合片段。在所述这些实施例中，Ab可以直接或间接连接至所述连接体-有效负载。在一些实施例，当Ab间接连接至所述连接体-有效负载，则 是
其中下标x是从1至4的整数。在一些实施例，下标x是1。在一些实施
例，下标x是2。在一些实施例，下标x是3。在一些实施例，下标x是4。在本发明中，Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所示PEG基团，即 连接至所述Ab上的谷氨酰胺。
在某些实施方案，n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数，例如n是1、2、3、或4。
其中下标x是从1至4的整数。在一些实施例，下标x是1。在一些实施
例，下标x是2。在一些实施例，下标x是3。在一些实施例，下标x是4。在本发明中，Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所示PEG基团，即 连接至所述Ab上的谷氨酰胺。
在某些实施方案，n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数，例如n是1、2、3、或4。
[0136] 在一些实施例，式(I)所示化合物选自：或其区域异构体、立体异构体形式、药学上可接受的盐、溶剂化物、或其混合物，其中Ab是抗体或其抗原结合片段。在所述这些实施例中，Ab可以直接或间接连接至所述连接体-有效负载。在一些实施例，当Ab间接连接至所述连接体-有效负载，则 是
其中下标x是从1至4的整数。在一些实施例，下标x是1。在一些实施
例，下标x是2。在一些实施例，下标x是3。在一些实施例，下标x是4。在本发明中，Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所示PEG基团，即 连接至所述Ab上的谷氨酰胺。
在某些实施方案，n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数，例如n是1、2、3、或4。
其中下标x是从1至4的整数。在一些实施例，下标x是1。在一些实施
例，下标x是2。在一些实施例，下标x是3。在一些实施例，下标x是4。在本发明中，Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所示PEG基团，即 连接至所述Ab上的谷氨酰胺。
在某些实施方案，n是从1至30的整数，例如，n是从1至4的整数，例如n是1、2、3、或4。
[0137] 在一些实施例，式(I)所示化合物选自：或其区域异构体、或立体异构体形式、其药学上可接受的盐、或其溶剂化物，其中Ab是抗体或其抗原结合片段。
[0138] 在一些实施例，本发明提供了药物组合物，其包含本发明所述的化合物，包括前述化合物中的任一种，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
[0139] 本领域技术人员将认识到，氨基酸残基可以是非手性或手性的，例如，L-氨基酸或D-氨基酸。氨基酸通常包括氨基酸侧链。所述侧链可以是技术人员已知的任何氨基酸的侧链。在某些实施方案，所述侧链是组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、高甘氨酸(例如β-高甘氨酸)、或酪氨酸的侧链。本领域技术人员将认识到，所述肽可以是非手性或手性的，例如，包括外消旋的DL-氨基酸、或非外消旋的D-或L-氨基酸、及其非对映异构体混合物。所述肽的侧链如上述氨基酸的上下文中所述。本领域技术人员将认识到，N-烷基氨基酸残基在氨基酸的末端氨基基团或肽的末端氨基基团处包含如本发明所定义的烷基取代基。
[0140] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是从0至30的整数。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是0。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是5。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是6。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是7。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是8。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是9。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是10。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是11。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是12。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是13。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是14。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是15。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是16。
在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是17。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是18。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是19。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是20。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是21。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是22。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是23。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是24。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是25。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是26。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是27。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是28。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是29。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是30。
结合剂
在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是17。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是18。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是19。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是20。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是21。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是22。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是23。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是24。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是25。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是26。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是27。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是28。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是29。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是30。
结合剂
[0141] 用于本发明提供的任何偶联物的合适的结合剂包括但不限于抗体类、淋巴因子类、激素类、生长因子类、病毒受体类、白介素类、或任何其他细胞结合分子类或物质类或肽结合分子类或物质类。
[0142] 在一些实施例，包括前述任一实施例，所述结合剂(BA)选自任何多肽。多肽的实例包括但不限于，天然多肽类和非天然多肽类。多肽的实例包括但不限于，由经遗传修饰的生物体产生的那些。
[0143] 在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自受体类、细胞因子类、蛋白质类、酶类、结合剂类、乳肽类、核糖体肽类、非核糖体肽类、蛋白胨类、和肽片段类。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自抗菌肽类、速激肽类、血管活性肠肽类、胰多肽相关肽类、阿片肽类、和降钙素肽类。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自B型利钠肽(BNP)、乳三肽类、神经肽类、脂肽类、蛋白酶类、或激素类。
[0144] 在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA进一步选自包含连接在一起的两个或两个以上氨基酸的短氨基酸链。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自分别具有连接在一起的2、3或4个氨基酸的二肽类(Val-Cit)、三肽类、和四肽类(例如Val-Gly-Ser-Ala)。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自二肽类、三肽类、四肽类、五肽类、六肽类、七肽类、八肽类、九肽类、十肽类、十一肽类、和二十肽类。
[0145] 在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自任何蛋白质类。在一些实施例，所述蛋白质仅包括天然氨基酸类。在一些实施例，所述蛋白质还包括非天然氨基酸类。在一些实施方案，所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。所述抗体可以是本领域技术人员已知的任何形式。本发明使用的术语“抗体”是指包含至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物，所述互补决定区(CDR)与特定抗原特异性结合或相互作用。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含四条多肽链，通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链，以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本发明缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本发明中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。所述VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在本发明的不同实施方案中，适用于本发明化合物的所述抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然、或人工修饰的。可基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。本发明使用的术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。本发明使用的术语抗体的“抗原结合部分”，抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、可酶促得到的、合成的、或基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术，例如涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和任选恒定结构域的DNA的蛋白水解消化或重组基因工程技术，由完整抗体分子衍生得到。此种DNA是已知的和/或容易从例如商业来源，DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)得到，或可以合成得到。可对DNA进行测序和化学操作或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基(例如，分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽组成的最小识别单元。其他工程化分子，如结构域特异性抗体类，单结构域抗体类，结构域缺失抗体类，嵌合抗体类，CDR嫁接抗体类，双抗体类，三抗体类，四抗体类，微抗体类，纳米抗体类(例如一价纳米抗体类，二价纳米抗体类等)，小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也包含在本发明所使用的表达“抗原结合片段”内。抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包含至少一个CDR，所述至少一个CDR与一个或多个框架序列相邻或在框内。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，所述VH和VL结构域可以任何合适的排列相对于彼此进行定位。譬如，所述可变区可以是二聚的并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，所述抗体的抗原结合片段可包含单体VH或VL结构域。在某些实施方案，抗体的抗原结合片段可包含至少一个可变结构域，所述可变结构域与至少一个恒定结构域共价连接。可在本发明公开的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上文列出的任何示例性构型，所述可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或连接体区域进行连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。
与完整的抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性的)。
抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或结合同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本发明公开的示例性双特异性抗体形式，可使用本领域可用的常规技术，适用于本发明抗体的抗原结合片段。在本发明所述的某些实施方案中，本发明所述抗体是人抗体。本发明使用的术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。
本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本发明使用的术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。术语“人抗体”不包括在天然存在的、未经修饰的生物体中通常不经修饰或人为干预/操作而存在的天然存在的分子。在一些实施方案，本发明所述抗体可以是重组人抗体。本发明使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)；从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)；从动物(例如小鼠)分离的抗体，所述动物是人免疫球蛋白基因的转基因动物(参见例如，Taylor etal.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案，对此种重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列并与之相关的序列，其在体内可不天然存在于人抗体种系库中。人抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。
在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，所述二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成。即使在亲和纯化后，这些形式也极难分离。在各种完整IgG同种型中出现第二种形式的频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸置换可以显著地将第二种形式(Angal etal.(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现降低至通常使用人IgG1铰链观察到的水平。本发明公开内容包括在铰链、CH2或CH3区域中具有一个或多个突变的抗体，所述突变可能是例如在生成中所需的，以提高所需抗体形式的产量。本发明所述抗体可以是分离的抗体。本发明使用的“分离的抗体”是指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，为了本发明的目的，已从生物体的至少一种组分或从其中天然存在或天然产生的抗体的组织或细胞中分离或除去的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。与衍生抗体的相应种系序列相比，本发明使用的抗体可在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本发明公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其衍生自本发明公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个人种系序列的相应残基，或突变为相应种系残基的保守氨基酸置换(此类序列变化在本发明中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本发明公开的重链和轻链可变区序列开始，可以生成许多抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个个体种系突变或其组合。在某些实施方案，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在衍生抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案，仅有某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变残基。在其他实施方案，将一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，种系序列不同于最初衍生抗体的种系序列)的相应残基。此外，本发明所述抗体可包含框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的相应残基，而某些与原始种系序列不同的其他残基保持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦得到，可容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，例如改善的结合特异性，增加的结合亲和力，改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)，降低的免疫原性等。以这种一般方式得到的抗体和抗原结合片段均包括在本发明中。可用于本发明化合物的抗体还包括抗体，其包含具有一个或多个保守置换的本发明公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可结合抗原上的不同区域并且可具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位是由线性多肽链不同区段在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻氨基酸残基产生。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基类或磺酰基类基团部分。
与完整的抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性的)。
抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或结合同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本发明公开的示例性双特异性抗体形式，可使用本领域可用的常规技术，适用于本发明抗体的抗原结合片段。在本发明所述的某些实施方案中，本发明所述抗体是人抗体。本发明使用的术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。
本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本发明使用的术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。术语“人抗体”不包括在天然存在的、未经修饰的生物体中通常不经修饰或人为干预/操作而存在的天然存在的分子。在一些实施方案，本发明所述抗体可以是重组人抗体。本发明使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)；从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)；从动物(例如小鼠)分离的抗体，所述动物是人免疫球蛋白基因的转基因动物(参见例如，Taylor etal.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案，对此种重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列并与之相关的序列，其在体内可不天然存在于人抗体种系库中。人抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。
在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，所述二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成。即使在亲和纯化后，这些形式也极难分离。在各种完整IgG同种型中出现第二种形式的频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸置换可以显著地将第二种形式(Angal etal.(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现降低至通常使用人IgG1铰链观察到的水平。本发明公开内容包括在铰链、CH2或CH3区域中具有一个或多个突变的抗体，所述突变可能是例如在生成中所需的，以提高所需抗体形式的产量。本发明所述抗体可以是分离的抗体。本发明使用的“分离的抗体”是指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，为了本发明的目的，已从生物体的至少一种组分或从其中天然存在或天然产生的抗体的组织或细胞中分离或除去的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。与衍生抗体的相应种系序列相比，本发明使用的抗体可在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本发明公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其衍生自本发明公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个人种系序列的相应残基，或突变为相应种系残基的保守氨基酸置换(此类序列变化在本发明中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本发明公开的重链和轻链可变区序列开始，可以生成许多抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个个体种系突变或其组合。在某些实施方案，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在衍生抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案，仅有某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变残基。在其他实施方案，将一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，种系序列不同于最初衍生抗体的种系序列)的相应残基。此外，本发明所述抗体可包含框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的相应残基，而某些与原始种系序列不同的其他残基保持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦得到，可容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，例如改善的结合特异性，增加的结合亲和力，改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)，降低的免疫原性等。以这种一般方式得到的抗体和抗原结合片段均包括在本发明中。可用于本发明化合物的抗体还包括抗体，其包含具有一个或多个保守置换的本发明公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可结合抗原上的不同区域并且可具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位是由线性多肽链不同区段在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻氨基酸残基产生。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基类或磺酰基类基团部分。
[0146] 在某些实施方案，所述抗体包含轻链。在某些实施方案，所述轻链是κ轻链。在某些实施方案，所述轻链是λ轻链。在某些实施方案，所述抗体包含重链。在某些方面，所述重链是IgA。在某些方面，所述重链是IgD。在某些方面，所述重链是IgE。在一些方面，所述重链是IgG。在一些方面，所述重链是IgM。在一些方面，所述重链是IgG1。在一些方面，所述重链是IgG2。在一些方面，所述重链是IgG3。在一些方面，所述重链是IgG4。在一些方面，所述重链是IgA1。在一些方面，所述重链是IgA2。
[0147] 在一些实施方案，所述抗体是抗体片段。在一些方面，所述抗体片段是Fv片段。在一些方面，所述抗体片段是Fab片段。在一些方面，所述抗体片段是F(ab')2片段。在一些方面，所述抗体片段是Fab'片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv-Fc片段。
[0148] 在一些实施方案，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案，所述抗体是多克隆抗体。
[0149] 在一些实施方案，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案，所述抗体是人抗体。
[0150] 所述抗体可对认为适合本领域技术人员的任何抗原具有结合特异性。在某些实施方案，所述抗原是跨膜分子(例如受体)或生长因子。示例性抗原包括但不限于诸如以下分子：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白类；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子类，例如vmc因子，IX因子，组织因子(TF)和vonWillebrands因子；抗凝血因子类，例如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(调节正常T细胞表达和分泌的激活)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-I-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；抑制穆勒(Muellerian)物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶(DNase)；19E；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素类或生长因子类的受体；蛋白A或蛋白D；类风湿因子类；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)，表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-II(IGF-1和IGF-II)；des(I-3)-IGF-l(脑IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白类，EpCAM，GD3，FLT3，PSMA，PSCA，MUCI，MUCI6，STEAP，CEA，TENB2，EphA受体类，EphB受体类，叶酸受体，FOLRI，间皮素，畸胎瘤衍化生长因子抗原C端(cripto)，αvβ6(alphavbeta6)，整合素类，VEGF，VEGFR，EGFR，转铁蛋白受体，IRTA1，IRTA2，IRTA3，IRTA4，IRTA5；CD蛋白质类，例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CDI52，或与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，其公开于美国专利公开号2008/0171040或美国专利公开号
2008/0305044中，所述专利申请通过引用其全部内容并入本发明；促红细胞生成素；骨诱导因子类；免疫毒素类；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ；集落落刺激因子类(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素类(IL)，例如IL-1至IL-
10；超氧化物歧化酶；T细胞受体类；表面膜蛋白类；衰变加速因子；病毒抗原，例如HIV包膜的一部分；转运蛋白类；归巢受体类；地址素类；调节蛋白类；整合素类，例如CDlla、CDllb、CDllc、CDI8、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如AFP、ALK、B7H4、BAGE蛋白质类、β-连环素、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9(碳酸酐酶IX)、半胱天冬酶-8、CD20、CD40、CD123、CDK4、CEA、CLEC12A、c-kit、cMET、CTLA4、细胞周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、内皮糖蛋白、Epcam、EphA2、ErbB2/Her2、ErbB3/Her3、ErbB4/Her4、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白质类(例如GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/EBNA1、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IGF1R、LGR5、LMP2、MAGE蛋白质类(例如，MAGE-
1、-2、-3、-4、-6、和-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NGEP、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PDGFR-α、PDGFR-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PLAC1、PRLR、PRAME、PSCA、PSGR、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质类、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1(前列腺跨膜上皮抗原-1)、Steap-
2、STn、生存素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TNFRSF17、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、和尿溶蛋白-3(uroplakin-3)，以及任何上述多肽的片段。在一些实施方案，所述抗原是肿瘤抗原，包括对特定类型的肿瘤特异的抗原或在特定类型的肿瘤上共有、过度表达或修饰的抗原。实例包括但不限于：患有肺癌的α-辅肌动蛋白-4(alpha-actinin-4)，患有黑素瘤的ARTC1，患有慢性粒细胞白血病的BCR-ABL融合蛋白，患有黑素瘤的B-RAF、CLPP或Cdc27，患有鳞状细胞癌的CASP-8，和患有肾细胞癌的hsp70-2，以及以下共有的肿瘤特异性抗原，例如：BAGE-
1、GAGE、GnTV、KK-LC-1、MAGE-A2、NA88-A、TRP2-INT2。在一些实施方案，所述抗原是PRLR或HER2。在一些实施方案，所述抗体是抗PRLR抗体或抗HER2抗体。
2008/0305044中，所述专利申请通过引用其全部内容并入本发明；促红细胞生成素；骨诱导因子类；免疫毒素类；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ；集落落刺激因子类(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素类(IL)，例如IL-1至IL-
10；超氧化物歧化酶；T细胞受体类；表面膜蛋白类；衰变加速因子；病毒抗原，例如HIV包膜的一部分；转运蛋白类；归巢受体类；地址素类；调节蛋白类；整合素类，例如CDlla、CDllb、CDllc、CDI8、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如AFP、ALK、B7H4、BAGE蛋白质类、β-连环素、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9(碳酸酐酶IX)、半胱天冬酶-8、CD20、CD40、CD123、CDK4、CEA、CLEC12A、c-kit、cMET、CTLA4、细胞周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、内皮糖蛋白、Epcam、EphA2、ErbB2/Her2、ErbB3/Her3、ErbB4/Her4、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白质类(例如GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/EBNA1、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IGF1R、LGR5、LMP2、MAGE蛋白质类(例如，MAGE-
1、-2、-3、-4、-6、和-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NGEP、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PDGFR-α、PDGFR-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PLAC1、PRLR、PRAME、PSCA、PSGR、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质类、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1(前列腺跨膜上皮抗原-1)、Steap-
2、STn、生存素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TNFRSF17、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、和尿溶蛋白-3(uroplakin-3)，以及任何上述多肽的片段。在一些实施方案，所述抗原是肿瘤抗原，包括对特定类型的肿瘤特异的抗原或在特定类型的肿瘤上共有、过度表达或修饰的抗原。实例包括但不限于：患有肺癌的α-辅肌动蛋白-4(alpha-actinin-4)，患有黑素瘤的ARTC1，患有慢性粒细胞白血病的BCR-ABL融合蛋白，患有黑素瘤的B-RAF、CLPP或Cdc27，患有鳞状细胞癌的CASP-8，和患有肾细胞癌的hsp70-2，以及以下共有的肿瘤特异性抗原，例如：BAGE-
1、GAGE、GnTV、KK-LC-1、MAGE-A2、NA88-A、TRP2-INT2。在一些实施方案，所述抗原是PRLR或HER2。在一些实施方案，所述抗体是抗PRLR抗体或抗HER2抗体。
[0151] 所述结合剂连接体可通过抗体或抗原结合分子内特定氨基酸处的附接而与所述结合剂(例如，抗体或抗原结合分子)连接。可在本发明此方面的上下文中使用的示例性氨基酸附接包括，例如，赖氨酸(参见例如，US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander etal.,Bioconjugate Chem.,2008,19:358–361；WO2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)，半胱氨酸(参见例如，US 2007/0258987；WO 2013/055993；
WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；
和US 7,750,116)，硒代半胱氨酸(参见例如，WO 2008/122039；和Hofer etal.,
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451–12456)，甲酰甘氨酸(参见例如，Carrico etal.,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321–322；Agarwal etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,
2013,110:46–51，和Rabuka etal.,Nat.Protocols,2012,10:1052–1067)，非天然氨基酸(参见例如，WO 2013/068874，和WO 2012/166559)，和酸性氨基酸(参见例如，WO 2012/
05982)。连接体也可通过与碳水化合物(参见例如，US 2008/0305497，WO 2014/065661，和Ryan etal.,Food&AgricultureImmunol.,2001,13:127–130)的附接而与抗原结合蛋白偶联。
WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；
和US 7,750,116)，硒代半胱氨酸(参见例如，WO 2008/122039；和Hofer etal.,
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451–12456)，甲酰甘氨酸(参见例如，Carrico etal.,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321–322；Agarwal etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,
2013,110:46–51，和Rabuka etal.,Nat.Protocols,2012,10:1052–1067)，非天然氨基酸(参见例如，WO 2013/068874，和WO 2012/166559)，和酸性氨基酸(参见例如，WO 2012/
05982)。连接体也可通过与碳水化合物(参见例如，US 2008/0305497，WO 2014/065661，和Ryan etal.,Food&AgricultureImmunol.,2001,13:127–130)的附接而与抗原结合蛋白偶联。
[0152] 在一些实施例，所述结合剂是抗体或抗原结合分子，和所述抗体通过赖氨酸残基与所述连接体连接。在一些实施方案，所述抗体或抗原结合分子通过半胱氨酸残基与所述连接体连接。
[0153] 连接体还可通过基于转谷氨酰胺酶的化学酶偶联而偶联至一个或多个谷氨酰胺残基上(参见例如，Dennleretal.,Bioconjugate Chem.2014,25,569–578)。例如，在转谷氨酰胺酶存在下，抗体的一个或多个谷氨酰胺残基可与伯胺化合物偶联。伯胺类化合物包括有效负载或连接体-有效负载，其通过转谷氨酰胺酶介导的偶联直接提供抗体药物偶联物。伯胺类化合物还包括被活性基团官能化的连接体和间隔基团，随后可与进一步的化合物反应以合成抗体药物偶联物。包含谷氨酰胺残基的抗体可从天然来源分离得到或经工程改造以包含一个或多个谷氨酰胺残基而得到。用于将谷氨酰胺残基工程化为抗体多肽链(谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子)的技术均在本领域技术人员的技术范围内。在某些实施方案，所述抗体是无糖基化的。
[0154] 在某些实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子在至少一个多肽链序列中包含至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子包含两个重链多肽，其中每个具有一个Gln295残基。在进一步的实施方案中，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子在除重链295以外的位点处包含一个或多个谷氨酰胺残基。本发明包括带有本发明所述的N297Q突变的抗体。简言之，在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶的存在下，用伯胺化合物处理包含谷氨酰胺残基的抗体，如下文更详细描述的。在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶的存在下，用伯胺化合物处理包含Asn297Gln(N297Q)突变的抗体，如下文更详细描述的。在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶的存在下，用伯胺化合物处理包含Gln295(Q295)残基的抗体，如下文更详细描述的。在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶的存在下，用伯胺化合物处理包含Gln55(Q55)残基的抗体，如下文更详细描述的。例如，在一些实施方案，可通过定点诱变以去除或破坏序列或以在除了任何干扰结构之外的位点插入谷氨酰胺残基来制备此类抗体。此类抗体也可从天然或人工来源分离得到。
伯胺类化合物
伯胺类化合物
[0155] 可用于由包含谷氨酰胺的抗体(或抗原结合化合物)的转谷氨酰胺酶介导的偶联的伯胺化合物可以是普通技术人员认为有用的任何伯胺化合物。通常，伯胺化合物具有式H2N-R所示结构，其中R可以是与抗体和反应条件相配的任何基团。在某些实施方案，R是烷基、取代的烷基、杂烷基、或取代的杂烷基。
[0156] 在一些实施方案，所述伯胺化合物包含活性基团或保护的活性基团。有用的活性基团包括叠氮化物类、炔烃类、环炔烃类、硫醇类、醇类、酮类、醛类、酸类、酯类、酰肼类、苯胺类、和胺类。在某些实施方案，所述活性基团选自由叠氮化物、炔烃、巯基、环炔烃、醛、和羧基组成的组。
[0157] 在某些实施方案，所述伯胺化合物具有式H2N-LL-X所示结构，其中LL是二价间隔基团，和X是活性基团或保护的活性基团。在特定实施方案，LL是二价聚乙二醇(PEG)基团。在某些实施方案，X是选自由-SH、–N3、炔烃、醛和四唑组成的组。在特定实施方案，X是–N3。
[0158] 在某些实施方案，所述伯胺化合物具有以下通式之一的结构：H2N-(CH2)n-X；
H2N-(CH2CH2O)n-(CH2)p-X；
H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X；
H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；
H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X；
H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；
H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；
H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X；
H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；和
H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X；
其中n是选自1至12的整数；
m是选自0至12的整数；
p是选自0至2的整数；
和X是选自由以下组成的组：–SH、–N3、–C≡CH、–C(O)H、四唑、和以下之一：
H2N-(CH2CH2O)n-(CH2)p-X；
H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X；
H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；
H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X；
H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；
H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；
H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X；
H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X；和
H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X；
其中n是选自1至12的整数；
m是选自0至12的整数；
p是选自0至2的整数；
和X是选自由以下组成的组：–SH、–N3、–C≡CH、–C(O)H、四唑、和以下之一：
[0159] 在上文中，任何所述烷基或亚烷基(即-CH2-)基团可任选地被例如C1-8烷基、甲基甲酰基、或–SO3H取代。在某些实施方案，所述烷基基团均是未取代的。
[0160] 在某些实施方案，所述伯胺化合物是选自由以下组成的组：
[0161] 在特定实施方案，所述伯胺化合物是：在以下实施例中提供了上述反应的示例性条件。
连接体
连接体
