用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌及在液体发酵中的应用
专利汇可以提供用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌及在液体发酵中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于 棉 籽蛋白 发酵 的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）ESIGMA-945，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014412，保藏日期：2014年9月14号；该枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）ESIGMA-945的筛选方法主要通过菌株粗筛、菌种产 碱 性蛋白酶复筛和菌种脱酚能 力 复筛得到；该枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）ESIGMA-945可应用到液体发酵中。本 发明 筛选出一株既能对棉籽蛋白进行发酵以降低棉酚含量，又能产生高含量的碱性蛋白酶对动物肠道有益的枯草芽孢杆菌；该菌株应用到液体发酵中，可将游离棉酚含量降到极低，满足 饲料 、食品、医药等行业对棉籽蛋白的需求；该发明工艺简单、安全环保、成本低廉、易于推广，所得发酵后棉籽蛋白产品含有枯草芽孢杆菌等有益菌还具有能够增强动物 机体 免疫力等功效。，下面是用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌及在液体发酵中的应用专利的具体信息内容。
1.一种用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌，其特征在于，该枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的保藏名称为ESIGMA-945，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014412，保藏日期：2014年9月14号。
2.一种权利要求1所述的用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌株初筛：
取棉籽储存仓库周围的土壤样品加入到无菌去离子水中稀释，移取1ml稀释液到富集培养基中，温度37℃、转数160r/min条件下恒温摇床富集培养44-52h；超净工作台上取出富集培养后的菌液，进行梯度稀释，稀释后分别涂布于分离培养基上，培养44-52h；挑取能够在分离培养基上正常生长的单菌落，纯化3次，得纯种微生物菌株；筛选的菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，富集培养基配方为：蛋白胨7-9ｇ，酵母膏2-4ｇ，牛肉膏3-5ｇ，氯化钠4-6 g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-9.5；分离培养基配方为：干酪素7-9ｇ，琼脂12-18ｇ，氯化钠4-6g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为8.5-9.5；
（2）菌种产碱性蛋白酶复筛：
初筛的纯种微生物菌株接种于产碱性蛋白酶发酵培养基中，温度37℃、转数200r/min条件下恒温摇床发酵培养44-52h；发酵培养液在温度４℃、转数12000r/min条件下离心8 min，分离得上清液即为粗酶液，粗酶液采用Folin酚显色法测定其碱性蛋白酶活性，进行菌种产碱性蛋白酶复筛；筛选强碱性蛋白酶活性菌株为目标菌株，用于下一步研究；将筛到的菌株放入LB固体培养基中斜面保藏；
其中产碱性蛋白酶发酵培养基：蛋白胨7-9ｇ，牛肉膏3-5ｇ，氯化钠4-6ｇ，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-11.5；
（3）菌种脱酚能力复筛
将碱性蛋白酶复筛得到的菌株接种于以棉酚为碳源的发酵液中，温度37℃，转数
