马流产沙门氏菌马源株及其在制备马流产沙门氏菌灭活疫苗中的应用
阅读：185发布：2020-05-08
专利汇可以提供马流产沙门氏菌马源株及其在制备马流产沙门氏菌灭活疫苗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 马 流产沙 门 氏菌马源株及其在制备马流产沙门氏菌灭活 疫苗 中的应用，属于 生物 疫苗技术领域。本发明所述的马流产沙门氏菌马源株，命名为20180316.H.AES.G，保藏在中国 微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.18341。本发明的马流产沙门氏菌马源株20180316.H.AES.G具有免疫原性好、培养特性好等优点，将本发明的马流产沙门氏菌马源株接种于沙门氏菌增菌液，培养后，用0.2％v/v甲 醛 灭活，制成灭活疫苗。实验证明，使用本发明制备得到的马流产沙门氏菌灭活疫苗免疫小鼠，攻毒后，能使小鼠免于死亡，免疫马体后，安全性良好。因此该疫苗具有安全、低剂量免疫等优点。本发明首次提出了一种马流产沙门氏菌灭活疫苗，可以用于 预防 由马流产沙门氏菌引起的流产。，下面是马流产沙门氏菌马源株及其在制备马流产沙门氏菌灭活疫苗中的应用专利的具体信息内容。
1.马流产沙门氏菌马源株，命名为20180316.H.AES.G，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.18341。
2.权利要求1所述的马流产沙门氏菌马源株在制备马流产沙门氏菌灭活疫苗中的应用。
3.一种马流产沙门氏菌灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的权利要求1所述的马流产沙门氏菌马源株。
4.如权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于所述的灭活是指将权利要求1所述的马流产沙门氏菌马源株采用0.2％v/v的甲醛在28℃、130rpm/min条件下灭活48小时后，涂布无抗LB平板，37℃，培养3天，无菌，则灭活合格，再继续灭活12小时，加入PBS清洗2遍。
5.如权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于所述的灭活疫苗中还含有佐剂。
6.如权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂。
7.权利要求3-6任一项所述的灭活疫苗在制备预防由马流产沙门氏菌引起的疾病的生物制品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的疾病为马流产沙门氏菌病。
马流产沙门氏菌马源株及其在制备马流产沙门氏菌灭活疫苗
中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 马流产沙门氏菌病(Equine abortus salmonellosis)，又称为马副伤寒性流产 (Equi parathphoid)，是由马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)引起的以马 属动物流产为特征的传染病，只对马属动物具有致病性，具有菌体抗原4、12，鞭 毛第二相抗原H-enx。早在18世纪末19世纪初，欧美地区发生过大批马流产的现象， 20世纪70年代末，我国华北、西北、东北等养马地区也陆续爆发马流产沙门氏菌病， 并造成了比较严重的经济损失，该病全年都可发生，但主要发生于春秋两季，大多 数表现为散发，有时呈地方流行性。马流产沙门氏菌易感染初孕马，主要在妊娠后 期流产，多数马在发生流产前，一般无明显临床症状，突发流产，绝大多数为死胎， 有少数存活的胎儿，在出生几天后，也会发生死亡。妊娠母马流产时，病原菌随流 产胎儿、胎衣、羊水及阴道分泌物排出体外，患病公马可随精液排菌。感染马流产 沙门氏菌的马常常成为该菌的病原携带者，也通常被认为是非疫区最初的传染源。 在国际上，该病在欧美等国得到了很好的控制，一些国家偶有零散报道，比如克罗 地亚(欧洲)报道发生了2起马流产疫情，流产率分别为11％和44％；非洲及亚洲国 家是马流产主要的流行地区，但是并没有采取太好的防控措施，疫病控制的效果也 不明显；我国上一次暴发马流产疫情是在20世纪80年代，之后的30年间鲜有相关的 报告。所以，马流产沙门氏菌引起的马流产越来越不受到关注，国内外的相关研究 也不多见，更不深入，是一种被忽视的传染病。然而，近年来该病有卷土重来的态 势，上个世纪爆发过马流产疫情的阿根廷、意大利、日本等国近几年再次出现相关 报道；我国自2014年起，各地陆续发生马流产疫情，内蒙古呼伦贝尔市仅一年发生 的马流产的流产率高达66.7％，之后5年陆续在呼伦贝尔市点状暴发，流产率为30～100％，其中大部分为草原上开放式散养马群，从疫病传播速度快、波及范围广 的特点来看，疑似马流产沙门氏菌病暴发。马流产沙门氏菌主要通过污染的水和食 物以及交配进行传播，母马流产时造成环境污染，难以根除，会持续在马群中传播。 该病的发生直接影响了我国马匹的存栏量、造成严重的间接经济损失，而且该病还 有蔓延的趋势，对我国马业持续发展产生了潜在的威胁和巨大的影响，严重阻碍了 我国马业的发展。