[0162] 本发明所述偶联物的连接体LL部分是一个基团部分，例如二价基团部分，其将结合剂共价连接至本发明所述的有效负载化合物。在其他情况下，连接体LL是将结合剂共价连接至本发明所述的有效负载化合物的三价或多价基团部分。合适的连接体可在例如Antibody-Drug Conjugates andImmunotoxins；Phillips,G.L.,Ed.；Springer Verlag:
NewYork,2013；Antibody-Drug Conjugates；Ducry,L.,Ed.；Humana Press,2013；
Antibody-Drug Conjugates；Wang,J.,Shen,W.-C.,andZaro,J.L.,Eds.；Springer
International Publishing,2015中获悉，各文献的内容通过引用其整体并入本发明。有效负载化合物包括图1中的化合物，以及其与连接体LL连接或结合后的残基。本领域技术人员将认识到，有效负载基团部分的某些官能团便于连接至连接体和/或结合剂。所述这些基团包括胺类、羟基类、磷酸盐/酯类和糖类。
NewYork,2013；Antibody-Drug Conjugates；Ducry,L.,Ed.；Humana Press,2013；
Antibody-Drug Conjugates；Wang,J.,Shen,W.-C.,andZaro,J.L.,Eds.；Springer
International Publishing,2015中获悉，各文献的内容通过引用其整体并入本发明。有效负载化合物包括图1中的化合物，以及其与连接体LL连接或结合后的残基。本领域技术人员将认识到，有效负载基团部分的某些官能团便于连接至连接体和/或结合剂。所述这些基团包括胺类、羟基类、磷酸盐/酯类和糖类。
[0163] 在某些实施方案，所述连接体在生理条件下是稳定的。在某些实施方案，所述连接体是可切割的，例如，能够在酶存在下或在特定pH范围或pH值下释放至少所述有效负载部分。在一些实施方案，连接体包含酶可切割的基团部分。示例性酶可切割的基团部分包括但不限于肽键类、酯键类、腙类、和二硫键类。在一些实施方案，所述连接体包含组织蛋白酶可切割的连接体。
[0164] 在一些实施方案，所述连接体包含不可切割基团部分。在一些实施方案，所述不可切割的连接体衍生自 或其残基。在一些实施方案，所述不可切割的连接体-有效负载是 或其区域异构体。在一些实施方
案，所述不可切割的连接体衍生自 或其残基。在一些实施方
案，所述不可切割的连接体-有效负载是 或其区域异构体。在一个
实施方案，所述连接体是马来酰亚胺环己烷羧酸酯或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸(MCC)。在所述结构中， 表示与结合剂连接的键。在所述结构中，在一些实施例， 表示由例如结合剂和连接体有效负载的反应产生的点击化学残基。
案，所述不可切割的连接体衍生自 或其残基。在一些实施方
案，所述不可切割的连接体-有效负载是 或其区域异构体。在一个
实施方案，所述连接体是马来酰亚胺环己烷羧酸酯或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸(MCC)。在所述结构中， 表示与结合剂连接的键。在所述结构中，在一些实施例， 表示由例如结合剂和连接体有效负载的反应产生的点击化学残基。
[0165] 在一些实施方案，合适的连接体包括但不限于与单一结合剂(例如抗体)的两个半胱氨酸残基进行化学键合的那些。此类连接体可用于模拟由于偶联过程而被破坏的所述抗体的二硫键。
[0166] 在一些实施方案，所述连接体包含一个或多个氨基酸。合适的氨基酸包括天然、非天然的、标准、非标准的、蛋白原、非蛋白原的、和L-或D-型α-氨基酸。在一些实施方案，所述连接体包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸、或其衍生物、或其组合。在某些实施方案，所述氨基酸的一个或多个侧链连接至如下所述的侧链基团。在一些实施方案，所述连接体包含缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案，所述连接体包含赖氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案，所述连接体包含赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案，所述连接体包含缬氨酸和丙氨酸。
[0167] 在一些实施方案，所述连接体包含自降解基团。所述自降解基团可以是技术人员已知的任何此类基团。在特定实施方案，所述自降解基团是对氨基苄基(PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括对氨基苄氧基羰基(PABC)。本领域技术人员将认识到，自降解基团能够进行化学反应，所述化学反应从有效负载中释放连接体的剩余原子。
[0168] 在一些实施方案，活性基团RG'可以是本领域技术人员已知的能够与结合剂连接形成一个或多个键的任何活性基团。活性基团RG'是在其结构中包含能够与结合剂反应(例如，在抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基或叠氮化物基团部分处与抗体反应，例如在一个或多个谷氨酰胺残基处与PEG-N3官能化的抗体反应)以形成式A、Aa或Ab所示化合物的部分的基团部分。与结合剂偶联后，活性基团成为活性基团(RG)或连接体残基。示例性活性基团包括但不限于，包含能够与结合剂反应的卤代乙酰基、异硫氰酸酯基、琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或马来酰亚胺部分的那些活性基团。
[0169] 在某些实施方案，活性基团包括但不限于炔烃类。在某些实施方案，所述炔烃是在不存在铜催化剂的情况下能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔烃，如应变炔烃。应变炔烃是适于应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC)的那些，环炔烃类，例如环辛炔类，苯并环化的炔烃类。合适的炔烃类还包括但不限于，二苯并氮杂环辛炔或(DIBAC)，二苯并环辛炔或 (DIBO)，二芳基氮杂环辛炔酮或
(BARAC)，二氟化环辛炔或
(DIFO)，取代的例如氟化炔烃类，氮杂-环炔烃类，二环[6.1.0]壬炔或
(BCN)，和其衍生物。特别有用的炔烃包括
(BARAC)，二氟化环辛炔或
(DIFO)，取代的例如氟化炔烃类，氮杂-环炔烃类，二环[6.1.0]壬炔或
(BCN)，和其衍生物。特别有用的炔烃包括
[0170] 在某些实施方案，所述结合剂直接连接至RG。在某些实施方案，所述结合剂通过间隔基团连接至RG。在特定实施方案，所述结合剂通过PEG间隔基团连接至RG。在某些实施方案，所述结合剂通过采用一个或多个叠氮基进行官能化来制备。每个叠氮基基团能够与RG'反应形成RG。在特定实施方案，所述结合剂采用与谷氨酰胺残基连接的–PEG-N3衍生得到。本发明提供了示例性–N3衍生的结合剂，其制备方法，以及其与RG'反应的方法。在某些实施方案，RG'是适于参与1,3-环加成的炔烃，和RG'是由RG'与叠氮基官能化的结合剂反应形成的1,2,3-三唑基基团部分。作为进一步的实例，在某些实施方案，RG连接至结合剂，所述结合剂如 所示，或各区域异构体的混合物。各R和R'分别具有
本发明所述定义。
本发明所述定义。
[0171] 在本发明所述通式中，各AA1分别为氨基酸。在本发明所述通式的一些实施例中，各AA2分别为氨基酸。在本发明所述通式的一些实施例中，各AA2分别为二肽。在本发明所述通式的一些实施例中，各AA2分别为三肽。各AA1或AA2的合适氨基酸包括天然、非天然的、标准、非标准的、蛋白原、非蛋白原的、L-型或D-型氨基酸。在一些实施方案，所述连接体包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸、或其衍生物、或其组合。在某些实施方案，所述氨基酸的一个或多个侧链连接至如下所述的侧链基团。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述2 2
AA 是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是赖氨酸-缬氨酸-丙氨
2 2
酸。在一些实施方案，所述AA是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA 是谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸-PABC。
AA 是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA2是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是赖氨酸-缬氨酸-丙氨
2 2
酸。在一些实施方案，所述AA是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA 是谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA2是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸-PABC。
[0172] 技术人员将认识到PABC是具有以下结构的对氨基苄氧基羰基的残基：已示出了PABC残基促进体外和体内切割某些连接体。
[0173] 在一些实施例，所述连接体是MC-Suc-PEGm-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0174] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEGm-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0175] 在一些实施例，所述连接体是MAL-PEGm-Lys(COT-CD)-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，所述连接体是MAL-PEGm-N(suc-DIBAC-CD)Lys-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0176] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-Lys(mc-pip-CD)-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0177] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-Suc-PEGm-N(CD-COT)Lys-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。
在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0178] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEGm-Lys(COT-CD)-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0179] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-Suc-PEGm-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0180] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-D-Lys-(PEGm-COT-CD)-vc-PAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0181] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEGm-Val-Ala。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0182] 在一些实施例，所述连接体是PEGm-D-Lys-Val-Ala。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0183] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEGm-D-Lys(PEGm)-vcPAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0184] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEGm-D-Lys(PEGm)-Val-Ala。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0185] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEGm-D-Lys(PEGm)-vcPAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0186] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-D-Lys-Val-Ala。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0187] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEGm-D-Lys-vcPAB。下标m是从0至4的整数。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。
[0188] 在一些实施例，所述连接体是MC-Suc-PEG4-vc-PAB。
[0189] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-vc-PAB。
[0190] 在一些实施例，所述连接体是MAL-Lys(suc-DIBAC-CD)-vc-PAB。
[0191] 在一些实施例，所述连接体是MAL-PEG4-Lys(COT-CD)-vc-PAB。
[0192] 在一些实施例，所述连接体是MAL-PEG4-N(suc-DIBAC-CD)Lys-vc-PAB。
[0193] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-Lys(mc-pip-CD)-vc-PAB。
[0194] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-Suc-PEG4-N(CD-COT)Lys-vc-PAB。
[0195] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-Lys(COT-CD)-vc-PAB。
[0196] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-Suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB。
[0197] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB。
[0198] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-Val-Ala。
[0199] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala。
[0200] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala。
[0201] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-Val-Ala。
[0202] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala。
[0203] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vcPAB。
[0204] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-Val-Ala。
[0205] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vcPAB。
[0206] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-Val-Ala。
[0207] 在一些实施例，所述连接体是BCN-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala。
[0208] 在一些实施例，所述连接体是DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vc-PAB。活性连接体-有效负载
[0209] 本发明提供的偶联物可由具有如上所述的活性基团RG'的活性连接体-有效负载制备得到。可根据以下所述方法将活性连接体有效负载连接至本发明所述的环糊精基团和/或结合剂。
[0210] 在一些实施方案，本发明提供了活性连接体-有效负载，其包含经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分的活性基团，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性基团、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分连接。
[0211] 如本发明所示，在一些实施例，所述活性基团直接连接至共价连接体，例如赖氨酸氨基酸。这意味着所述活性基团与所述共价连接体相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还直接连接至有效负载基团部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、类固醇或本发明所述的任何有效负载)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还直接连接至环糊精基团部分。这意味着所述共价连接体与环糊精(例如本发明所述的环糊精)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。
[0212] 在其他实施例，所述活性基团间接连接至共价连接体。这意味着所述活性基团与共价连接体相距一个以上的键位置。这也意味着所述活性基团通过另一基团部分与所述共价连接体连接。例如，所述活性基团可连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团连接至所述共价连接体。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至有效负载部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、或类固醇、或本发明所述的任何有效负载)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述有效负载连接。例如，所述共价连接体可连接至二肽，例如但不限于Val-Ala或Val-Cit，其可连接至PAB，所述PAB可连接至所述有效负载。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至环糊精基团部分。这意味着所述共价连接体与环糊精(例如本发明所述的环糊精)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述环糊精连接。例如，所述共价连接体可连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团可连接至活性基团，所述活性基团可连接至所述环糊精。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。
[0213] 在一些实施方案，本发明提供了式(II)所示的活性连接体-有效负载：在式(II)中，RG'是活性基团，L是三价连接体，CD是环糊精残基；和PA是有效负载残基。
[0214] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIa)的化合物：在式(IIa)中，RG'是活性基团，RG是活性连接体残基，LL是三价连接体，SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团；和PA是有效负载。
[0215] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb)或(IIc)的化合物。在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb)的化合物：在式(IIb)或(IIc)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体。SP在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团，环A与三唑稠合，并且环A选自由环烷基、环烯基、环炔基、杂环烷基、杂环烯基、和杂环炔基组成的组，其中环烷基、环烯基、环炔基、杂环烷基、杂环烯基、和杂环炔基均任选地被烷基、OH、或NRaRb取代，其中Ra和Rb各自为烷基或H，和PA是有效负载。在一些实施例，环A任选地被环烷基取代。在一些实施例，环A任选地被环烯基取代。在一些实施例，环A任选地被环炔基取代。在一些实施例，环A任选地被杂环烷基取代。在一些实施例，环A任选地被杂环炔基取代。在一些实施例，式(IIb)或(IIc)的化合物还包括式(IIb)或(IIc)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0216] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIc)的化合物：在式(IIc)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体。SP不存在或SP是间隔基团，和PA是有效负载。在一些实施例，式(IIb)、(IIc)的化合物包括式(IIc)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述琥珀酰亚胺键)、立体异构体及其混合物。
[0217] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb1)、(IIb2)、(IIb3)、(IIb4)、(IIb5)、或(IIb6)的化合物。在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb1)的化合物：在式(IIb1)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体。SP不存在或SP是间隔基团，和PA是有效负载。在一些实施例，式(IIb1)的化合物包括式(IIb1)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0218] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb2)的化合物：
在式(IIb2)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体。SP不存在或SP是间隔基团，和PA是有效负载。在一些实施例，式(IIb2)的化合物包括式(IIb2)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
在式(IIb2)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体。SP不存在或SP是间隔基团，和PA是有效负载。在一些实施例，式(IIb2)的化合物包括式(IIb2)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0219] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb3)的化合物：在式(IIb3)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体，和PA是有效负载。在一些实施例，式(IIb3)的化合物包括式(IIb3)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0220] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb4)的化合物：在式(IIb4)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体，和PA是有效负载。在一些实施例，式(IIb4)的化合物包括式(IIb4)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0221] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb5)的化合物：在式(IIb5)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体，e是从0至4的整数，和PA是有效负载。
在一些实施例，e是0。在一些实施例，e是1。在一些实施例，e是2。在一些实施例，e是3。在一些实施例，e是4。在一些实施例，式(IIb5)的化合物包括式(IIb5)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
在一些实施例，e是0。在一些实施例，e是1。在一些实施例，e是2。在一些实施例，e是3。在一些实施例，e是4。在一些实施例，式(IIb5)的化合物包括式(IIb5)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0222] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIb6)的化合物：在式(IIb6)中，RG'是活性基团，LL是三价连接体，e是从0至4的整数，和PA是有效负载。
在一些实施例，e是0。在一些实施例，e是1。在一些实施例，e是2。在一些实施例，e是3。在一些实施例，e是4。在一些实施例，式(IIb6)的化合物包括式(IIb6)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
在一些实施例，e是0。在一些实施例，e是1。在一些实施例，e是2。在一些实施例，e是3。在一些实施例，e是4。在一些实施例，式(IIb6)的化合物包括式(IIb6)所示化合物的区域异构体(例如，关于所述三唑键)、立体异构体及其混合物。
[0223] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIc1)的化合物：在式(IIc1)中，RG'是结合剂，LL是三价连接体，和PA是有效负载。式(IIc1)的化合物还包括其区域异构体(例如，关于所述琥珀酰亚胺键)、立体异构体及其混合物。
[0224] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IId)的化合物：在式(IId)中，RG'是活性基团，SP1和SP2在每种情况下，各自独立地不存在，或各自独立地为间隔基团残基，和其中SP1包含三价连接体，AA1是包含氨基酸残基的三价连接体；AA2是二肽残基，PEG是聚乙二醇残基，PAB是 其中所述 表示所述PAB通过其
与所述通式中相邻基团连接的原子，CD在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为环糊精残基，其中存在至少一个CD，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
与所述通式中相邻基团连接的原子，CD在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为环糊精残基，其中存在至少一个CD，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
[0225] 在式(IId)的一些实例中，CD是具有以下结构式的经修饰的CD基团：其中RG在每种情况下，分别独立地为活性连接体残基；SP3在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组的间隔基团残基，下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数；q是从0至5的整数，和 表示所述经修饰的CD基团通过其与SP1或AA1连接的原子。
[0226] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIe)的化合物：在式(IIe)中，RG'是活性基团，RG是活性基团残基；SP2在每种情况下，分别独立地不存
2
在，或分别独立地为间隔基团残基，和其中AA 是二肽残基，PEG是聚乙二醇残基，PAB是其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD
不存在或CD是环糊精残基，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是
4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
2
在，或分别独立地为间隔基团残基，和其中AA 是二肽残基，PEG是聚乙二醇残基，PAB是其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD
不存在或CD是环糊精残基，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是
4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
[0227] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIe1)的化合物：在式(IIe1)中，RG'是活性基团，SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基，和其中AA2是二肽残基，PEG是聚乙二醇残基，PAB是 其中
所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD不存在或CD是环糊精
残基，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD不存在或CD是环糊精
残基，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
[0228] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIe2)的化合物：在式(IIe2)中，RG'是活性基团，SP2在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基，和其中AA2是二肽残基，PEG是聚乙二醇残基，PAB是 其
中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD是环糊精残基，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是
0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD是环糊精残基，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在所述这些实施例中，下标m是
0、1、2、3、4、或5。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。
[0229] 在一些实施例，式(II)所示化合物是式(IIf)的化合物：在式(IIf)中，RG'是结合剂，RG是活性基团残基，SP1、SP2和SP3在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基，AA2是二肽残基，PEG是聚乙二醇残基，PAB是其中所述 表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子，CD
是环糊精残基，下标q是从0至5的整数，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。
在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，q是0。在一些实施例，q是1。在一些实施例，q是2。在一些实施例，q是3。在一些实施例，q是4。在一些实施例，q是5。在式(IIf)的
1 2
一些实施例中，SP 不存在，和SP 在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
是环糊精残基，下标q是从0至5的整数，下标m是从0至5的整数，下标p是0或1；和PA是有效负载基团部分。在一些实施例，下标m是0。在一些实施例，下标m是1。在一些实施例，下标m是2。
在一些实施例，下标m是3。在一些实施例，下标m是4。在一些实施例，下标m是5。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，q是0。在一些实施例，q是1。在一些实施例，q是2。在一些实施例，q是3。在一些实施例，q是4。在一些实施例，q是5。在式(IIf)的
1 2
一些实施例中，SP 不存在，和SP 在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、和其组合组成的组，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。
[0230] 在一些实施例，包括前述任一实施例，式(II)所示化合物包含至少一个CD基团。在具体实施例，式(I)所示化合物是本发明所述的式(IIe)、式(IIe1)或式(IIe2)的化合物并包含一个CD基团。在另一具体实施例，式(II)所示化合物是本发明所述的式(IIf)的化合物并包含一个CD基团。
[0231] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地为环糊精。在一些实施例，所述CD是α-环糊精。在一些实施例，所述CD是β-环糊精。在一些实施例，所述CD是γ-环糊精。在任一所述这些实施例中，所述α-环糊精、β-环糊精、或γ-环糊精是任选取代的。
[0232] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自：其中所述 表示所述CD通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在某些实施例，
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
[0233] 在一些实施例，包括前述任一实施例，RG在每种情况下，分别独立地为点击化学反应的残基。在一些实施例，包括前述任一实施例，RG在每种情况下，分别独立地包含三唑或稠合三唑。
[0234] 在一些实施例，包括前述任一实施例，RG'在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：其中所述 表示所述RG'通过其与所述通式中相邻基
团连接的原子。在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG '在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为 在
所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例
的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG'在
每种情况下，分别独立地为
团连接的原子。在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG '在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为 在
所述这些实施例的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例
的某些中，RG'在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG'在
每种情况下，分别独立地为
[0235] 在一些实施例，包括前述任一实施例，RG在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：其中所述 表示所述RG通过其与所述通式中相邻基团连接
的原子。在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所
述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例
的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些
中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG
在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况
下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别
独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地
为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为
在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述
这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某
些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每
种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独
立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为
的原子。在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所
述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例
的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些
中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG
在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况
下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别
独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地
为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为
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这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某
些中，RG在每种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每
种情况下，分别独立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独
立地为 在所述这些实施例的某些中，RG在每种情况下，分别独立地为
[0236] 在一些实施例， 选自：还包括其盐、溶剂化物、立体异构体形式，其区域异构体，或其区域异构体的混合物，其中各 分别是与所述有效负载连接的键；和R9是–CH3或-(CH2)3N(H)C(O)NH2。在一些实施例，R9是–CH3。在一些实施例，R9是-(CH2)3N(H)C(O)NH2。
[0237] 在一些实施例，式(II)所示化合物包含选自以下的基团：或其盐、溶剂化物、立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物，其中各 分别是与所述有效负载连接的键。
[0238] 在一些实施例，-LL-具有式(LL1)所示结构：其中RAA1、RAA2和RAA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与-SP-RG-SP-CD连接。在一些实施例，RAA1是赖氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，RAA2是缬氨酸氨基酸侧链。
AA3 AA3
在一些实施例，R 是丙氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，R 是瓜氨酸氨基酸侧链。在某些实施例，RAA1是直接或间接连接至CD的赖氨酸氨基酸侧链，和RAA2与RAA3分别独立地为缬氨酸和丙氨酸氨基酸侧链。在某些实施例，RAA1是直接或间接连接至CD的赖氨酸氨基酸侧链，和RAA2与RAA3分别独立地为缬氨酸和瓜氨酸氨基酸侧链。
AA3 AA3
在一些实施例，R 是丙氨酸氨基酸侧链。在一些实施例，R 是瓜氨酸氨基酸侧链。在某些实施例，RAA1是直接或间接连接至CD的赖氨酸氨基酸侧链，和RAA2与RAA3分别独立地为缬氨酸和丙氨酸氨基酸侧链。在某些实施例，RAA1是直接或间接连接至CD的赖氨酸氨基酸侧链，和RAA2与RAA3分别独立地为缬氨酸和瓜氨酸氨基酸侧链。
[0239] 在一些实施例，包括前述任一实施例，RAA1是直接或间接连接至CD的赖氨酸氨基酸侧链，和RAA2与RAA3分别为赖氨酸和缬氨酸侧链或分别为缬氨酸和赖氨酸侧链。
[0240] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地为环糊精。在一些实施例，所述CD是α-环糊精。在一些实施例，所述CD是β-环糊精。在一些实施例，所述CD是γ-环糊精。在任一所述这些实施例中，所述α-环糊精、β-环糊精、或γ-环糊精是任选取代的。
[0241] 在一些实施例，包括前述任一实施例，CD在每种情况下，分别独立地选自：其中所述 表示所述CD通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在某些实施例，
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
所述CD是 在某些实施例，所述CD是
[0242] 在一些实施例，包括前述任一实施例，-AA2-是
[0243] 在一些实施例，包括前述任一实施例，所述间隔基团在每种情况下，分别独立地选自由C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-组成的组。
[0244] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q、或e是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是1。
[0245] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q、或e是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是2。
[0246] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q、或e是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是3。
[0247] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m、q、或e是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标m是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标q是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标e是4。
[0248] 在一些实施例，包括前述任一实施例，下标p是1。
[0249] 在一些实施例，包括前述任一实施例，PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷(taxane)，和长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)。在一些实施例，PA是图1中所述的任一化合物。
[0250] 在一些实施例，式(II)所示化合物选自：或其立体异构体形式，或其区域异构体，或其区域异构体的混合物。
[0251] 在一些实施例，本发明提供了包含本发明所述化合物的连接体-有效负载。
[0252] 在一些实施例，本发明提供了包含与本发明所述的任何化合物的氧原子或伯氮原子或仲氮原子连接的本发明所述化合物的连接体-有效负载。
[0253] 在一些实施例，本发明提供了抗体-药物偶联物，其包含与抗体或其抗原结合片段连接的本发明所述化合物或连接体-有效负载。制备化合物的方法
[0254] 本发明提供的化合物可通过本领域技术人员显而易见的任何方法制备、分离或得到。在以下实施例中详细描述了示例性制备方法。在某些实施方案，本发明提供的化合物可根据图1-11和图13-14制备得到。
[0255] 本发明所述的偶联物可通过在标准偶联条件下将本发明所述的连接体-有效负载与结合剂例如抗体偶联来合成得到(参见例如，Doronina etal.Nature Biotechnology 2003,21,7,778，其通过引用其全部内容并入本发明)。当所述结合剂是抗体时，所述抗体可通过抗体的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基偶联至连接体-有效负载。连接体-有效负载可以，例如通过使抗体经受还原剂(例如二硫苏糖醇)的作用以切割抗体的二硫键，例如通过凝胶过滤纯化所述还原的抗体，然后用含有合适的活性基团部分(例如马来酰亚胺基基团)的连接体-有效负载处理所述抗体，从而与半胱氨酸残基偶联。合适的溶剂包括但不限于水、DMA、DMF、和DMSO。含有活性基团例如活化酯或酰基卤基团的连接体-有效负载可以与抗体的赖氨酸残基偶联。合适的溶剂包括但不限于水、DMA、DMF、和DMSO。偶联物可使用已知的蛋白质技术进行纯化，包括例如体积排除色谱法、透析法和超滤/渗滤法。
[0001] 结合剂，例如抗体，也可通过点击化学反应进行偶联。在所述点击化学反应的一些实施方案中，连接体-有效负载包括能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的活性基团，例如炔。此类合适的活性基团如上所述。所述抗体包括一个或多个叠氮基团。此类抗体包括用例如叠氮基-聚乙二醇基团官能化的抗体。在某些实施方案，此类官能化抗体通过在转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理具有至少一个谷氨酰胺残基(例如重链Gln295或Gln55)的抗体，进行衍生得到。此类抗体还可包含Asn297Gln(N297Q)突变体。在某些实施方案，此类官能化抗体通过在转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理具有至少两个谷氨酰胺残基(例如重链Gln295和重链Gln297)的抗体，进行衍生得到。此类抗体包括Asn297Gln(N297Q)突变体。在某些实施方案，所述抗体具有如本段所述的两条重链，用于总共两个或总共四个谷氨酰胺残基。在某些情况下，待偶联的抗体在其可变区中含有一个或多个其他天然存在的谷氨酰胺残基，转谷氨酰胺酶可接近它并因此能够进行偶联，例如Gln55。在这些情况下，经转谷氨酰胺酶偶联后的抗体的DAR值可高于4。此类抗体包括Asn297Gln(N297Q)突变体。在一些实施方案，抗体具有如本段中所述的两个重链，用于总共两个或总共四个或总共五个或六个谷氨酰胺残基。