200r／min恒温摇床发酵培养54 h；发酵后培养液在温度4℃，转数10000 r/min条件下离心获得上清液，上清液经0.2μm微孔滤膜过滤除菌，除菌后干燥得样品；以苯胺法后发酵液中棉酚的含量，计算发酵液中棉酚的降解量，筛选降解量高的菌株为目标菌株；目标菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，棉酚为碳源的发酵液配方为：棉酚6-8 g，硫酸铵1-2 g，七水硫酸镁 0.2-0.4 g，磷酸二氢钠 0.7-0.9 g，氯化钙0.1-0.3 g，磷酸氢二钾0.3-0.5 g，琼脂13-18 g，加去离子水定容至1000 mL，调整pH为 8.5-9.5。
3.一种权利要求1所述的用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌在液体发酵中的应用，其特征在于，包括以下工艺流程：
（1）枯草芽孢杆菌活化后以1-5%接种量接种到液体培养基中，在35℃恒温培养箱中培养22-26h，获得发酵液；
（2）步骤（1）中发酵液接种到新培养基并转入35℃种子培养罐培养46-50h，培养结束后获得液体菌种；
（3）棉籽蛋白加水混匀后进行蒸汽灭菌，灭菌结束后冷却备用；
（4）灭菌冷却的棉籽蛋白加入步骤（3）中液体菌种，充分搅拌，进行液体发酵。
4.根据权利要求3所述的用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌在液体发酵中的应用，其特征在于，所述棉籽蛋白和液体菌种质量比为1: 3-6。
5.根据权利要求4所述的用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌在液体发酵中的应用，其特征在于，所述棉籽蛋白和液体菌种质量比优选1:5。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌在液体发酵中的应用，其特征在于，所述液体发酵发酵温度为32-40℃，pH为8.5-11.5，接种量为1-5%，发酵时间为24-72h，转速为180-220r/min。
7.根据权利要求3-5任意一项所述的用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌在液体发酵中的应用，其特征在于，所述液体发酵优选条件为发酵温度40℃，pH 10，接种量5%，发酵时间24h，转速220r/min。
用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌及在液体发酵中的应用
201310152646.7的中国专利，采用60%-68%的含水甲醇或含水乙醇作为溶剂，得到脱酚棉籽粕。上述方法不但消耗大量有机溶剂，而且会造成环境污染。
一种用于棉籽蛋白发酵的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的保藏名称为ESIGMA-945，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M
2014412，保藏日期：2014年9月14号。
取棉籽储存仓库周围的土壤样品加入到无菌去离子水中稀释，移取1ml稀释液到富集培养基中，温度37℃、转数160r/min条件下恒温摇床富集培养44-52h；超净工作台上取出富集培养后的菌液，进行梯度稀释，稀释后分别涂布于分离培养基上，培养44-52h；挑取能够在分离培养基上正常生长的单菌落，纯化3次，得纯种微生物菌株；筛选的菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，富集培养基配方为：蛋白胨7-9ｇ，酵母膏2-4ｇ，牛肉膏3-5ｇ，氯化钠4-6 g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-9.5；分离培养基配方为：干酪素7-9ｇ，琼脂12-18ｇ，氯化钠4-6g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为8.5-9.5；
（2）菌种产碱性蛋白酶复筛：
初筛的纯种微生物菌株接种于产碱性蛋白酶发酵培养基中，温度37℃、转数200r/min条件下恒温摇床发酵培养44-52h；发酵培养液在温度４℃、转数12000r/min条件下离心8 min，分离得上清液即为粗酶液，粗酶液采用Folin酚显色法测定其碱性蛋白酶活性，进行菌种产碱性蛋白酶复筛；筛选强碱性蛋白酶活性菌株为目标菌株，用于下一步研究；将筛到的菌株放入LB固体培养基中斜面保藏；
其中产碱性蛋白酶发酵培养基：蛋白胨7-9ｇ，牛肉膏3-5ｇ，氯化钠4-6ｇ，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-11.5；