[0003] 本发明的发明人于2018年从内蒙呼伦贝尔市某马场流产马驹组织分离到一株 马流产沙门氏菌，经实验室鉴定为强毒株，命名为20180316.H.AES.G。利用 20180316.H.AES.G株，开展了马流产沙门氏菌灭活疫苗的研制开发工作，筛选培 育出免疫原性良好的马流产沙门氏菌强毒20180316.H.AES.G株，选择了符合制 造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫 程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定，并获得了大量的试验 数据，实验证明，使用本发明制备得到的马流产沙门氏菌灭活疫苗免疫小鼠，攻毒 后，能使小鼠免于死亡，免疫马体后，安全性良好。因此该疫苗具有安全、低剂量 免疫等优点。
发明内容
[0004] 本发明的目的之一是提供一种免疫原性良好、效价稳定的马流产沙门氏菌菌 株；
[0005] 本发明的目的之二是提供所述的马流产沙门氏菌株在制备疫苗中的应用；
[0006] 本发明的目的之三是提供一种由所述的马流产沙门氏菌株制备得到的疫 苗；
[0007] 本发明的目的之四是提供所述的疫苗在制备预防马流产沙门氏菌病药物中 应用。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0009] 本发明的发明人于2018年从内蒙呼伦贝尔市某马场流产马驹组织分离到一株 马流产沙门氏菌，经鉴定为强毒株，命名为20180316.H.AES.G。本发明的 20180316.H.AES.G株是从发生典型马流产沙门氏菌感染导致妊娠母马流产的胎儿 肝脏组织中分离获得的，因此与分离到的其它毒株相比毒力强，对马的免疫原性好。 经沙门氏菌显色培养基分离和实验室鉴定后可作为疫苗毒种。对于该菌的毒力测定 采用马流产沙门氏菌强毒C77-1株作为对照。将该菌株与强毒株C77-1在 5×105CFU/0.2ml剂量下，攻毒6周龄18-21g Balb/c鼠时，7天内均可以引起100％小鼠 死亡。因此，该菌株也属于强毒株。
[0010] 本发明的一株马流产沙门氏 菌马源株，经实验室鉴定后，命名为 20180316.H.AES.G，分类命名为马流产沙门氏菌(Salmonella abortus)，保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.18341，保藏日 期为2019年7月26日。
[0011] 本发明还提供了所述的马流产沙门氏菌马源株在制备马流产沙门氏菌灭活疫 苗中的应用。
[0012] 本发明的一种马流产沙门氏菌灭活疫苗，其含有灭活后的本发明所述的马流产 沙门氏菌马源株。
[0013] 在本发明中，优选的，所述的灭活是指将所述的马流产沙门氏菌马源株采用 0.2％v/v的甲醛在28℃、130rpm/min条件下灭活48小时后，涂布无抗LB平板，37℃， 培养3天，无菌，则灭活合格，再继续灭活12小时，加入PBS清洗2遍。
[0014] 在本发明中，优选的，所述的灭活疫苗中还含有佐剂。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂。
[0016] 在本发明中，优选的，所述的马流产沙门氏菌灭活疫苗是由20％v/v的法国赛比 克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂和0.2％v/v甲醛(HCHO)灭活的马流产沙 门氏菌马源株(20180316.H.AES.G株)乳化后得到。
[0017] 在本发明中，乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐 剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批沙门氏菌菌液混合，佐 剂按照总体积25％的比例混合。
[0018] 进一步的，本发明还提供了所述的灭活疫苗在制备预防由马流产沙门氏菌引起 的疾病的生物制品中的用途。
[0020] 图1为沙门氏菌的分离与鉴定；
[0021] 图2为马流产沙门氏菌的凝集结果；
[0022] 其中：左图，O因子4、12混合血清，右图鞭毛特异性抗血清H-enx
[0023] 图3为FliC基因的PCR扩增；
[0024] 其中：M：maker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-4：20180316.H.AES.G菌株 扩增结果；