[0256] 在某些实施方案，所述抗体在EU编号体系中在编号为295的一个或多个重链位置处包含谷氨酰胺残基。在本发明中，此位置称为谷氨酰胺295，或称为Gln295，或称为Q295。技术人员将认识到，这是许多抗体的野生型序列中的保守谷氨酰胺残基。在其他有用的实施方案中，可将所述抗体工程化以包含谷氨酰胺残基。修饰抗体序列以包括谷氨酰胺残基的 技术是包含在本领域技术人员的技术范围内(参见例如，Ausubel
etal.CurrentProtoc.Mol.Biol.)。
etal.CurrentProtoc.Mol.Biol.)。
[0257] 在某些实施方案，所述抗体包含两个谷氨酰胺残基，每个重链中有一个。在特定实施方案，所述抗体在每个重链中包含Q295残基。在进一步的实施方案，所述抗体包含1、2、3、4、5、6、7、8个、或更多个谷氨酰胺残基。所述这些谷氨酰胺残基可在重链中、轻链中、或在重链和轻链两者中。所述这些谷氨酰胺残基可以是野生型残基、或工程化残基。所述抗体可根据标准技术制备得到。在某些实施方案，所述抗体包含或进一步包含Q55残基。
[0258] 本领域技术人员将认识到，抗体通常在重链序列中的残基Q295附近的残基N297处进行糖基化。残基N297处的糖基化可干扰残基Q295处的转谷氨酰胺酶(Dennler etal.，同上)。因此，在有利的实施方案中，所述抗体未被糖基化。在某些实施方案，所述抗体进行去糖基化或无糖基化。在特定实施方案，所述抗体重链具有N297突变。换言之，所述抗体突变为在位置297不再具有天冬酰胺残基。在特定实施方案，抗体重链具有N297Q突变。此类抗体可通过定点诱变以除去糖基化序列或使糖基化序列无效或通过定点诱变将谷氨酰胺残基插入除任何干扰糖基化位点或任何其他干扰结构之外的位点，来制备得到。可从天然或人工来源中分离任何此类抗体。
[0259] 然后不干扰糖基化的抗体用伯胺化合物处理。在某些实施方案，无糖基化的抗体用伯胺化合物处理以生成谷氨酰胺基修饰的抗体。在某些实施方案，去糖基化的抗体与伯胺化合物反应以生成谷氨酰胺基修饰的抗体。
[0260] 伯胺可以是在转谷氨酰胺酶存在下能够与谷氨酰胺残基形成共价键的任何伯胺。有用的伯胺如下所述。所述转谷氨酰胺酶可以是本领域技术人员认为合适的任何转谷氨酰胺酶。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶是催化伯胺化合物上的游离胺基团与谷氨酰胺残基的侧链上的酰基基团之间的异肽键形成的酶。转谷氨酰胺酶也称为蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶。在特定实施方案，所述转谷氨酰胺酶被分类为EC 2.3.2.13。所述转谷氨酰胺酶可以来自认为合适的任何来源。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶是微生物。有用的转谷氨酰胺酶已从茂原链轮丝菌(Streptomyces mobaraense)、肉桂链霉菌
(Streptomyces cinnamoneum)、灰肉链霉菌(Streptomycesgriseo-carneum)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离得到。也可使用非微生物的转谷氨酰胺酶，包括哺乳动物的转谷氨酰胺酶。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶可通过任何技术生成或从本领域技术人员认为合适的任何来源得到。在特定实施方案，所述转谷氨酰胺酶得自商业来源。
(Streptomyces cinnamoneum)、灰肉链霉菌(Streptomycesgriseo-carneum)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离得到。也可使用非微生物的转谷氨酰胺酶，包括哺乳动物的转谷氨酰胺酶。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶可通过任何技术生成或从本领域技术人员认为合适的任何来源得到。在特定实施方案，所述转谷氨酰胺酶得自商业来源。
[0261] 在特定实施方案，所述伯胺化合物包含能够在转谷氨酰胺化之后进一步反应的活性基团。在所述这些实施方案中，可将谷氨酰胺基修饰的抗体与活性有效负载化合物或活性连接体-有效负载化合物反应或处理以形成抗体-有效负载偶联物。在某些实施方案，所述伯胺化合物包含本发明所述的叠氮化物。
[0262] 在某些实施方案，将谷氨酰胺基修饰的抗体与活性连接体-有效负载反应或处理以形成抗体-有效负载偶联物。所述反应可在本领域技术人员认为合适的条件下进行。在某些实施方案，使谷氨酰胺基修饰的抗体与活性连接体-有效负载化合物在适于在谷氨酰胺基修饰的抗体与连接体-有效负载化合物之间形成键的条件下接触。合适的反应条件是本领域技术人员周知的。
[0263] 示例性反应提供在以下实施例中。
[0264] 在一些实施例，本发明提供了制备偶联物的方法，其包括在偶联条件下处理化合物和结合剂或使化合物与结合剂接触，其中所述化合物包含经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分的活性连接体，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性连接体、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分连接。在一些实施例，与结合剂反应的化合物是式(II)所示化合物：在式(II)中，RG'是活性基团，L是三价连接体，CD是环糊精残基；和PA是有效负载残基。
[0265] 在一些实施例，与式(II)所示化合物反应的结合剂是抗体或其抗原结合片段。
[0266] 在一些实施例，在本发明中，所述D-Lys可用图20中所述试剂代替。
[0267] 在一些实施例，含环糊精的基团部分可在选自[3+2]点击反应、Diels-Alder反应、还原胺化、光点击反应、或其他反应的生物正交反应中反应。
[0268] 适用于本发明方法的其他有用的生物正交反应包括但不限于施陶丁格(Staudinger)连接反应，点击反应，四嗪连接反应和光点击反应。
[0269] 以下参考文献示出了可与本发明所述的生物正交反应一同使用的示例性反应和试剂：Zheng,Mengmeng,etal.,Molecules 2015,20,3190-3205，其内容通过引用其整体并入本发明用于所有目的。药物组合物和治疗方法
[0270] 本发明提供了治疗和预防疾病、病况或病症的方法，其包含施用治疗或预防有效量的本发明公开的一种或多种化合物，例如本发明提供通式所示一种或多种化合物。本领域技术人员将认识到疾病、病症和/或病况包括但不限于与本发明所列抗原相关的那些。
[0271] 本发明所述化合物可单独施用或与一种或多种其他治疗剂一同施用。可在施用本发明所述化合物之前、同时或之后不久施用一种或多种其他治疗剂。本发明还包括药物组合物，其包含任何本发明所述化合物与一种或多种其他治疗剂组合，以及治疗方法，所述方法包含向有需要的受试者施用此类组合。
[0272] 合适的其他治疗剂包括但不限于：第二糖皮质激素，自身免疫治疗剂，激素，生物药，或单克隆抗体。合适的治疗剂还包括但不限于本发明所述化合物的任何药学上可接受的盐类、酸类或衍生物类。
[0273] 在本发明所述方法的一些实施方案中，可在限定的时间疗程中向受试者施用多剂量的本发明所述化合物(或包含本发明所述化合物和本发明提及的任何其他治疗剂的组合的药物组合物)。根据本发明内容的此方面的方法包括向受试者依次施用多剂量的本发明所述化合物。本发明使用的“依次施用”是指在不同的时间点，例如在以预定间隔(例如，小时、天、周、或月)隔开的不同天，将化合物的每个剂量施用于受试者。本发明包含以下方法，所述方法包含依次向患者施用单一初始剂量的本发明所述化合物，随后施用一个或多个二次剂量的所述化合物，以及任选地后续施用一个或多个三次剂量的所述化合物。
[0274] 术语“初始剂量”，“二次剂量”，和“三次剂量”是指本发明所述化合物的给药时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时给药的剂量(也称为“基线剂量”)；“二次剂量”是在所述初始剂量给药后施用的剂量；和“三次剂量”是在所述二次剂量给药后施用的剂量。所述初始、二次和三次剂量均可含有相同量的本发明化合物，但通常可在给药频率方面彼此不同。在一些实施方案，在治疗过程中，所述初始、二次和/或三次剂量中所含的化合物的量彼此变化(例如，酌情上调或下调)。在一些实施方案，在治疗方案开始时，将两种或更多种(例如，2、3、4或5种)剂量施用为“负荷剂量”，随后以较不频繁的方式施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
[0275] 在本发明所述的一些示例性实施方案中，每个二次和/或三次剂量在紧随前述剂量之后进行给药1至26周(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、
17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、
251/2、26、261/2、或更多)。本发明使用的短语“紧随前述剂量”是指在多次给药的序列中，在施用紧邻下一个剂量之前，对患者施用本发明化合物的剂量，在所述给药序列中不存在干预剂量。
17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、
251/2、26、261/2、或更多)。本发明使用的短语“紧随前述剂量”是指在多次给药的序列中，在施用紧邻下一个剂量之前，对患者施用本发明化合物的剂量，在所述给药序列中不存在干预剂量。
[0276] 本发明此方面的方法可包含向患者施用任何数量的二次和/或三次剂量的本发明化合物。譬如，在一些实施方案，仅向患者施用单次二次剂量。在其他实施方案，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)二次剂量。同理，在一些实施方案，仅向患者施用单次的三次剂量。在其他实施方案，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)三次剂量。给药方案可在特定受试者的寿命期内无限期地进行，或者直至此种治疗不再是治疗需要或有利的。
[0277] 在涉及多个二次剂量的实施方案中，每个二次剂量可以与其他二次剂量相同的频率施用/给药。譬如，每个二次剂量可在紧随前述剂量之后，对患者进行给药1至2周或1至2个月。同理，在涉及多个三次剂量的实施方案中，每个三次剂量可以与其他三次剂量相同的频率施用/给药。譬如，每个三次剂量可在紧随前述剂量之后，对患者进行给药2至12周。在本发明的一些实施方案中，向患者施用二次和/或三次剂量的频率可在治疗方案的过程中变化。也可根据临床检查后的个体患者的需要，由医师在治疗过程中调整给药频率。
[0278] 本发明包括其中以第一频率(例如，每周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次等)向患者施用2至6次负荷剂量，然后以较不频繁的方式向患者施用两次或更多次维持剂量的给药方案。例如，根据本发明的此方面，如果以每月一次的频率施用负荷剂量，那么维持剂量可以每6周施用一次，每两个月施用一次，每三个月施用一次等。
[0279] 本发明包括本发明所述化合物和/或偶联物如式I、Ia、Ib所示化合物的药物组合物，譬如，组合物包含本发明所述化合物、其盐、立体异构体、多晶型物，和药学上可接受的载体、稀释剂、和/或辅料。合适的载体、稀释剂和辅料的实例包括，但不限于：用于维持适当组合物pH值的缓冲剂类(例如，柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液等)，载体蛋白类(如人血清白蛋白)，盐水，多元醇类(例如，海藻糖、蔗糖、木糖醇、山梨糖醇等)，表面活性剂类(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯酸酯(polyoxolate)等)，抗微生物剂类，和抗氧化剂类。
[0280] 在一些实施例，本发明提供了治疗疾病、病症或病况的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ib2)、(Ib3)、(Ib4)、(Ib5)、(Ib6)、(Ic)、(Ic1)、(Id)、(Ie)、(Ie1)、(1e2)、或(If)的化合物或其药物组合物。
[0281] 在一些实施例，本发明提供了预防疾病、病症或病况的方法，包括向患有所述病症的患者施用预防有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ib2)、(Ib3)、(Ib4)、(Ib5)、(Ib6)、(Ic)、(Ic1)、(Id)、(Ie)、(Ie1)、(1e2)、或(If)的化合物或其药物组合物。
[0282] 在一些实施例，本发明提供了治疗或预防选自由以下组成的组的疾病、病症、或病况的方法：增殖性疾病，神经退行性疾病，免疫性疾病，自身免疫性疾病，炎性疾病，皮肤病，代谢性疾病，心血管疾病，和胃肠道疾病。
[0283] 本发明提供了调节细胞中LDLR(低密度脂蛋白受体)蛋白表达或胆固醇外排的方法，其包含使所述细胞与抗体药物偶联物(ADC)接触，其中所述ADC包含靶向所述细胞的抗体，环糊精，和LXR激动剂。
[0284] 所述增殖性疾病可以是技术人员已知的任何增殖性疾病。在某些实施方案，所述增殖性疾病包括但不限于肿瘤学疾病，其中所述肿瘤学疾病可以是技术人员已知的任何癌症疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防黑素瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防转移性黑素瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防肺癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防EGFR-酪氨酸激酶抑制剂抗性肺癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防口腔癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防口腔鳞状细胞癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防前列腺癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防霍奇金淋巴瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防乳腺癌的方法。
[0285] 所述神经退行性疾病可以是技术人员已知的任何神经退行性疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防阿尔茨海默病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防帕金森病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防亨廷顿病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防肌萎缩性侧索硬化症的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防髓磷脂基因表达的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防髓鞘化和再髓鞘化病况、疾病或病症的方法。
[0286] 所述免疫疾病可以是技术人员已知的任何免疫疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防炎症性肠病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防溃疡性结肠炎的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防克罗恩病的方法。
[0287] 所述炎性疾病可以是技术人员已知的任何炎性疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防关节炎的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防类风湿性关节炎的方法。
[0288] 所述代谢性疾病可以是技术人员已知的任何代谢疾病。在某些实施方案，血脂异常选自由以下组成的组：高脂血症，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，高脂蛋白血症，HDL缺乏症，ApoA-I缺乏症，和心血管疾病例如冠状动脉疾病(包括，例如，治疗和预防心绞痛、心肌梗塞、和心源性猝死)；动脉粥样硬化(包括，例如，治疗和预防动脉粥样硬化)；和再狭窄(包括，例如，预防或治疗由于诸如气囊血管成形术之类的医疗程序而形成的动脉粥样硬化斑块)。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防糖尿病的方法。
[0289] 所述心血管疾病可以是技术人员已知的任何心血管疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防动脉粥样硬化的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防源自异常巨噬细胞加工的动脉粥样硬化的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防源自氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)形成的动脉粥样硬化的方法，其中巨噬细胞不能加工氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防缺血性心脏病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防中风的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防高血压性心脏病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防主动脉瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防心内膜炎的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防外周动脉疾病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防本段提供的任何疾病的组合的方法。
[0290] 在一些实施例，本发明阐述了调节核受体功能的方法。通过非限制性实例，所述功能可选自炎性介质(例如细胞因子、趋化因子)的表达/分泌，胆固醇调节，胆固醇摄入，胆固醇外排，胆固醇氧化、迁移、趋化性，细胞凋亡和坏死，炎性活性，脂质调节，细胞凋亡、迁移、趋化性，基因转录，和蛋白质表达。
[0291] 在一些实施例，本发明阐述了治疗有需要的患者的疾病或病症的方法，所述方法包含向患者施用本发明所述的化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。
[0292] 在一些实施例，本发明阐述了抗体-药物偶联物的方法，所述方法包含以下步骤：在适于在结合剂与化合物之间形成键的条件下，使所述结合剂与连接体-有效负载化合物接触。
[0293] 在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者增殖性疾病、代谢性疾病、炎症或神经退行性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。
[0294] 在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者的疾病、病症、或病况的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。
[0295] 在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者增殖性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。
[0296] 在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者代谢性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。
[0297] 在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者炎症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。
[0298] 在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者神经退行性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。实施例
[0299] 在实施例中列出的是环糊精-(PEG)n连接体，其将抗体与至少三种类型的有效负载连接(参见图1)。在偶联物中使用了两种抗体，即抗HER2抗体和抗PRLR(抗体PRLR Ab)抗体。抗体通过[3+2]点击反应直接与马来酰亚胺-连接体-有效负载连接(参见图13)，或通过叠氮基官能团与DIBAC-连接体-有效负载连接(参见图14)。
[0300] 与不含环糊精基团部分的那些相比，含有环糊精-(PEG)n连接体的偶联物显示较低的计算LogP/LogD值，在反相HPLC上较短的保留时间，以及较好的水溶性，表明较好的亲水性(表8)。所述这些新的连接体-有效负载在组织蛋白酶B测定中也可切割(表8)。此外，这些ADC在体外测定中显示出与不含CD基团部分的那些ADC的生物活性相当的生物活性(表10、11、12)。
[0301] 如本发明使用的，除非另有相反说明，所述方法和实施例中使用的符号和惯例均与当代科学文献(例如，《美国化学学会杂志》或《生物化学杂志》)中使用的那些一致。具体但不限于，以下缩写可用于实施例和整个说明书：
[0302] 通过以下非限制性实施例来阐明本发明的某些实施方案。
[0303] 除非另有明确说明，否则试剂和溶剂均得自商业来源，例如国药集团化学试剂有限公司(Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC))、Sigma-Aldrich、Alfa或其他供应商。
[0304] 在Bruker AVIII 400或Bruker AVIII 500上记录1H NMR和其他NMR光谱。用Nuts软件或MestReNova软件处理数据，测定内标(例如四甲基硅烷(TMS))低磁场的质子位移百万分率(ppm)。
[0305] HPLC-MS测定在Agilent 1200 HPLC/6100 SQ系统上运行，使用以下条件：
[0306] 用于HPLC-MS测定的方法A包括作为流动相：A：水(0.01％三氟乙酸TFA)和B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：5％的B，其在15分钟(min)的时间段内增加至95％的B；流速：1.0mL/min；色谱柱SunFire C18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：模数转换器(ADC)蒸发光散射检测器(ELSD)，二极管阵列检测器(DAD)(214nm和254nm)，电喷雾电离-大气压电离(ES-API)。
[0307] 用于HPLC-MS测定的方法B包括作为流动相：A：水(10mMNH4HCO3)和B：乙腈；梯度相：在15分钟(min)内由5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；色谱柱：XBridge C18，
4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，质量选择检测器(MSD)(ES-API)。
4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，质量选择检测器(MSD)(ES-API)。
[0308] LC-MS测定在Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上运行，使用以下条件：
[0309] 用于LC-MS测定的方法A包含在WATERS 2767仪器上进行；色谱柱：Shimadzu Shim-Pack，PRC-ODS，20x250mm，15μm，两个串联连接；流动相：A：水(0.01％TFA)，B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在3分钟内由5％的B增加至95％的B；流速：1.8-2.3mL/min；色谱柱：SunFire C18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃；检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，ES-API。
[0310] 用于LC-MS测定的方法B包括在Gilson GX-281仪器上进行。色谱柱：Xbridge Prep C18 10um OBD，19x250mm；流动相：A：水(10mMNH4HCO3)，B：乙腈；梯度相：在3分钟内由5％的B增加至95％的B；流速：1.8-2.3mL/min；色谱柱：XBridge C18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，MSD(ES-API)。
[0311] 在GilsonGX-281仪器上以酸性(方法A)或碱性(方法B)溶剂体系进行制备型高压液相色谱(制备型HPLC)。所述酸性溶剂体系采用Waters SunFire 10μmC18柱( 250 x 19mm)，和用于制备型HPLC的溶剂A是水/0.05％TFA，和溶剂B是乙腈。洗脱条件是线性梯度，其在20分钟的时间段内以30mL/min的流速，从5％的溶剂B增至100％的溶剂B。碱性溶剂体系包括Waters Xbridge 10μm C18柱( 250 x 19mm)，和用于制备型HPLC的溶剂A是水/
10mM碳酸氢铵(NH4HCO3)，和溶剂B是乙腈。洗脱条件是线性梯度，其在20分钟的时间段内以
30mL/min的流速，从5％的溶剂B增至100％的溶剂B。
10mM碳酸氢铵(NH4HCO3)，和溶剂B是乙腈。洗脱条件是线性梯度，其在20分钟的时间段内以
30mL/min的流速，从5％的溶剂B增至100％的溶剂B。
[0312] 使用Agela Flash Column silica-CS柱在Biotage仪器上进行快速色谱法；在Biotage仪器上使用Boston ODS或Agela C18柱进行反相快速色谱法。
表1.连接体-有效负载列表
连接体-有效负载 连接体 有效负载
实施例36(Ex36) DIBAC-suc-PEG4-vc-PAB MMAE(1a)
实施例37(Ex37) MAL-Lys(suc-DIBAC-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例38(Ex38) DIBAC-suc-Lys(mc-pip-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例39(Ex39) MAL-PEG4-Lys(COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例40(Ex40) MAL-PEG4-N(suc-DIBAC-CD)Lys-vc-PAB MMAE(1a)
实施例41(Ex41) DIBAC-Suc-PEG4-N(CD-COT)Lys-vc-PAB MMAE(1a)
实施例42(Ex42) BCN-PEG4-Lys(COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例43(Ex43) DIBAC-Suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例44(Ex44) BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例45(Ex45) DIBAC-suc-PEG4-Val-Ala 图1中的1c
实施例46(Ex46) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1b
实施例47(Ex47) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1c
实施例48(Ex48) DIBAC-suc-PEG4-Val-Ala 图1中的1d
实施例49(Ex49) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例50(Ex50) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vcPAB 图1中的1d
实施例51(Ex51) BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例52(Ex52) BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vcPAB 图1中的1e
实施例53(Ex53) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例54(Ex54) BCN-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例55(Ex55) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vcPAB 图1中的1f
实施例56(Ex56) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vcPAB 图1中的1g
实施例57(Ex57) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vcPAB 图1中的1d
实施例58(Ex58) DIBAC-suc-PEG4-vcPAB 图1中的1h
实施例59(Ex59) DIBAC-suc-PEG4-dLys(COT-CD)-vc-PAB 图1中的1h
实施例60(Ex60) BCN-PEG4-dLys(COT-CD)-vc-PAB 图1中的1h
实施例61(Ex61) DIBAC-suc-PEG4-vc-PAB 图1中的1i
实施例62(Ex62) DIBAC-suc-PEG4-dLys(COT-CD)-vc-PAB 图1中的1i
实施例63(Ex63) DIBAC-suc-PEG4-dLys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1i
表2A.连接体-有效负载的结构式
表2b.连接体-有效负载的cLogP
+≤-6；-6<++≤-3；-3<+++≤1；1<++++≤5；5<+++++≤9.5
表3a.连接体-有效负载的分析结果
表3b.连接体-有效负载的分析结果
表1.连接体-有效负载列表
连接体-有效负载 连接体 有效负载
实施例36(Ex36) DIBAC-suc-PEG4-vc-PAB MMAE(1a)
实施例37(Ex37) MAL-Lys(suc-DIBAC-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例38(Ex38) DIBAC-suc-Lys(mc-pip-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例39(Ex39) MAL-PEG4-Lys(COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例40(Ex40) MAL-PEG4-N(suc-DIBAC-CD)Lys-vc-PAB MMAE(1a)
实施例41(Ex41) DIBAC-Suc-PEG4-N(CD-COT)Lys-vc-PAB MMAE(1a)
实施例42(Ex42) BCN-PEG4-Lys(COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例43(Ex43) DIBAC-Suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例44(Ex44) BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vc-PAB MMAE(1a)
实施例45(Ex45) DIBAC-suc-PEG4-Val-Ala 图1中的1c
实施例46(Ex46) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1b
实施例47(Ex47) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1c
实施例48(Ex48) DIBAC-suc-PEG4-Val-Ala 图1中的1d
实施例49(Ex49) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例50(Ex50) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vcPAB 图1中的1d
实施例51(Ex51) BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例52(Ex52) BCN-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-vcPAB 图1中的1e
实施例53(Ex53) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(PEG4-COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例54(Ex54) BCN-PEG4-D-Lys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1d
实施例55(Ex55) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vcPAB 图1中的1f
实施例56(Ex56) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vcPAB 图1中的1g
实施例57(Ex57) DIBAC-suc-PEG4-D-Lys(COT-CD)-vcPAB 图1中的1d
实施例58(Ex58) DIBAC-suc-PEG4-vcPAB 图1中的1h
实施例59(Ex59) DIBAC-suc-PEG4-dLys(COT-CD)-vc-PAB 图1中的1h
实施例60(Ex60) BCN-PEG4-dLys(COT-CD)-vc-PAB 图1中的1h
实施例61(Ex61) DIBAC-suc-PEG4-vc-PAB 图1中的1i
实施例62(Ex62) DIBAC-suc-PEG4-dLys(COT-CD)-vc-PAB 图1中的1i
实施例63(Ex63) DIBAC-suc-PEG4-dLys(COT-CD)-Val-Ala 图1中的1i
表2A.连接体-有效负载的结构式
表2b.连接体-有效负载的cLogP
+≤-6；-6<++≤-3；-3<+++≤1；1<++++≤5；5<+++++≤9.5
表3a.连接体-有效负载的分析结果
表3b.连接体-有效负载的分析结果
[0313] 实施例1-6描述了某些化合物的制备，这些化合物尤其可用于合成本发明所述连接体、连接体-有效负载和/或偶联物的合成中间体。实施例1
中间体5a的制备(参见图2)
(2R)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-炔-2-
基}-4-氧丁酰胺基)-2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]己酸(5a)
中间体5a的制备(参见图2)
(2R)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-炔-2-
基}-4-氧丁酰胺基)-2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]己酸(5a)
[0314] 室温下，向H-D-Lys(Boc)-OH(11a，0.25g，1.0mmol)的DMF(10mL)混合物中依次加入6-马来酰亚胺基己酸-NHS(10a，0.31g，1.0mmol)和DIPEA(0.26g，2.0mmol)。反应在室温下搅拌过夜，直至化合物11a完全耗尽，通过LCMS进行监测。混合物经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液(0.05％TFA))直接分离，得到中间体Boc-12a(ESI m/z:440(M+H)+)为无色油状物，将其溶于DCM(5mL)。在0℃下，向所得溶液中滴加TFA(0.5mL)，并将混合物在室温下搅拌1小时。反应通过LCMS监测，直至中间体Boc-12a完全耗尽。真空浓缩除去挥发物，得到粗品12a(ESI m/z:340(M/2+H)+)，其无需进一步纯化即可用于下一步骤。在室温下，向粗品化合物12a(0.21g，0.62mmol)的DMF(5mL)混合物中依次加入活化酯10b(0.20g，
0.50mmol)和DIPEA(50mg，0.39mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜之后，化合物12a完全耗尽，通过LCMS进行监测。然后反应混合物经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液)直接+ 1
分离，得到化合物5a(0.10g，从10a开始的3步收率为20％)为白色固体。ESI m/z:627(M+H) 。H NMR(DMSOd6,400MHz):δ7.89(d,J＝13.2Hz,1H),7.69-7.62(m,3H),7.48-7.47(m,3H),7.36-
7.28(m,3H),6.99(s,2H),5.03(d,J＝13.6Hz,1H),4.09-4.04(m,1H),3.60(d,J＝13.6Hz,
1H),3.38-3.34(m,1H),2.90-2.87(m,2H),2.61-2.55(m,1H),2.25-2.17(m,1H),2.08-1.51(m,5H),1.46-1.15(m,12H)ppm。
实施例2
中间体5b的制备(参见图2)
(2S)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-炔-2-
基}-4-氧丁酰胺基)-2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]己酸(5b)
0.50mmol)和DIPEA(50mg，0.39mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜之后，化合物12a完全耗尽，通过LCMS进行监测。然后反应混合物经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液)直接+ 1
分离，得到化合物5a(0.10g，从10a开始的3步收率为20％)为白色固体。ESI m/z:627(M+H) 。H NMR(DMSOd6,400MHz):δ7.89(d,J＝13.2Hz,1H),7.69-7.62(m,3H),7.48-7.47(m,3H),7.36-
7.28(m,3H),6.99(s,2H),5.03(d,J＝13.6Hz,1H),4.09-4.04(m,1H),3.60(d,J＝13.6Hz,
1H),3.38-3.34(m,1H),2.90-2.87(m,2H),2.61-2.55(m,1H),2.25-2.17(m,1H),2.08-1.51(m,5H),1.46-1.15(m,12H)ppm。
实施例2
中间体5b的制备(参见图2)
(2S)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-炔-2-
基}-4-氧丁酰胺基)-2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]己酸(5b)
[0315] 根据实施例1中的中间体5a的制备方法，不同之处在于用H-L-Lys(Boc)-OH(11b)代替H-D-Lys(Boc)-OH(11a)，得到中间体5b(0.16g，从11b开始的收率为19％)为白色固体。ESI m/z:627(M+H)+。1H NMR(DMSOd6,400MHz)δ7.94-7.15(m,10H),6.99(s,2H),5.02(d,J＝
14.0Hz,1H),4.09-4.04(m,1H),3.60(d,J＝14.0Hz,1H),3.38-3.34(m,1H),2.91-2.86(m,
2H),2.58-2.54(m,1H),2.23-2.18(m,1H),2.07-2.04(m,2H),1.98-1.92(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.63-1.58(m,1H),1.47-1.12(m,12H)ppm。
实施例3
中间体5c的制备(参见图2)
(2R)-2-氨基-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-
炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)己酸(12c)
14.0Hz,1H),4.09-4.04(m,1H),3.60(d,J＝14.0Hz,1H),3.38-3.34(m,1H),2.91-2.86(m,
2H),2.58-2.54(m,1H),2.23-2.18(m,1H),2.07-2.04(m,2H),1.98-1.92(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.63-1.58(m,1H),1.47-1.12(m,12H)ppm。
实施例3
中间体5c的制备(参见图2)
(2R)-2-氨基-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-
炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)己酸(12c)
[0316] 室温下，向商购的H-D-Lys(Fmoc)-OH(11c，0.55g，1.5mmol)的干燥DMF(3.0mL)混合物中依次加入DIPEA(0.38g，3.0mmol)和化合物10b(参见，Accounts of Chemical Research,2011,805-815)(0.60g，1.5mmol)。所得溶液在室温下搅拌2小时，直至通过LCMS监测，化合物11c完全耗尽。然后混合物经反相快速色谱法(0-80％乙腈的水溶液)纯化，得到中间体Fmoc-12c(0.48g，49％收率)为白色固体。ESI m/z:656.3(M+H)+。向中间体Fmoc-
12c(0.15g，0.23mmol)的DMF(3mL)混合物中加入二乙胺(0.1mL)。混合物在室温下搅拌1小时，LCMS显示Fmoc-12c完全耗尽。将混合物过滤，滤液经制备型HPLC纯化(方法B)，得到化合物12c(42mg，42％收率)为白色固体。ESI m/z:434(M+H)+。1H NMR(DMSOd6,400MHz)δ7.71-
7.60(m,3H),7.50-7.42(m,3H),7.39-7.27(m,3H),5.02(d,J＝14.0Hz,1H),3.60(d,J＝
14.0Hz,1H),3.08-3.07(m,1H),2.89-2.88(m,2H),2.61-2.52(m,1H),2.25-2.17(m,1H),
2.00-1.96(m,1H),1.80-1.72(m,1H),1.65-1.62(m,1H),1.52-1.44(m,1H),1.23-1.21(m,
5H)ppm。
(2R)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-炔-2-
基}-4-氧丁酰胺基)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]己酸(5c)
12c(0.15g，0.23mmol)的DMF(3mL)混合物中加入二乙胺(0.1mL)。混合物在室温下搅拌1小时，LCMS显示Fmoc-12c完全耗尽。将混合物过滤，滤液经制备型HPLC纯化(方法B)，得到化合物12c(42mg，42％收率)为白色固体。ESI m/z:434(M+H)+。1H NMR(DMSOd6,400MHz)δ7.71-
7.60(m,3H),7.50-7.42(m,3H),7.39-7.27(m,3H),5.02(d,J＝14.0Hz,1H),3.60(d,J＝
14.0Hz,1H),3.08-3.07(m,1H),2.89-2.88(m,2H),2.61-2.52(m,1H),2.25-2.17(m,1H),
2.00-1.96(m,1H),1.80-1.72(m,1H),1.65-1.62(m,1H),1.52-1.44(m,1H),1.23-1.21(m,
5H)ppm。
(2R)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,13,15-六烯-10-炔-2-
基}-4-氧丁酰胺基)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]己酸(5c)
[0317] 室温下，向化合物12c(40mg，92μmol)的DMF(2mL)混合物中依次加入化合物4d(41mg，0.11mmol)和TEA(18mg，0.18mmol)的DMF溶液。混合物在室温下搅拌1小时后，通过LCMS监测，大部分化合物4d已耗尽。然后所得混合物经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液)直接分离，得到中间体5c(33mg，47％收率)为浅黄色油状物。ESI m/z:761(M+H)+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.96(d,J＝12.8Hz,1H),7.69-7.62(m,3H),7.51-7.30(m,6H),7.02(s,2H),5.04(d,J＝14.4Hz,1H),4.06(m,1H),3.62-3.46(m,18H),2.89(m,2H),2.63-2.57(m,4H),2.39-2.19(m,3H),2.01-1.20(m,6H)ppm。实施例4
中间体6b的制备(参见图3)
[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-
2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]
2
四十二烷-5-基]甲基4-甲基苯-1-磺酸酯(14)
中间体6b的制备(参见图3)
[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-
2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]
2
四十二烷-5-基]甲基4-甲基苯-1-磺酸酯(14)
[0318] 室温下，向α-环糊精(13，10g，10mmol)的干燥吡啶(Py)(0.32L)溶液中加入4-甲苯磺酰氯(TsCl)(20g，0.10mol)。混合物在此温度下搅拌15分钟，并立即用水(60mL)淬灭。将反应混合物减压浓缩以除去挥发物(吡啶和水)。所得残余物经反相快速色谱法纯化(0-25％乙腈的水溶液)，得到产物14(1.1g，10％收率)为白色固体。ESI m/z:1127(M+H)+。
5,10,15,20,25-五(羟甲基)-30-(哌嗪-1-基甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,
29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42-十二醇(6b)
5,10,15,20,25-五(羟甲基)-30-(哌嗪-1-基甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,
29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42-十二醇(6b)