（3）菌种脱酚能力复筛
将碱性蛋白酶复筛得到的菌株接种于以棉酚为碳源的发酵液中，温度37℃，转数
200r／min恒温摇床发酵培养54 h；发酵后培养液在温度4℃，转数10000 r/min条件下离心获得上清液，上清液经0.2μm微孔滤膜过滤除菌，除菌后干燥得样品；以间苯三酚法分别测定发酵前后发酵液中棉酚的含量，计算发酵液中棉酚的降解量，筛选降解量高的菌株为目标菌株；目标菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，棉酚为碳源的发酵液配方为：棉酚6-8 g，硫酸铵1-2 g，七水硫酸镁 0.2-0.4 g，磷酸二氢钠 0.7-0.9 g，氯化钙0.1-0.3 g，磷酸氢二钾0.3-0.5 g，琼脂13-18 g，加去离子水1000 mL，pH 8.5-9.5。
（2）步骤（1）中发酵液接种到新培养基并转入35℃种子培养罐培养46-50h，培养结束后获得液体菌种；
（3）棉籽蛋白加水混匀后进行蒸汽灭菌，灭菌结束后冷却备用；
（4）灭菌冷却的棉籽蛋白加入步骤（3）中液体菌种，充分搅拌，进行液体发酵。
接种量5%。 正交实验及综合分析结果显示，该条件下，脱毒效果最好，棉酚的含量可以降低98%(＜10ppm)，达到国家饲料用棉籽饼粕的安全标准为棉酚含量在200ppm以下。
（2）菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，边缘光滑；
（3）发酵后可产生碱性蛋白酶；
（4）该枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶稳定性条件为温度20℃-55℃，pH值8.5-11.5；
（5）该枯草芽孢杆菌在温度35℃，pH 8.5，接种量为2%，发酵时间28h的条件下，可发酵产碱性蛋白酶800U/ml。
取棉籽储存仓库周围的土壤样品加入到无菌去离子水中稀释，移取1ml稀释液到富集培养基中，温度37℃、转数160r/min条件下恒温摇床富集培养48h；超净工作台上取出富集培养后的菌液，进行梯度稀释，稀释后分别涂布于分离培养基上，培养48h；挑取能够在分离培养基上正常生长的单菌落，纯化3次，得纯种微生物菌株；筛选的菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，富集培养基配方为：蛋白胨8ｇ，酵母膏3ｇ，牛肉膏4ｇ，氯化钠5 g，加水至
1000ml，利用氨水将pH调至 8.5-9.5；分离培养基配方为：干酪素8ｇ，琼脂15ｇ，氯化钠
5g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为8.5-9.5；
（2）菌种产碱性蛋白酶复筛：
初筛的纯种微生物菌株接种于产碱性蛋白酶发酵培养基中，温度37℃、转数200r/min条件下恒温摇床发酵培养48h；发酵培养液在温度４℃、转数12000r/min条件下离心8 min，分离得上清液即为粗酶液，粗酶液采用Folin酚显色法测定其碱性蛋白酶活性，进行菌种产碱性蛋白酶复筛；筛选强碱性蛋白酶活性菌株为目标菌株，用于下一步研究；将筛到的菌株放入LB固体培养基中斜面保藏；
其中产碱性蛋白酶发酵培养基：蛋白胨8ｇ，牛肉膏4ｇ，氯化钠5ｇ，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-11.5；
（3）菌种脱酚能力复筛
将碱性蛋白酶复筛得到的菌株接种于以棉酚为碳源的发酵液中，温度37℃，转数
200r／min恒温摇床发酵培养54 h；发酵后培养液在温度4℃，转数10000 r/min条件下离心获得上清液，上清液经0.2μm微孔滤膜过滤除菌，除菌后干燥得样品；以间苯三酚法分别测定发酵前后发酵液中棉酚的含量，脱毒后的棉籽蛋白中棉酚含量≤20ppm，计算发酵液中棉酚的降解量，筛选降解量高的菌株为目标菌株；目标菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，棉酚为碳源的发酵液配方为：棉酚7 g，硫酸铵1.5 g，七水硫酸镁 0.3 g，磷酸二氢钠 0.8 g，氯化钙0.2 g，磷酸氢二钾0.4 g，琼脂15 g，加去离子水定容至1000 mL，调整pH为 8.5-9.5。
1:5，充分搅拌，在pH 9.0，温度35℃，转数200r/min条件下进行发酵培养48h。
（1）菌株粗筛：