[0025] 图4为20180316.H.AES.G生长曲线；
[0026] 图5为不同菌株攻毒后小鼠的生存曲线；
[0027] 图6为不同代次灭活疫苗最小免疫剂量免疫下，攻毒后体重变化；
[0028] 图7为不同剂量免疫后小鼠体重变化；
[0029] 图8为不同剂量免疫，攻毒后小鼠体重变化；
[0030] 图9为最低免疫剂量下耐受最大攻毒剂量。
具体实施方式
[0031] 下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0032] 实施例1马流产沙门氏菌马源株20180316.H.AES.G的分离及培养鉴定
[0033] 根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽 药典》(2005年版)，对制苗用毒种进行了鉴定，现将试行规程(草案)中毒种标 准进行以下说明。
[0034] 1毒种的分离及培养鉴定
[0035] 制造本品用的毒种为马流产沙门氏菌马源株20180316.H.AES.G，是本发明人在 本发明的发明人在2018年从内蒙呼伦贝尔市某马场流产马驹组织分离到一株马流 产沙门氏菌。
[0036] 将流产马驹肝脏组织，划线接种于在沙门氏菌显色培养基上，沙门氏菌呈现紫 色，如图1。利用沙门氏菌特异性血清，对沙门氏菌显色培养基上紫色菌落进行鉴 定，当H-enx出现凝集时，证实为马流产沙门氏菌，如图2(左图，O因子4、12 混合血清，右图鞭毛特异性抗血清H-enx)。
[0037] 利用马流产沙门氏菌FliC基因特异性引物，对20180316.H.AES.G菌株进行PCR 扩增和测序鉴定结果如图3，序列证实，该菌株为马流产沙门氏菌。
[0038] 测定20180316.H.AES.G菌在沙门氏菌增菌液中的生长曲线，每小时进行细菌 计数，如图4，结果表明，0-1h，处于平台期期；1-8h处于对数生长期，8h以后处 于平台期，因此菌液一般选择8h收集。
[0039] 将马流产沙门氏菌20180316.H.AES.G株与C77-1毒力比较；分别以 5*105CFU/0.2ml，腹腔注射小鼠，20180316.H.AES.G株与强毒株C77-1相比，均能 使小鼠7天内全部致死，如图5。因此，也属于强毒株。
[0040] 本发明的20180316.H.AES.G株是从发生典型马流产沙门氏菌感染导致妊娠母 马所产的流产胎儿肝脏组织中分离获得的，因此与分离到的其它毒株相比毒力强， 对马的免疫原性好。经沙门氏菌显色培养基分离和实验室鉴定后可作为疫苗毒种。 该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳 区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.18341，保藏日期为2019年7月26日。
[0041] 2毒种(CGMCC No.18341)标准
[0042] 2.1毒力
[0043] 细菌代次为马流产沙门氏菌马源株20180316.H.AES.G株第2～10代。攻毒剂 量为5×105CFU/0.2ml，程序是SPF级6周龄Balb/C雌性小鼠8只，采取腹腔注射 方式，注射后观察7天，每天记录小鼠死亡情况；判定标准是攻毒后7天，小鼠应 全部死亡。
[0044] 2.2免疫原性
[0045] 将毒种接种于沙门氏菌增菌液进行培养，利用试管进行2倍梯度稀释，采 用平板涂布法计数，用0.2％的甲醛溶液灭活后，加MONTANIDE ISA35佐剂混 合乳化制成灭活疫苗，用SPF级6周龄Balb/C雌性小鼠8只，腹腔注射菌苗 1×107CFU/0.2ml，未免疫菌苗小鼠8只作为对照组，19天后，免疫组与对照组小鼠 均腹腔注射强毒株C77-1，攻毒剂量为5个最小完全致死剂量/0.2ml(5MLD/0.2ml)， 攻毒后观察15天，对照组7日内全部死亡，免疫组小鼠15天内，死亡不超过2只。
[0046] 2.3毒种使用代次
[0047] 利用显色培养基，划线连续传代，传至40代，以20、30、40代，以最小完全 致死剂量(5×105CFU/0.2ml)去攻毒8只小鼠，观察15天，死亡率分别为100％、 87.5％、87.5％，结果表明，菌株传至20代以后，毒力略有降低，如表1。马流 产沙门氏菌20180316.H.AES.G株不同代次(20、30、40代)菌株制备成灭活疫 苗，以最低免疫剂量免疫8只小鼠，第19天，攻强毒C77-1，5MLD。结果表 明，不同代次免疫后，仅引起小鼠体重下降，均不引起小鼠死亡，如图6。攻强 毒C77-1后小鼠免疫保护率分别为100％、87.5％、87.5％。死亡均不超过2只， 如表
2。为确保菌株的毒力及疫苗免疫原性，将菌株最高代次定为20代。
2。为确保菌株的毒力及疫苗免疫原性，将菌株最高代次定为20代。