[0319] 将化合物14(1.2g，1.0mmol)的哌嗪(1.7g，20mmol)混合物密封，并在120℃下搅拌16小时。将反应冷却至室温后，混合物用DMF(3mL)和乙腈(30mL)稀释。通过过滤收集沉淀物，然后将粗产物经制备型HPLC纯化(方法B)，得到中间体6b(0.32g，30％收率)为白色固体。ESI m/z:1041(M+H)+。
实施例5
中间体7a的制备(参见图4)
(2R)-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}
己酸(7a)
实施例5
中间体7a的制备(参见图4)
(2R)-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}
己酸(7a)
[0320] 向商购化合物17(65mg，0.23mmol，CAS：1425803-45-7)的DMF(2mL)混合物中加入Fmoc-D-Lys-OH(15a，85mg，0.23mmol)和三乙胺(52mg，0.51mmol)。反应混合物在室温下搅拌30分钟。所得混合物经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液(0.05％TFA))直接分离，得到中间体7a(85mg，70％收率)为白色固体。ESI m/z:533(M+H)+。1H NMR(MeODd4,500MHz):δ7.70(d,J＝7.5Hz,2H),7.59(t,J＝8.0Hz,2H),7.30(t,J＝7.5Hz,2H),7.22(t,J＝7.4Hz,
2H),4.35-4.22(m,2H),4.22-4.09(m,2H),4.09-3.99(m,1H),3.94-3.81(m,1H),3.79-3.67(m,1H),3.15(t,J＝6.9Hz,2H),2.17-1.96(m,3H),1.96-1.86(m,1H),1.85-1.66(m,4H),
1.66-1.41(m,5H),1.41-1.25(m,3H)ppm。
实施例6
中间体7b的制备(参见图4)
(R)-26-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-2,2-二甲基-4,20-二氧-3,8,11,14,17-
五氧杂-5,21-二氮杂二十七烷-27-羧酸(16)
2H),4.35-4.22(m,2H),4.22-4.09(m,2H),4.09-3.99(m,1H),3.94-3.81(m,1H),3.79-3.67(m,1H),3.15(t,J＝6.9Hz,2H),2.17-1.96(m,3H),1.96-1.86(m,1H),1.85-1.66(m,4H),
1.66-1.41(m,5H),1.41-1.25(m,3H)ppm。
实施例6
中间体7b的制备(参见图4)
(R)-26-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-2,2-二甲基-4,20-二氧-3,8,11,14,17-
五氧杂-5,21-二氮杂二十七烷-27-羧酸(16)
[0321] 向化合物10c(4.6g，10mmol，CAS：859230-20-9)的DMF(10mL)混合物中加入15a(3.6g，10mmol)和三乙胺(2.0g，20mmol)。反应混合物在25℃下搅拌1小时，直至通过TLC监测化合物15a完全耗尽。混合物用DCM稀释，然后用水和盐水洗。有机层经无水硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法(0-5％甲醇的DCM溶液)纯化，得到16(5.5g，77％收率)为无色油状物。ESI m/z:716.2(M+H)+。1H NMR(DMSOd6,500MHz)δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.84-7.80(m,1H),7.74-7.72(d,J＝7.5Hz,2H),7.61-7.59(m,1H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),
7.33(t,J＝7.5Hz,2H),6.76-6.74(m,1H),4.28-4.21(m,3H),3.93-3.85(m,1H),3.58(t,J＝6.5Hz,2H),3.48-3.47(m,12H),3.16(d,J＝5.5Hz,1H),3.07-2.97(m,3H),2.28(t,J＝
6.5Hz,2H),2.02-1.94(m,1H),1.71-1.56(m,2H),1.36(s,9H),1.23-1.15(m,6H)ppm。
(24R)-24-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-1-(环辛-2-炔基氧基)-2,18-二氧-6,
9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十五烷-25-羧酸(7b)
7.33(t,J＝7.5Hz,2H),6.76-6.74(m,1H),4.28-4.21(m,3H),3.93-3.85(m,1H),3.58(t,J＝6.5Hz,2H),3.48-3.47(m,12H),3.16(d,J＝5.5Hz,1H),3.07-2.97(m,3H),2.28(t,J＝
6.5Hz,2H),2.02-1.94(m,1H),1.71-1.56(m,2H),1.36(s,9H),1.23-1.15(m,6H)ppm。
(24R)-24-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-1-(环辛-2-炔基氧基)-2,18-二氧-6,
9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十五烷-25-羧酸(7b)
[0322] 在0℃下，向化合物16(0.60g，0.84mmol)的DCM(10mL)溶液中加入三氟乙酸(2.0mL)。将反应溶液加热并在25℃下搅拌过夜，直至通过LCMS监测(ESI m/z:616.3(M+H)+)化合物16完全耗尽。真空浓缩除去挥发物，得到粗品15b，其可直接用于下一步骤。
[0323] 根据实施例5中制备中间体7a的方法，不同之处在于用15b代替15a，通过硅胶柱色谱法纯化(0-5％甲醇的DCM溶液)得到标题化合物7b(0.38g，49％收率)为无色油状物。ESI m/z:780.3(M+H)+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.61(t,J＝7.6Hz,2H),7.39(t,J＝7.6Hz,2H),7.32-7.27(m,2H),7.05-7.01(m,1H),6.86-6.83(m,1H),5.85(d,J＝7.6Hz,1H),4.38-4.37(m,3H),4.27-4.15(m,2H),4.11-4.05(m,1H),3.91-3.87(m,1H),
3.69(t,J＝5.6Hz,2H),3.62-3.47(m,17H),3.28-3.19(m,2H),2.46(t,J＝5.6Hz,2H),
2.27-2.01(m,3H),1.91-1.72(m,5H),1.66-1.55(m,4H),1.42-1.34(m,3H)ppm。
实施例7
一般方法A(参见图5)：
3.69(t,J＝5.6Hz,2H),3.62-3.47(m,17H),3.28-3.19(m,2H),2.46(t,J＝5.6Hz,2H),
2.27-2.01(m,3H),1.91-1.72(m,5H),1.66-1.55(m,4H),1.42-1.34(m,3H)ppm。
实施例7
一般方法A(参见图5)：
[0324] 室温下，通过注射器向Fmoc-vc-PAB-PNP(2a，0.68-1.0当量)和化合物1(1e、1f、1g、1h、1i或1m，1.0当量)的DMF溶液中注射加入DIPEA(5当量)。混合物在25℃下搅拌16-24小时，根据LCMS监测大部分2a已耗尽。向所得混合物中加入哌啶(0.1-1mL，过量)，将其在25℃下搅拌2小时，直至通过LCMS进行监测已完全脱去Fmoc。通过膜过滤后，将滤液直接经制备型HPLC纯化(方法B)，得到化合物3(32-73％收率)为白色固体。表4提供了制备化合物3e-
3g、3H和3I的具体反应条件。
表4
Pip.*＝哌啶；纯化*:制备型HPLC方法；**:具有相同当量的HOBt。
实施例8
一般方法B(参见图6)：
3g、3H和3I的具体反应条件。
表4
Pip.*＝哌啶；纯化*:制备型HPLC方法；**:具有相同当量的HOBt。
实施例8
一般方法B(参见图6)：
[0325] 在25℃下，向酸(Fmoc-Val-Ala-OH(2b)、Fmoc-dLys(COT)-OH(7a)或Fmoc-dLys(PEG4-COT)-OH(7b)，1.0-1.8当量)的DMF溶液(或8a的DCM/THF溶液)中加入HATU(1.0-2.8当量)和DIPEA或TEA(2.0-5.0当量)。在25℃下，将混合物搅拌30分钟后，通过注射器加入胺(1b-d、1i或3a-I，1.0当量)的DMF(1mL)溶液。所得混合物在25℃下搅拌2-24小时，直至根据LCMS监测大部分胺已耗尽。然后向混合物中加入哌啶或二乙胺(过量)，将混合物在25℃下搅拌1-20小时，直至通过LCMS监测已完全脱去Fmoc。将反应混合物通过膜过滤，滤液经制备型HPLC(方法B)或反相快速色谱法直接纯化，得到化合物3b-d或8a-J(23-80％收率)为白色固体。表5.根据一般方法B合成化合物3b-d、3J和8a-L的反应条件
对于纯化方法-B：制备型HPLC方法B；A：制备型HPLC方法A；RP：RP-快速色谱法；RP-B：
RP-快速色谱法方法B；RP-A:RP-快速色谱法方法A。
S**:DCM/THF＝4/8(mL)
*:步骤1中40％产物用于步骤32。
实施例9
化合物3a的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(3a)
(参见WO2012/166560，通过引用其全部内容并入本发明)
对于纯化方法-B：制备型HPLC方法B；A：制备型HPLC方法A；RP：RP-快速色谱法；RP-B：
RP-快速色谱法方法B；RP-A:RP-快速色谱法方法A。
S**:DCM/THF＝4/8(mL)
*:步骤1中40％产物用于步骤32。
实施例9
化合物3a的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(3a)
(参见WO2012/166560，通过引用其全部内容并入本发明)
[0326] 向25mL圆底烧瓶中加入Fmoc-vc-PAB-PNP(2a)(0.33g，0.43mmol)和无水DMF(5mL)。在25℃下，向溶液中依次加入MMAE(1a，0.21g，0.21mmol)，HOBt(38mg，0.28mmol)和DIPEA(74mg，0.57mmol)。混合物在25-30℃下搅拌16小时，直至根据LCMS监测MMAE完全耗尽。将反应混合物通过膜过滤，滤液经制备型HPLC纯化(方法A)，得到Fmoc-3a为白色固体，将其溶于DMF(5mL)。向溶液中加入二乙胺(0.3mL)。反应混合物在30℃下搅拌1小时，直至根据LCMS监测已脱去Fmoc。将反应混合物通过膜过滤，滤液经制备型HPLC纯化(方法A)，得到vcPAB-MMAE(3a)(0.20g，58％收率)为白色固体。ESI m/z:562.5(M/2+H)+。
实施例10
化合物3b的制备(参见图6和表5)
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-
二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺基(3b)
实施例10
化合物3b的制备(参见图6和表5)
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-
二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺基(3b)
[0327] 根据一般方法B，得到化合物3b(60mg，23％收率)为白色固体。ESI m/z:692(M+H)+。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.90-8.77(m,1H),7.87(t,J＝7.9Hz,1H),7.48-7.36(m,2H),7.26-7.20(m,1H),6.88-6.81(m,2H),6.30-6.25(m,1H),6.05-6.00(m,1H),5.21-5.17(m,1H),
5.06-5.00(m,0.5H),4.96-4.90(m,1H),4.73-4.54(m,2.5H),4.53-4.46(m,1H),3.33-3.28(m,1H),2.95-2.90(m,1H),2.62-2.52(m,1H),2.39-2.28(m,2H),2.22-2.03(m,4H),1.85-
1.51(m,10H),1.48-1.34(m,5H),1.21-1.10(m,2H),1.03-0.89(m,9H),0.86-0.75(m,3H)ppm。
实施例11
化合物3c的制备(参见图6和表5)
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,
2,9 4,8 13,18
13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十烷-14,17-二烯-
8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺(3c)
5.06-5.00(m,0.5H),4.96-4.90(m,1H),4.73-4.54(m,2.5H),4.53-4.46(m,1H),3.33-3.28(m,1H),2.95-2.90(m,1H),2.62-2.52(m,1H),2.39-2.28(m,2H),2.22-2.03(m,4H),1.85-
1.51(m,10H),1.48-1.34(m,5H),1.21-1.10(m,2H),1.03-0.89(m,9H),0.86-0.75(m,3H)ppm。
实施例11
化合物3c的制备(参见图6和表5)
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,
2,9 4,8 13,18
13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十烷-14,17-二烯-
8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺(3c)
[0328] 根据一般方法B，得到化合物3c(36mg，28％收率)为白色固体。ESIm/z:692(M+H)+。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.94-8.83(m,1H),7.93-7.84(m,1H),7.49-7.38(m,2H),7.24(d,J＝10.1Hz,1H),6.89-6.80(m,2H),6.30-6.24(m,1H),6.03(s,1H),4.99-4.88(m,2H),4.74-
4.55(m,3H),4.51(s,1H),3.31(t,J＝3.9Hz,1H),3.02-2.96(m,1H),2.62-2.52(m,1H),
2.38-2.28(m,2H),2.21-2.03(m,4H),1.80-1.55(m,10H),1.48-1.38(m,5H),1.21-1.09(m,
2H),1.03-0.92(m,9H),0.86-0.76(m,3H)ppm。
实施例12
化合物3d的制备(参见图6和表5)
(1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-N-((1S,4aS,
10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,
3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(3d)
4.55(m,3H),4.51(s,1H),3.31(t,J＝3.9Hz,1H),3.02-2.96(m,1H),2.62-2.52(m,1H),
2.38-2.28(m,2H),2.21-2.03(m,4H),1.80-1.55(m,10H),1.48-1.38(m,5H),1.21-1.09(m,
2H),1.03-0.92(m,9H),0.86-0.76(m,3H)ppm。
实施例12
化合物3d的制备(参见图6和表5)
(1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-N-((1S,4aS,
10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,
3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(3d)
[0329] 根据一般方法B，得到化合物3d(0.88g，67％收率)为白色固体。ESI m/z:699(M+H)+。1
H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ8.40(s,1H),7.47(s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.03(d,J＝
8.3Hz,1H),6.88(d,J＝8.2Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),
4.60-4.48(m,1H),3.22-3.11(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.92-2.76(m,3H),2.74-2.70(m,
1H),2.43-2.31(m,3H),2.28(d,J＝14.1Hz,3H),2.16-1.96(m,3H),1.81(s,1H),1.78-1.65(m,4H),1.53-1.42(m,4H),1.38(d,J＝5.3Hz,6H),1.33-1.22(m,2H),1.14(d,J＝6.6Hz,
6H),1.09(d,J＝18.6Hz,6H)ppm。
实施例13
化合物3e的制备(参见图5和表4)
4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基2-((4bS,8S,8aR)-
8-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基氨基甲酰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基氧基)乙基氨基甲酸酯(3e)
H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ8.40(s,1H),7.47(s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.03(d,J＝
8.3Hz,1H),6.88(d,J＝8.2Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),
4.60-4.48(m,1H),3.22-3.11(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.92-2.76(m,3H),2.74-2.70(m,
1H),2.43-2.31(m,3H),2.28(d,J＝14.1Hz,3H),2.16-1.96(m,3H),1.81(s,1H),1.78-1.65(m,4H),1.53-1.42(m,4H),1.38(d,J＝5.3Hz,6H),1.33-1.22(m,2H),1.14(d,J＝6.6Hz,
6H),1.09(d,J＝18.6Hz,6H)ppm。
实施例13
化合物3e的制备(参见图5和表4)
4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基2-((4bS,8S,8aR)-
8-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基氨基甲酰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基氧基)乙基氨基甲酸酯(3e)
[0330] 根据一般方法A，得到化合物3e(14mg，68％收率)为白色固体。ESI m/z:978(M+1)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.22(s,1H),9.04(s,1H),8.71(d,J＝7.5Hz,1H),8.12(s,2H),7.59(d,J＝8.3Hz,2H),7.42(t,J＝5.4Hz,1H),7.29(d,J＝8.2Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),6.84-6.76(m,2H),6.67(d,J＝8.4Hz,1H),6.64(s,1H),6.51(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.12(s,1H),5.52(s,2H),4.96(s,2H),4.51(d,J＝5.1Hz,1H),3.92(s,2H),3.66(d,J＝5.7Hz,
1H),3.32(d,J＝5.6Hz,2H),3.13-2.63(m,6H),2.26(d,J＝7.2Hz,2H),2.22-2.03(m,4H),
1.89-1.82(m,4H),1.79-1.69(m,1H),1.68-1.53(m,4H),1.46-1.40(m,2H),1.27(d,J＝
3.3Hz,8H),1.19-1.08(m,4H),1.03-0.89(m,12H)ppm。
实施例14
化合物3f的制备(参见图5和表4)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,
10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(3f)
1H),3.32(d,J＝5.6Hz,2H),3.13-2.63(m,6H),2.26(d,J＝7.2Hz,2H),2.22-2.03(m,4H),
1.89-1.82(m,4H),1.79-1.69(m,1H),1.68-1.53(m,4H),1.46-1.40(m,2H),1.27(d,J＝
3.3Hz,8H),1.19-1.08(m,4H),1.03-0.89(m,12H)ppm。
实施例14
化合物3f的制备(参见图5和表4)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,
10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(3f)
[0331] 根据一般方法A，得到化合物3f(85mg，32％收率)为白色固体。ESI m/z:991(M+1)+。1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ8.40(s,1H,酰亚胺啶的NH),7.58(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(s,1H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.30(d,J＝7.5Hz,1H),7.02(d,J＝8.3Hz,1H),6.88(d,J＝8.3Hz,
1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.2,2.5Hz,1H),5.10(s,2H),4.66-4.52(m,1H),
3.92(s,2H),3.75(d,J＝5.7Hz,1H),3.26-2.75(m,6H),2.42-2.22(m,7H),2.14-1.59(m,
11H),1.40(t,J＝15.9Hz,8H),1.34-1.27(m,3H),1.16-1.12(m,6H),1.10(d,J＝6.9Hz,
3H),1.07(d,J＝6.9Hz,3H)ppm。
实施例15
化合物3g的制备(参见图5和表4)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,
4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-
3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯(3g)
1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.2,2.5Hz,1H),5.10(s,2H),4.66-4.52(m,1H),
3.92(s,2H),3.75(d,J＝5.7Hz,1H),3.26-2.75(m,6H),2.42-2.22(m,7H),2.14-1.59(m,
11H),1.40(t,J＝15.9Hz,8H),1.34-1.27(m,3H),1.16-1.12(m,6H),1.10(d,J＝6.9Hz,
3H),1.07(d,J＝6.9Hz,3H)ppm。
实施例15
化合物3g的制备(参见图5和表4)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,
4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-
3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯(3g)
[0332] 根据一般方法A，得到化合物3g(22mg，40％收率)为白色固体。ESI m/z:1021(M+1)+。1
H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.02(s,1H),9.82(s,1H),9.00(s,1H),8.69-8.65(m,1H),8.11-
8.00(m,4H),7.65-7.53(m,3H),7.40-7.30(m,3H),7.30-7.20(m,1H),6.96(d,J＝8.0Hz,
1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.65-6.61(m,1H),6.50(dd,J＝8.0Hz,2.0Hz,1H),6.00-5.95(m,1H),5.48(s,2H),5.00-4.95(m,3H),4.60-4.40(m,1H),4.25-4.20(m,1H),3.65-3.55(m,4H),3.15-2.55(m,10H),2.40-2.20(m,3H),2.20-2.00(m,5H),2.00-1.80(m,4H),1.86-
1.55(m,6H),1.27(d,J＝4.8Hz,9H),1.20-1.10(m,2H),0.97-0.90(m,6H)ppm。
实施例15-A
化合物3H的制备-参见图5和表4
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(3H)
H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.02(s,1H),9.82(s,1H),9.00(s,1H),8.69-8.65(m,1H),8.11-
8.00(m,4H),7.65-7.53(m,3H),7.40-7.30(m,3H),7.30-7.20(m,1H),6.96(d,J＝8.0Hz,
1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.65-6.61(m,1H),6.50(dd,J＝8.0Hz,2.0Hz,1H),6.00-5.95(m,1H),5.48(s,2H),5.00-4.95(m,3H),4.60-4.40(m,1H),4.25-4.20(m,1H),3.65-3.55(m,4H),3.15-2.55(m,10H),2.40-2.20(m,3H),2.20-2.00(m,5H),2.00-1.80(m,4H),1.86-
1.55(m,6H),1.27(d,J＝4.8Hz,9H),1.20-1.10(m,2H),0.97-0.90(m,6H)ppm。
实施例15-A
化合物3H的制备-参见图5和表4
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(3H)
[0333] 根据实施例7中所述的一般方法，得到化合物3H(127mg，73％收率)为白色固体。ESI m/z:871(M+1)+。
实施例15-B
化合物3I的制备-参见图5和表4
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-
2,9 4,8 13,18
16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧
乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(3I)
实施例15-B
化合物3I的制备-参见图5和表4
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}
甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-
2,9 4,8 13,18
16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧
乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(3I)
[0334] 根据实施例7中所述的一般方法，得到化合物3I(80mg，64％收率)为白色固体。ESI m/z:963(M+1)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.22(s,1H),9.57(s,1H),8.69(d,J＝7.5Hz,1H),8.08(s,3H),7.61(d,J＝6.8Hz,2H),7.36(d,J＝6.8Hz,3H),7.27(d,J＝8.0Hz,1H),
7.22-7.00(m,1H),6.84(d,J＝7.2Hz,2H),6.30(dd,J＝8.0Hz,1.6Hz,1H),6.11(s,1H),
6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,1H),5.52(s,1H),5.48(s,1H),5.16-5.05(m,3H),4.88-
4.80(m,1H),4.80-4.76(m,1H),4.75-4.70(m,1H),4.55-4.48(m,1H),4.25-4.20(m,1H),
3.70-3.60(m,1H),3.12-2.90(m,2H),2.70-2.55(m,1H),2.40-2.20(m,1H),2.15-2.00(m,
3H),1.86-1.75(m,1H),1.75-1.65(m,1H),1.64-1.54(m,5H),1.49(s,4H),1.46-1.34(m,
4H),0.97-0.91(m,5H),0.90-0.85(m,4H),0.85-0.80(m,3H)ppm。
实施例15-C
化合物3J的制备-参见图6
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二
氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺TFA盐(3J)
7.22-7.00(m,1H),6.84(d,J＝7.2Hz,2H),6.30(dd,J＝8.0Hz,1.6Hz,1H),6.11(s,1H),
6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,1H),5.52(s,1H),5.48(s,1H),5.16-5.05(m,3H),4.88-
4.80(m,1H),4.80-4.76(m,1H),4.75-4.70(m,1H),4.55-4.48(m,1H),4.25-4.20(m,1H),
3.70-3.60(m,1H),3.12-2.90(m,2H),2.70-2.55(m,1H),2.40-2.20(m,1H),2.15-2.00(m,
3H),1.86-1.75(m,1H),1.75-1.65(m,1H),1.64-1.54(m,5H),1.49(s,4H),1.46-1.34(m,
4H),0.97-0.91(m,5H),0.90-0.85(m,4H),0.85-0.80(m,3H)ppm。
实施例15-C
化合物3J的制备-参见图6
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二
氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺TFA盐(3J)
[0335] 在10℃下，向Boc-Val-Ala-OH(2d，0.31g，1.1mmol)的DMF(15mL)溶液中加入HATU(0.48g，1.3mmol)和DIPEA(0.35g，2.7mmol)。混合物在10℃下搅拌30分钟后，将胺(1i，0.50g，0.90mmol)加至混合物中。反应混合物在10℃下搅拌1小时，直至胺完全耗尽。将混合物用水淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(50％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到Boc-3J，将其溶于DCM(9mL)。在10℃下，向溶液中加入TFA(3mL)。将反应混合物在10℃下搅拌2小时，然后真空浓缩，得到化合物3J(0.53g，84％收率)为TFA盐，其无需进一步纯化即可用于下一步骤。ESI +
m/z:728(M+1) 。
实施例16
化合物8a的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(8a)
m/z:728(M+1) 。
实施例16
化合物8a的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(8a)
[0336] 根据一般方法B，在经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的水溶液(0.05％TFA))后，得到化合物8a(17mg，35％收率)为白色固体。ESI m/z:1415(M+H)+。1H NMR(DMSOd6,400MHz)δ10.09-10.02(m,1H),8.54(d,J＝8.4Hz,1H),8.38(d,J＝7.5Hz,1H),8.35-8.26(m,0.5H),8.12-8.02(m,3H),7.94-7.85(m,0.5H),7.66-7.54(m,3H),7.34-7.23(m,6H),
7.20-7.13(m,1H),6.08-5.97(m,1H),5.54-5.37(m,3H),5.13-4.94(m,2H),4.52-4.21(m,
6H),4.03-3.70(m,4H),3.63-3.51(m,1H),3.25-3.17(m,8H),3.13-2.82(m,10H),2.31-
1.91(m,10H),1.85-1.64(m,9H),1.64-1.25(m,15H),1.07-0.96(m,6H),0.90-0.74(m,26H)ppm。
实施例17
化合物8b的制备(参见图6和表5)
(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-
[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(8b)
7.20-7.13(m,1H),6.08-5.97(m,1H),5.54-5.37(m,3H),5.13-4.94(m,2H),4.52-4.21(m,
6H),4.03-3.70(m,4H),3.63-3.51(m,1H),3.25-3.17(m,8H),3.13-2.82(m,10H),2.31-
1.91(m,10H),1.85-1.64(m,9H),1.64-1.25(m,15H),1.07-0.96(m,6H),0.90-0.74(m,26H)ppm。
实施例17
化合物8b的制备(参见图6和表5)
(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-
[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(8b)
[0337] 根据一般方法B，得到化合物8b(50mg，49％收率)为白色固体。ESI m/z:984(M+1)+。实施例18
化合物8c的制备(参见图6和表5)
(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-
[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(8c)
化合物8c的制备(参见图6和表5)
(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-
[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(8c)
[0338] 根据一般方法B，得到化合物8c(80mg，56％收率)为白色固体。ESI m/z:984(M+1)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.08(s,0.5H),9.46(s,0.5H),8.43(d,J＝7.5Hz,0.5H),8.22(d,J＝7.0Hz,0.5H),8.07-7.91(m,1H),7.61(dd,J＝13.1,6.2Hz,1H),7.56(d,J＝9.0Hz,1H),
7.51(d,J＝9.0Hz,1H),7.32(d,J＝10.1Hz,1H),6.85(d,J＝7.0Hz,2H),6.18(d,J＝
10.0Hz,1H),5.93(s,1H),5.10(d,J＝18.4Hz,1H),4.85-4.66(m,4H),4.46-4.08(m,4H),
3.85-3.17(m,3H),3.09-3.00(m,2H),2.40-1.69(m,15H),1.66-1.48(m,8H),1.45-1.15(m,
15H),1.05-0.94(m,2H),0.91-0.79(m,12H)ppm。
实施例19
化合物8d的制备(参见图6和表5)
(1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-氨基-6-(2-(环辛-2-炔基氧基)乙酰胺
基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-N-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,
2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(8d)
7.51(d,J＝9.0Hz,1H),7.32(d,J＝10.1Hz,1H),6.85(d,J＝7.0Hz,2H),6.18(d,J＝
10.0Hz,1H),5.93(s,1H),5.10(d,J＝18.4Hz,1H),4.85-4.66(m,4H),4.46-4.08(m,4H),
3.85-3.17(m,3H),3.09-3.00(m,2H),2.40-1.69(m,15H),1.66-1.48(m,8H),1.45-1.15(m,
15H),1.05-0.94(m,2H),0.91-0.79(m,12H)ppm。
实施例19
化合物8d的制备(参见图6和表5)
(1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-氨基-6-(2-(环辛-2-炔基氧基)乙酰胺
基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-N-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,
2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(8d)
[0339] 根据一般方法B，得到化合物8d(30mg，47％收率)为白色固体。ESIm/z:991(M+1)+。1
H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.51(d,J＝1.5Hz,1H),7.37(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.02(d,J＝
8.3Hz,1H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),
4.64-4.57(m,1H),4.48(q,J＝7.1Hz,1H),4.33-4.27(m,1H),4.20(d,J＝6.7Hz,1H),3.93(m,2H),3.43(t,J＝6.6Hz,1H),3.24(t,J＝6.9Hz,2H),3.02-2.93(m,2H),2.92-2.76(m,
3H),2.40-2.32(m,2H),2.33-2.23(m,4H),2.22-2.12(m,3H),2.12-2.00(m,5H),1.99-1.91(m,1H),1.91-1.81(m,2H),1.78-1.66(m,6H),1.66-1.58(m,1H),1.58-1.49(m,2H),1.45(d,J＝7.1Hz,6H),1.38(d,J＝4.0Hz,6H),1.34-1.22(m,4H),1.14(d,J＝7.0Hz,6H),1.06-
0.98(m,6H)ppm。
实施例20
化合物8e的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(8e)[0340] 根据一般方法B，得到化合物8e(65mg，62％收率)为白色固体。ESI m/z:1283(M+1)+。
1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.53-7.33(m,3H),7.28-7.14(m,3H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),
6.76(d,J＝8.3Hz,1H),6.60(d,J＝2.5Hz,1H),6.43(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),4.97(s,2H),
4.53-4.46(m,2H),4.41(dd,J＝8.9,5.0Hz,1H),4.18(t,J＝6.0Hz,1H),4.09(d,J＝7.1Hz,
1H),3.92-3.72(m,4H),3.31(t,J＝6.6Hz,1H),3.16-3.05(m,3H),3.06-2.97(m,1H),2.90-
2.62(m,4H),2.27-2.09(m,7H),2.09-1.87(m,7H),1.86-1.68(m,4H),1.66-1.40(m,12H),
1.36-1.22(m,10H),1.20-1.09(m,3H),1.01(s,3H),1.01(s,3H),0.89(t,J＝7.0Hz,6H)
ppm。
实施例21
化合物8f的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,
8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯(8f)
H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.51(d,J＝1.5Hz,1H),7.37(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.02(d,J＝
8.3Hz,1H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),
4.64-4.57(m,1H),4.48(q,J＝7.1Hz,1H),4.33-4.27(m,1H),4.20(d,J＝6.7Hz,1H),3.93(m,2H),3.43(t,J＝6.6Hz,1H),3.24(t,J＝6.9Hz,2H),3.02-2.93(m,2H),2.92-2.76(m,
3H),2.40-2.32(m,2H),2.33-2.23(m,4H),2.22-2.12(m,3H),2.12-2.00(m,5H),1.99-1.91(m,1H),1.91-1.81(m,2H),1.78-1.66(m,6H),1.66-1.58(m,1H),1.58-1.49(m,2H),1.45(d,J＝7.1Hz,6H),1.38(d,J＝4.0Hz,6H),1.34-1.22(m,4H),1.14(d,J＝7.0Hz,6H),1.06-
0.98(m,6H)ppm。
实施例20
化合物8e的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(8e)[0340] 根据一般方法B，得到化合物8e(65mg，62％收率)为白色固体。ESI m/z:1283(M+1)+。
1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.53-7.33(m,3H),7.28-7.14(m,3H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),
6.76(d,J＝8.3Hz,1H),6.60(d,J＝2.5Hz,1H),6.43(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),4.97(s,2H),
4.53-4.46(m,2H),4.41(dd,J＝8.9,5.0Hz,1H),4.18(t,J＝6.0Hz,1H),4.09(d,J＝7.1Hz,
1H),3.92-3.72(m,4H),3.31(t,J＝6.6Hz,1H),3.16-3.05(m,3H),3.06-2.97(m,1H),2.90-
2.62(m,4H),2.27-2.09(m,7H),2.09-1.87(m,7H),1.86-1.68(m,4H),1.66-1.40(m,12H),
1.36-1.22(m,10H),1.20-1.09(m,3H),1.01(s,3H),1.01(s,3H),0.89(t,J＝7.0Hz,6H)
ppm。
实施例21
化合物8f的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,
8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯(8f)
[0341] 根据一般方法B，得到化合物8f(15mg，33％收率)为白色固体。ESI m/z:1313.6(M+H)+。1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.59(d,J＝8.5Hz,2H),7.51(s,1H),7.36-7.26(m,3H),7.01(d,J＝8.5Hz,1H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.72-6.71(m,1H),6.57-6.54(m,1H),5.09(s,2H),4.64-4.52(m,1H),4.35-4.28(m,2H),4.21(d,J＝7.0Hz,1H),4.01-3.98(m,1H),3.88-
3.84(m,3H),3.43(t,J＝6.5Hz,1H),3.26-3.10(m,4H),3.00-2.76(m,3H),2.38-2.24(m,
7H),2.19-2.02(m,9H),1.98-1.78(m,4H),1.74-1.54(m,12H),1.45-1.26(m,14H),1.13(s,
6H),1.00(t,J＝7.5Hz,6H)ppm。
实施例22
化合物8g的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,
6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,
2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(8g)
3.84(m,3H),3.43(t,J＝6.5Hz,1H),3.26-3.10(m,4H),3.00-2.76(m,3H),2.38-2.24(m,
7H),2.19-2.02(m,9H),1.98-1.78(m,4H),1.74-1.54(m,12H),1.45-1.26(m,14H),1.13(s,
6H),1.00(t,J＝7.5Hz,6H)ppm。
实施例22
化合物8g的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,