取棉籽储存仓库周围的土壤样品加入到无菌去离子水中稀释，移取1ml稀释液到富集培养基中，温度37℃、转数160r/min条件下恒温摇床富集培养44h；超净工作台上取出富集培养后的菌液，进行梯度稀释，稀释后分别涂布于分离培养基上，培养44h；挑取能够在分离培养基上正常生长的单菌落，纯化3次，得纯种微生物菌株；筛选的菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，富集培养基配方为：蛋白胨7ｇ，酵母膏2ｇ，牛肉膏3ｇ，氯化钠4g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-9.5；分离培养基配方为：干酪素7ｇ，琼脂12ｇ，氯化钠4g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为8.5-9.5；
（2）菌种产碱性蛋白酶复筛：
初筛的纯种微生物菌株接种于产碱性蛋白酶发酵培养基中，温度37℃、转数200r/min条件下恒温摇床发酵培养44h；发酵培养液在温度４℃、转数12000r/min条件下离心8 min，分离得上清液即为粗酶液，粗酶液采用Folin酚显色法测定其碱性蛋白酶活性，进行菌种产碱性蛋白酶复筛；筛选强碱性蛋白酶活性菌株为目标菌株，用于下一步研究；将筛到的菌株放入LB固体培养基中斜面保藏；
其中产碱性蛋白酶发酵培养基：蛋白胨7ｇ，牛肉膏3ｇ，氯化钠4ｇ，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-11.5；
（3）菌种脱酚能力复筛
将碱性蛋白酶复筛得到的菌株接种于以棉酚为碳源的发酵液中，温度37℃，转数
200r／min恒温摇床发酵培养54 h；发酵后培养液在温度4℃，转数10000 r/min条件下离心获得上清液，上清液经0.2μm微孔滤膜过滤除菌，除菌后干燥得样品；以间苯三酚法分别测定发酵前后发酵液中棉酚的含量，计算发酵液中棉酚的降解量，筛选降解量高的菌株为目标菌株；目标菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
其中，棉酚为碳源的发酵液配方为：棉酚6 g，硫酸铵1 g，七水硫酸镁 0.2 g，磷酸二氢钠 0.7 g，氯化钙0.1 g，磷酸氢二钾0.35 g，琼脂13 g，加去离子水定容至1000 mL，调整pH为 8.5-9.5。枯草芽孢杆菌在液体发酵中的应用，包括以下工艺流程：
枯草芽孢杆菌活化后以1%接种量接种，在35℃恒温培养箱中培养22h，获得的发酵液接种到新培养基中并转入35℃种子培养罐培养46h，获得液体菌种；棉籽蛋白加水后进行蒸汽灭菌，结束后冷却并加入上述液体菌种，棉籽蛋白和液体菌种质量比为1:3，充分搅拌，在发酵温度32℃，pH 8.5，转速180r/min条件下发酵培养24h。
（1）菌株粗筛：
取棉籽储存仓库周围的土壤样品加入到无菌去离子水中稀释，移取1ml稀释液到富集培养基中，温度37℃、转数160r/min条件下恒温摇床富集培养52h；超净工作台上取出富集培养后的菌液，进行梯度稀释，稀释后分别涂布于分离培养基上，培养52h；挑取能够在分离培养基上正常生长的单菌落，纯化3次，得纯种微生物菌株；筛选的菌株接入LB固体培养基中斜面保藏；
取其中，富集培养基配方为：蛋白胨9ｇ，酵母膏4ｇ，牛肉膏5ｇ，氯化钠6 g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-9.5；分离培养基配方为：干酪素9ｇ，琼脂18ｇ，氯化钠6g，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为8.5-9.5；
（2）菌种产碱性蛋白酶复筛：
初筛的纯种微生物菌株接种于产碱性蛋白酶发酵培养基中，温度37℃、转数200r/min条件下恒温摇床发酵培养52h；发酵培养液在温度４℃、转数12000r/min条件下离心8 min，分离得上清液即为粗酶液，粗酶液采用Folin酚显色法测定其碱性蛋白酶活性，进行菌种产碱性蛋白酶复筛；筛选强碱性蛋白酶活性菌株为目标菌株，用于下一步研究；将筛到的菌株放入LB固体培养基中斜面保藏；
其中产碱性蛋白酶发酵培养基：蛋白胨9ｇ，牛肉膏5ｇ，氯化钠6ｇ，加去离子水定容至1000ml，利用氨水调整pH为 8.5-11.5；
（3）菌种脱酚能力复筛
将碱性蛋白酶复筛得到的菌株接种于以棉酚为碳源的发酵液中，温度37℃，转数
200r／min恒温摇床发酵培养54 h；发酵后培养液在温度4℃，转数10000 r/min条件下
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