[0048] 表1不同代次菌株的毒力鉴定——最小完全致死剂量下
[0049]
[0050] 表2不同代次菌株制备的灭活疫苗的免疫保护效果
[0051]
[0052] 实施例2灭活疫苗的制备
[0053] 1灭活工艺
[0054] 选择终浓度为0.1％v/v、0.15％v/v、0.2％v/v的甲醛溶液在4、28℃、37℃灭活， 0.2％甲醛在28℃灭活48小时，灭活效果完全。因而最终确定0.2％v/v甲醛在28℃ 灭活48小时，涂布无抗LB平板，37℃，培养3天，无菌，则灭活合格，然后再继 续灭活12h。利用PBS洗
2遍，去除甲醛。
2遍，去除甲醛。
[0055] 2乳化工艺
[0056] 采用法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂与0.2％v/v甲醛 (HCHO)灭活的马流产沙门氏菌马源株20180316.H.AES.G株混合乳化制成灭活疫 苗，佐剂浓度为25％。利用PBS定容。
[0057] 3半成品检验质量标准
[0058] 3.1无菌检验
[0059] 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0060] 3.3灭活检验
[0061] 取灭活后的原菌液，涂布无抗LB平板100μl，37℃观察3天，应无菌生长。
[0062] 4关于成品检验质量标准
[0063] 4.1安全检验标准
[0064] 将安全性试验合格的3批灭活疫苗，分别按照不同剂量106CFU/0.2ml、 107CFU/0.2ml、108CFU/0.2ml分别腹腔注射小鼠，每天记录每组小鼠的平均体重。 结果表明3组不同剂量免疫后，仅引起小鼠体重下降，免疫剂量越大，体重下降约 明显，如图7；不同剂量免疫均不能引起小鼠死亡，如表3，说明本发明灭活疫苗 对小鼠均安全。
[0065] 表3不同免疫剂量的小鼠安全性检验
[0066]
[0067] 4.2效力检验标准的制定
[0068] 4.2.1小鼠最小免疫剂量和最小使用剂量试验
[0069] 将安全性试验合格的3批灭活疫苗，按照不同剂量106CFU/0.2ml、 107CFU/0.2ml、108CFU/0.2ml分别免疫6月龄balb/C小鼠8只，19天进行攻强 毒C77-1，5MLD剂量。每天记录每组小鼠的平均体重变化及小鼠的死亡情况。 结果表明，免疫剂量108CFU/0.2ml组，攻毒后体重下降最小，如图8。对照组， 7日内全部死亡，免疫组15天内，无小鼠死亡，如表4。因此以106CFU/0.2ml， 作为小鼠的最低免疫剂量。
[0070] 表4不同免疫剂量的小鼠免疫效力检验
[0071]
[0072] 4.2.2免疫保护小鼠可抵抗的最高攻毒剂量试验
[0073] 将安全性试验合格的灭活疫苗在最低免疫剂量(106CFU/0.2ml)下各免疫8只， 19天后，各攻C77-1强毒5、10、15、20MLD，对照组不免疫只攻毒5MLD的C77-1， 观察15天。对照组7天内100％死亡，免疫组小鼠15天死亡只数分别为1、2、1、 2只，死亡数量均不超过2只，如图9，符合要求。
[0074] 5免疫程序的确定
[0075] 根据马流产沙门氏菌病的发病特点，一般妊娠后，进行免疫注射。灭活疫 苗一般1年2次，本发明也采用一年2次免疫，每隔6个月免疫一次，为了确 保免疫效果，每次免疫后1个月再追加免疫一次。
[0076] 6疫苗的保存期
[0077] 本发明对实验室制备的灭活疫苗在小鼠上进行了保存期试验研究，将3批疫 苗在2～8℃条件下保存2、6、8个月，在各个时间段分别取样对其性状、安全 性及免疫效力(以最小免疫剂量免疫)检测。结果显示，疫苗在2～8℃条件下 保存6个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。 最低免疫剂量下，攻5MLD的强毒C77-1，死亡均不超过2只，对照组7天内 100％死亡。考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，本发明将疫苗的 保存期定为2～8℃条件下保存6个月。
[0078] 实施例3马体安全性试验
[0079] 将实施例2制备的安全性试验合格的3批灭活疫苗，对种公马、未孕及妊娠前 期、妊娠中期、妊娠后期母马进行免疫(100亿/ml/匹，1.0×1010CFU/ml)，观察实 验马对疫苗的吸收情况，饮食、饮水、精神状况是否正常。结果表明，仅个别马匹 出现不爱吃草，饮水正常，个别马匹免疫部位出现肿胀，但无破溃，一般第4天开 始肿胀消退，2周肿胀完全消失。体温个别出现短暂上升，2天内恢复正常。通过 一个月的观察，疫苗免疫不会引起妊娠母马发生流产，见表5。
[0080] 表5马体安全性试验
[0081]
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