6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,
2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(8g)
[0342] 根据一般方法B，得到化合物8g(17mg，43％收率)为白色固体。ESI m/z:832.2(M/2+H)+。1H NMR(CH3OHd4,500MHz):δ7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.41-7.30(m,6H),7.25-7.22(m,1H),5.23-5.08(m,2H),4.78-4.50(m,3H),4.33-4.10(m,5H),4.04-3.88(m,2H),3.74(t,J＝6.0Hz,3H),3.65-3.57(m,15H),3.46-3.29(m,9H),3.24-3.12(m,6H),3.01-2.88(m,3H),
2.56-2.44(m,4H),2.30-2.10(m,6H),2.07-1.67(m,14H),1.63-1.32(m,13H),1.21-1.13(m,6H),1.07-0.78(m,26H)ppm。
实施例23
化合物8h的制备(参见图6和表5)
N-[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟
基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,
5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(8h)[0343] 根据一般方法B，得到化合物8h(54mg，50％收率)为白色固体。ESI m/z:620(M/2++ 1
1) 。H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.61-7.48(m,1H),7.35-7.29(m,1H),7.02(d,J＝8.3Hz,1H),
6.88(d,J＝8.3Hz,1H),6.71(d,J＝1.8Hz,1H),6.56(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),4.52-4.44(m,
1H),4.27(dd,J＝21.9,7.2Hz,2H),4.03(dd,J＝15.1,2.4Hz,1H),3.96(dt,J＝22.5,
6.5Hz,1H),3.89(dd,J＝15.1,3.1Hz,1H),3.75(t,J＝5.8Hz,2H),3.64(t,J＝8.6Hz,12H),
3.60-3.54(m,3H),3.44(dd,J＝11.7,5.9Hz,2H),3.23(t,J＝6.7Hz,2H),3.02-2.91(m,
1H),2.91-2.74(m,3H),2.46(t,J＝5.9Hz,2H),2.40-2.31(m,3H),2.26-2.22(m,5H),2.21-
1.79(m,12H),1.77-1.65(m,6H),1.62-1.53(m,3H),1.47-1.43(m,5H),1.38(s,3H),1.37(s,3H),1.33-1.22(m,3H),1.14(s,3H),1.12(s,3H),1.06-0.95(m,6H)ppm。
实施例24
化合物8i的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,
6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(2-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,
2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酸酯(8i)
2.56-2.44(m,4H),2.30-2.10(m,6H),2.07-1.67(m,14H),1.63-1.32(m,13H),1.21-1.13(m,6H),1.07-0.78(m,26H)ppm。
实施例23
化合物8h的制备(参见图6和表5)
N-[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟
基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,
5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(8h)[0343] 根据一般方法B，得到化合物8h(54mg，50％收率)为白色固体。ESI m/z:620(M/2++ 1
1) 。H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.61-7.48(m,1H),7.35-7.29(m,1H),7.02(d,J＝8.3Hz,1H),
6.88(d,J＝8.3Hz,1H),6.71(d,J＝1.8Hz,1H),6.56(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),4.52-4.44(m,
1H),4.27(dd,J＝21.9,7.2Hz,2H),4.03(dd,J＝15.1,2.4Hz,1H),3.96(dt,J＝22.5,
6.5Hz,1H),3.89(dd,J＝15.1,3.1Hz,1H),3.75(t,J＝5.8Hz,2H),3.64(t,J＝8.6Hz,12H),
3.60-3.54(m,3H),3.44(dd,J＝11.7,5.9Hz,2H),3.23(t,J＝6.7Hz,2H),3.02-2.91(m,
1H),2.91-2.74(m,3H),2.46(t,J＝5.9Hz,2H),2.40-2.31(m,3H),2.26-2.22(m,5H),2.21-
1.79(m,12H),1.77-1.65(m,6H),1.62-1.53(m,3H),1.47-1.43(m,5H),1.38(s,3H),1.37(s,3H),1.33-1.22(m,3H),1.14(s,3H),1.12(s,3H),1.06-0.95(m,6H)ppm。
实施例24
化合物8i的制备(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,
6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(2-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,
2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酸酯(8i)
[0344] 根据一般方法B，得到化合物8i(40mg，30％收率)为白色固体。ESI m/z:759(M/2+1)+，1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.01(s,1H),9.00(s,1H),8.24-8.09(m,1H),8.06-7.74(m,
1H),7.64-7.36(m,3H),7.28(d,J＝8.3Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),6.82(d,J＝8.4Hz,
2H),6.68(d,J＝7.6Hz,1H),6.64(s,1H),6.51(d,J＝6.4Hz,1H),6.00(s,1H),5.42(s,1H),
4.96(s,2H),4.39(s,1H),4.28-2.21(m,2H),4.05(s,2H),3.93(t,J＝5.6Hz,2H),3.86-
3.79(m,2H),3.59(t,J＝6.5Hz,2H),3.53-3.47(m,11H),3.43(t,J＝5.9Hz,2H),3.36(s,
6H),3.24(dt,J＝12.8,6.1Hz,3H),3.10-2.91(m,4H),2.85(t,J＝17.2Hz,2H),2.75-2.69(m,2H),2.34-2.10(m,10H),2.10-1.66(m,12H),1.67-1.54(m,8H),1.47-1.24(m,16H),
1.14(t,J＝13.3Hz,2H),1.01(d,J＝11.8Hz,6H),0.88(s,3H)0.84(s,3H)ppm。
实施例24A
化合物8J的制备-(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,
9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(8J)
1H),7.64-7.36(m,3H),7.28(d,J＝8.3Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),6.82(d,J＝8.4Hz,
2H),6.68(d,J＝7.6Hz,1H),6.64(s,1H),6.51(d,J＝6.4Hz,1H),6.00(s,1H),5.42(s,1H),
4.96(s,2H),4.39(s,1H),4.28-2.21(m,2H),4.05(s,2H),3.93(t,J＝5.6Hz,2H),3.86-
3.79(m,2H),3.59(t,J＝6.5Hz,2H),3.53-3.47(m,11H),3.43(t,J＝5.9Hz,2H),3.36(s,
6H),3.24(dt,J＝12.8,6.1Hz,3H),3.10-2.91(m,4H),2.85(t,J＝17.2Hz,2H),2.75-2.69(m,2H),2.34-2.10(m,10H),2.10-1.66(m,12H),1.67-1.54(m,8H),1.47-1.24(m,16H),
1.14(t,J＝13.3Hz,2H),1.01(d,J＝11.8Hz,6H),0.88(s,3H)0.84(s,3H)ppm。
实施例24A
化合物8J的制备-(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,
9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(8J)
[0345] 根据实施例8中所述的一般方法，得到化合物8J(120mg，52％收率)为白色固体。+ 1
ESI m/z:1163(M+1) 。H NMR(400MHz,MeODd4)δ7.65-7.55(m,2H),7.40-7.26(m,3H),6.39-
6.27(m,2H),5.65-5.45(m,1H),5.13-5.01(m,2H),4.71-4.50(m,2H),4.40-4.14(m,4H),
4.11-3.82(m,3H),3.46-3.39(m,1H),3.29-3.09(m,4H),2.76-2.54(m,1H),2.41-2.10(m,
7H),2.09-1.99(m,1H),1.96-1.80(m,5H),1.78-1.21(m,23H),1.06-0.82(m,12H)ppm。
实施例24B
化合物8K的制备-(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,
8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(8K)
ESI m/z:1163(M+1) 。H NMR(400MHz,MeODd4)δ7.65-7.55(m,2H),7.40-7.26(m,3H),6.39-
6.27(m,2H),5.65-5.45(m,1H),5.13-5.01(m,2H),4.71-4.50(m,2H),4.40-4.14(m,4H),
4.11-3.82(m,3H),3.46-3.39(m,1H),3.29-3.09(m,4H),2.76-2.54(m,1H),2.41-2.10(m,
7H),2.09-1.99(m,1H),1.96-1.80(m,5H),1.78-1.21(m,23H),1.06-0.82(m,12H)ppm。
实施例24B
化合物8K的制备-(参见图6和表5)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺
基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,
8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(8K)
[0346] 根据实施例8中所述的一般方法，得到化合物8K(192mg，80％收率)为白色固体。+
ESI m/z:1256(M+1) 。
实施例24C
化合物8L的制备-(参见图6和表5)
(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-
[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(8L)
ESI m/z:1256(M+1) 。
实施例24C
化合物8L的制备-(参见图6和表5)
(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-
[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(8L)
[0347] 根据实施例8中所述的一般方法，得到化合物8L(0.21g，46％收率)为白色固体。ESI m/z:1021(M+1)+。ESI m/z:1021.5(M+H)+.1H NMR(400MHz,MeODd4)δ7.33-7.60(m,3H),
6.87-6.91(m,2H),6.32-6.37(m,2H),5.47-5.65(m,1H),5.07-5.30(m,1H),4.72-4.86(m,
3H),4.34-4.51(m,3H),3.83-4.20(m,3H),3.33-3.49(m,1H),3.14-3.27(m,3H),2.59-2.75(m,1H),1.31-2.39(m,33H),0.93-1.05(m,12H)ppm。
实施例25
制备化合物9a-i和J-L的一般方法C(参见图7)
6.87-6.91(m,2H),6.32-6.37(m,2H),5.47-5.65(m,1H),5.07-5.30(m,1H),4.72-4.86(m,
3H),4.34-4.51(m,3H),3.83-4.20(m,3H),3.33-3.49(m,1H),3.14-3.27(m,3H),2.59-2.75(m,1H),1.31-2.39(m,33H),0.93-1.05(m,12H)ppm。
实施例25
制备化合物9a-i和J-L的一般方法C(参见图7)
[0348] 向炔8a-i、J-L(1.0当量)的相应溶剂的溶液中加入α-环糊精-叠氮化物6a(参见Synth.Commun.,2002,32(21),3367-3372；J.Am.Chem.Soc.,2012,134(46),19108-19117；J.Med.Chem.,1997,40(17),2755-2761；J.Am.Chem.Soc.,1993,115(12),5035-5040)(1.5-
3.0当量)。然后将所得混合物在20-30℃下搅拌16小时至3天，直至通过LCMS监测大部分化合物8耗尽并检测到所需中间体质量。过滤后，所得混合物经制备型HPLC直接纯化(或直接使用)，得到化合物9(9a-i，J-L)(16-78％收率)为白色固体(含三唑区域异构体)。
表6.根据一般方法C合成化合物9A-I的反应条件
*:9bA和9bB为两个三唑区域异构体。
对于纯化-B：制备型HPLC方法B；A：制备型HPLC方法A；RP：RP-快速色谱法；RP-B：RP-快速色谱法方法B；RP-A:RP-快速色谱法方法A。
实施例26
化合物9a的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-
[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(9a)
3.0当量)。然后将所得混合物在20-30℃下搅拌16小时至3天，直至通过LCMS监测大部分化合物8耗尽并检测到所需中间体质量。过滤后，所得混合物经制备型HPLC直接纯化(或直接使用)，得到化合物9(9a-i，J-L)(16-78％收率)为白色固体(含三唑区域异构体)。
表6.根据一般方法C合成化合物9A-I的反应条件
*:9bA和9bB为两个三唑区域异构体。
对于纯化-B：制备型HPLC方法B；A：制备型HPLC方法A；RP：RP-快速色谱法；RP-B：RP-快速色谱法方法B；RP-A:RP-快速色谱法方法A。
实施例26
化合物9a的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-
[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(9a)
[0349] 根据一般方法C，得到化合物9a(9.6mg，25％收率)为白色固体。ESI m/z:1207(M/2+H)+。1H NMR(CH3OHd4,500MHz):δ7.64-7.55(m,2H),7.50-7.39(m,3H),7.39-7.29(m,3H),7.26-7.20(m,1H),5.22-4.93(m,11H),4.70-4.54(m,6H),4.25-4.20(m,4H),4.09-3.78(m,
21H),3.69-3.42(m,18H),3.38-3.36(s,6H),3.28(s,4H),3.24-3.12(m,5H),2.97-2.94(m,
6H),2.73-2.47(m,3H),2.28-1.77(m,12H),1.71-1.37(m,12H),1.35-1.28(m,1H),1.21-
1.14(m,6H),1.03-0.78(m,24H)ppm。
实施例27
化合物9b的制备(参见图7和表6)
(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,
2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,
12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(9b)
21H),3.69-3.42(m,18H),3.38-3.36(s,6H),3.28(s,4H),3.24-3.12(m,5H),2.97-2.94(m,
6H),2.73-2.47(m,3H),2.28-1.77(m,12H),1.71-1.37(m,12H),1.35-1.28(m,1H),1.21-
1.14(m,6H),1.03-0.78(m,24H)ppm。
实施例27
化合物9b的制备(参见图7和表6)
(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,
2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,
12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(9b)
[0350] 根据一般方法C，分离得到三唑区域异构体9bA(LCMS中的第一峰，13mg，22％收率)和9bB(LCMS中的第二峰，19mg，32％收率)，为白色固体。两个化合物的ESI m/z：991(M+H)+。实施例28
化合物9c的制备(参见图7和表6)
(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,
2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,
2,9 4,
11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0
8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(9c)
化合物9c的制备(参见图7和表6)
(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,
2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,
2,9 4,
11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0
8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(9c)
[0351] 根据一般方法C，得到化合物9c(80mg，40％收率)为白色固体。ESIm/z:991(M+H)+。1
H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.92-9.73(m,1H),8.52-8.19(m,2H),8.11-7.93(m,1H),7.90-
7.76(m,1H),7.70-7.47(m,3H),7.32(d,J＝10.0Hz,1H),7.03-6.77(m,3H),6.49-6.29(m,
1H),6.18(d,J＝10.0Hz,1H),5.93(s,1H),5.71-5.53(m,5H),5.51-5.33(m,5H),5.21-3.51(m,42H),3.50-2.64(m,19H),2.43-2.26(m,3H),2.16-1.93(m,4H),1.90-1.78(m,3H),
1.74-1.11(m,24H),1.07-0.72(m,16H)ppm。
实施例29
化合物9d的制备(参见图7和表6)
(1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-
{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,
7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]羰基}-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(9d)
H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.92-9.73(m,1H),8.52-8.19(m,2H),8.11-7.93(m,1H),7.90-
7.76(m,1H),7.70-7.47(m,3H),7.32(d,J＝10.0Hz,1H),7.03-6.77(m,3H),6.49-6.29(m,
1H),6.18(d,J＝10.0Hz,1H),5.93(s,1H),5.71-5.53(m,5H),5.51-5.33(m,5H),5.21-3.51(m,42H),3.50-2.64(m,19H),2.43-2.26(m,3H),2.16-1.93(m,4H),1.90-1.78(m,3H),
1.74-1.11(m,24H),1.07-0.72(m,16H)ppm。
实施例29
化合物9d的制备(参见图7和表6)
(1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-
{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,
7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]羰基}-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(9d)
[0352] 根据一般方法C，得到化合物9d(0.38g，60％收率)为白色固体。ESI m/z:995(M/2+1)+。1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ8.40(s,1H,酰亚胺啶(imidine)-H),7.56-7.52(m,1H),7.32(t,J＝7.7Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),6.88(d,J＝8.3Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),
6.56(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),5.24-5.16(m,1H),5.01-4.95(m,6H),4.65-3.43(m,40H),
3.14-2.72(m,7H),2.55-1.26(m,44H),1.16(s,3H),1.13(s,3H),1.09-0.93(m,6H)ppm。
实施例30
化合物9e的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,2H,3H,4H,5H,
6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺
基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(9e)
6.56(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),5.24-5.16(m,1H),5.01-4.95(m,6H),4.65-3.43(m,40H),
3.14-2.72(m,7H),2.55-1.26(m,44H),1.16(s,3H),1.13(s,3H),1.09-0.93(m,6H)ppm。
实施例30
化合物9e的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,2H,3H,4H,5H,
6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺
基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(9e)
[0353] 根据一般方法C，得到化合物9e(67mg，64％收率)为白色固体。ESI m/z:1141(M/2+1)+。1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ8.40(s,1H),7.65-7.45(m,3H),7.40-7.26(m,3H),7.02(d,J＝8.3Hz,1H),6.88(d,J＝8.3Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),
5.24-5.16(m,1H),5.10(s,2H),5.02-4.93(m,4H),4.66-4.51(m,2H),4.43-4.22(m,2H),
4.15-3.73(m,22H),3.64-3.42(m,12H),3.37(s,3H),3.24-3.03(m,4H),3.01-2.75(m,6H),
2.42-2.25(m,6H),2.18-1.98(m,8H),1.94-1.58(m,15H),1.56-1.50(m,3H),1.47-1.40(m,
3H),1.38(s,3H),1.37(s,3H),1.34-1.25(m,4H),1.16-1.10(m,6H),1.09-0.93(m,7H)ppm。
实施例31
化合物9f的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯(9f)
5.24-5.16(m,1H),5.10(s,2H),5.02-4.93(m,4H),4.66-4.51(m,2H),4.43-4.22(m,2H),
4.15-3.73(m,22H),3.64-3.42(m,12H),3.37(s,3H),3.24-3.03(m,4H),3.01-2.75(m,6H),
2.42-2.25(m,6H),2.18-1.98(m,8H),1.94-1.58(m,15H),1.56-1.50(m,3H),1.47-1.40(m,
3H),1.38(s,3H),1.37(s,3H),1.34-1.25(m,4H),1.16-1.10(m,6H),1.09-0.93(m,7H)ppm。
实施例31
化合物9f的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯(9f)
[0354] 根据一般方法C，得到化合物9f(20mg，57％收率)为白色固体。ESI m/z:1156.0(M/2+1)+。
实施例32
化合物9g的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,
7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(9g)
实施例32
化合物9g的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,
7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(9g)
[0355] 根据一般方法C，得到化合物9g(46mg，58％收率)为白色固体。ESI m/z:887.9(M/3+ 1+H) 。H NMR(CH3OHd4,500MHz)δ7.61(d,J＝6.5Hz,2H),7.46-7.27(m,6H),7.23(t,J＝
7.2Hz,1H),5.38-5.02(m,3H),5.00-4.91(m,6H),4.72-4.50(m,5H),4.44-4.15(m,5H),
4.12-3.78(m,21H),3.77-3.69(m,5H),3.68-3.41(m,30H),3.39-3.35(m,4H),3.30-3.26(m,3H),3.24-2.84(m,12H),2.59-2.40(m,4H),2.31-1.86(m,11H),1.84-1.69(m,5H),
1.67-1.50(m,8H),1.48-1.37(m,4H),1.36-1.29(m,3H),1.22-1.11(m,6H),1.06-0.76(m,
24H)ppm。
实施例33
化合物9h的制备(参见图7和表6)
N-[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟
基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,
5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(9h)
7.2Hz,1H),5.38-5.02(m,3H),5.00-4.91(m,6H),4.72-4.50(m,5H),4.44-4.15(m,5H),
4.12-3.78(m,21H),3.77-3.69(m,5H),3.68-3.41(m,30H),3.39-3.35(m,4H),3.30-3.26(m,3H),3.24-2.84(m,12H),2.59-2.40(m,4H),2.31-1.86(m,11H),1.84-1.69(m,5H),
1.67-1.50(m,8H),1.48-1.37(m,4H),1.36-1.29(m,3H),1.22-1.11(m,6H),1.06-0.76(m,
24H)ppm。
实施例33
化合物9h的制备(参见图7和表6)
N-[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟
基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,
5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(9h)
[0356] 根据一般方法C，得到化合物9h(30mg，72％收率)为白色固体。ESI m/z:1118(M/2+1)+。
1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.91-9.85(m,1H),9.13-8.90(m,1H),8.58(t,J＝9.3Hz,2H),
8.50-8.47(m,1H),8.17-8.00(m,6H),7.88-7.78(m,2H),7.53-7.49(m,1H),7.36-7.30(m,
1H),6.97(d,J＝8.5Hz,1H),6.82(d,J＝8.3Hz,1H),6.63(s,1H),6.51(d,J＝8.3Hz,1H),
5.52-5.50(m,11H),5.14(s,1H),4.86-4.67(m,10H),4.54(d,J＝12.9Hz,2H),4.46-4.32(m,5H),4.06-3.94(m,3H),3.89-3.76(m,4H),3.73-3.61(m,5H),3.57(t,J＝6.5Hz,3H),
3.53-3.34(m,12H),3.33-3.19(m,4H),3.17-3.08(m,3H),3.00(dd,J＝12.6,6.2Hz,3H),
2.91-2.68(m,8H),2.31-2.22(m,5H),2.18-2.07(m,6H),1.93-1.78(m,6H),1.74-1.35(m,
15H),1.28(d,J＝6.6Hz,17H),1.19-1.06(m,5H),1.01-0.94(m,9H),0.89-0.79(m,6H)ppm。
实施例34
化合物9i的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,
7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(2-
{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酸酯(9i)
1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.91-9.85(m,1H),9.13-8.90(m,1H),8.58(t,J＝9.3Hz,2H),
8.50-8.47(m,1H),8.17-8.00(m,6H),7.88-7.78(m,2H),7.53-7.49(m,1H),7.36-7.30(m,
1H),6.97(d,J＝8.5Hz,1H),6.82(d,J＝8.3Hz,1H),6.63(s,1H),6.51(d,J＝8.3Hz,1H),
5.52-5.50(m,11H),5.14(s,1H),4.86-4.67(m,10H),4.54(d,J＝12.9Hz,2H),4.46-4.32(m,5H),4.06-3.94(m,3H),3.89-3.76(m,4H),3.73-3.61(m,5H),3.57(t,J＝6.5Hz,3H),
3.53-3.34(m,12H),3.33-3.19(m,4H),3.17-3.08(m,3H),3.00(dd,J＝12.6,6.2Hz,3H),
2.91-2.68(m,8H),2.31-2.22(m,5H),2.18-2.07(m,6H),1.93-1.78(m,6H),1.74-1.35(m,
15H),1.28(d,J＝6.6Hz,17H),1.19-1.06(m,5H),1.01-0.94(m,9H),0.89-0.79(m,6H)ppm。
实施例34
化合物9i的制备(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,
7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(2-
{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酸酯(9i)
[0357] 根据一般方法C，得到化合物9i(51mg，78％收率)为白色固体。ESI m/z:1258(M/2+1)+。
1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.08(s,1H),9.09-8.91(m,1H),8.56(d,J＝8.7Hz,1H),8.39(d,J＝7.3Hz,1H),8.12(s,1H),8.07(s,1H),7.85-7.78(m,2H),7.58(d,J＝8.5Hz,2H),
7.41(s,1H),7.29(d,J＝8.5Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),6.85-6.78(m,2H),6.68(d,J＝
8.3Hz,1H),6.63(s,1H),6.51(d,J＝8.2Hz,1H),6.06(s,1H),5.50(br s,25H),5.15(s,
1H),4.96(s,3H),4.85-4.78(m,12H),4.70(s,3H),4.56(s,3H),4.39(s,5H),3.89-3.75(m,
14H),3.74-3.56(m,8H),3.54-3.39(m,8H),3.38-3.29(m,7H),3.14(s,2H),3.01(d,J＝
5.5Hz,5H),2.86-2.8(m,2H),2.74(s,4H),2.32-2.23(m,5H),2.16(d,J＝11.2Hz,3H),2.00(d,J＝6.6Hz,2H),1.93-1.86(m,5H),1.77-1.54(m,10H),1.46-1.42(m,6H),1.30-1.27(m
11H),1.14(s,3H),1.00(d,J＝12.5Hz,6H),0.88(s,3H)0.84(s,3H)ppm。
实施例34A
化合物9J的制备-(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-
2,9 4,8 13,18
二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十
烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(9J)
1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.08(s,1H),9.09-8.91(m,1H),8.56(d,J＝8.7Hz,1H),8.39(d,J＝7.3Hz,1H),8.12(s,1H),8.07(s,1H),7.85-7.78(m,2H),7.58(d,J＝8.5Hz,2H),
7.41(s,1H),7.29(d,J＝8.5Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),6.85-6.78(m,2H),6.68(d,J＝
8.3Hz,1H),6.63(s,1H),6.51(d,J＝8.2Hz,1H),6.06(s,1H),5.50(br s,25H),5.15(s,
1H),4.96(s,3H),4.85-4.78(m,12H),4.70(s,3H),4.56(s,3H),4.39(s,5H),3.89-3.75(m,
14H),3.74-3.56(m,8H),3.54-3.39(m,8H),3.38-3.29(m,7H),3.14(s,2H),3.01(d,J＝
5.5Hz,5H),2.86-2.8(m,2H),2.74(s,4H),2.32-2.23(m,5H),2.16(d,J＝11.2Hz,3H),2.00(d,J＝6.6Hz,2H),1.93-1.86(m,5H),1.77-1.54(m,10H),1.46-1.42(m,6H),1.30-1.27(m
11H),1.14(s,3H),1.00(d,J＝12.5Hz,6H),0.88(s,3H)0.84(s,3H)ppm。
实施例34A
化合物9J的制备-(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-
2,9 4,8 13,18
二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十
烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(9J)
[0358] 根据实施例25中所述的一般方法，得到化合物9J(0.11g，51％收率)为白色固体。+ 1
ESI m/z:1081(M/2+1) 。H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.05(s,1H),8.30-7.80(m,3H),7.80-
7.55(m,2H),7.50-7.40(m,1H),7.40-7.25(m,3H),6.30(d,J＝12.5Hz,1H),6.11(s,1H),
6.00(s,1H),5.80-5.35(m,16H),5.25-5.05(m,1H),4.97(s,2H),4.90-4.50(m,13H),4.50-
4.00(m,5H),3.95-3.55(m,22H),3.30-3.20(m,8H),3.20-3.00(m,4H),3.00-2.85(m,5H),
2.25-2.20(m,2H),2.10-1.95(m,4H),1.80-1.00(m,30H),1.00-0.90(m,4H),0.90-0.80(m,
14H)ppm。
实施例34B
化合物9K的制备-(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,
19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(9K)
ESI m/z:1081(M/2+1) 。H NMR(500MHz,DMSOd6)δ10.05(s,1H),8.30-7.80(m,3H),7.80-
7.55(m,2H),7.50-7.40(m,1H),7.40-7.25(m,3H),6.30(d,J＝12.5Hz,1H),6.11(s,1H),
6.00(s,1H),5.80-5.35(m,16H),5.25-5.05(m,1H),4.97(s,2H),4.90-4.50(m,13H),4.50-
4.00(m,5H),3.95-3.55(m,22H),3.30-3.20(m,8H),3.20-3.00(m,4H),3.00-2.85(m,5H),
2.25-2.20(m,2H),2.10-1.95(m,4H),1.80-1.00(m,30H),1.00-0.90(m,4H),0.90-0.80(m,
14H)ppm。
实施例34B
化合物9K的制备-(参见图7和表6)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,
41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,
8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,
19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(9K)
[0359] 根据实施例25中所述的一般方法，得到化合物9K(0.11g，58％收率)为白色固体。ESI m/z:751(M/3+1)+。
实施例34C
化合物9L的制备-(参见图7和表6)
(2R)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-
12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺(9L)
实施例34C
化合物9L的制备-(参见图7和表6)
(2R)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-
12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺(9L)
[0360] 根据实施例25中所述的一般方法，得到化合物9L(40mg，34％收率)为白色固体。+
ESI m/z:1009.5(M/2+1) 。
实施例35
ESI m/z:1009.5(M/2+1) 。
实施例35
[0361] 某些连接体-有效负载是根据以下方法合成得到(一般方法D)(参见图8)。
[0362] 一般方法D：室温下，向酸4a或4c(1.0-2.5当量)的DMF(或DCM/DMF)溶液中依次加入DIPEA(1.5-10当量)和HATU(2.5-4.0当量)。所得混合物在此温度下搅拌0.5-1小时，然后加入胺(3a、3c、3d、3H、3I或9a-i、9J-L)(1.0当量)。反应混合物在室温下搅拌2-16小时，直至通过LCMS监测胺完全耗尽。将反应混合物通过膜过滤，然后滤液经制备型HPLC分离，得到实施例化合物(20-69％收率)为白色固体。表7.实施例36和41-61的反应条件–一般方法D
对于纯化-B：制备型HPLC方法B。
实施例36
连接体-MMAE的制备-(参见图8和表7)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,
15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯
ESI m/z:829.7(M/2+H)+(100％),1659.7(M+H)+(20％)。
1H NMR(DMSOd6,500MHz):δ9.98(s,1H),8.29(s,1H),8.11(d,J＝7.3Hz,1H),8.04(s,
1H),7.92-7.82(m,2H),7.75(t,J＝5.1Hz,1H),7.68(d,J＝7.2Hz,1H),7.65-7.53(m,3H),
7.53-7.42(m,3H),7.41-7.22(m,9H),7.22-7.10(m,1H),6.06-5.91(m,1H),5.75(s,1H),
5.40(s,2H),5.33(d,J＝4.8Hz,1H),5.15-4.91(m,3H),4.79-4.57(m,1H),4.54-4.17(m,
5H),4.08-3.88(m,2H),3.67-3.40(m,16H),3.27-2.80(m,18H),2.62-2.53(m,1H),2.41-
1.27(m,21H),1.07-0.95(m,6H),0.90-0.67(m,26H)ppm。
分析型HPLC：98％，保留时间：8.25min(方法B)。
溶解度:<0.1mg/mL水。
实施例37
对于纯化-B：制备型HPLC方法B。
实施例36
连接体-MMAE的制备-(参见图8和表7)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,
15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯
ESI m/z:829.7(M/2+H)+(100％),1659.7(M+H)+(20％)。
1H NMR(DMSOd6,500MHz):δ9.98(s,1H),8.29(s,1H),8.11(d,J＝7.3Hz,1H),8.04(s,
1H),7.92-7.82(m,2H),7.75(t,J＝5.1Hz,1H),7.68(d,J＝7.2Hz,1H),7.65-7.53(m,3H),
7.53-7.42(m,3H),7.41-7.22(m,9H),7.22-7.10(m,1H),6.06-5.91(m,1H),5.75(s,1H),
5.40(s,2H),5.33(d,J＝4.8Hz,1H),5.15-4.91(m,3H),4.79-4.57(m,1H),4.54-4.17(m,
5H),4.08-3.88(m,2H),3.67-3.40(m,16H),3.27-2.80(m,18H),2.62-2.53(m,1H),2.41-
1.27(m,21H),1.07-0.95(m,6H),0.90-0.67(m,26H)ppm。
分析型HPLC：98％，保留时间：8.25min(方法B)。
溶解度:<0.1mg/mL水。
实施例37
[0363] 本实施例提供了用于生成某些连接体-有效负载的代表性合成路线(参见图9)。{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡
咯-1-基)己酰胺基]-6-[4-(3-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-3,4,5,13-四氮杂四环[13.4.0.02,6.07,12]十九碳-1(19),2(6),4,7(12),8,10,15,17-八烯-13-基)-4-氧丁酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-
[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯
咯-1-基)己酰胺基]-6-[4-(3-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-3,4,5,13-四氮杂四环[13.4.0.02,6.07,12]十九碳-1(19),2(6),4,7(12),8,10,15,17-八烯-13-基)-4-氧丁酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-
[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯
