技术领域
[0001] 本
发明涉及一种花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌及其筛选纯化方法和用途。
[0002] 本发明得到的菌株已于2014年10月31日中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC M 2014535，分类名称：沙芬西芽孢杆菌GHF4(Bacillus safensis GHF4)。
背景技术
[0003] 随着社会的发展，人们对健康有了新需求，天然抗
氧化剂因其应用范围广，毒
副作用小，越来越受关注，而提取天然抗氧化活性物质更是众多学者一直研究的热点。近年来，
植物内生菌倍受关注，许多国内外研究证实，植物内生菌是一种可开发利用的新型资源，它在与宿主相互作用过程中，不仅具有促进植物生长，提高植物抗病性的能
力,而且还能代谢与宿主相同或相类似的活性物质，植物内生菌代谢产物是一种潜在的资源，大多具有
生物学活性，如抗菌、抗病毒等作用(Schulz,B.,Boyle,C.,Draeger,S.,A.K.,&Krohn,K.Endophytic fungi:A source of novel biologically active secondary metabolites[J].Mycological Research,2002,106:996–1004.)。因其具有高产、环境友好，安全等特点，所以使其在食品、药品等行业中的应用具有广阔前景。
[0004] 目前，未见有关于从花椒叶中分离得到内生沙芬西芽孢杆菌的
专利和非专利文献报道，也没有关于花椒叶内生菌代谢产物有抗氧化性的研究报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一株花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌，并在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO.：M2014535；本发明的另一个目的是该花椒叶内生菌的抗氧化活性的应用。
[0006] 本发明的花椒内生菌是
发明人从花椒叶中分离得到的一株沙芬西芽孢杆菌，经传统方法鉴定和分子鉴定表明它属于内生沙芬西芽孢杆菌，并将其命名为GHF4。
[0007] 本发明的花椒叶内生菌——GHF4已于2014年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2014535。
[0008] 花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌的筛选及纯化包括以下步骤：
[0009] (1)清洗消毒
[0010] 在无菌操作台内，用无菌
水冲洗新鲜花椒叶3次，再用浓度为0.5～1.5％
次氯酸钠溶液浸泡新鲜红花椒叶3～8min，之后用浓度为75％的
乙醇消毒5～10min，无菌水冲洗3次，并保留最后一次洗涤用水作为对照；
[0011] (2)富集培养
[0012] 将上述清洗消毒处理的新鲜红花椒叶，在研钵中
研磨捣碎，接种于含有1％重铬酸
钾的营养琼脂固体培养基，于
温度28～30℃恒温
培养箱下培养5～7天，观察有菌落长出；
[0013] (3)平板涂布
[0014] 将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28～30℃恒温培养箱中培养5～7天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度28～30℃的恒温培养箱中培养5天；
[0015] (4)初筛
[0016] 将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28～30℃恒温培养箱中培养5～7天后，挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线，置于28～30℃的恒温培养箱中培养5～7天；挑选以上步骤得到的单菌落，划线接种于新的营养琼脂固体培养基中；
[0017] (5)复筛
[0018] 将步骤(3)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度28～30℃摇床中
发酵培养，将发酵液离心后取上清液，通过2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除实验评价发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏；
[0019] (6)生理生化特征和16S rDNA分析
[0020] 生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0021] 所述富集培养基：蛋白胨1％，
酵母提取物0.5％，
氯化钠1％，琼脂1.5％，pH为7.0～7.6，灭菌后加入1％重铬酸钾；营养琼脂固体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％，pH为7.0～7.6；营养琼脂液体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH为7.0～7.6。
[0022] 性能测试与结构表征
[0023] 生理生化特征：如表1所示，16S rDNA分析：详见SEQUENCE LISTING。
[0024] 经过上述6个筛选步骤所得菌株分别在光学
显微镜(革兰氏
染色后)以及
电子显微镜下观察细菌，其形态特征：本发明菌种为
革兰氏阳性菌，菌体单个短杆状，表面光滑，长1.0～1.1μm，宽0.5μm，在营养琼脂培养基上生长良好，菌落形态呈乳白色，表面光滑， 菌落边缘不平整；生长温度为28～30℃，菌种的生长能够利用
葡萄糖、蜜
二糖、
纤维二糖作为唯一
碳源，经过分子扩增测序得到该菌株CCTCC M 2014535的16S rDNA序列与沙芬西芽孢杆菌Bacillus safensis(GENEBANK登录号为NR_113945.1)分子同源性最高，达99％以上。
[0025] 本发明对沙芬西芽孢杆菌CCTCC M 2014535的发酵液进行HPLC分析，高效液相色谱分析条件如下：ODS-3色谱柱( 4.6×250mm，5μm)；流速，1mL/min；柱温，25℃；检测
波长，254nm；梯度洗脱液：0min，0％甲醇(0.1％
甲酸)；10min，20％甲醇(0.1％甲酸)；20min，25％甲醇(0.1％甲酸)；30min～40min，100％甲醇(0.1％甲酸)。
[0026] 本发明的沙芬西芽孢杆菌CCTCC M 2014535发酵液的抗氧化作用包括以下步骤：
[0027] (1)将营养琼脂液体培养基分装于三
角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的菌种于培养瓶中，在温度28～30℃摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10min，取上清液，减压浓缩干燥后得花椒叶内生菌发酵液提取物；
[0028] (2)将花椒叶内生菌发酵液提取物分别以18.75mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.25mg/mL的浓度加入96孔板，加入量为50μL/孔，再在96孔板中加入
200μLABTS工作液。在避光条件下，进行自由基清除实验反应30min，反应结束后立即测定各个反应液的吸光度，并计算清除率及半抑制浓度值(IC50)。
[0029] 本发明具有如下优点：
[0030] 1、筛选方法简单，操作方便。
[0031] 2、筛选得到的花椒叶内生菌GHF4为沙芬西芽孢杆菌。
[0032] 3、筛选得到的花椒叶内生菌菌株发酵液具有较好的抗氧化活性。
附图说明
[0033] 图1a为菌株CCTCC M 2014535的扫描电镜图
[0034] 图1b为菌株CCTCC M 2014535的扫描电镜放大图
[0035] 图2为菌株CCTCC M 2014535的ABTS自由基清除活性图