[0364] 室温下，向Mc-(L)D-Lys(suc-DIBAC)-OH(5b，2.0mg，3.1μmol)的干燥THF(1mL)溶液中依次加入HATU(1.8mg，4.7μmol)和DIPEA(0.8mg，6.2μmol)。混合物在室温下搅拌30分钟，然后将化合物3a(3.6mg，3.1μmol)的干燥THF(1mL)溶液加至反应混合物中。所得混合物在室温下搅拌16小时，直至通过LCMS监测认为反应完成。真空浓缩除去挥发物，将所得残余物8j(ESI m/z:866.3(M/2+H)+)溶于乙腈(1mL)。向溶液中加入αCD-叠氮化物6a(4.6mg，4.7μmol)的水(1mL)溶液。反应混合物在室温下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。所得混合物经制备型HPLC直接纯化(方法A)，得到本实施例中所述的连接体有效负载化合物(2mg，25％收率)为白色固体。ESI m/z:910.8(M/3+H)+(100％),1365.4(M/2+H)+(20％)。
分析型HPLC：>99.9％，保留时间：6.97min(方法B)。
实施例38
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,
13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-2-{6-[3-(4-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}哌嗪-1-基)-2,
5-二氧吡咯烷-1-基]己酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图10)
分析型HPLC：>99.9％，保留时间：6.97min(方法B)。
实施例38
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-6-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4,6,8,
13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-2-{6-[3-(4-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}哌嗪-1-基)-2,
5-二氧吡咯烷-1-基]己酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图10)
[0365] 室温下，将中间体5a(15mg，24μmol)和HATU(15mg，39μmol)的THF(1mL)混合物搅拌半小时。然后加入vc-PAB-MMAE(I，26mg，23μmol)的DMF(2mL)和DIPEA(8.9mg，69μmol)溶液。混合物在室温下搅拌过夜。反应通过LCMS进行监测，直至vc-PAB-MMAE耗尽并检测到所需化合物。真空浓缩除去挥发物，所得残余物经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的水溶液)，得到实施例38的中间体Ex38-Int(18mg，26％收率)为白色固体。ESI m/z:1732(M+H)+。1H NMR(DMSOd6,400MHz):δ9.61(s,1H),8.31-7.87(m,6H),7.68-7.61(m,5H),7.49-7.37(m,
4H),7.30-7.12(m,13H),6.98(s,2H),5.95(m,1H),5.38-5.33(m,4H),5.12-5.02(m,2H),
4.76-4.26(m,7H),4.16-4.14(m,2H),4.04-3.94(m,3H),3.79-3.43(m,5H),3.3(s,6H),
3.24-3.23(m,5H),3.20(s,3H),3.17(s,2H),3.11(m,2H),3.04-2.84(m,8H),2.64-2.57(m,
2H),2.43-2.36(m,2H),2.29-2.14(m,2H),2.04-1.94(m,5H),1.80-1.72(m,3H),1.57-1.24(m,5H),1.11-0.97(m,6H),0.89-0.75(m,24H)ppm。将上述中间体溶于DMF(0.7mL)。室温下，向溶液中依次加入TEA(0.5mg，5.0μmol)和αCD-pip 6b(9.6mg，9.4μmol)。所得混合物在室温下搅拌16小时，直至根据LCMS监测反应完成。将此混合物经制备型HPLC直接纯化(方法B)，得到本实施例中所述连接体有效负载化合物(3mg，23％收率)为白色固体。
4H),7.30-7.12(m,13H),6.98(s,2H),5.95(m,1H),5.38-5.33(m,4H),5.12-5.02(m,2H),
4.76-4.26(m,7H),4.16-4.14(m,2H),4.04-3.94(m,3H),3.79-3.43(m,5H),3.3(s,6H),
3.24-3.23(m,5H),3.20(s,3H),3.17(s,2H),3.11(m,2H),3.04-2.84(m,8H),2.64-2.57(m,
2H),2.43-2.36(m,2H),2.29-2.14(m,2H),2.04-1.94(m,5H),1.80-1.72(m,3H),1.57-1.24(m,5H),1.11-0.97(m,6H),0.89-0.75(m,24H)ppm。将上述中间体溶于DMF(0.7mL)。室温下，向溶液中依次加入TEA(0.5mg，5.0μmol)和αCD-pip 6b(9.6mg，9.4μmol)。所得混合物在室温下搅拌16小时，直至根据LCMS监测反应完成。将此混合物经制备型HPLC直接纯化(方法B)，得到本实施例中所述连接体有效负载化合物(3mg，23％收率)为白色固体。
[0366] ESI m/z:925.1(M/3+H)+(100％),1387(M/2+H)+(10％)。
[0367] 1H NMR(DMSOd6,500MHz):δ9.68(s,1H),8.34-7.83(m,4H),7.72-7.56(m,5H),7.55-7.24(m,12H),7.21-7.12(m,1H),5.97(s,1H),5.69-5.26(m,14H),5.25-4.70(m,9H),
4.69-4.38(m,7H),4.36-4.21(m,3H),4.17(s,1H),4.06-3.88(m,2H),3.87-3.53(m,25H),
3.52-3.35(m,14H),3.32-3.08(m,21H),3.08-2.80(m,7H),2.79-2.52(m,9H),2.46-1.88(m,11H),1.87-1.10(m,21H),1.07-0.96(m,6H),0.90-0.74(m,24H)ppm。
分析型HPLC：96％，保留时间：7.22min(方法B)。
溶解度：0.25mg/mL水。
实施例39
4.69-4.38(m,7H),4.36-4.21(m,3H),4.17(s,1H),4.06-3.88(m,2H),3.87-3.53(m,25H),
3.52-3.35(m,14H),3.32-3.08(m,21H),3.08-2.80(m,7H),2.79-2.52(m,9H),2.46-1.88(m,11H),1.87-1.10(m,21H),1.07-0.96(m,6H),0.90-0.74(m,24H)ppm。
分析型HPLC：96％，保留时间：7.22min(方法B)。
溶解度：0.25mg/mL水。
实施例39
[0368] 本实施例提供了用于制备某些连接体-有效负载的代表性合成路线(参见图11)。{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡
咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,
29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,
6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,
2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯
咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,
29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,
6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,
2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯
[0369] 在25℃下，通过注射器向化合物8a(10mg，7.1μmol)和化合物4d(6.2mg，14μmol)的DMF(0.5mL)混合物中加入TEA(2.1mg，21μmol)。将混合物在20-25℃下搅拌16小时，直至通过LCMS监测大部分8a耗尽。反应混合物经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的水溶液(含有0.03％TFA))，得到白色固体(ESI m/z:1743(M+H)+)，将其溶于DMF(1mL)和水(1mL)中。在25℃下，向所得溶液中加入叠氮化物6a(3.0mg，3.0μmol)，将混合物在此温度下搅拌3天。然后通过LCMS监测认为反应完成。真空浓缩除去挥发物，所得残余物经制备型HPLC纯化(方法A)，得到本实施例中所述的连接体有效负载化合物(1.5mg，9％收率)为白色固体。
[0370] ESI m/z:1371(M/2+H)+。
[0371] 1H NMR(DMSOd6,500MHz):δ9.70(s,1H),8.36-7.54(m,8H),7.37-7.09(m,8H),7.01(s,2H),6.55(s,1H),6.05-5.94(m,1H),5.76(s,3H),5.64-5.29(m,16H),5.24-4.91(m,3H),4.89-4.67(m,8H),4.62-4.14(m,13H),4.07-3.89(m,3H),3.87-3.53(m,28H),3.53-
3.15(m,15H),3.15-3.03(m,9H),3.01-2.80(m,10H),2.43-2.35(m,3H),2.31-2.22(m,2H),
2.16-1.94(m,5H),1.90-1.11(m,23H),1.07-0.94(m,8H),0.92-0.68(m,28H)ppm。
3.15(m,15H),3.15-3.03(m,9H),3.01-2.80(m,10H),2.43-2.35(m,3H),2.31-2.22(m,2H),
2.16-1.94(m,5H),1.90-1.11(m,23H),1.07-0.94(m,8H),0.92-0.68(m,28H)ppm。
[0372] 分析型HPLC：>99.9％，保留时间：5.78min(方法A)。实施例40
{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡
咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-[4-(3-{[31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,
29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-3,4,5,13-四氮杂四环[13.4.0.02,6.07,12]十九碳-1(19),2(6),4,7(12),8,10,15,17-八烯-13-基)-
4-氧丁酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图9)
{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡
咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-[4-(3-{[31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,
29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-3,4,5,13-四氮杂四环[13.4.0.02,6.07,12]十九碳-1(19),2(6),4,7(12),8,10,15,17-八烯-13-基)-
4-氧丁酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图9)
[0373] 参见实施例37中的合成路线。根据实施例37的方法，不同之处在于用化合物5c代替5b，得到本实施例中所述的连接体有效负载化合物(8.0mg，36％收率)为白色固体。
[0374] ESI m/z:1432(M/2+H)+。
[0375] 1H NMR(DMSOd6,500MHz):δ9.68(s,1H),8.10-8.07(m,4H),7.89-7.81(m,1H),7.67-7.39(m,10H),7.31-7.10(m,12H),7.01(s,2H),5.98-5.87(m,1H),5.67-5.22(m,
14H),5.05-4.67(m,11H),4.49-4.16(m,13H),4.04-3.69(m,12H),3.68-2.85(m,54H),
2.71-1.29(m,28H),1.05-0.97(m,7H),0.89-0.68(m,29H)ppm。
14H),5.05-4.67(m,11H),4.49-4.16(m,13H),4.04-3.69(m,12H),3.68-2.85(m,54H),
2.71-1.29(m,28H),1.05-0.97(m,7H),0.89-0.68(m,29H)ppm。
[0376] 分析型HPLC：>99.9％，保留时间：6.84min(方法B)。
[0377] 溶解度：0.33mg/mL水。实施例41
4,9
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 ]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16 18,21 23,26
.2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-
基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
4,9
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 ]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16 18,21 23,26
.2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-
基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0378] ESI m/z:983.4(M/3+H)+(100％),1475(M/2+H)+(5％)。
[0379] 1H NMR(DMSOd6,500MHz):δ9.70(s,1H),8.39-7.09(m,24H),5.97(s,1H),5.79-5.30(m,15H),5.22-4.92(m,4H),4.90-4.64(m,8H),4.64-4.14(m,13H),4.06-3.90(m,4H),
3.90-2.81(m,77H),2.65-2.55(m,2H),2.44-1.93(m,9H),1.89-1.59(m,8H),1.57-1.40(m,
8H),1.35-1.18(m,7H),1.07-0.95(m,6H),0.90-0.67(m,24H)ppm。
3.90-2.81(m,77H),2.65-2.55(m,2H),2.44-1.93(m,9H),1.89-1.59(m,8H),1.57-1.40(m,
8H),1.35-1.18(m,7H),1.07-0.95(m,6H),0.90-0.67(m,24H)ppm。
[0380] 分析型HPLC：>99.9％，保留时间：7.29min(方法B)。溶解度：0.25mg/mL水。
实施例42
(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-
(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-
基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,
20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,
6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,
3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
实施例42
(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-
(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-
基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,
20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,
6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,
3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0381] ESI m/z:946.3(M/3+H)+(100％),1418.9(M/2+H)+(20％)。
[0382] 1H NMR(CH3OHd4,500MHz):δ7.59-7.58(m,2H),7.29-7.10(m,7H),5.25-4.98(m,4H),4.86-4.81(m,5H),4.58-4.31(m,4H),4.22-4.03(m,6H),3.92-3.61(m,21H),3.53-
3.32(m,36H),3.26-3.25(m,5H),3.18-2.83(m,13H),2.56-2.54(m,1H),2.44-1.43(m,
33H),1.35-1.01(m,15H),0.91-0.69(m,29H)ppm。
分析型HPLC：>99.9％，保留时间：7.33min(方法B)。
溶解度：1.0mg/mL水。
实施例43
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-
[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
3.32(m,36H),3.26-3.25(m,5H),3.18-2.83(m,13H),2.56-2.54(m,1H),2.44-1.43(m,
33H),1.35-1.01(m,15H),0.91-0.69(m,29H)ppm。
分析型HPLC：>99.9％，保留时间：7.33min(方法B)。
溶解度：1.0mg/mL水。
实施例43
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-
[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0383] ESI m/z:1065.9(M/3+H)+(100％),1598.4(M/2+H)+(20％)。
[0384] 1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.67-7.04(m,17H),5.24(t,J＝4.7Hz,1H),5.13-4.82(m,10H),4.60-4.41(m,5H),4.37-4.31(m,1H),4.22-4.04(m,5H),3.99-3.66(m,18H),3.65-3.57(m,4H),3.55-3.29(m,40H),3.29-2.65(m,24H),2.64-2.55(m,1H),2.45-1.12(m,46H),1.09-1.00(m,6H),0.94-0.66(m,24H)ppm。
[0385] 分析型HPLC：98.2％，保留时间：5.79min(方法B)。
[0386] 溶解度：0.5mg/mL水。实施例44
[(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-
(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-
基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,
2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基]氨基甲酰
基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-
(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-
基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,
15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,
2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基]氨基甲酰
基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0387] ESI m/z:1028.7(M/3+H)+(100％),1541.5(M/2+H)+(5％)。
[0388] 1H NMR(500MHz,CH3OHd4):δ7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.29-7.09(m,7H),5.26-4.98(m,4H),4.87-4.85(m,3H),4.54-4.43(m,3H),4.35-4.32(m,1H),4.19-4.03(m,10H),3.93-3.71(m,19H),3.65-3.47(m,30H),3.39-3.25(m,32H),3.24-3.17(m,5H),3.10-2.90(m,
5H),2.89-2.69(m,4H),2.50-2.34(m,7H),2.23-1.97(m,13H),1.97-1.34(m,16H),1.22-
1.20(m,7H),1.08-0.91(m,7H),0.82-0.67(m,26H)ppm。
5H),2.89-2.69(m,4H),2.50-2.34(m,7H),2.23-1.97(m,13H),1.97-1.34(m,16H),1.22-
1.20(m,7H),1.08-0.91(m,7H),0.82-0.67(m,26H)ppm。
[0389] 分析型HPLC：>99.9％，保留时间：7.02min(方法B)。
[0390] 溶解度：1.0mg/mL水。实施例45
[0391] 本实施例提供了连接体-糖皮质激素(GC)类固醇的合成(参见图8和表7)。1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,
17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,
12-四氧杂十五烷-15-酰胺
ESI m/z:1227(M+H)+。
1H NMR(500MHz,DMSOd6)(旋转异构体)δ9.79(s,0.5H),9.70(s,0.5H),8.41(d,J＝
7.5Hz,0.5H),8.17(d,J＝7.0Hz,0.5H),8.02(d,J＝8.0Hz,0.5H),7.89(d,J＝8.6Hz,
0.5H),7.77(t,J＝4.8Hz,1H),7.68(d,J＝7.3Hz,1H),7.62(d,J＝7.3Hz,1H),7.58(d,J＝
9.0Hz,1H),7.53-7.43(m,4H),7.40-7.28(m,4H),6.88-6.82(m,2H),6.18(d,J＝9.1Hz,
1H),5.93(s,1H),5.10(d,J＝18.4Hz,1H),5.03(d,J＝14.0Hz,1H),4.83-4.67(m,4H),
4.45-4.29(m,2H),4.23-4.17(m,0.5H),4.11(t,J＝7.7Hz,0.5H),3.64-3.40(m,15H),
3.31-3.26(m,2H),3.13-3.03(m,2H),2.65-2.52(m,2H),2.47-1.26(m,24H),1.06-0.93(m,
2H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
4-氧丁酰胺基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,
17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,
12-四氧杂十五烷-15-酰胺
ESI m/z:1227(M+H)+。
1H NMR(500MHz,DMSOd6)(旋转异构体)δ9.79(s,0.5H),9.70(s,0.5H),8.41(d,J＝
7.5Hz,0.5H),8.17(d,J＝7.0Hz,0.5H),8.02(d,J＝8.0Hz,0.5H),7.89(d,J＝8.6Hz,
0.5H),7.77(t,J＝4.8Hz,1H),7.68(d,J＝7.3Hz,1H),7.62(d,J＝7.3Hz,1H),7.58(d,J＝
9.0Hz,1H),7.53-7.43(m,4H),7.40-7.28(m,4H),6.88-6.82(m,2H),6.18(d,J＝9.1Hz,
1H),5.93(s,1H),5.10(d,J＝18.4Hz,1H),5.03(d,J＝14.0Hz,1H),4.83-4.67(m,4H),
4.45-4.29(m,2H),4.23-4.17(m,0.5H),4.11(t,J＝7.7Hz,0.5H),3.64-3.40(m,15H),
3.31-3.26(m,2H),3.13-3.03(m,2H),2.65-2.52(m,2H),2.47-1.26(m,24H),1.06-0.93(m,
2H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
[0392] 分析型HPLC：99％，保留时间：8.55min(方法B)。
[0393] 溶解度：<0.1mg/mL水；0.06mg/mL 20％DMSO的水溶液；0.07mg/mL 30％DMSO的水溶液。实施例46
4,9
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 ]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,
8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
4,9
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 ]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,
8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
[0394] ESI m/z:1259(M/2+H)+。
[0395] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)(旋转异构体)δ9.84(s,1H),8.34(s,0.5H),8.15(d,J＝7.3Hz,1H),8.04(d,J＝6.6Hz,1H),7.90-7.84(m,1H),7.81-7.74(m,1.5H),7.72-7.56(m,
4H),7.56-7.27(m,11H),6.89-6.79(m,2H),6.17(d,J＝10.0Hz,1H),5.93(s,1H),5.64-
5.44(m,12H),5.24-5.00(m,5H),4.86-4.51(m,16H),4.40-4.16(m,5H),4.05-3.96(m,1H),
3.86-3.73(m,10H),3.67-2.88(m,35H),2.80-2.69(m,1H),2.62-2.55(m,1H),2.41-2.20(m,6H),2.10-1.71(m,10H),1.66-1.07(m,26H),1.05-0.79(m,17H)ppm。
4H),7.56-7.27(m,11H),6.89-6.79(m,2H),6.17(d,J＝10.0Hz,1H),5.93(s,1H),5.64-
5.44(m,12H),5.24-5.00(m,5H),4.86-4.51(m,16H),4.40-4.16(m,5H),4.05-3.96(m,1H),
3.86-3.73(m,10H),3.67-2.88(m,35H),2.80-2.69(m,1H),2.62-2.55(m,1H),2.41-2.20(m,6H),2.10-1.71(m,10H),1.66-1.07(m,26H),1.05-0.79(m,17H)ppm。
[0396] 分析型HPLC：97％，保留时间：6.62和6.67min(方法B)。实施例47
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,
6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环
[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,
6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环
[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
[0397] ESI m/z:839.5(M/3+H)+,1259(M/2+H)+(60％)。
[0398] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)(含有三唑区域异构体)δ9.77-9.42(m,1H),8.27-8.20(m,0.5H),8.17-8.01(m,2H),7.86-7.74(m,2.5H),7.70-7.60(m,4H),7.57-7.43(m,7H),7.39-
7.28(m,6H),6.88-6.81(m,2H),6.21-6.14(m,1H),5.93(s,1H),5.61-5.42(m,10H),5.16-
4.97(m,4H),4.89-4.48(m,17H),4.40-4.28(m,4H),4.16-4.10(m,1H),4.04-3.94(m,1H),
3.83-3.74(m,7H),3.65-3.56(m,9H),3.48-3.21(m,23H),3.15-3.06(m,4H),2.97-2.89(m,
1H),2.81-2.69(m,1H),2.61-2.53(m,2H),2.40-2.20(m,6H),2.14-2.06(m,2H),2.03-1.95(m,4H),1.91-1.70(m,5H),1.64-1.52(m,9H),1.49-1.25(m,14H),1.13-0.81(m,19H)ppm。
7.28(m,6H),6.88-6.81(m,2H),6.21-6.14(m,1H),5.93(s,1H),5.61-5.42(m,10H),5.16-
4.97(m,4H),4.89-4.48(m,17H),4.40-4.28(m,4H),4.16-4.10(m,1H),4.04-3.94(m,1H),
3.83-3.74(m,7H),3.65-3.56(m,9H),3.48-3.21(m,23H),3.15-3.06(m,4H),2.97-2.89(m,
1H),2.81-2.69(m,1H),2.61-2.53(m,2H),2.40-2.20(m,6H),2.14-2.06(m,2H),2.03-1.95(m,4H),1.91-1.70(m,5H),1.64-1.52(m,9H),1.49-1.25(m,14H),1.13-0.81(m,19H)ppm。
[0399] 分析型HPLC：98％，保留时间：6.61(59％)和6.73(39％)min(方法B)。
[0400] 溶解度：0.1mg/mL 10％DMSO的水溶液。实施例48
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,
4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,
8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,
4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,
8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
[0401] ESI m/z:1234(M+H)+。
[0402] 1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.65(d,J＝7.4Hz,1H),7.62-7.51(m,2H),7.48-7.28(m,6H),7.27-7.21(m,1H),7.00(d,J＝8.5Hz,1H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),5.15-5.10(m,1H),4.52-4.43(m,1H),4.20(d,J＝
6.5Hz,0.5H),4.04(d,J＝7.9Hz,0.5H),3.77-3.64(m,3H),3.63-3.49(m,12H),3.47-3.39(m,2H),3.24(t,J＝5.5Hz,2H),2.99-2.66(m,5H),2.57-2.42(m,2H),2.42-1.94(m,14H),
1.76-1.63(m,4H),1.48-1.21(m,13H),1.14-1.10(m,6H),1.05-0.97(m,6H)ppm。
6.5Hz,0.5H),4.04(d,J＝7.9Hz,0.5H),3.77-3.64(m,3H),3.63-3.49(m,12H),3.47-3.39(m,2H),3.24(t,J＝5.5Hz,2H),2.99-2.66(m,5H),2.57-2.42(m,2H),2.42-1.94(m,14H),
1.76-1.63(m,4H),1.48-1.21(m,13H),1.14-1.10(m,6H),1.05-0.97(m,6H)ppm。
[0403] 分析型HPLC：>99％，保留时间：9.21min(方法B)。
[0404] 溶解度：<0.1mg/mL水。实施例49
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)[0405] ESI m/z:1261(M/2+H)+。
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)[0405] ESI m/z:1261(M/2+H)+。
[0406] 1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.69-7.44(m,6H),7.41-7.30(m,3H),7.26(d,J＝6.8Hz,1H),7.04-6.96(m,1H),6.88(d,J＝8.4Hz,1H),6.72(d,J＝1.9Hz,1H)6.56(dd,J＝
8.3,2.4Hz,1H),5.25-4.94(m,6H),4.75-4.55(m,16H),4.53-3.41(m,49H),3.33-1.20(m,
53H),1.18-1.10(m,6H),1.06-0.94(m,6H)ppm。
8.3,2.4Hz,1H),5.25-4.94(m,6H),4.75-4.55(m,16H),4.53-3.41(m,49H),3.33-1.20(m,
53H),1.18-1.10(m,6H),1.06-0.94(m,6H)ppm。
[0407] 分析型HPLC：99％，保留时间：6.55min(方法B)。
[0408] 溶解度：0.05mg/mL水。实施例50
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(2-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,
10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表
7)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(2-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,
10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表
7)
[0409] 向化合物9i(25mg，9.9μmol)和DIBAC-Suc-PEG4-OSu4b(6.8mg，12μmol)的DMF(1mL)溶液中加入三乙胺(2.0mg，20μmol)，混合物在20-25℃下搅拌16小时。然后根据LCMS监测认为反应完成。真空浓缩除去大部分挥发物，所得残余物经制备型HPLC纯化(方法B)，得到产物(12mg，39％收率)为白色固体。
[0410] ESI m/z:1017(M/3+H)+。
[0411] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.68(s,1H),8.21-8.04(m,3H),7.88-7.74(m,2H),7.71-7.56(m,3H),7.52-7.21(m,8H),6.93(d,J＝8.6Hz,1H),6.84-6.77(m,1H),6.70-6.58(m,
2H),6.51(d,J＝8.1Hz,1H),6.01(s,1H),5.78-5.33(m,12H),5.22-4.51(m,14H),4.43-
4.12(m,4H),4.07-3.55(m,35H),3.53-3.33(m,38H),3.33-2.52(m,32H),2.43-1.21(m,
41H),1.20-0.77(m,14H)ppm。
2H),6.51(d,J＝8.1Hz,1H),6.01(s,1H),5.78-5.33(m,12H),5.22-4.51(m,14H),4.43-
4.12(m,4H),4.07-3.55(m,35H),3.53-3.33(m,38H),3.33-2.52(m,32H),2.43-1.21(m,
41H),1.20-0.77(m,14H)ppm。
[0412] 分析型HPLC：96％，保留时间：6.68min(方法B)。
[0413] 溶解度：0.33mg/mL水。实施例51
{二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基}甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,
8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,
42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,
9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
{二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基}甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,
8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,
42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,
9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0414] ESI m/z:1330(M/2+H)+。
[0415] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.70(br s,0.6H),9.28(br s,0.4H),9.00(s,1H),8.26-7.75(m,5H),7.56-7.35(m,2H),7.16-7.03(m,1H),7.01-6.86(m,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,
1H),6.63(s,1H),6.50(d,J＝8.8Hz,1H),5.71-5.32(m,12H),4.87-4.49(m,12H),4.42-
3.93(m,8H),3.90-3.54(m,25H),3.52-3.33(m,28H),3.33-2.66(m,17H),2.33-1.20(m,
58H),1.19-0.77(m,21H)ppm。
1H),6.63(s,1H),6.50(d,J＝8.8Hz,1H),5.71-5.32(m,12H),4.87-4.49(m,12H),4.42-
3.93(m,8H),3.90-3.54(m,25H),3.52-3.33(m,28H),3.33-2.66(m,17H),2.33-1.20(m,
58H),1.19-0.77(m,21H)ppm。
[0416] 分析型HPLC：>99％，保留时间：6.33min(方法B)。
[0417] 溶解度：0.33mg/mL水。实施例52
[0418] 根据图8和表7进行制备。{二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基}甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-
{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
3,6 8,11 13,16 18,21 23,26
[26.2.2.2 .2 .2 .2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环
辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氧基}乙基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
3,6 8,11 13,16 18,21 23,26
[26.2.2.2 .2 .2 .2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环
辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0419] ESI m/z:1470(M/2+H)+。
[0420] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.68(s,1H),9.00(s,1H),8.21-8.03(m,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(d,J＝8.3Hz,2H)6.93(d,J＝8.8Hz,1H)6.81(d,J＝8.4Hz,1H),6.80(s,
1H),6.67(d,J＝8.6Hz,1H),6.63(s,1H),6.50(d,J＝7.9Hz,1H),5.99(s,1H),5.64-5.37(m,12H),5.14(s,1H),5.00-4.50(m,13H),4.38-4.29(m,3H),4.20-4.13(m,1H),4.09-3.97(m,10H),3.95-3.89(m,2H),3.86-3.54(m,23H),3.52-3.33(m,28H),3.16-2.61(m,17H),
2.45-1.20(m,66H),1.18-0.80(m,21H)ppm。
1H),6.67(d,J＝8.6Hz,1H),6.63(s,1H),6.50(d,J＝7.9Hz,1H),5.99(s,1H),5.64-5.37(m,12H),5.14(s,1H),5.00-4.50(m,13H),4.38-4.29(m,3H),4.20-4.13(m,1H),4.09-3.97(m,10H),3.95-3.89(m,2H),3.86-3.54(m,23H),3.52-3.33(m,28H),3.16-2.61(m,17H),
2.45-1.20(m,66H),1.18-0.80(m,21H)ppm。
[0421] 分析型HPLC：>99％，保留时间：6.62min(方法B)。
[0422] 溶解度：0.29mg/mL水。实施例53
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
3,6 8,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.2 .2
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-(1-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
3,6 8,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.2 .2
11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-9-基)氧基]乙酰胺基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)戊基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)
[0423] ESI m/z:1385.9(M/2+H)+。
[0424] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.71(br s,0.6H),9.30(brs,0.4H),9.01(s,1H),8.29-7.99(m,4H),7.89-7.76(m,3H),7.74-7.60(m,2H),7.58-7.27(m,7H),7.01-6.92(m,1H),
6.82(d,J＝8.1Hz,1H),6.68-6.48(m,2H),5.71-5.45(m,12H),5.17-4.69(m,2H),4.90-
4.50(m,12H),4.44-3.54(m,33H),3.54-3.41(m,38H),3.33-2.54(m,15H),2.43-1.19(m,
44H),1.18-0.66(m,18H)ppm。
6.82(d,J＝8.1Hz,1H),6.68-6.48(m,2H),5.71-5.45(m,12H),5.17-4.69(m,2H),4.90-
4.50(m,12H),4.44-3.54(m,33H),3.54-3.41(m,38H),3.33-2.54(m,15H),2.43-1.19(m,
44H),1.18-0.66(m,18H)ppm。
[0425] 分析型HPLC：98％，保留时间：6.42min(方法B)。
[0426] 溶解度：0.18mg/mL水。实施例54
{二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基}甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,
8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
{二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基}甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,
8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0427] ESI m/z:1207(M/2+H)+。
[0428] 1H NMR(500MHz,CH3OHd4)δ7.62(s,1H)7.39(d,J＝8.2Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(d,J＝8.3Hz,1H),6.72(d,J＝2.3Hz,1H),6.56(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),5.21(t,J＝2.8Hz,1H),4.99-4.95(m,4H),4.65-3.43(m,57H),3.31-2.74(m,11H),2.55-1.22(m,
55H),1.16(s,3H),1.13(s,3H),1.06-0.87(m,9H)ppm。
55H),1.16(s,3H),1.13(s,3H),1.06-0.87(m,9H)ppm。
[0429] 分析型HPLC：>99％，保留时间：6.37min(方法B)。实施例55
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11 13,16 18,21 23,26
.2 .2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三
唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)[0430] ESI m/z:1409(M/2+H)+。
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,
30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,
11 13,16 18,21 23,26
.2 .2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三
唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图8和表7)[0430] ESI m/z:1409(M/2+H)+。
[0431] 1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.79(s,1H),9.68(s,1H),8.99(s,1H),8.24-8.05(m,3H),7.86-7.73(m,2H),7.71-7.58(m,3H),7.54-7.42(m,4H),7.42-7.25(m,5H),6.96(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝8.4Hz,1H),6.63(s,1H),6.57-6.45(m,1H),5.99(s,1H),5.69-
5.31(m,12H),5.17-4.49(m,14H),4.39-3.95(m,5H),3.90-3.51(m,25H),3.50-3.33(m,
32H),3.33-2.53(m,21H),2.44-1.20(m,41H),1.21-0.77(m,16H)ppm。
5.31(m,12H),5.17-4.49(m,14H),4.39-3.95(m,5H),3.90-3.51(m,25H),3.50-3.33(m,
32H),3.33-2.53(m,21H),2.44-1.20(m,41H),1.21-0.77(m,16H)ppm。
[0432] 分析型HPLC：99％，保留时间：6.33和6.44min(方法B)。实施例56
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,
9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,
9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟乙基]氨基甲酸酯的制备(参见图8和表7)
[0433] ESI m/z:1424.3(M/2+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.81(s,1H),9.65(s,1H),8.97(s,1H),8.28-8.04(m,3H),
7.91-7.73(m,2H),7.73-7.16(m,12H),6.95(d,J＝8.8Hz,1H),6.81(d,J＝7.8Hz,1H),
6.73-6.59(m,1H),6.59-6.44(m,1H),5.98(s,1H),5.71-5.27(m,12H),5.23-4.48(m,14H),
4.43-3.93(m,5H),4.09-3.50(m,24H),3.51-3.33(m,31H),3.33-2.53(m,17H),2.42-1.08(m,51H),1.06-0.67(m,14H)ppm。
7.91-7.73(m,2H),7.73-7.16(m,12H),6.95(d,J＝8.8Hz,1H),6.81(d,J＝7.8Hz,1H),
6.73-6.59(m,1H),6.59-6.44(m,1H),5.98(s,1H),5.71-5.27(m,12H),5.23-4.48(m,14H),
4.43-3.93(m,5H),4.09-3.50(m,24H),3.51-3.33(m,31H),3.33-2.53(m,17H),2.42-1.08(m,51H),1.06-0.67(m,14H)ppm。
[0434] 分析型HPLC：>99％，保留时间：6.11和6.21min(方法B)。
[0435] 溶解度：<0.1mg/mL水。实施例57
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0+]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56-十六羟基-
10,15,20,25,30,35,40-七(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34,37,39-十六氧杂九环[36.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31.233,36]五十六烷-5-基]甲基}-
1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图9和表7)
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0+]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-
6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56-十六羟基-
10,15,20,25,30,35,40-七(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34,37,39-十六氧杂九环[36.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31.233,36]五十六烷-5-基]甲基}-
1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的制备(参见图9和表7)
[0436] C136H195N11O54，精确质量：2846.3
[0437] ESI m/z:1424.2(M/2+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.26(s,1H),8.95(s,1H),8.24-7.98(m,4H),7.81(d,J＝5.6Hz,1H),7.72(t,J＝5.5Hz,1H),7.67(d,J＝8.1Hz,1H),
7.61(d,J＝7.4Hz,1H),7.55(s,1H),7.53-7.25(m,7H),6.95(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝
8.4Hz,1H),6.63(d,J＝2.1Hz,1H),6.50(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),5.94-5.58(m,15H),5.39-
4.43(m,17H),4.37-4.24(m,3H),4.13-4.08(m,1H),3.98-3.33(m,52H),3.26-2.52(m,
18H),2.40-1.18(m,48H),1.18-0.63(m,19H)ppm。
实施例58
根据图8和表7进行制备。
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,
15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,
19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯
7.61(d,J＝7.4Hz,1H),7.55(s,1H),7.53-7.25(m,7H),6.95(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝
8.4Hz,1H),6.63(d,J＝2.1Hz,1H),6.50(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),5.94-5.58(m,15H),5.39-
4.43(m,17H),4.37-4.24(m,3H),4.13-4.08(m,1H),3.98-3.33(m,52H),3.26-2.52(m,
18H),2.40-1.18(m,48H),1.18-0.63(m,19H)ppm。
实施例58
根据图8和表7进行制备。
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,
15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,
19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯
[0438] C74H94F2N8O17，精确质量：1404.7
[0439] ESI m/z:1406(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.11(d,J＝7.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,1H),7.80-7.75(m,1H),7.70-7.66(m,1H),7.65-7.60(m,3H),7.53-
7.33(m,6H),7.33-7.28(m,3H),6.30(dd,J＝10.0Hz,1.5Hz,1H),6.11(s,1H),6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,2H),5.41(s,2H),5.05-5.01(m,1H),4.97(s,2H),4.80-4.72(m,1H),
4.60-4.58(m,1H),4.43-4.33(m,1H),4.25-4.10(m,3H),3.88-3.80(m,1H),3.65-3.55(m,
3H),3.50-3.40(m,12H),3.30-3.25(m,2H),3.12-2.90(m,4H),2.70-2.55(m,2H),2.48-
2.35(m,2H),2.30-2.20(m,2H),2.15-1.95(m,4H),1.86-1.65(m,3H),1.64-1.54(m,5H),
1.49(s,4H),1.46-1.34(m,5H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
7.33(m,6H),7.33-7.28(m,3H),6.30(dd,J＝10.0Hz,1.5Hz,1H),6.11(s,1H),6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,2H),5.41(s,2H),5.05-5.01(m,1H),4.97(s,2H),4.80-4.72(m,1H),
4.60-4.58(m,1H),4.43-4.33(m,1H),4.25-4.10(m,3H),3.88-3.80(m,1H),3.65-3.55(m,
3H),3.50-3.40(m,12H),3.30-3.25(m,2H),3.12-2.90(m,4H),2.70-2.55(m,2H),2.48-
2.35(m,2H),2.30-2.20(m,2H),2.15-1.95(m,4H),1.86-1.65(m,3H),1.64-1.54(m,5H),
1.49(s,4H),1.46-1.34(m,5H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
[0440] 分析型HPLC：100％，保留时间：7.40min(方法B)。
[0441] 溶解度：0.02mg/mL水。实施例59
根据图8和表7进行制备。
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯
根据图8和表7进行制备。
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯
[0442] C126H177F2N13O49，精确质量：2694.2
[0443] ESI m/z:1349(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.71(s,1H),8.30-8.00(m,3H),8.00-7.74(m,2H),7.70-7.58(m,5H),7.52-7.20(m,12H),6.35-6.20(m,2H),6.15-5.85(m,
3H),5.80-5.35(m,18H),5.25-4.90(m,6H),4.90-4.50(m,14H),4.40-4.25(m,4H),4.25-
4.10(m,3H),4.10-3.95(m,2H),3.95-3.55(m,22H),3.55-3.40(m,22H),3.20-3.00(m,6H),
3.00-2.85(m,3H),2.65-2.55(m,1H),2.25-2.20(m,4H),2.10-1.95(m,6H),1.80-1.70(m,
5H),1.70-1.50(m,10H),1.50-1.45(m,9H),0.90-0.80(m,14H)ppm。
3H),5.80-5.35(m,18H),5.25-4.90(m,6H),4.90-4.50(m,14H),4.40-4.25(m,4H),4.25-
4.10(m,3H),4.10-3.95(m,2H),3.95-3.55(m,22H),3.55-3.40(m,22H),3.20-3.00(m,6H),
3.00-2.85(m,3H),2.65-2.55(m,1H),2.25-2.20(m,4H),2.10-1.95(m,6H),1.80-1.70(m,
5H),1.70-1.50(m,10H),1.50-1.45(m,9H),0.90-0.80(m,14H)ppm。
[0444] 分析型HPLC：100％，保留时间：6.23min(方法B)。
[0445] 溶解度：0.026mg/mL水。实施例60
根据图8和表7进行制备。
(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-
(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,
17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-
2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-
1-基)氨基甲酸酯
根据图8和表7进行制备。
(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-
(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,
17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-
2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-
1-基)氨基甲酸酯
[0446] C118H176F2N12O49，精确质量：2583.2
[0447] ESI m/z:1292.8(M/2+1)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.68(s,1H),8.14-7.08(m,11H),6.30(d,J＝10.0Hz,1H),6.11(s,1H),5.99(s,1H),5.67-5.31(m,15H),5.21-3.33(m,
61H),3.13-2.60(m,22H),2.30-1.96(m,46H),0.95-0.80(m,17H)ppm。
61H),3.13-2.60(m,22H),2.30-1.96(m,46H),0.95-0.80(m,17H)ppm。
[0448] 分析型HPLC(含有三唑区域异构体)：48％，保留时间：7.31min；和52％，保留时间：7.41min(方法B)。
实施例61
根据图8和表7进行制备。
4,9
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 ]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,
15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基
N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-
2,9 4,8 13,18
16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧
乙氧基}苯基)氨基甲酸酯
实施例61
根据图8和表7进行制备。
4,9
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 ]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,
15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基
N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-
2,9 4,8 13,18
16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0 .0 .0 ]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧
乙氧基}苯基)氨基甲酸酯
[0449] C80H98F2N8O18，精确质量：1496.7
[0450] ESI m/z:1499(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.02(s,1H),9.59(s,1H),8.14(d,J＝7.6Hz,1H),7.88(d,J＝8.8Hz,1H),7.80-7.75(m,1H),7.70-7.66(m,1H),7.65-7.60(m,3H),7.53-7.45(m,3H),7.40-7.28(m,7H),6.84(d,J＝9.2Hz,2H),6.30(dd,J＝10.4Hz,1.6Hz,1H),6.11(s,1H),6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,1H),5.52(s,1H),5.43(s,2H),
5.16-5.05(m,4H),4.88-4.70(m,3H),4.43-4.33(m,1H),4.25-4.20(m,2H),3.65-3.55(m,
3H),3.50-3.40(m,12H),3.30-3.25(m,2H),3.12-2.90(m,4H),2.70-2.55(m,2H),2.48-
2.43(m,1H),2.40-2.35(m,1H),2.30-2.20(m,2H),2.15-1.95(m,4H),1.86-1.75(m,2H),
1.64-1.54(m,5H),1.49(s,4H),1.46-1.34(m,4H),1.23(s,2H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
5.16-5.05(m,4H),4.88-4.70(m,3H),4.43-4.33(m,1H),4.25-4.20(m,2H),3.65-3.55(m,
3H),3.50-3.40(m,12H),3.30-3.25(m,2H),3.12-2.90(m,4H),2.70-2.55(m,2H),2.48-
2.43(m,1H),2.40-2.35(m,1H),2.30-2.20(m,2H),2.15-1.95(m,4H),1.86-1.75(m,2H),
1.64-1.54(m,5H),1.49(s,4H),1.46-1.34(m,4H),1.23(s,2H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
[0451] 分析型HPLC：100％，保留时间：7.99min(方法B)。
[0452] 溶解度：<0.01mg/mL水。实施例62
根据图8和表7进行制备。
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-
16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯
根据图8和表7进行制备。
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4
(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
基]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环[26.2.2.23,6.28,11.213,
16.218,21.223,26]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-
16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯
[0453] C132H181F2N13O50，精确质量：2786.2
[0454] ESI m/z:1394(M/2+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd4)δ9.67(s,1H),9.56(s,1H),8.20-8.05(m,2H),7.85-7.70(m,2H),7.70-7.60(m,4H),7.50-7.25(m,12H),6.90-6.80(m,2H),
6.30(d,J＝12.5Hz,1H),6.11(s,1H),6.0(s,1H),5.80-5.35(m,16H),5.25-5.00(m,6H),
4.90-4.65(m,10H),4.65-4.45(m,4H),4.40-4.00(m,6H),3.95-3.55(m,22H),3.50-3.30(m,22H),3.20-2.85(m,12H),2.65-2.55(m,2H),2.45-2.35(m,2H),2.35-2.20(m,3H),
2.15-1.95(m,5H),1.90-1.70(m,4H),1.70-1.50(m,10H),1.50-1.00(m,18H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
6.30(d,J＝12.5Hz,1H),6.11(s,1H),6.0(s,1H),5.80-5.35(m,16H),5.25-5.00(m,6H),
4.90-4.65(m,10H),4.65-4.45(m,4H),4.40-4.00(m,6H),3.95-3.55(m,22H),3.50-3.30(m,22H),3.20-2.85(m,12H),2.65-2.55(m,2H),2.45-2.35(m,2H),2.35-2.20(m,3H),
2.15-1.95(m,5H),1.90-1.70(m,4H),1.70-1.50(m,10H),1.50-1.00(m,18H),0.90-0.80(m,12H)ppm。
[0455] 分析型HPLC(含有三唑区域异构体)：82％，保留时间：7.93min；18％，保留时间：8.02min(方法B)。
[0456] 溶解度：0.02mg/mL水。实施例63
根据图8和表7进行制备。
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,
2
13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
3,6 8,11 13,16 18,21 23,26
[26.2.2.2 .2 .2 .2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环
辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
根据图8和表7进行制备。
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-
4-氧丁酰胺基)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,
2
13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十二羟基-10,15,20,25,30-五(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂七环
3,6 8,11 13,16 18,21 23,26
[26.2.2.2 .2 .2 .2 .2 ]四十二烷-5-基]甲基}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环
辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基]乙酰胺基}戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
[0457] 向化合物9L(19mg，9.4μmol)的DMF(2mL)溶液中加入DIBAC-Suc-PEG4-OSu4b(7.0mg，11μmol)和DIPEA(2.3mg，18μmol)。在室温下搅拌过夜后，所得混合物经制备型HPLC直接纯化(方法B)，得到Ex105(7mg，29％收率)为白色固体。
[0458] C121H168F2N10O47，精确质量：2551.1
[0459] ESI m/z:1276.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.80-9.47(m,1H),8.23-7.91(m,3H),7.83-7.11(m,13H),6.87-6.66(m,2H),6.32-6.11(m,2H),5.85-5.23(m,14H),5.14-5.01(m,3H),4.86-3.99(m,19H),3.85-3.40(m,38H),3.27-2.87(m,13H),2.76-2.55(m,3H),2.33-2.20(m,4H),2.12-1.91(m,6H),1.83-1.72(m,4H),1.59-0.98(m,31H),0.89-
0.84(m,12H)ppm。
0.84(m,12H)ppm。
[0460] 分析型HPLC：100％，保留时间：7.76min(方法B)。实施例64
有效负载1h和1i的合成，参见图1B
有效负载1h和1i的合成，参见图1B
[0461] 根据方案1，从商购醋酸氟轻松P2(CAS：67-73-2)开始制备类固醇类有效负载1h和1i。通过在高氯酸存在下与丁醛进行缩酮交换，将由P2得到的化合物P3转化为甲磺酸酯P4，然后用叠氮化物部分替代甲磺酸酯基团以形成P5，然后其进一步还原为胺1h。另外，P4中的甲磺酸酯部分也被4-氨基苯酚替代，得到苯胺1i。
[0462] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-8-(2-羟基乙酰基)-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(P3)
[0463] 在10℃下，向醋酸氟轻松(P2，0.90g，2.0mmol)和硅胶(18g)的庚烷(90mL)混合物中加入丁醛(0.27mL，3.0mmol)，将悬浮液在10-20℃下搅拌10分钟。在0℃下，向混合物中滴加高氯酸(70％，0.68mL，8.3mmol)。然后将反应混合物在10-20℃下搅拌过夜。根据TLC和LCMS监测，大部分醋酸氟轻松P2耗尽。反应混合物用石油醚稀释，然后用饱和Na2CO3溶液淬灭。将悬浮液过滤，所得固体用DCM/甲醇(v/v＝1)洗。合并的滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶快速色谱法纯化(0-100％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P3(0.15g，16％收率)+为白色固体。ESI m/z:467.1(M+H) 。
[0464] 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基甲磺酸酯(P4)
[0465] 在0℃下，向化合物P3(0.28g，0.65mmol)和三乙胺(0.13g，1.3mmol)的DCM(3mL)溶液中加入甲磺酰氯(89mg，0.78mmol)。反应在0℃下搅拌0.5小时后，反应混合物用DCM(20mL)稀释。混合物用水(20mL×2)洗，经无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法在硅胶上纯化(0-50％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P4(0.26g，>99％收+率)为白色固体。ESI m/z:545(M+H) 。
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-叠氮基乙酰基)-12,19-二氟-11-羟基-9,
13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(P5)
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-叠氮基乙酰基)-12,19-二氟-11-羟基-9,
13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(P5)
[0466] 将化合物P4(1.0g，1.8mmol)和叠氮化钠(1.2g，18mmol)的丙酮(15mL)悬浮液在50℃下搅拌过夜。混合物冷却至室温，然后倒入水(80mL)中。含水混合物用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(30mL)洗，经无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到粗品化合物P5(0.90g，＞99％收率)为黄色固体，其无需纯化即可用于下一步骤。ESI m/z:492(M+H)+。
[0467] 有效负载1h，(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-氨基乙酰基)-12,19-二氟-11-羟基-
9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮；三氟乙酸盐(1h)
9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮；三氟乙酸盐(1h)
[0468] 向化合物P5(0.85g，1.7mmol)的THF(20mL)溶液中加入盐酸水溶液(1N，10mL)。混合物在28-32℃下搅拌直至变澄清，然后向混合物中加入三苯膦(0.68g，2.6mmol)。所得黄色澄清溶液在室温下搅拌18小时。将混合物真空浓缩，所得残余物经反相快速色谱法纯化(0-50％乙腈的TFA水溶液(0.05％))，得到化合物1h(0.56g，57％收率，TFA盐)为类白色固+体。ESI m/z:466(M+H) 。
1H NMR(400MHz,MeODd4)δ7.33(d,J＝9.9Hz,1H),6.40-6.29(m,2H),5.69-5.45(m,1H),
4.93-4.92(m,1H),4.71(t,J＝4.3Hz,1H),4.35-4.27(m,2H),3.90-3.84(m,1H),2.81-2.54(m,1H),2.42-2.06(m,3H),1.82-1.32(m,11H),1.09-0.87(m,6H)ppm。19F NMR(376MHz,CD3OD)δ-77.01,-166.24,-166.92,-188.81,-188.83ppm。分析型HPLC：100％，保留时间：
6.86min(方法A)。
1H NMR(400MHz,MeODd4)δ7.33(d,J＝9.9Hz,1H),6.40-6.29(m,2H),5.69-5.45(m,1H),
4.93-4.92(m,1H),4.71(t,J＝4.3Hz,1H),4.35-4.27(m,2H),3.90-3.84(m,1H),2.81-2.54(m,1H),2.42-2.06(m,3H),1.82-1.32(m,11H),1.09-0.87(m,6H)ppm。19F NMR(376MHz,CD3OD)δ-77.01,-166.24,-166.92,-188.81,-188.83ppm。分析型HPLC：100％，保留时间：
6.86min(方法A)。
[0469] 有效负载1i，(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-氨基苯氧基)乙酰基]-12,19-二氟-
11-羟基-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(1i)
11-羟基-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.02,9.04,8.013,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(1i)
[0470] 将化合物P4(93mg，0.17mmol)，4-氨基苯酚(37mg，0.34mmol)和碳酸铯(0.11g，0.34mmol)的丙酮(0.5mL)混合物回流2小时。混合物冷却至室温，并用H2O(10mL)稀释。然后混合物用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。合并的有机层用水(20mL)和盐水(20mL)洗，经Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化，得到有效负载1i(6.0mg，6.3％收率)为白色固体。ESI m/z:298(M/2+H)+,558(M+H)+(10％)。1H NMR(500MHz,MeODd4)δ7.34(d,J＝
10.0Hz,1H),6.78-6.71(m,4H),6.37-6.33(m,2H),5.63-5.49(m,1H),5.10-4.99(m,1H),
4.77-4.63(m,2H),4.33(d,J＝9.1Hz,1H),2.74-2.57(m,1H),2.39-2.13(m,3H),1.98-1.31(m,12H),1.03-0.93(m,6H)ppm。分析型HPLC：纯度97.4％，保留时间：7.55min(方法B)。
有效负载1d的合成，参见图1C
10.0Hz,1H),6.78-6.71(m,4H),6.37-6.33(m,2H),5.63-5.49(m,1H),5.10-4.99(m,1H),
4.77-4.63(m,2H),4.33(d,J＝9.1Hz,1H),2.74-2.57(m,1H),2.39-2.13(m,3H),1.98-1.31(m,12H),1.03-0.93(m,6H)ppm。分析型HPLC：纯度97.4％，保留时间：7.55min(方法B)。
有效负载1d的合成，参见图1C
[0471] (1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸甲酯(P7)
[0472] 向罗汉松酸(P6，90g，0.33mol)的甲醇(200mL)和甲苯(600mL)溶液中加入(三甲基硅烷基)重氮甲烷(2M的己烷溶液，200mL)。反应混合物在室温下搅拌2小时。然后根据LCMS监测罗汉松酸完全耗尽。真空浓缩除去挥发物，将所得残余物在石油醚(2L)中研磨，得到化合物P7(91g，96％收率)为白色固体。ESI m/z:289(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.95(s,1H),6.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.63(d,J＝2.4Hz,1H),6.48(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),3.58(s,
3H),2.80-2.55(m,2H),2.20-2.02(m,3H),1.96-1.71(m,2H),1.56-1.45(m,2H),1.27(t,J＝13.5Hz,1H),1.21(s,3H),1.09(td,J＝13.5,4.1Hz,1H),0.91(s,3H)ppm。
3H),2.80-2.55(m,2H),2.20-2.02(m,3H),1.96-1.71(m,2H),1.56-1.45(m,2H),1.27(t,J＝13.5Hz,1H),1.21(s,3H),1.09(td,J＝13.5,4.1Hz,1H),0.91(s,3H)ppm。
[0473] (1S,4aS,10aR)-1,4a-二甲基-6-(三氟甲磺酰基氧基)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸甲酯(P8)
[0474] 在氮气氛下，向化合物P7(10g，35mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液中加入吡啶(3.3g，42mmol)和DMAP(0.84g，6.9mmol)。将混合物冷却至-78℃，然后加入三氟甲磺酸酐(12g，42mmol)，使所得混合物升温至25℃，并在25℃下再搅拌4小时。反应混合物用DCM(500mL)稀释，然后用水(100mL)、盐酸水溶液(1N，150mL)和盐水(100mL)洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩，得到粗品化合物P8(14g，97％粗收率)为粘稠油状物，其纯度足以用于下一步骤。
粗品化合物P8可通过快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到纯产物为粘稠油状物。ESI m/z:421.2(M+1)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.12(d,J＝2.5Hz,1H),7.10(d,J＝
8.5Hz,1H),6.97(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),3.67(s,J＝3.4Hz,3H),2.93(dd,J＝17.2,4.4Hz,
1H),2.85-2.71(m,1H),2.29(d,J＝13.5Hz,1H),2.25-2.14(m,2H),2.03-1.89(m,2H),
1.71-1.61(m,1H),1.56-1.48(m,1H),1.40(td,J＝13.4,4.2Hz,1H),1.30-1.22(m,3H),
1.09(td,J＝13.6,4.2Hz,1H),1.02(s,3H)ppm。
粗品化合物P8可通过快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到纯产物为粘稠油状物。ESI m/z:421.2(M+1)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.12(d,J＝2.5Hz,1H),7.10(d,J＝
8.5Hz,1H),6.97(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),3.67(s,J＝3.4Hz,3H),2.93(dd,J＝17.2,4.4Hz,
1H),2.85-2.71(m,1H),2.29(d,J＝13.5Hz,1H),2.25-2.14(m,2H),2.03-1.89(m,2H),
1.71-1.61(m,1H),1.56-1.48(m,1H),1.40(td,J＝13.4,4.2Hz,1H),1.30-1.22(m,3H),
1.09(td,J＝13.6,4.2Hz,1H),1.02(s,3H)ppm。
[0475] (1S,4aS,10aR)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸甲酯(P9)
[0476] 室温下，向化合物P8(14g，34mmol)和氨基甲酸叔丁酯(BocNH2，7.9g，68mmol)的叔丁醇(100mL)溶液中依次加入碳酸铯(22g，68mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3，1.8g，2.0mmol)和2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(X-Phos，1.8g，4.0mmol)。将混合物脱气并用氩气充满，重复3次，然后在氩气保护下(气球)在80℃下搅拌过夜，直至化合物P8完全耗尽，通过TLC进行监测。反应冷却至室温后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并通过硅藻土过滤。所得固体用乙酸乙酯洗3次。合并的滤液真空浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(0-6.25％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P9(11g，82％收率)为白色固体。ESI m/z:410(M+23)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.07(s,1H),7.39(s,1H),7.13(d,J＝8.5Hz,
1H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),3.59(s,3H),2.76(dd,J＝16.4,4.5Hz,1H),2.70-2.61(m,1H),
2.16-2.05(m,3H),2.00-1.75(m,2H),1.65-1.50(m,2H),1.45(s,9H),1.31-1.25(m,1H),
1.21(s,3H),1.10(td,J＝13.5,4.1Hz,1H),0.92(s,3H)ppm。
1H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),3.59(s,3H),2.76(dd,J＝16.4,4.5Hz,1H),2.70-2.61(m,1H),
2.16-2.05(m,3H),2.00-1.75(m,2H),1.65-1.50(m,2H),1.45(s,9H),1.31-1.25(m,1H),
1.21(s,3H),1.10(td,J＝13.5,4.1Hz,1H),0.92(s,3H)ppm。
[0477] (1S,4aS,10aR)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸(P10)
[0478] 室温下，向化合物P9(4.9g，13mmol)的DMSO溶液中分批加入叔丁醇钾(15g，0.13mol)。反应混合物在氩气保护下于60℃下搅拌3小时，直至根据LCMS监测反应完成。反应冷却至室温后，将反应混合物倒入冰中，用盐酸水溶液(0.5M)缓慢酸化至pH 5，在此期间温度不得高于25℃。过滤收集沉淀物，并用水洗几次。粗产物经硅胶柱色谱法进一步纯化(0-20％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P10(4.5g，93％收率)为白色固体。ESI m/z:
318(M-55)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ12.08(s,1H),9.08(s,1H),7.40(s,1H),7.11(s,1H),
6.87(d,J＝8.3Hz,1H),2.79-2.68(m,1H),2.65(d,J＝12.6Hz,1H),2.17-2.03(m,4H),
1.94-1.76(m,2H),1.53(d,J＝13.7Hz,1H),1.46(d,J＝7.4Hz,9H),1.29-1.14(m,5H),1.04(s,3H)ppm。
318(M-55)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ12.08(s,1H),9.08(s,1H),7.40(s,1H),7.11(s,1H),
6.87(d,J＝8.3Hz,1H),2.79-2.68(m,1H),2.65(d,J＝12.6Hz,1H),2.17-2.03(m,4H),
1.94-1.76(m,2H),1.53(d,J＝13.7Hz,1H),1.46(d,J＝7.4Hz,9H),1.29-1.14(m,5H),1.04(s,3H)ppm。
[0479] N-[(4bS,8S,8aR)-8-氨基甲酰基-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酸叔丁酯(P11)
[0480] 向P10(4.5g，12mmol)和HATU(4.9g，13mmol)的DMF(50mL)溶液中加入二异丙基乙胺(20mL，0.12mol)，将混合物在25℃下搅拌1小时。然后向混合物中加入氯化铵(16g，0.30mol)，将混合物在室温下搅拌过夜。所得混合物用乙酸乙酯稀释，然后用水和盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经快速色谱纯化(0-20％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P11(4.2g，94％收率)为白色固体。ESI m/z:373.3(M+1)+。1H NMR(500MHz,MeODd4)δ7.20(s,1H),6.97(d,J＝7.7Hz,1H),6.80(d,J＝8.3Hz,1H),2.77-2.68(m,2H),2.66-2.55(m,1H),2.20(d,J＝12.9Hz,1H),2.13(dd,J＝13.2,5.3Hz,1H),2.08(d,J＝14.0Hz,1H),
2.03-1.86(m,2H),1.54(d,J＝11.1Hz,1H),1.40(s,9H),1.26(t,J＝26.7Hz,1H),1.18(s,
3H),1.14-1.03(m,4H)ppm。
2.03-1.86(m,2H),1.54(d,J＝11.1Hz,1H),1.40(s,9H),1.26(t,J＝26.7Hz,1H),1.18(s,
3H),1.14-1.03(m,4H)ppm。
[0481] (1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸甲酯(P13)
[0482] 将化合物P7(12g，40mmol)和碳酸铯(14g，44mmol)的DMF(100mL)混合物在20-25℃下搅拌15分钟。室温下，向此混合物中加入苄基溴(7.1mL，60mmol)。反应在室温下搅拌4小时后，将所得混合物倒入冷水中，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用水和盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。粗产物经快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到标题化合物P13(13g，89％收率)为白色固体。ESI m/z:379(M+H)+。1H NMR(500MHz,MeODd4)δ7.60-7.20(m,5H),7.00-6.82(m,2H),6.73(d,J＝7.1Hz,1H),5.03(s,2H),3.66(s,3H),
2.95-2.58(m,2H),2.36-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.70-1.48(m,2H),1.44-1.21(m,
4H),1.15(t,J＝17.2Hz,1H),1.01(s,3H)ppm。
2.95-2.58(m,2H),2.36-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.70-1.48(m,2H),1.44-1.21(m,
4H),1.15(t,J＝17.2Hz,1H),1.01(s,3H)ppm。
[0483] (1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸(P14)
[0484] 将化合物P13(11g，29mmol)和叔丁醇钾(33g，0.29mol)的DMSO(0.19L)混合物在100℃下搅拌1小时，直至甲基基团完全脱去，通过LCMS和TLC进行监测。反应冷却至25℃后，将混合物用盐酸水溶液(1N)淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(0-24％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P14(7.5g，71％收率)为白色固体。ESI m/z:365(M+H)+。1H NMR(500MHz,MeODd4)δ