[0036] 图3为菌株CCTCC M 2014535的发酵液的HPLC分析图谱
具体实施方式
[0037] 下面通过
实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0038] 实施例1：
[0039] (1)清洗消毒
[0040] 在无菌操作台内，无菌水冲洗三次，用0.5％次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花花椒叶8min后，用75％的乙醇消毒10min，无菌水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。
[0041] (2)富集培养
[0042] 将表面消毒后的花椒叶研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度28℃恒温培养箱中培养5天。
[0043] (3)平板涂布
[0044] 将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28℃恒温培养箱中培养7天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度28℃的恒温培养箱中培养5天；
[0045] (4)初筛
[0046] 从营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28℃恒温培养箱中培养7天后，挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线，置于温度28℃的恒温培养箱中培养7天；挑选以上步骤得到的单菌落，划线接种于新的营养琼脂固体培养基中。
[0047] (5)复筛
[0048] 将步骤(3)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度28℃摇床中发酵培养。将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验检测其发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏。
[0049] (6)生理生化特征和16S rDNA分析：
[0050] 生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0051] 实施例2
[0052] (1)清洗消毒：
[0053] 在无菌操作台内，无菌水冲洗三次，用1％次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花椒叶5min后，用75％的乙醇消毒8min，无菌水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。
[0054] (2)富集培养：将表面消毒后的花椒叶研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度29℃恒温培养箱中培养6天。
[0055] (3)平板涂布
[0056] 将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度29℃恒温培养箱中培养6天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体 培养基上平板划线后置于温度29℃的恒温培养箱中培养5天；
[0057] (4)初筛：
[0058] 从营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度29℃恒温培养箱中培养6天后，挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线，置于29℃的恒温培养箱中培养6天；挑选以上步骤得到的单菌落，划线接种于新的营养琼脂固体培养基中。
[0059] (5)复筛：
[0060] 将步骤(3)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度29℃摇床中发酵培养。将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验检测其发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏。
[0061] (6)生理生化特征和16S rDNA分析：生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0062] 实施例3
[0063] (1)清洗消毒：
[0064] 在无菌操作台内，无菌水冲洗三次，用1.5％次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花椒叶3min后，用75％的乙醇消毒5min，无菌水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。
[0065] (2)富集培养：
[0066] 将表面消毒后的花椒叶研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度30℃恒温培养箱中培养7天。
[0067] (3)平板涂布
[0068] 将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度30℃恒温培养箱中培养5天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度30℃的恒温培养箱中培养5天；
[0069] (4)初筛：
[0070] 从营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度30℃恒温培养箱中培养5天后，挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线，置于温度30℃的恒温培养箱中培养5天；挑选以上步骤得到的单菌落，划线接种于新的营养琼脂固体培养基中。
[0071] (5)复筛：
[0072] 将步骤(4)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度30℃摇床中发酵培养。 将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验检测其发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏。
[0073] (6)生理生化特征和16S rDNA分析：生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0074] 应用实例1
[0075] 花椒叶内生菌发酵液的抗氧化活性检测方法之一：
[0076] (1)通过实例1的分离纯化方案，将从花椒叶中分离纯化得到的内生菌菌株进行液体发酵培养：花椒叶内生细菌培养基为营养琼脂液体培养基，将营养琼脂液体培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的菌种于培养瓶中，在温度28～30℃摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10min，取上清液，减压浓缩干燥后得到花椒叶内生菌发酵液提取物。
[0077] (2)抗氧化活性测定：在96孔板中加入200μL ABTS工作液。将花椒叶内生菌发酵液提取物分别以18.75mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.25mg/mL浓度加入96孔板，加入量为50μL/孔。在避光条件下，进行自由基清除实验反应30min，反应结束后立即测定各个反应液的吸光度，并计算清除率及IC50。
[0078] (3)抗氧化活性测定实验结果如图2所示。结果表明，当花椒叶内生菌发酵液浓度达到3.75mg/mL时，对ABTS自由基的清除率可以达到99.48％。经计算花椒叶内生菌发酵液对ABTS自由基的IC50＝0.802mg/mL。
[0079] 表1 GHF4的生理生化特征
[0080]