7.42(d,J＝7.4Hz,2H),7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.30(t,J＝7.3Hz,1H),6.92(d,J＝8.4Hz,
1H),6.87(d,J＝2.5Hz,1H),6.72(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.02(s,2H),2.82(dd,J＝16.3,
4.4Hz,1H),2.77-2.65(m,1H),2.24(d,J＝13.2Hz,2H),2.19(dd,J＝13.8,6.0Hz,1H),
2.11-1.96(m,2H),1.64-1.56(m,1H),1.53(d,J＝11.0Hz,1H),1.35(td,J＝13.3,3.7Hz,
1H),1.30(s,3H),1.13(s,3H),1.11-1.05(m,1H)ppm。
7.42(d,J＝7.4Hz,2H),7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.30(t,J＝7.3Hz,1H),6.92(d,J＝8.4Hz,
1H),6.87(d,J＝2.5Hz,1H),6.72(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.02(s,2H),2.82(dd,J＝16.3,
4.4Hz,1H),2.77-2.65(m,1H),2.24(d,J＝13.2Hz,2H),2.19(dd,J＝13.8,6.0Hz,1H),
2.11-1.96(m,2H),1.64-1.56(m,1H),1.53(d,J＝11.0Hz,1H),1.35(td,J＝13.3,3.7Hz,
1H),1.30(s,3H),1.13(s,3H),1.11-1.05(m,1H)ppm。
[0485] (1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸五氟苯酯(P15)
[0486] 向P14(9.6g，26mmol)的DMF(100mL)溶液中加入DIPEA(14mL，79mmol)和全氟苯基2,2,2-三氟乙酸酯(15g，53mmol)。所得混合物在室温下搅拌过夜，通过LCMS进行监测。然后将反应混合物用乙醚(200mL)稀释，并用水(300mL)和盐水(200mL)洗。有机溶液经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P15(12g，88％收率)为白色固体。ESI m/z:531(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ7.43(d,J＝
7.1Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),6.93(dd,J＝10.2,5.5Hz,2H),
6.76(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.05(s,2H),2.81(dd,J＝16.3,4.5Hz,1H),2.77-2.68(m,
1H),2.28-2.19(m,2H),2.18(dd,J＝13.4,5.6Hz,1H),2.00-1.83(m,2H),1.74(d,J＝
11.8Hz,1H),1.65(d,J＝14.1Hz,1H),1.47(s,3H),1.38-1.27(m,2H),1.08(s,3H)ppm。
7.1Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),6.93(dd,J＝10.2,5.5Hz,2H),
6.76(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.05(s,2H),2.81(dd,J＝16.3,4.5Hz,1H),2.77-2.68(m,
1H),2.28-2.19(m,2H),2.18(dd,J＝13.4,5.6Hz,1H),2.00-1.83(m,2H),1.74(d,J＝
11.8Hz,1H),1.65(d,J＝14.1Hz,1H),1.47(s,3H),1.38-1.27(m,2H),1.08(s,3H)ppm。
[0487] N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酸叔丁酯(P16)
[0488] 在-78℃下，向化合物P11(2.3g，6.2mmol)的THF(20mL)溶液中滴加正丁基锂(2.5M的己烷溶液，5.5mL，14mmol)。反应混合物在此温度下搅拌反应1小时。向混合物中加入P15(3.0g，5.6mmol)的THF(20mL)溶液，然后将所得混合物在10-20℃下搅拌过夜，直至通过LCMS监测化合物P15耗尽。反应用饱和氯化铵水溶液淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用水和盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经快速色谱法纯化(0-30％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物P16(1.59g，51％收率)为白色固体。ESI m/z:719(M+1)+。
[0489] N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酸叔丁酯(P17)
[0490] 在氮气保护下，向P16(2.0g，2.78mmol)的乙酸乙酯(40mL)溶液中加入湿的钯/碳(10％Pd，0.9g)。将混合物脱气并充满氢气，然后在室温下在氢气球中搅拌过夜，直至P16完全耗尽，通过LCMS进行监测。混合物通过硅藻土过滤，滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(0-55％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到P17(1.06g，61％收率)为白色固体。ESI m/z:629(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ9.10(s,1H),8.98(s,1H),8.11(s,1H),7.40(s,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H),6.63(d,J＝
2.3Hz,1H),6.50(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),2.84(td,J＝16.3,3.8Hz,2H),2.77-2.64(m,2H),
2.30-2.22(m,2H),2.14(t,J＝10.9Hz,4H),2.00-1.80(m,4H),1.65-1.54(m,4H),1.45(s,
9H),1.34-1.28(m,2H),1.27(d,J＝2.5Hz,6H),1.15-1.08(m,2H),0.99(s,6H)ppm。
2.3Hz,1H),6.50(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),2.84(td,J＝16.3,3.8Hz,2H),2.77-2.64(m,2H),
2.30-2.22(m,2H),2.14(t,J＝10.9Hz,4H),2.00-1.80(m,4H),1.65-1.54(m,4H),1.45(s,
9H),1.34-1.28(m,2H),1.27(d,J＝2.5Hz,6H),1.15-1.08(m,2H),0.99(s,6H)ppm。
[0491] 有效负载1d，(1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-氨基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八
氢菲-1-羰基]-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(1d)
氢菲-1-羰基]-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(1d)
[0492] 室温下，向化合物P17(0.17g，0.27mmol)的DCM(10mL)溶液中滴加TFA(3mL)。反应混合物在室温下搅拌1小时，直至根据LCMS监测已脱去Boc。真空浓缩除去挥发物，所得残余物经制备型HPLC纯化(方法B)，得到1d(0.10g，70％收率)为白色固体。
[0493] ESI m/z:529.3(M+1)+。
[0494] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(s,1H),6.92(d,J＝8.3Hz,1H),6.86(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(d,J＝2.5Hz,1H),6.65-6.57(m,2H),6.50(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),4.75(s,1H),
3.49(s,1H),2.99-2.85(m,2H),2.79(tt,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.34-2.14(m,6H),2.15-
1.95(m,4H),1.74-1.51(m,5H),1.46-1.34(m,2H),1.30(s,6H),1.21-1.06(m,8H)ppm。
3.49(s,1H),2.99-2.85(m,2H),2.79(tt,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.34-2.14(m,6H),2.15-
1.95(m,4H),1.74-1.51(m,5H),1.46-1.34(m,2H),1.30(s,6H),1.21-1.06(m,8H)ppm。
[0495] 1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.99(s,1H),8.09(s,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.68(d,J＝8.0Hz,1H),6.63(d,J＝2.5Hz,1H),6.50(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),6.48(d,J＝2.5Hz,1H),6.34(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),4.69(s,2H),2.86-2.60(m,4H),2.28-2.10(m,6H),1.94-
1.75(m,4H),1.65-1.53(m,4H),1.35-1.20(m,8H),1.20-1.06(m,2H),0.98(s,6H)ppm。
1.75(m,4H),1.65-1.53(m,4H),1.35-1.20(m,8H),1.20-1.06(m,2H),0.98(s,6H)ppm。
[0496] 13CNMR(100MHz,DMSOd6)δ174.03,173.92,155.34,148.39,147.63,146.43,129.56,129.09,124.60,121.65,113.23,112.58,111.81,110.77,52.32,52.09,45.56,
45.52,39.20,39.36,38.23,38.17,37.18,37.12,31.08,31.00,27.65,27.64,23.08,
23.03,21.43,21.27,19.64,19.61ppm。
45.52,39.20,39.36,38.23,38.17,37.18,37.12,31.08,31.00,27.65,27.64,23.08,
23.03,21.43,21.27,19.64,19.61ppm。
[0497] HPLC(方法B)：保留时间：8.92min，纯度：99.4％。手性HPLC：>99.9％(在色谱柱AD、AS、OD和OJ中)。
[0498] 旋光度(α)：+2.53°(1.7g/100mL THF,25℃)。实施例65
[0499] 本实施例描述了对某些连接体-有效负载的分析。
[0500] 在与抗体偶联之前，在几种理化测定法和酶测定法中评估了所述连接体-有效负载，以比较含有环糊精基团部分的连接体-有效负载与不含环糊精基团部分的连接体-有效负载。
[0501] 以下试验测定了含有环糊精基团部分的连接体-有效负载和不含环糊精基团部分的连接体-有效负载的溶解度。
[0502] 使用LC-MS方法A或B将测试化合物溶于DMSO中以建立标准曲线。将测试样品溶于水中，超声处理10分钟，然后离心。使用相同的方法A或B来分析上清液，并根据其峰面积来计算溶解度。实施例49(Ex49)的溶解度结果如图12所示。相应的连接体-有效负载(Ex47)的水溶性低于可检测水平。
[0503] 参见图12，实施例49化合物的溶解度。
[0504] 详细测试程序如下所示：1.将0.5mg的测试化合物溶于0.5mLDMSO。
·将所述DMSO溶液(1mg/mL，0.5mL，0.5mg)用水(4.5mL)稀释，得到溶液A(0.1mg/mL，
5mL，0.5mg)。
·将0.5mL溶液A(0.1mg/mL，0.5mL，0.05mg)用水(0.5mL)稀释，得到溶液B(0.05mg/mL，
2mL，0.05mg)。
·将0.5mL溶液A(0.1mg/mL，0.5mL，0.05mg)用水(1.5mL)稀释，得到溶液C(0.025mg/
mL，2mL，0.05mg)。
·将0.5mL溶液A(0.1mg/mL，0.5mL，0.05mg)用水(4.5mL)稀释，得到溶液D(0.01mg/mL，
5mL，0.05mg)。
·将0.5mL溶液D(0.01mg/mL，0.5mL，5μg)用水(4.5mL)稀释，得到溶液E(1μg/mL，5mL，
0.5μg)。
2.将0.05mg化合物悬浮于水(1mL)中并超声处理10分钟。离心后，收集上清液以提供饱和的样品溶液。
3.通过LCMS分析所有标准溶液A、B、C、D、E和样品溶液(使用相同的方法和相同的进样量)以得到峰面积。
4.根据A-D的数据计算标准曲线(X＝浓度，Y＝峰面积)。
5.根据以上得到的函数计算得到饱和样品溶液的浓度。
实施例66
·将所述DMSO溶液(1mg/mL，0.5mL，0.5mg)用水(4.5mL)稀释，得到溶液A(0.1mg/mL，
5mL，0.5mg)。
·将0.5mL溶液A(0.1mg/mL，0.5mL，0.05mg)用水(0.5mL)稀释，得到溶液B(0.05mg/mL，
2mL，0.05mg)。
·将0.5mL溶液A(0.1mg/mL，0.5mL，0.05mg)用水(1.5mL)稀释，得到溶液C(0.025mg/
mL，2mL，0.05mg)。
·将0.5mL溶液A(0.1mg/mL，0.5mL，0.05mg)用水(4.5mL)稀释，得到溶液D(0.01mg/mL，
5mL，0.05mg)。
·将0.5mL溶液D(0.01mg/mL，0.5mL，5μg)用水(4.5mL)稀释，得到溶液E(1μg/mL，5mL，
0.5μg)。
2.将0.05mg化合物悬浮于水(1mL)中并超声处理10分钟。离心后，收集上清液以提供饱和的样品溶液。
3.通过LCMS分析所有标准溶液A、B、C、D、E和样品溶液(使用相同的方法和相同的进样量)以得到峰面积。
4.根据A-D的数据计算标准曲线(X＝浓度，Y＝峰面积)。
5.根据以上得到的函数计算得到饱和样品溶液的浓度。
实施例66
[0505] 含有和不含环糊精的连接体-有效负载的组织蛋白酶B切割率
[0506] 组织蛋白酶B测定法的程序如下，测试结果总结在表8中。
[0507] 步骤1：组织蛋白酶B缓冲液的制备：0.1MNaOAc/0.01M DTT(pH5.0)将8.3g/LNaOAc和1.54g/LDTT溶于去离子水中。用HCl/氢氧化钠调节pH至5.0。
[0508] 步骤2：测试切割率1.准备25μM测试样品：向2mL试管中加入0.5mg测试样品，然后加入0.2mL DMSO。将所得溶液滴加至0.8mL的0.1M NaOAc/0.01M DTT缓冲液中。将得到的混合物超声处理5分钟，以获得澄清且无色的溶液。根据pH测试试纸，溶液的pH值为约5。
2.预热测定缓冲液：0.1M NaOAc/0.01M DTT(pH 5.0)
3.测试化合物的加标溶液：25μM测试化合物的加标溶液：将2μL的5mM储备溶液加至398μL的0.1M NaOAc/0.01M DTT缓冲液(pH 5.0)中。
4.在50mM NaOAc/1mM EDTA(pH 5.0)中制备0.47μg/μL组织蛋白酶B。放置在冰上。
5.不含CA074样品：将4μL的0.47μg/μL组织蛋白酶B加入196μL的25μM加标溶液中(来自步骤2)，在管中于37℃下孵育。
6.含CA074样品：向196μL的25μM加标溶液(来自步骤2)中，加入4μL的0.47μg/μL组织蛋白酶B和4μL的10mM抑制剂(CA074)，在管中孵育。
7.淬灭后，摇动平板并在14000rpm下离心。
8.将每孔中的50μL上清液转移至含有50μL超纯水(Millipore，ZMQS50F01)的96孔样品板中，以进行LC/MS分析。
2.预热测定缓冲液：0.1M NaOAc/0.01M DTT(pH 5.0)
3.测试化合物的加标溶液：25μM测试化合物的加标溶液：将2μL的5mM储备溶液加至398μL的0.1M NaOAc/0.01M DTT缓冲液(pH 5.0)中。
4.在50mM NaOAc/1mM EDTA(pH 5.0)中制备0.47μg/μL组织蛋白酶B。放置在冰上。
5.不含CA074样品：将4μL的0.47μg/μL组织蛋白酶B加入196μL的25μM加标溶液中(来自步骤2)，在管中于37℃下孵育。
6.含CA074样品：向196μL的25μM加标溶液(来自步骤2)中，加入4μL的0.47μg/μL组织蛋白酶B和4μL的10mM抑制剂(CA074)，在管中孵育。
7.淬灭后，摇动平板并在14000rpm下离心。
8.将每孔中的50μL上清液转移至含有50μL超纯水(Millipore，ZMQS50F01)的96孔样品板中，以进行LC/MS分析。
[0509] 步骤3：测试参考化合物：9.预热测定缓冲液：100mM Na/K磷酸盐，pH 6.0，含有1.33mM EDTA和2mM DTT。
10.准备0.024μg/μL组织蛋白酶B：将1μL 0.47μg/μL组织蛋白酶B储备液加至19μL测定缓冲液中(来自步骤11)。
11.将2μL的0.024μg/μL组织蛋白酶B(来自步骤12)加至不透明的96孔板中。
12.将96μL测定缓冲液加至每个样品中。
13.加入2μL的10mM底物Z-RR-MNA(200μM终浓度)。
14.对于阴性对照(含抑制剂)，加入2μL的10mM抑制剂(CA074)：立即以动力学模式在
340nm激发/425nm发射下读取样品(每30秒读取平板一次，持续3分钟)。
10.准备0.024μg/μL组织蛋白酶B：将1μL 0.47μg/μL组织蛋白酶B储备液加至19μL测定缓冲液中(来自步骤11)。
11.将2μL的0.024μg/μL组织蛋白酶B(来自步骤12)加至不透明的96孔板中。
12.将96μL测定缓冲液加至每个样品中。
13.加入2μL的10mM底物Z-RR-MNA(200μM终浓度)。
14.对于阴性对照(含抑制剂)，加入2μL的10mM抑制剂(CA074)：立即以动力学模式在
340nm激发/425nm发射下读取样品(每30秒读取平板一次，持续3分钟)。
[0510] 步骤4：组织蛋白酶B在孵育样品中的稳定性：15.取5μL孵育样品加入93μL测定缓冲液(来自步骤11)中，然后加入2μL 10mM底物(Z-RR-MNA)。
16.将样品在37℃下孵育2分钟。
17.在340nm激发/425nm发射下读取样品。
16.将样品在37℃下孵育2分钟。
17.在340nm激发/425nm发射下读取样品。
[0511] 通常，具有vcPAB-部分的大多数偶联物可被capB切割，切割率>50％。
[0512] 通常，将环糊精插入连接体可增加组织蛋白酶B的切割率，例如从14％(实施例47(Ex47))增至62％(实施例48(Ex48))。
[0513] 测试其他样品并总结在表8中。通常，大多数测试化合物在HPLC上的保留时间(RT)为6至7分钟。如果保留时间(RT)>7min，则cLogP大于5，并且其水溶性差。表8.含有环糊精的连接体-有效负载的溶解度和CapB(组织蛋白酶B)切割率
*A和B：分别参见一般方法中的HPLC方法A和方法B。
**：在其他溶剂中的水溶性
对于实施例44化合物：在20％DMSO/水中为0.06mg/mL；在30％DMSO/水中为0.07mg/mL。
对于实施例46化合物：在10％DMSO/H2O中为0.10mg/mL。
+≤-6cLogP
-6<++≤-3cLogP
-3<+++≤1cLogP
1<++++≤5cLogP
5<+++++≤9.5cLogP
％≤50CapB(％)
50<％％≤60CapB(％)
60<％％％≤70CapB(％)
70<％％％％≤80CapB(％)
80<％％％％％
表8A.含有环糊精与不含环糊精的连接体-有效负载的溶解度和CapB(组织蛋白酶B)切
割率的比较
实施例67
*A和B：分别参见一般方法中的HPLC方法A和方法B。
**：在其他溶剂中的水溶性
对于实施例44化合物：在20％DMSO/水中为0.06mg/mL；在30％DMSO/水中为0.07mg/mL。
对于实施例46化合物：在10％DMSO/H2O中为0.10mg/mL。
+≤-6cLogP
-6<++≤-3cLogP
-3<+++≤1cLogP
1<++++≤5cLogP
5<+++++≤9.5cLogP
％≤50CapB(％)
50<％％≤60CapB(％)
60<％％％≤70CapB(％)
70<％％％％≤80CapB(％)
80<％％％％％
表8A.含有环糊精与不含环糊精的连接体-有效负载的溶解度和CapB(组织蛋白酶B)切
割率的比较
实施例67
[0514] 在不同的pH缓冲液下，含有或不含环糊精的连接体-有效负载的稳定性
[0515] 将测试样品溶于0.5mg/mL的pH值为5.0、7.4或8.0的20％DMSO+80％PBS缓冲液中。缓冲液的制备如下所示：
1.0.05M磷酸钠和0.07MNaCl缓冲液，pH 7.4：
·将14.505g/L Na2HPO4_12H2O，1.483g/L NaH2PO4_2H2O和4.095g/L NaCl溶于去离子
水中。用磷酸/氢氧化钠调节pH至7.40。
2.具有0.5％BSA的PBS：
·将0.5gBSA溶于100mL缓冲液1中。
1.0.05M磷酸钠和0.07MNaCl缓冲液，pH 7.4：
·将14.505g/L Na2HPO4_12H2O，1.483g/L NaH2PO4_2H2O和4.095g/L NaCl溶于去离子
水中。用磷酸/氢氧化钠调节pH至7.40。
2.具有0.5％BSA的PBS：
·将0.5gBSA溶于100mL缓冲液1中。
[0516] 结果表明，DIBAC-亲水性连接体-有效负载在pH 6-8下相当稳定，在测试时仍保留＞95％。所述连接体的亲水性增加导致连接体-有效负载的水稳定性随时间而增加。
实施例68
实施例68
[0517] ADC偶联物
[0518] 图13和14分别概述了马来酰亚胺-连接体-有效负载与抗体的偶联物(图13)以及通过[3+2]点击反应DIBAC-连接体-有效负载与叠氮基官能化抗体的偶联物(图14)。
[0519] 用于偶联至抗体的非位点特异性马来酰亚胺-连接体-有效负载的一般方法E
[0520] 本实施例说明了通过迈克尔加成或硫醇-马来酰亚胺键形成，非特异性地将连接体-有效负载偶联至抗体或抗原结合片段的方法。本实施例涉及图13所示化合物。通过抗体-半胱氨酸的偶联使用类似于制备 类ADC的方法分两步进行(参见Mol.Pharm.2015,12(6),1863-71)。用1mM二硫苏糖醇(0.006mg每mg抗体)或TCEP(相对于抗体为2.5摩尔当量)在37℃下，将pH值为7-8的单克隆抗体(mAb)(10mg/mL的50mM HEPES、
150mMNaCl溶液)还原30分钟。凝胶过滤(G-25，pH 4.5乙酸钠)后，将在DMSO中的浓度为1-
10mg/mL的实施例38化合物加至经还原的抗体中，并将反应搅拌3-14小时。所得混合物经SEC纯化以生成纯的偶联物。使用测定的ADC吸光度以及抗体和实施例38化合物的消光系数来确定DAR(UV)值。偶联结果总结于下表9中。
150mMNaCl溶液)还原30分钟。凝胶过滤(G-25，pH 4.5乙酸钠)后，将在DMSO中的浓度为1-
10mg/mL的实施例38化合物加至经还原的抗体中，并将反应搅拌3-14小时。所得混合物经SEC纯化以生成纯的偶联物。使用测定的ADC吸光度以及抗体和实施例38化合物的消光系数来确定DAR(UV)值。偶联结果总结于下表9中。
[0521] 由Ab-实施例38(Ab-Ex38)表示的通过迈克尔加成的偶联。参见图13。表9.通过迈克尔加成进行偶联的实例
实施例69
实施例69
[0522] 抗体与炔烃-连接体-有效负载进行位点特异性偶联的一般方法F
[0523] 本实施例说明了用于抗体或其抗原结合片段与连接体-有效负载进行位点特异性偶联的一般方法。本实施例涉及图14所示的化合物。
[0524] 在本实施例中，分两步生成了位点特异性偶联物。第一步是基于微生物转谷氨酰胺酶(MTG)，将小分子(例如叠氮化物-PEG3-胺(同上))与具有Q标签(参考Qtag)的抗体进行酶促连接(以下称为“基于MTG”的偶联)。第二步是通过[2+3]环加成，例如叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成(又称无铜点击化学反应)，将连接体-有效负载连接至叠氮基官能化抗体上。参见Baskin,J.M.；Prescher,J.A.；Laughlin,S.T.；Agard,N.J.；Chang,P.V.；Miller,I.A.；Lo,A.；Codelli,J.A.；Bertozzi,C.R.PNAS 2007,104(43),16793–7。图14示出的是具有DIBAC基团部分的连接体-有效负载与叠氮基官能化抗体通过[2+3]环加成进行偶联的实例。此方法以约50–80％的分离收率提供了位点特异性和化学计量的偶联物。
[0525] 方案10.现图14通过Ab-Ex49(Ab-实施例49)表示的通过[2+3]点击反应的ADC偶联。
[0526] 步骤1：叠氮基官能化抗体的制备。
[0527] 在PBS(pH 6.5–8.0)中，将无糖基化的人抗体IgG(IgG1、IgG4等)或具有N297Q突变的人IgG1同种型与≥200摩尔当量的叠氮基-dPEG3-胺(MW＝218.26g/mol)混合。将所得溶液与MTG(EC 2.3.2.13，来自德国达德施塔特(Darmstadt)的Zedira或ModernistPantry[L#210115A]-ACTIVA TI包含来自日本味之素(Ajinomoto)的麦芽糖糊精(Maltodextrin))
(25U/mL；每毫克抗体5UMTG)混合，使得抗体最终浓度为0.5–5mg/mL，然后将溶液于37℃下孵育4–24h，同时轻轻振荡。反应通过ESI-MS进行监测。反应完成后，通过SEC或蛋白A柱色谱法除去过量的胺和MTG，以生成叠氮基官能化抗体。在SDS-PAGE(参见图15)和ESI-MS(参见图16)上分析此产物。将叠氮基-dPEG3-胺添加至抗体的两个位点，使得所述2DAR抗体-PEG3-叠氮化物偶联物增加204Da。
(25U/mL；每毫克抗体5UMTG)混合，使得抗体最终浓度为0.5–5mg/mL，然后将溶液于37℃下孵育4–24h，同时轻轻振荡。反应通过ESI-MS进行监测。反应完成后，通过SEC或蛋白A柱色谱法除去过量的胺和MTG，以生成叠氮基官能化抗体。在SDS-PAGE(参见图15)和ESI-MS(参见图16)上分析此产物。将叠氮基-dPEG3-胺添加至抗体的两个位点，使得所述2DAR抗体-PEG3-叠氮化物偶联物增加204Da。
[0528] 在具体实验中，在MTG(0.350mL，35U，mTGase，Zedira，Darmstadt(达姆施塔特)，德国)存在下，将7mL无钾PBS缓冲液(pH 7.3)中的N末端Q标签抗体(24mg)与>200摩尔当量的叠氮基-PEG3-胺(MW 218.26)一起温育。将反应物在37℃下温育过夜，同时轻轻混合。通过体积排除色谱法(SEC，Superdex 200PG，GE Healthcare)除去过量的叠氮基-PEG3-胺和mTGase。
[0529] 步骤2：使用点击化学反应来制备药物与抗体的位点特异性偶联物。
[0530] 通过叠氮基官能化抗体与含有连接体-有效负载的炔烃之间的[2+3]点击反应，来制备表10中具有人IgG(IgG1、IgG4等)的位点特异性抗体药物偶联物。详细的偶联程序如下。通过将mAb–PEG3–N3(1-3mg/mL)在溶于适当有机溶剂(如DMSO、DMF或DMA)(即，反应混合物包含5-20％的有机溶剂，v/v)中的≥6摩尔当量LP的水性介质(例如PBS，含5％甘油的PBS，HBS)中，在24℃至37℃下孵育6小时，来制备具有连接体-有效负载(LP)的位点特异性抗体偶联物。通过ESI-MS监测反应进程，并且不存在mAb–PEG3–N3表示偶联完成。通过SEC用PBS进行洗脱，或通过蛋白A柱色谱法用酸性缓冲液进行洗脱，然后用Tris(pH 8.0)中和，来除去过量的LP和有机溶剂。
[0531] 在具体实施例中，在室温下，用6摩尔当量的DIBAC-PEG4-D-Lys(COT-∝-CD)-VC-PABC-有效负载(浓度为10mg/mL的DMSO溶液)处理0.800mL PBSg(PBS，5％甘油，pH 7.4)中的叠氮基官能化抗体(1mg)6-12小时，然后通过体积排除色谱法(SEC，Superdex 200HR，GE Healthcare)除去过量的连接体有效负载(LP)。
[0532] 通过超速离心法浓缩最终产物，并通过UV、SEC、SDS-PAGE和ESI-MS进行表征。
[0533] 表10示出了来自相应LP的非细胞毒性类固醇抗体偶联物(ncADC)，其裸抗体、叠氮基官能化抗体、LP和ncADC的分子量，以及ESI-DAR值。在表中，Ab是指抗体，Ab–N3是指叠氮基官能化抗体，和ncADC是指非细胞毒性抗体药物偶联物。表10.具有含CD的连接体-有效负载的位点特异性偶联物列表
实施例70
实施例70
[0534] 用于表征抗体和抗体-药物-偶联物的一般方法G
[0535] 通过SEC、SDS-PAGE和ESI-MS来分析纯化的偶联物。表10中的抗Her2-LP偶联物是通过表10中的叠氮基官能化抗体(抗Her2–PEG3–N3)与LP的点击反应，由抗Her2抗体生成。所述ADC通过SEC(图15)、ESI-MS、和SEC(图16)进行表征。
[0536] 通过SDS–PAGE对ADC进行表征
[0537] 在其中一种方法，SDS-PAGE条件包括非还原和还原的样品(2-4μg)以及BenchMark预染色蛋白质阶梯(BenchMarkPre–StainedProteinLadder，Invitrogen，目录号10748-010；L#1671922.)，其每泳道载入(1.0mmx 10孔)Novex 4-20％Tris–甘氨酸凝胶，并在
180V、300mA下运行80分钟。使用Novex Tris-甘氨酸SDS缓冲液(2倍)(Invitrogen，目录号LC2676)制备分析样品，所述还原样品采用含10％2-甲巯基乙醇的SDS样品缓冲液(2倍)制得。
180V、300mA下运行80分钟。使用Novex Tris-甘氨酸SDS缓冲液(2倍)(Invitrogen，目录号LC2676)制备分析样品，所述还原样品采用含10％2-甲巯基乙醇的SDS样品缓冲液(2倍)制得。
[0538] 在图15中示出了代表性凝胶，其表明在还原条件下进行的SDS-PAGE上抗体和ADC的分子量略有变化。在轻链上未观测到质量变化。但与裸抗体相比，ADC重链的质量增加了。未发现可检测到的交联物质，也未发现可检测到的聚集体。
[0539] 图15.抗Her2抗体、抗Her2–PEG3–N3和抗Her2-EX49的考马斯染色的(Coomassie-stained)SDS-PAGE凝胶。在图15中，根据以下图例标记泳道：
[0540] 通过LC–ESI–MS对ADC进行表征
[0541] 通过LC-ESI-MS来测定ncADC样品的完整质量以确定药物-有效负载分布曲线，并计算平均DAR。将每个测试样品(20-50ng，5uL)上样到Acquity UPLC ProteinBEH C4柱(10Kpsi， 1.7μm，75μm×100mm；目录号186003810)上。脱盐3分钟后，对蛋白质进行洗脱，并通过Waters Synapt G2-Si质谱仪获得质谱。
[0542] 解卷积质谱示出了分子量为145126.0Da的无糖基化抗Her2抗体的主要峰，并且其叠氮基官能化抗Her2抗体的主要峰具有145932.0Da的分子量，表明与其无糖基化的亲本抗体相比增加了806Da(对应于与每种无糖基化抗体偶联的4个氨基–PEG3–叠氮化物)。此外，抗Her2-LP偶联物的主要峰具有152166.0Da的分子量，表明与其无糖基化的亲本抗体相比增加了6234Da(对应于与每种无糖基化抗体偶联的4个LP(MW＝1558.5Da))。如表3所示，本发明中的大多数位点特异性ADC均具有4DAR。实施例71
[0543] 本实施例示出了通过SEC对ADC进行表征。
[0544] 使用Waters 600仪器，在Superdex 200(1.0x30cm)色谱柱上以0.80mL/min的流速使用PBS pH 7.4进行分析型SEC实验，并使用Waters 2998PDA在λ＝280nm处进行监测。分析样品由200μL PBS(pH 7.4)和30-100μL测试样品组成。使用GE Healthcare的AKTA仪器，在Superdex 200PG(2.6x60 cm)色谱柱上以2mL/min的流速用PBS pH 7.4洗脱，进行制备性SEC纯化，并在λ＝280nm处进行监测。图16中的SEC结果示出了单体mAb及其偶联物的典型保留时间，并且未发现可检测到的聚集体或降解物。
[0545] 图16.抗Her2 Ab、抗Her2–PEG3–N3、和抗Her2-Ex49的SEC。实施例72
[0546] 本实施例示出了含有和不含环糊精连接体的细胞毒性ADC的生物活性(图17)。
[0547] 为了评估具有或不具有包含CD的细胞毒性有效负载的ADC的可比性，使用了SKBR3细胞进行细胞毒性测定。SKBR3细胞已普遍用于评估aHer2 ADC活性。在SKBR3细胞毒性试验中，aPRLR ADC被用作对照mAb ADC。对于所述测定试验，使用CellTiter-Glo分析试剂盒(Assay Kit，Promega，目录号G7573)评估了抗Her2 ADC或PRLR ADC的体外细胞毒性，其中所存在的ATP的量用于确定培养物中活细胞的数量。对于所述测定试验，将SKBR3细胞以6000个细胞/孔接种在Nunclon白色96孔板上的完全生长培养基中，并在37℃下、5％CO2中生长过夜。对于细胞活力曲线，以100nM的浓度(包括无处理对照)将1：4连续稀释的ADC或游离有效负载MMAE添加至细胞，然后孵育5天。孵育5天后，将细胞与100μL CellTiter-Glo试剂在室温下孵育5分钟。相对发光单位(RLU)在Victor读板仪(PerkinElmer)上测定。IC50值是通过10点响应曲线上的四参数逻辑斯蒂方程进行确定(GraphPad Prism)。所有曲线和EC50值均针对有效负载当量进行校正。所有IC50均以nM浓度表示，并报告了所测试的最高浓度的杀死细胞百分比(杀死率％)。
[0548] 如表11和图17所示，含CD的抗Her2 Ab ADC(实施例38(Ex38)、实施例40(Ex40)、实施例41(Ex41)、实施例48(Ex48)、实施例42(Ex42)、实施例39(Ex39))与不含CD的抗Her2 Ab ADC(抗Her2 Ab-Ex36)具有相似的杀死SKBR3细胞的功效。两组抗HER2 ADC在测试的最高浓度下均显示出大于90％的杀死率。在本测定试验中，未偶联的抗体未显示出任何效果。同种型对照ADC，无论它们是否包含CD，均未在此试验中显示出任何效果。表11：含有或不含环糊精连接体的ADC在SKBR3细胞中的细胞毒性
NA＝不适用
NA＝不适用
[0549] 图18示出了含有和不含环糊精连接体的类固醇ADC的生物活性。
[0550] 为了测试含类固醇有效负载的具有和不具有CD的ADC的可比性，在孵育72小时后研究了它们在293/PRLR/GRE-Luc细胞中的活性。对于所述测定试验，将20,000个细胞接种到96孔板中的含有DMEM、补充有10％FBS和青霉素/链霉素的培养基(完全培养基)中，并在37℃下、5％CO2中生长过夜。对于游离药物或ADC剂量响应曲线，将100nM至5.1pM的连续稀释试剂添加至细胞中，并在37℃下孵育72小时。通过添加One-GloTM试剂(Promega，目录号E6130)来确定荧光素酶活性，并在Victor发光计(PerkinElmer)上测定相对光单位(RLU)。
EC50值是使用GraphPadPrism由10点响应曲线上的四参数逻辑斯蒂方程进行确定。类固醇的递送将导致293/PRLR/GRE-Luc细胞中的Luc报告基因激活。本测定试验中的完全激活定义为使用游离有效负载测得的90％至100％的最大激活。本测定试验中的部分激活定义为使用游离有效负载测得的10％至90％的最大激活的激活。本测定试验中的最小激活定义为使用游离有效负载测得的小于10％的最大激活。
EC50值是使用GraphPadPrism由10点响应曲线上的四参数逻辑斯蒂方程进行确定。类固醇的递送将导致293/PRLR/GRE-Luc细胞中的Luc报告基因激活。本测定试验中的完全激活定义为使用游离有效负载测得的90％至100％的最大激活。本测定试验中的部分激活定义为使用游离有效负载测得的10％至90％的最大激活的激活。本测定试验中的最小激活定义为使用游离有效负载测得的小于10％的最大激活。
[0551] 如表12和图18所示，含CD的抗PRLR Ab ADC(抗PRLR Ab-Ex46、抗PRLR Ab-Ex47)与不含CD的抗PRLR Ab ADC(抗PRLR Ab-Ex45)一样，在293/PRLR/GRE-Luc细胞中在激活GRE-Luc报告基因方面，具有相似的功效和效力。在本测定试验中，同种型对照ADC(无论它们是否包含CD)以及未偶联的抗体均未在本试验中显示出任何明显效果。表12：293/PRLR/GRE-LUC细胞中含有或不含环糊精连接体的类固醇ADC的GR激活
NA＝不适用
NA＝不适用
[0552] 含有和不含环糊精连接体的LXR激动剂ADC的生物活性。参见图19。
[0553] 为了测试含有和不含CD的包含LXR激动剂的ADC的可比性，在THP1/LXR-Luc/Her2生物测定中测试了含有和不含CD的抗HER2 Ab ADC激活LXR的能力。在所述测定试验中，将THP1/LXR-Luc细胞或THP1/LXR-Luc/Her2细胞以30,000个细胞/孔接种到白色96孔板上的培养基中，所述培养基含有RPMI，补充有10％FBS和青霉素/链霉素(完全培养基)。随后将抗体药物偶联物、未偶联的抗体或游离有效负载的3倍连续稀释液以100nM至0.01nM的终浓度添加至细胞中。孵育48小时后，向细胞的每个孔中加入One-GloTM试剂(Promega，E6130)后，测定荧光素酶活性。在Victor光度计(PerkinElmer)上测定相对光单位(RLU)，并使用四参数逻辑斯蒂方程在10点剂量响应曲线(GraphPadPrism)上确定EC50值。本发明的LXR激动剂和参考化合物的EC50值均示于表13中。ncADC和相应的LXR激动剂的EC50值均示于表13中。本测定试验中的完全激活定义为使用游离有效负载1d测得的95％至超过100％的最大激活。本测定试验中的部分激活定义为使用游离有效负载1d测得的10％至94.9％的最大激活。本测定试验中的最小激活定义为使用游离有效负载1d测得的小于10％的最大激活。
[0554] 如表13和图19所示，含有CD并释放有效负载1d的抗Her2 Ab ADC(抗Her2 Ab-Ex49)在THP1/Her2/LXR-Luc细胞中在激活LXR方面，与不包含CD且释放有效负载1d的抗Her2 Ab ADC(抗Her2 Ab-Ex48)具有类似的功效和效力。与游离有效负载1d相比，另一包含CD且释放有效负载1f的抗Her2 Ab ADC也显示出完全激活。在本测定试验中，未偶联的抗体未显示出任何效果。同种型对照ADC，无论它们是否包含CD，在大多数测试浓度下均无明显效果。一些同种型对照在最高测试浓度下确实显示出一定的部分激活。
表13：LXR激动剂和ncADC在THP1/LXR-LUC/HER2试验中的激活
NA＝不适用
表13：LXR激动剂和ncADC在THP1/LXR-LUC/HER2试验中的激活
NA＝不适用
[0555] 也可参见J.Am.Chem.Soc.,2012,134(46),19108-19117；Org.Biomol.Chem.,2009,7(8),1680-1688和US2015/284416A1；Angew.Chem.Int.Ed.,2011,50(47),11117-
11120；J.Am.Chem.Soc.,2012,134(46),18886-18888；Synthesis(Germany),201446(5),
669-677。
实施例73
11120；J.Am.Chem.Soc.,2012,134(46),18886-18888；Synthesis(Germany),201446(5),
669-677。
实施例73
[0556] 为了确定当在连接体中添加环糊精基团部分时类固醇有效负载或LXR激动剂有效负载对切割效率的影响，进行了组织蛋白酶B切割测定试验。对于所述测定试验，将连接体-有效负载储备溶液(10mM连接体-有效负载的DMSO溶液)加至pH值为5的100mMNaOAc、10mM二硫苏糖醇溶液中，以得到50μM底物溶液。将pH值为5的50mMNaOAc、1mM EDTA中的人肝组织蛋白酶B(Athens Research&Technology，目录号16-12-030102)加至底物溶液中。将所述组织蛋白酶B和底物溶液与和不与10mM组织蛋白酶B抑制剂(CA074；APE Bio，目录号A1926)混合，并在37℃下孵育4小时。孵育4小时后，加入乙酸，然后加入乙腈以终止反应。然后将淬灭的样品以14,000rpm进行离心。然后将等份的上清液用等体积的水稀释，并通过LC/MS进行分析以确定释放的有效负载的量。组织蛋白酶B的稳定性和活性通过与组织蛋白酶B的200μM荧光底物(Santa Cruz Biotechnology，目录号207975)(激发波长为340nm/发射波长为425nm的荧光)一同孵育来确证。
[0557] 如表14所示，当用组织蛋白酶B处理4小时时，不含环糊精的LXR激动剂连接体有效负载释放了13.6％的游离有效负载，而当使用组织蛋白酶B处理4小时时，含有环糊精的LXR激动剂连接体有效负载释放了38.5％的游离有效负载。当用组织蛋白酶B处理4小时时，不含环糊精的类固醇连接体有效负载释放了7.5-17.2％的游离有效负载，而当使用组织蛋白酶B处理4小时时，含有环糊精的类固醇连接体有效负载释放了28.9％的游离有效负载。表14：组织蛋白酶B试验中含有环糊精基团部分和不含环糊精基团部分的链接体有效
负载释放的有效负载的量
实施例74
负载释放的有效负载的量
实施例74
[0558] 为了确定添加环糊精连接体对抗MSR1抗体LXR激动剂非细胞毒性ADC的活性的影响，开发了体外的基于细胞的LXR响应性荧光素酶报告基因测定法。为了生成测定细胞系，将LXR调节的荧光素酶报道基因[Cignal Lenti LXR Reporter(luc)试剂盒(Qiagen，目录号CLS-001L)]转导至THP1细胞，并在嘌呤霉素中对所述细胞进行选择两周。慢病毒在最小的CMV启动子和LXR转录反应元件的串联重复序列的控制下表达萤火虫荧光素酶基因。所得细胞系称为THP1/LXR-Luc细胞。
[0559] 对于所述测定试验，将THP1/LXR-Luc细胞以40,000个细胞/孔接种到96孔板的培养基中，所述培养基含有RPMI，补充有10％FBS和青霉素/链霉素，然后用200nM佛波醇(Phorbol)肉豆蔻酸酯乙酸酯分化3天。经过3天的分化之后，在新鲜培养基中，将抗体药物偶联物的三倍连续稀释液以100nM至0.01nM的终浓度加至细胞中。板中的最后一个孔用作仅包含培养基的空白对照。48小时后，在向每个孔中添加One-GloTM试剂(Promega，目录号E6130)后，测定荧光素酶活性。在Victor光度计(PerkinElmer)上测定相对光单位(RLU)，并使用四参数逻辑斯蒂方程在10点剂量响应曲线(GraphPad Prism)上确定EC50值。表15示出了每个测试分子的EC50值。对于每种抗MSR1抗体，通过计算标准品1的RLU相对于标准品8的RLU来确定信噪比(S/N)。
[0560] 如表15所示，与不含环糊精的LXR激动剂连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-Ex 48)表现出对THP1/LXR-Luc细胞的刺激，EC50值为1.77nM，S/N值为16。与含环糊精的LXR激动剂连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-Ex 49)表现出对THP1/LXR-Luc细胞的刺激，EC50值为1.99nM，S/N值为17。
表15：基于THP1/LXR-LUC细胞试验的抗MSR1 AB-LXR激动剂ncADC的活性
实施例75
表15：基于THP1/LXR-LUC细胞试验的抗MSR1 AB-LXR激动剂ncADC的活性
实施例75
[0561] 为了确定添加环糊精连接体对抗MSR1抗体类固醇非细胞毒性ADC的活性是否有影响，进行了体外脂多糖(LPS)介导的IL-1β释放测定法。对于所述测定试验，将THP-1细胞以40,000个细胞/孔接种到96孔板的培养基中，所述培养基含有RPMI，补充有10％FBS和青霉素/链霉素，并用200nM佛波醇(Phorbol)肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)分化3天。经过3天的分化之后，在新鲜培养基中，将抗体药物偶联物的三倍连续稀释液以100nM至0.01nM的终浓度加至细胞中。板中的最后一个孔用作仅包含培养基的空白对照。72小时后，将细胞用5μg/mL的LPS(InVivoGen，目录号tlrl-eklps)处理5小时。然后收集细胞培养基，并按照制造商的说明书使用V-PLEX Proinflammatory Panel 1人用试剂盒(Meso Scale Diagnostics，目录号15049D-2)来测定IL-1β。随后在MSD读板仪(Meso Scale Discovery)上读取所述板。IC50值是通过10点响应曲线上的四参数逻辑斯蒂方程(GraphPad Prism)进行确定。所有IC50值均以摩尔(M)浓度表示。
[0562] 如表16所示，与不含环糊精的类固醇连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-Ex 58)表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的抑制，IC50值为
1.73nM，且释放的IL-1β降低至97.2pg/mL。与不含环糊精的类固醇连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-Ex 59)表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的相似抑制，IC50值为1.33nM，且释放的IL-1β降低至126.46pg/mL。未偶联的抗体表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的抑制，IC50值为22.9nM，释放的IL-1β降低至343.7pg/mL，与偶联的抗体相比缺乏功效。
表16：抗MSR1 AB-类固醇ncADC对LPS诱导的THP1细胞IL-1β释放的活性
1.73nM，且释放的IL-1β降低至97.2pg/mL。与不含环糊精的类固醇连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-Ex 59)表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的相似抑制，IC50值为1.33nM，且释放的IL-1β降低至126.46pg/mL。未偶联的抗体表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的抑制，IC50值为22.9nM，释放的IL-1β降低至343.7pg/mL，与偶联的抗体相比缺乏功效。
表16：抗MSR1 AB-类固醇ncADC对LPS诱导的THP1细胞IL-1β释放的活性
[0563] 上述实施方案和实施例旨在仅是说明性的而非限制性的。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验便可以确定许多等同的具体化合物、材料/物料和程序/方法。所有此类等同形式均认为包含在本发明范围内，并被所附权利要求所涵盖。
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